JP7411326B2 - タンパク質－タンパク質インターフェースを分析するための方法および試薬 - Google Patents

タンパク質－タンパク質インターフェースを分析するための方法および試薬 Download PDF

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Description

低分子薬剤の大多数は、標的タンパク質上の機能的重要ポケットに結合することにより作用し、それにより、そのタンパク質の活性をモジュレートする。たとえば、コレステロール低下薬剤のスタチンは、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの酵素活性部位に結合し、それにより、酵素がその基質にエンゲージするのを防止する。多くのかかる薬剤／標的相互作用ペアが知られているという事実から、適正量の時間、労力、および資源をかければすべてではないにしてもほとんどのタンパク質に対する低分子モジュレータを発見可能であるという誤った考えに導かれる者が現れうる。このことは真実からはほど遠い。現在の推定値によれば、全ヒトタンパク質の約１０％が低分子の標的となりうるにすぎない。残りの９０％は、低分子薬剤の発見が面倒または困難であると現在考えられている。かかる標的は、通常「アンドラッガブル」として参照される。こうしたアンドラッガブル標的には、医学的に重要なヒトタンパク質の莫大なかつほとんど未開発の宝庫が含まれる。それゆえ、かかるアンドラッガブル標的の機能をモジュレート可能な新しい分子モダリティーを発見することに大きな関心が存在する。
標的との小分子の相互作用は接着力によって推進され、その強さは接触表面積と概ね比例するため、小分子はそれらの標的化能力において制限されている。それらの小さなサイズのために、小分子が十分な分子間の接触表面積を増大し、標的タンパク質と効果的に相互作用する唯一の方法は、そのタンパク質によって文字どおりに取り込まれることである。実際に、多数の実験および計算用データの両方は、それらの表面上に疎水性「ポケット」を有するそれらのタンパク質のみが、小分子を結合することができるという考え方を支持する。そのような場合、結合は、取込みによって可能となる。
小分子が、疎水性ポケット以外の部位において標的タンパク質と相互作用することを可能とする戦略を自然は進展させてきた。この戦略は、天然由来の免疫抑制薬であるシクロスポリンＡ、ラパマイシン、およびＦＫ５０６によって例示される。これらの薬物の生物活性は、小さな提示タンパク質との小分子の高親和性複合体の形成を伴う。小分子および提示タンパク質の複合表面は、標的と会合する。このように、例えば、シクロスポリンＡおよびシクロフィリンＡの間に形成される二元複合体は、高親和性および特異性を伴ってカルシニューリンを標的とするが、シクロスポリンＡまたはシクロフィリンＡ単独のどちらも測定可能な親和性を伴ってカルシニューリンを結合しない。
本発明者らは、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質ペアを同定し、かつこれらの相互作用をモジュレートすることができる小分子の開発において使用するための、これらの間のインターフェースを探索するのに有用な化合物およびコンジュゲートを開発した。
したがって、本開示は、タンパク質－タンパク質インターフェース、例えば、プレゼンタータンパク質（例えば、ＦＫＢＰファミリーのメンバー、シクロフィリンファミリーのメンバー、またはＰＩＮ１）および標的タンパク質の間のインターフェースを分析するのに有用な方法および試薬を提供する。このような分析は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の両方に同時に結合することができる小分子の設計を助けることにおいて有用であり、このように得られた小分子－プレゼンタータンパク質複合体は、標的タンパク質に結合し、標的タンパク質の活性をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、標的および／またはプレゼンタータンパク質は、細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、標的および／またはプレゼンタータンパク質は、哺乳動物のタンパク質である。
一部の態様では、本開示は、架橋基質として使用し得る化合物を提供する。これらの化合物は、タンパク質（例えば、標的タンパク質またはプレゼンタータンパク質）に共有結合または非共有結合することができるタンパク質結合部分と、タンパク質結合部分に結合するものとは異なるタンパク質のアミノ酸と化学選択的反応をすることができる少なくとも１個の架橋基とを含み得る。一部の実施形態では、化合物は、１個のみの架橋基を含む。
したがって、一態様では、本開示は、タンパク質結合部分（例えば、プレゼンタータンパク質結合部分または標的タンパク質結合部分）および架橋基（例えば、タンパク質結合部分に結合するものとは異なるタンパク質のアミノ酸と化学選択的反応と化学選択的反応をすることができる部分）を含む化合物を提供する。タンパク質結合部分は、タンパク質（例えば、これがプレゼンタータンパク質結合部分または標的タンパク質結合部分であるかによって、プレゼンタータンパク質または標的タンパク質）に結合（共有結合的または非共有結合的）することができ、一方、架橋基は、タンパク質（例えば、プレゼンタータンパク質、標的タンパク質、またはこのような他のタンパク質を結合することができる別の化合物）と共に共有結合を形成することができる。一部の実施形態では、化合物がプレゼンタータンパク質結合部分を含むとき、化合物は、標的タンパク質結合部分を含まない。一部の実施形態では、化合物が標的タンパク質結合部分を含むとき、化合物は、プレゼンタータンパク質結合部分を含まない。
一部の実施形態では、架橋基は、スルフヒドリル反応性架橋基（例えば、架橋基は、混合ジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、ビニルケトン、またはハロゲン化アルキルを含む）、アミノ反応性架橋基、カルボキシル反応性架橋基、カルボニル反応性架橋基、またはトリアゾール形成架橋基である。
一部の実施形態では、架橋基は、混合ジスルフィドを含み、例えば、架橋基は、化学式Ｉの構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示し、
ａは、０、１、または２であり、
ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールである。 一部の実施形態では、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール（例えば、ピリジル）である。一部の実施形態では、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。
一部の実施形態では、ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル）である。一部の実施形態では、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。 一部の実施形態では、架橋基は、マレイミドを含み、例えば、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。
一部の実施形態では、架橋基は、ビニルスルホンを含み、例えば、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。
一部の実施形態では、架橋基は、ビニルケトンを含み、例えば、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。
一部の実施形態では、架橋基は、ハロゲン化アルキル、例えば、塩化アルキルを含み、例えば、架橋基は、構造
を含み、化学式中、波線は、化合物の残部への架橋基の付着点を例示する。
上記の化合物のいずれかの一部の実施形態では、タンパク質結合部分ポーションは、タンパク質と非共有結合性相互作用をすることができる。上記の化合物のいずれかの一部の実施形態では、タンパク質結合部分ポーションは、タンパク質と共有結合性相互作用をすることができる。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物を提供する。一部の実施形態では、タンパク質結合部分および架橋基は、リンカーを介して付着している。
一部の態様では、本開示は、構造
を有する化合物を提供する。
一部の態様では、本開示は、リンカーを介して標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質に共有結合または非共有結合することができるプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、これらの合成のための方法、およびその使用を提供する。
したがって、別の態様では、本開示は、標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、コンジュゲートのプレゼンタータンパク質結合部分ポーションは、プレゼンタータンパク質と非共有結合性相互作用をすることができる。一部の実施形態では、コンジュゲートのプレゼンタータンパク質結合部分ポーションは、プレゼンタータンパク質と共有結合性相互作用をすることができる。
一部の態様では、本開示は、標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートを生成する方法を提供する。この方法は、コンジュゲートの生成を可能とする条件下で、（ａ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物を、（ｂ）標的タンパク質と反応させることを含む。
一部の態様では、本開示は、標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートを生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物；（ｂ）標的タンパク質；および（ｃ）プレゼンタータンパク質を提供することと；コンジュゲートの生成を可能とする条件下で、化合物を標的タンパク質と反応させることとを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と、プレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質を含むコンジュゲートとを含む複合体、これらの生成のための方法、およびその使用を提供する。
したがって、別の態様では、本開示は、（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、（ｉｉ）プレゼンタータンパク質とを含む複合体を提供する。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、（ｉｉ）プレゼンタータンパク質とを含む複合体を生成する方法を提供する。この方法は、複合体の生成を可能とする条件下で、標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、プレゼンタータンパク質とを合わせることを含む。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、（ｉｉ）プレゼンタータンパク質とを含む複合体を生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物；（ｂ）標的タンパク質；および（ｃ）プレゼンタータンパク質を提供することと；複合体の生成を可能とする条件下で、化合物を標的タンパク質と反応させることとを含む。
上記の方法の一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、標的タンパク質の非存在下で、化合物に結合する。上記の方法の一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、標的タンパク質の非存在下で、化合物に実質的に結合しない。上記の方法の一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で、実質的に反応しない。上記の方法の一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で反応する。上記の方法の一部の実施形態では、条件は、還元試薬を含まない。上記の方法の一部の実施形態では、条件は、過剰なプレゼンタータンパク質を含む。
一部の実施形態では、化合物およびプレゼンタータンパク質の間の検出可能な結合は、標的タンパク質の非存在下で観察される。しかし、一部の実施形態では、化合物およびプレゼンタータンパク質の間の検出可能な結合は、標的タンパク質の非存在下で観察されない（例えば、プレゼンタータンパク質は、化合物に実質的に結合しない）。一部の実施形態では、架橋基および標的タンパク質の間のかなりの反応（例えば、かなりのコンジュゲート形成）は、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察されない。しかし、一部の実施形態では、架橋基および標的タンパク質の間のかなりの反応は、プレゼンタータンパク質の非存在下でさえ観察し得る。一部の実施形態では、このような反応の速度および／または程度（例えば、コンジュゲート形成の速度および／または量）は、プレゼンタータンパク質が存在するとき、これが存在しないときと比較して、所与のアッセイにおいて異なり得る（例えば、コンジュゲート形成の速度および／または量は、プレゼンタータンパク質の存在下で、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、または１００倍大きい）。
一部の実施形態では、本明細書に記載のようなコンジュゲート生成は、還元試薬を含まない（例えば、実質的に非含有である）条件下で行われる。
一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）プレゼンタータンパク質と；（ｉｉ）本明細書に記載のような化合物（例えば、その構造がプレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物）と；（ｉｉｉ）標的タンパク質とを含む複合体を提供する。一部の実施形態では、このような複合体は、架橋部分と標的タンパク質との反応を可能とする条件に曝露されるか、かつ／または、それらの間の架橋が形成されるように、この条件下に維持される。一部の実施形態では、架橋は、標的タンパク質のアミノ酸（例えば、アミノ酸側鎖）中のヘテロ原子とのものである。一部の実施形態では、架橋は、標的タンパク質中のシステインにおける－Ｓ－原子とのものである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、天然標的タンパク質の変異体である。一部のこのような実施形態では、変異体は、天然標的タンパク質と高度（例えば、８０％、８１％、８２％；８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超）を示すが、架橋基との架橋への関与の影響を受けやすい少なくとも１個のアミノ酸の置換または添加によって異なるアミノ酸配列を有する（例えば、そのアミノ酸側鎖は、このような架橋に関与することができるヘテロ原子を含む）。
一部の態様では、本開示は、リンカーを介してプレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質に共有結合または非共有結合することができる標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲート、これらの合成のための方法、およびその使用を提供する。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、コンジュゲートの標的タンパク質結合部分ポーションは、標的タンパク質と非共有結合性相互作用をすることができる。一部の実施形態では、コンジュゲートの標的タンパク質結合部分ポーションは、標的タンパク質と非共有結合性相互作用をすることができる。一部の実施形態では、標的タンパク質結合部分およびプレゼンタータンパク質は、リンカーを介してコンジュゲートしている。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートを生成する方法を提供する。この方法は、コンジュゲートの生成を可能とする条件下で、（ａ）標的タンパク質結合部分および架橋基を含む化合物を、（ｂ）プレゼンタータンパク質と反応させることを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートを生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）標的タンパク質結合部分および架橋基を含む化合物；（ｂ）プレゼンタータンパク質；ならびに（ｃ）標的タンパク質を提供することと；コンジュゲートの生成を可能とする条件下で、化合物をプレゼンタータンパク質と反応させることとを含む。
一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質の間の検出可能な結合は、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察される。しかし、一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質の間の検出可能な結合は、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察されない（例えば、プレゼンタータンパク質は、化合物に実質的に結合しない）。一部の実施形態では、架橋基およびプレゼンタータンパク質の間のかなりの反応（例えば、かなりのコンジュゲート形成）は、標的タンパク質の非存在下で観察されない。しかし、一部の実施形態では、架橋基およびプレゼンタータンパク質の間のかなりの反応は、標的タンパク質の非存在下でさえ観察し得る。一部の実施形態では、このような反応の速度および／または程度（例えば、コンジュゲート形成の速度および／または量）は、プレゼンタータンパク質が存在するとき、これが存在しないときと比較して、所与のアッセイにおいて異なり得る（例えば、コンジュゲート形成の速度および／または量は、プレゼンタータンパク質の存在下で、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍大きい）。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で、化合物に結合する。一部の実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で、化合物に実質的に結合しない。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、標的タンパク質の非存在下で、化合物に実質的に結合しない。一部の実施形態では、架橋基および標的タンパク質の間の反応（例えば、コンジュゲート形成）は、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察されない。しかし、一部の実施形態では、架橋基および標的タンパク質の間の反応は、プレゼンタータンパク質の非存在下でさえ観察される。一部の実施形態では、本明細書に記載のようなコンジュゲート生成は、還元剤を含まない（例えば、実質的に非含有である）条件下で行われる。
一部の実施形態では、本発明は、（ｉ）プレゼンタータンパク質と；（ｉｉ）本明細書に記載のような化合物（例えば、その構造がプレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物）と；（ｉｉｉ）標的タンパク質とを含む複合体を提供する。一部の実施形態では、このような複合体は、架橋部分と標的タンパク質との反応を可能とする条件に曝露されるか、かつ／または、それらの間の架橋が形成されるように、この条件下に維持される。一部の実施形態では、架橋は、標的タンパク質のアミノ酸（例えば、アミノ酸側鎖）中のヘテロ原子とのものである。一部の実施形態では、架橋は、標的タンパク質中のシステインにおける－Ｓ－原子とのものである。一部の実施形態では、標的タンパク質は、天然標的タンパク質の変異体である。一部のこのような実施形態では、変異体は、天然標的タンパク質と高度（例えば、８０％、８１％、８２％；８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超）を示すが、架橋基との架橋への関与の影響を受けやすい少なくとも１個のアミノ酸の置換または添加によって異なるアミノ酸配列を有する（例えば、そのアミノ酸側鎖は、このような架橋に関与することができるヘテロ原子を含む）。
一部の態様では、本開示は、標的タンパク質と、リンカーを介してプレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートとを含む複合体、これらの生成のための方法、およびその使用を提供する。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートと；（ｉｉ）標的タンパク質と；（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質とを含む複合体を提供する。一部の実施形態では、このような複合体は、プレゼンタータンパク質との架橋部分の反応を可能とする条件に曝露されるか、かつ／または、それらの間の架橋が形成されるように、この条件下に維持される。一部の実施形態では、架橋は、プレゼンタータンパク質のアミノ酸（例えば、アミノ酸側鎖）中のヘテロ原子とのものである。
一部の実施形態では、架橋は、プレゼンタータンパク質中のシステインにおける－Ｓ－原子とのものである。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、天然プレゼンタータンパク質の変異体である。一部のこのような実施形態では、変異体は、天然プレゼンタータンパク質と高度（例えば、８０％、８１％、８２％；８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超）を示すが、架橋基との架橋への関与の影響を受けやすい少なくとも１個のアミノ酸の置換または添加によって異なるアミノ酸配列を有する（例えば、そのアミノ酸側鎖は、このような架橋に関与することができるヘテロ原子を含む）。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、（ｉｉ）標的タンパク質とを含む、複合体を生成する方法を提供する。この方法は、複合体の生成を可能とする条件下で、プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、標的タンパク質とを合わせることを含む。 一部の態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載のようなコンジュゲート（例えば、標的タンパク質結合部分およびプレゼンタータンパク質を含むコンジュゲート）と、（ｉｉ）標的タンパク質とを含む複合体を生成する方法を特徴とする。一部のこのような実施形態では、提供する方法は、複合体の生成を可能とする条件下で、コンジュゲートおよび標的タンパク質を合わせることを含む。代わりにまたはさらに、一部の実施形態では、このような方法は、例えば、（ｉ）（ａ）化合物（例えば、その構造が標的タンパク質結合部分および架橋基を含む化合物）；（ｂ）標的タンパク質；ならびに（ｃ）プレゼンタータンパク質を互いに合わせることと；（ｉｉ）組合せを複合体の生成を可能とする条件に曝露し、かつ／または組合せを複合体の生成を可能とする条件下に維持することとを含む。一部のこのような実施形態では、条件は、コンジュゲートが生成されるように、プレゼンタータンパク質との架橋基の反応を可能とする。
一部の態様では、本開示は、（ｉ）プレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートと、（ｉｉ）標的タンパク質とを含む複合体を生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）標的タンパク質結合部分および架橋基を含む化合物；（ｂ）プレゼンタータンパク質；ならびに（ｃ）標的タンパク質を提供することと；複合体の生成を可能とする条件下で、化合物をプレゼンタータンパク質と反応させることとを含む。
一部のこのような実施形態では、条件は、化合物および標的タンパク質の間の検出可能な結合が、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察されるという点において、化合物、プレゼンタータンパク質、および／または標的タンパク質が、特性決定されるというものである。しかし、一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質の間の検出可能な結合は、この条件下で、プレゼンタータンパク質の非存在下で観察されない（例えば、標的タンパク質は、化合物に実質的に結合しない）。一部の実施形態では、架橋基およびプレゼンタータンパク質の間のかなりの反応は、この条件下で、標的タンパク質の非存在下で観察されない。しかし、一部の実施形態では、架橋基およびプレゼンタータンパク質の間のかなりの反応は、この条件下で、標的タンパク質の非存在下でさえ観察し得る。一部の実施形態では、条件は、還元試薬を含まない。一部の実施形態では、条件は、過剰なプレゼンタータンパク質を含む。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で、化合物に結合する。一部の実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の非存在下で、化合物に実質的に結合しない。一部の実施形態では、化合物およびプレゼンタータンパク質は、標的タンパク質の非存在下で実質的に反応しない。一部の実施形態では、化合物およびプレゼンタータンパク質は、標的タンパク質の非存在下で反応する。一部の実施形態では、条件は、還元試薬を含まない。一部の実施形態では、条件は、過剰な標的タンパク質を含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と非共有結合性相互作用をすることができるプレゼンタータンパク質結合部分と、標的タンパク質と共有結合性または非共有結合性相互作用をすることができる標的タンパク質結合部分とを含む化合物を提供する。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質結合部分は、リンカーを介して付着している。
したがって、一部の態様では、本開示は、化学式ＶＩＩの構造
Ａ－Ｌ－Ｂ
化学式ＶＩＩ
を有する化合物を提供し、化学式中、Ａは、化学式ＶＩＩＩの構造
を含み、化学式中、ｂおよびｃは、独立に、０、１、または２であり、
ｄは、０、１、２、３、４、５、６、または７であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、非存在、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＮＲ１３であり、
各Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素、ヒドロキシル、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール）、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル）であるか、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と合わさって、Ｃ＝Ｏを形成するか、あるいはＲ１およびＲ２は合わさって、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリルまたは任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルを形成し、
各Ｒ３は、独立に、ヒドロキシル、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール）、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル）であるか、あるいは２個のＲ８は合わさって、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル、例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールを形成し、
Ｒ４は、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｌは、任意選択のリンカーであり、
Ｂは、標的タンパク質結合部分である。
化学式ＶＩＩの化合物の一部の実施形態では、標的タンパク質結合部分であるＢは、標的タンパク質と非共有結合性相互作用をすることができる。化学式ＶＩＩの化合物の一部の実施形態では、標的タンパク質結合部分であるＢは、標的タンパク質と共有結合性相互作用をすることができる。化学式ＶＩＩの化合物の一部の実施形態では、リンカー、Ｌは存在する。化学式ＶＩＩの化合物の一部の実施形態では、リンカー、Ｌは存在しない。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と、標的タンパク質と、プレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質結合部分を含む化合物とを含む三元複合体、これらの生成のための方法、およびその使用を提供する。
したがって、別の態様では、本開示は、（ｉ）化学式ＶＩＩの化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を含む複合体を提供する。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる、プレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質を含むコンジュゲートの同定のために有用であり得る。
一部の態様では、本発明は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる本明細書に記載のようなコンジュゲート（例えば、ここで、その構造がプレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物は、標的タンパク質にコンジュゲートしている）を同定および／または特性決定する方法を特徴とする。一部の実施形態では、このような方法は、（ａ）（ｉ）このようなコンジュゲート（例えば、ここで、その構造がプレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物は、標的タンパク質にコンジュゲートしている）、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、コンジュゲートおよびレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質を含む複合体が形成されているかを決定するステップとを含み、複合体の形成は、コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるものであることを示す。
したがって、一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるコンジュゲートを同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、コンジュゲートおよびレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質を含む複合体が形成されているかを決定するステップとを含み、複合体の形成は、コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるものであることを示す。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、化合物と共有結合を形成することができる標的タンパク質の同定のために有用であり得る。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質の存在下で化合物と反応することができる標的タンパク質を同定および／または特性決定する方法を提供し、化合物は、プレゼンタータンパク質結合部分および架橋部分を含む。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分および架橋部分を含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）標的タンパク質および化合物が複合体の形成の間に反応して、コンジュゲートを形成しているかを決定するステップとを含み、標的タンパク質および化合物が、コンジュゲートを形成する場合、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質の存在下で化合物と反応することができると同定される。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質の同定のために有用であり得る。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質に結合する標的タンパク質を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、コンジュゲートおよびレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）標的タンパク質が、複合体中のプレゼンタータンパク質に結合しているかを決定するステップとを含み、標的タンパク質がプレゼンタータンパク質に結合する場合、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質に結合すると同定される。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質に結合する標的タンパク質を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分および架橋部分を含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）標的タンパク質が、複合体中のプレゼンタータンパク質に結合しているかを決定するステップとを含み、標的タンパク質がプレゼンタータンパク質に結合する場合、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質に結合する標的タンパク質であると同定される。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）化学式ＶＩＩの化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質が、複合体を形成しているかを決定するステップとを含み、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質が複合体を形成する場合、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質であると同定される。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質に結合する標的タンパク質を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）化学式ＶＩＩの化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）化合物がプレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）標的タンパク質が複合体中のプレゼンタータンパク質に結合するかを決定するステップとを含み、標的タンパク質がプレゼンタータンパク質に結合する場合、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質に結合する標的タンパク質であると同定される。
一部の態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）１つもしくは複数の標的タンパク質、（ｉｉ）上記の化合物のいずれか；および（ｉｉｉ）タグ（例えば、親和性タグ）を含むプレゼンタータンパク質を提供することと；（ｂ）標的タンパク質の１つもしくは複数が、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、１つもしくは複数の標的タンパク質、化合物、およびプレゼンタータンパク質を合わせることと；（ｃ）１つもしくは複数の標的タンパク質が、化合物およびプレゼンタータンパク質と共に複合体を形成しているかを決定することとによって、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定する方法を提供し、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成する標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質であると同定される。
一部の実施形態では、決定ステップは、プレゼンタータンパク質と複合体を形成している標的タンパク質を選択的に単離する前記プレゼンタータンパク質のタグを利用することを含む（例えば、プルダウン実験における使用による）。一部の実施形態では、複合体は、標的タンパク質、プレゼンタータンパク質、および本発明の化合物を含む。一部の実施形態では、複合体は、標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート（例えば、本発明の化合物の架橋基と、標的タンパク質の反応性アミノ酸との間の反応によって形成されたコンジュゲート）、ならびにプレゼンタータンパク質を含む。一部の実施形態では、方法は、（ｄ）１つもしくは複数の標的タンパク質、化合物、およびプレゼンタータンパク質の間に形成される複合体において、標的タンパク質を同定すること（例えば、標的タンパク質の構造を決定すること）をさらに含む。一部の実施形態では、標的タンパク質の構造を同定することは、複合体上の質量分析法を行うことを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質が複合体を形成し、かつ／または標的タンパク質が複合体中のプレゼンタータンパク質に結合するかどうかの決定は、標的タンパク質またはプレゼンタータンパク質が標識されているプルダウン実験を使用して行い得る（例えば、ここで複合体は、複合体中にはない標的タンパク質および／またはプレゼンタータンパク質の存在下で選択的にプルダウンし得る）。
一部の態様では、本開示は、（ａ）（ｉ）２つもしくはそれよりも多い標的タンパク質；（ｉｉ）上記の化合物のいずれか；および（ｉｉｉ）親和性タグを含むプレゼンタータンパク質を提供することと；（ｂ）前記標的タンパク質が、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、２つもしくはそれよりも多い標的タンパク質、化合物、およびプレゼンタータンパク質を合わせることと；（ｃ）（ｂ）において形成される標的タンパク質、化合物、およびプレゼンタータンパク質の１つもしくは複数の複合体を選択的に単離することと；（ｄ）質量分析法によってステップ（ｃ）において単離した１つもしくは複数の複合体中の標的タンパク質を同定し（例えば、標的タンパク質の構造を決定し）、それによって、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定することとによって、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定する方法を提供する。
一部の実施形態では、決定ステップは、プレゼンタータンパク質と複合体を形成している標的タンパク質を選択的に単離する前記プレゼンタータンパク質のタグを利用することを含む（例えば、プルダウン実験における使用による）。一部の実施形態では、複合体は、標的タンパク質、プレゼンタータンパク質、および本発明の化合物を含む。一部の実施形態では、複合体は、標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート（例えば、本発明の化合物の架橋基と、標的タンパク質の反応性アミノ酸との間の反応によって形成されたコンジュゲート）、ならびにプレゼンタータンパク質を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質が複合体を形成し、かつ／または標的タンパク質が複合体中のプレゼンタータンパク質に結合するかどうかの決定は、標的タンパク質またはプレゼンタータンパク質が標識されているプルダウン実験を使用して行い得る（例えば、ここで複合体は、複合体中にはない標的タンパク質および／またはプレゼンタータンパク質の存在下で選択的にプルダウンし得る）。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるコンジュゲートをもたらす、プレゼンタータンパク質結合部分を付着させる標的タンパク質上の場所を同定するのに有用であり得る。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質結合部分とコンジュゲートを形成する標的タンパク質上の場所を同定および／または特性決定する方法を提供し、ここでコンジュゲートは、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる。この方法は、（ａ）（ｉ）ある場所において標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートおよびレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成しているかを決定するステップと；（ｄ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成するまで、標的タンパク質上の異なる場所においてコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分でステップ（ａ）～（ｃ）を任意選択で繰り返すステップとを含み、コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が、複合体を形成する場合、プレゼンタータンパク質結合部分とコンジュゲートを形成する標的タンパク質上の場所（コンジュゲートは、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる）は同定される。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、天然由来の標的タンパク質の変異体である。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質結合部分とコンジュゲートを形成する標的タンパク質上の場所を同定および／または特性決定する方法を提供し、ここでコンジュゲートは、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）プレゼンタータンパク質の存在下である場所において標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートの形成を可能とする条件下で、化合物と標的タンパク質とを併せるステップと；（ｃ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成しているかを決定するステップと；（ｄ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成するまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を任意選択で繰り返し（プレゼンタータンパク質結合部分は、標的タンパク質上の異なる場所においてコンジュゲートしている）（コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が、複合体を形成する場合、プレゼンタータンパク質結合部分とコンジュゲートを形成する標的タンパク質上の場所（コンジュゲートは、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる）は同定される）、それによって、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるコンジュゲートを形成する標的タンパク質上の場所を同定するステップとを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、天然由来の標的タンパク質の変異体である。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質と共有結合を形成することができる化合物を同定するのに有用であり得る。一部の実施形態では、化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質と共有結合を選択的に形成すると同定される。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質に共有結合することができる化合物を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を含む試料を提供するステップと；（ｂ）化合物および標的タンパク質が、試料中の前記化合物中の架橋基を介して共有結合を形成しているかを決定するステップとを含み、化合物および標的タンパク質が試料中で反応する場合、化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質に共有結合すると同定される。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質の存在下で、標的タンパク質に選択的および共有結合することができる化合物を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を含む第１の試料、ならびに（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分と架橋基とを含む、第１の試料と同じ化合物と、（ｉｉ）第１の試料中と同じ標的タンパク質とを含む第２の試料を提供するステップと；（ｂ）化合物および標的タンパク質が、第２の試料と比較して、第１の試料中で反応する程度を決定するステップとを含み、化合物および標的タンパク質が、第２の試料中よりも第１の試料中で反応する場合、化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質に選択的に共有結合すると同定される。
一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質が、第２の試料中よりも少なくとも５倍多く第１の試料中で反応する場合、化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質に選択的に共有結合すると同定される。一部の実施形態では、化合物および標的タンパク質が第１の試料中で反応するが、第２の試料中で実質的に反応しない場合、化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下で標的タンパク質に選択的に共有結合すると同定される。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートの同定において有用であり得る。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるコンジュゲートを同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）複合体を形成するのに適した条件下で、コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成しているかを決定し（コンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質が複合体を形成する場合、コンジュゲートは、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができると同定される）、それによって、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができるコンジュゲートを同定するステップとを含む。
一部の実施形態では、コンジュゲートおよびタンパク質の間の結合は、三元時間分解蛍光エネルギー移動アッセイ、三元増幅発光近接ホモジニアスアッセイ、等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、または核磁気共鳴を含む方法によって決定し得る。
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、および複合体は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間のタンパク質－タンパク質インターフェースの構造を決定するのに有用であり得る。
したがって、別の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定し、かつ／またはその１つもしくは複数の構造的フィーチャをアセスメントする方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートとプレゼンタータンパク質とを接触させて、複合体を形成させる（例えば、バイアル中）ステップと；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し（インターフェースの構造は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間の結晶構造の少なくともポーションを含む）、それによって、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定するステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定し、かつ／またはその１つもしくは複数の構造的フィーチャをアセスメントする方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分および架橋部分を含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）化合物および標的タンパク質の間のコンジュゲートの形成、ならびに前記コンジュゲートおよび前記プレゼンタータンパク質の間の複合体の形成（例えば、バイアル中）に適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し（インターフェースの構造は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間の結晶構造の少なくともポーションを含む）、それによって、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定するステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定し、かつ／またはその１つもしくは複数の構造的フィーチャをアセスメントする方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）化学式ＶＩＩの化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を含む複合体を形成するステップ（例えば、バイアル中）と；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し（インターフェースの構造は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間の結晶構造の少なくともポーションを含む）、それによって、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースの構造を決定するステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるタンパク質－タンパク質インターフェースの構造を決定し、かつ／またはその１つもしくは複数の構造的フィーチャをアセスメントする方法を提供する。この方法は、（ａ）上記の複合体のいずれかの結晶を提供するステップと；（ｂ）結晶の構造を決定し（インターフェースの構造は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間の結晶構造の少なくともポーションを含む）、それによって、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるタンパク質－タンパク質インターフェースの構造を決定するステップとを含む。 一部の態様では、本開示は、標的タンパク質の生物活性をモジュレートすることができる化合物を同定および／または特性決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるタンパク質－タンパク質インターフェースの構造（例えば、上記の方法のいずれかによって決定される構造）を提供するステップと；（ｂ）インターフェースにおいて結合することができる化合物の構造を決定し、それによって、標的タンパク質の生物活性をモジュレートすることができる化合物を同定するステップとを含む。一部の実施形態では、インターフェースにおいて結合することができる化合物の構造は、計算的方法を使用して決定される。一部の実施形態では、インターフェースにおいて結合することができる化合物の構造は、標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質の存在下で、複合体形成のための本明細書に記載されているプレゼンタータンパク質結合部分を含む化合物のスクリーニングによって決定される。
一部の態様では、本開示は、複合体についてのＸ線結晶座標を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲート、および（ｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）コンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、コンジュゲートおよびレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し、それによって、複合体についてのＸ線結晶座標を得るステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、複合体についてのＸ線結晶座標を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）プレゼンタータンパク質結合部分および架橋部分を含む化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；ならびに（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）化合物がプレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し、それによって、複合体についてのＸ線結晶座標を得るステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、複合体についてのＸ線結晶座標を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）（ｉ）本発明の化合物；（ｉｉ）標的タンパク質；および（ｉｉｉ）プレゼンタータンパク質を提供するステップと；（ｂ）化合物がプレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる場合、複合体形成を可能とするのに適した条件下で、化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質を合わせるステップと；（ｃ）複合体の結晶構造を決定し、それによって、複合体についてのＸ線結晶座標を得るステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、プレゼンタータンパク質との結合に関与する標的タンパク質上の残基を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）本発明の方法によって得られる複合体のＸ線結晶座標を提供するステップと；（ｂ）プレゼンタータンパク質上の原子の４Å内の原子を含む標的タンパク質の残基を同定し、それによって、プレゼンタータンパク質との結合に関与する標的タンパク質上の残基を決定するステップとを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載されているプレゼンタータンパク質／標的タンパク質複合体のいずれかの生化学的および／または生物物理学的特性を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）本明細書に記載されている方法によって得られる本明細書に記載されている複合体のＸ線結晶座標を提供するステップと；（ｂ）複合体の生化学的および／または生物物理学的特性を計算し、それによって、プレゼンタータンパク質／標的タンパク質複合体の生化学的および／または生物物理学的特性を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、生化学的および／または生物物理学的特性は、複合体の結合の自由エネルギー、複合体のＫｄ、複合体のＫｉ、複合体のＫｉｎａｃｔ、および／または複合体のＫｉ／Ｋｉｎａｃｔを含む。一部の実施形態では、生化学的および／または生物物理学的特性は、等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、および／または質量分析法によって決定される。
一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質を含む複合体におけるインターフェースは、結合ポケットであるか、あるいは結合ポケットを含む。
一部の態様では、本開示は、溶液中の上記の化合物、標的タンパク質、およびプレゼンタータンパク質のいずれかを含む組成物を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本発明の化合物、コンジュゲートまたは複合体のいずれかと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、医薬組成物はユニット製剤である。
いくつかの態様では、本発明は、標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）をモジュレートする方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、かかる方法は、標的タンパク質と、モジュレーション（たとえば、正または負のモジュレーション）量の本発明の化合物（たとえば、プレゼンタータンパク質の存在下）、標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲート、または組成物のいずれかと、を接触させる工程を含む。
いくつかの態様では、本開示は、標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）をモジュレート（たとえば、正または負にモジュレート）する方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、化合物がプレゼンタータンパク質との複合体を形成可能でありかつ得られる複合体が標的タンパク質に結合可能である条件下で、標的タンパク質とプレゼンタータンパク質とを発現する細胞と、有効量の本発明の化合物または組成物と、を接触させることにより、標的タンパク質をモジュレート（たとえば、正または負にモジュレート）する工程を含む。
いくつかの態様では、本開示は、標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）をモジュレート（たとえば、正または負にモジュレート）する方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、標的タンパク質と標的タンパク質結合部分を含む本発明のコンジュゲートとを接触させることにより、標的タンパク質をモジュレートする工程を含む。
いくつかの態様では、本開示は、プロリルイソメラーゼ活性を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、化合物とプロリルイソメラーゼとの間の複合体の形成を可能にする条件下で本発明の化合物または組成物とプロリルイソメラーゼを発現する細胞とを接触させることにより、プロリルイソメラーゼ活性を阻害する工程を含む。
いくつかの態様では、本開示は、細胞内でプレゼンタータンパク質／化合物複合体を形成する方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる方法は、化合物とプレゼンタータンパク質との間の複合体の形成を可能にする条件下で、プレゼンタータンパク質を発現する細胞と本発明の化合物または組成物とを接触させる工程を含む。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、表１の遺伝子のいずれか１つによってコードされるタンパク質を結合することができる。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、プロリルイソメラーゼ結合部分である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、ＦＫＢＰ結合部分（例えば、プレゼンタータンパク質結合部分は、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２．６、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ５１、もしくはＦＫＢＰ５２を結合することができる）、シクロフィリン結合部分（例えば、プレゼンタータンパク質結合部分は、ＰＰ１Ａ、ＣＹＰＢ、ＣＹＰＣ、ＣＹＰ４０、ＣＹＰＥ、ＣＹＰＤ、ＮＫＴＲ、ＳＲＣｙｐ、ＣＹＰＨ、ＣＷＣ２７、ＣＹＰＬ１、ＣＹＰ６０、ＣＹＰＪ、ＰＰＩＬ４、ＰＰＩＬ６、ＲＡＮＢＰ２、もしくはＰＰＷＤ１を結合することができる）、またはＰＩＮ１結合部分である。上記の方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質結合部分に結合することが既知である。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、ＦＫＢＰ結合部分（例えば、選択的ＦＫＢＰ結合部分または非選択的ＦＫＢＰ結合部分）である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、ＦＫＢＰ結合部分は、化学式ＩＩａまたはＩＩｂの構造
を含み、化学式中、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立に、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキルであるか、あるいはＺ１およびＺ２は合わさって、これらが付着している原子と共に、任意選択で置換されている１０～４０メンバーの大環状分子を形成し、Ｚ１またはＺ２の少なくとも１つは、架橋基への付着点を含み、
ｂおよびｃは、独立に、０、１、または２であり、
ｄは、０、１、２、３、４、５、６、または７であり、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立に、非存在、ＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、またはＮＲ４であり、
各Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素、ヒドロキシル、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール）、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル）であるか、あるいはＲ１およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と合わさって、Ｃ＝Ｏを形成するか、あるいはＲ１およびＲ２は合わさって、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリルまたは任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルを形成し、
各Ｒ３は、独立に、ヒドロキシル、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール）、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル）であるか、あるいは２個のＲ８は合わさって、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールを形成し、
各Ｒ４は、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および任意選択で置換されているＣ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルである。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、構造
を含む。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、シクロフィリン結合部分（例えば、選択的シクロフィリン結合部分または非選択的シクロフィリン結合部分）である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、シクロフィリン結合部分は、化学式ＩＩＩまたはＩＶの構造
を含み、化学式中、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６は、それぞれ独立に、ヒドロキシル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキルであるか、あるいはＺ３およびＺ４またはＺ５およびＺ６は合わさって、これらが付着している原子と共に、任意選択で置換されている１０～４０メンバーの大環状分子を形成し、
Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、またはＲ５の少なくとも１つは、架橋基への付着点を含み、
ｅは、０、１、２、３、または４であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｒ６は、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキルであり、
各Ｒ７は、独立に、ヒドロキシル、シアノ、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリール）、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールＣ１～Ｃ６アルキル）であり、
Ｒ８は、水素、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および任意選択で置換されているＣ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルである。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、構造
を含む。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＧＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、グアニンヌクレオチド交換因子、熱ショックタンパク質、イオンチャネル、コイルドコイルタンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、転写因子、クロマチンモディファイヤー／リモデラー、または古典的なタンパク質－タンパク質相互作用ドメインおよびモチーフを有するタンパク質である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質は、アンドラッガブル表面を含む。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質は、伝統的な結合ポケットを有さない。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質のアミノ酸配列は修飾されており、少なくとも１個の天然アミノ酸が反応性アミノ酸（例えば、天然アミノ酸、例えば、システイン、リシン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはセリン、または非天然アミノ酸）で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質のアミノ酸配列は修飾されており、少なくとも１個の天然反応性アミノ酸（例えば、システイン、リシン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはセリン）が非反応性アミノ酸（例えば、天然アミノ酸、例えば、セリン、バリン、アラニン、イソロイシン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはロイシン、または非天然アミノ酸）で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、少なくとも１個の天然反応性アミノ酸は、溶媒に曝露されたアミノ酸である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質のアミノ酸配列は修飾されて、全ての反応性アミノ酸が非反応性アミノ酸で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、置換は、保存的置換である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、標的タンパク質は、１つのみの、溶媒に曝露された反応性アミノ酸を含む。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、表１の遺伝子のいずれか１つによってコードされるタンパク質である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、プロリルイソメラーゼである。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プロリルイソメラーゼは、ＦＫＢＰファミリーのメンバー（例えば、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２．６、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ５１、もしくはＦＫＢＰ５２）、シクロフィリンファミリーのメンバー（例えば、ＰＰ１Ａ、ＣＹＰＢ、ＣＹＰＣ、ＣＹＰ４０、ＣＹＰＥ、ＣＹＰＤ、ＮＫＴＲ、ＳＲＣｙｐ、ＣＹＰＨ、ＣＷＣ２７、ＣＹＰＬ１、ＣＹＰ６０、ＣＹＰＪ、ＰＰＩＬ４、ＰＰＩＬ６、ＲＡＮＢＰ２、もしくはＰＰＷＤ１）、またはＰＩＮ１である。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質のアミノ酸配列は修飾されており、少なくとも１個の天然アミノ酸は反応性アミノ酸（例えば、天然アミノ酸、例えば、システイン、リシン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはセリン、または非天然アミノ酸）で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質のアミノ酸配列は修飾されており、少なくとも１個の天然反応性アミノ酸（例えば、システイン、リシン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはセリン）が非反応性アミノ酸（例えば、天然アミノ酸、例えば、セリン、バリン、アラニン、イソロイシン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはロイシン、または非天然アミノ酸）で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、少なくとも１個の天然反応性アミノ酸は、溶媒に曝露されたアミノ酸である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質のアミノ酸配列は修飾されて、全ての反応性アミノ酸が非反応性アミノ酸で置換されている。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、置換は、保存的置換である。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、リンカーは、長さで１～２０個の原子である。上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、リンカーは、長さで１．５～３０オングストロームである。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、リンカーは、化学式Ｖの構造
Ａ１－（Ｂ１）ｆ－（Ｃ１）ｇ－（Ｂ２）ｈ－（Ｄ）－（Ｂ３）ｉ－（Ｃ２）ｊ－（Ｂ４）ｋ－Ａ２
化学式Ｖ
を有し、
化学式中、Ａ１は、リンカーおよびタンパク質結合部分の間の結合であり、Ａ２は、架橋基およびリンカーの間の結合であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４は、それぞれ独立に、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ２アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ３ヘテロアルキル、Ｏ、Ｓ、およびＮＲＮから選択され、ＲＮは、水素、任意選択で置換されているＣ１～４アルキル、任意選択で置換されているＣ２～４アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～４アルキニル、任意選択で置換されているＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択で置換されているＣ６～１２アリール、または任意選択で置換されているＣ１～７ヘテロアルキルであり、Ｃ１およびＣ２は、それぞれ独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルから選択され、ｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋは、それぞれ独立に、０または１であり、Ｄは、任意選択で置換されているＣ１～１０アルキル、任意選択で置換されているＣ２～１０アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～１０アルキニル、任意選択で置換されているＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択で置換されているＣ６～１２アリール、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ１０ポリエチレングリコール、または任意選択で置換されているＣ１～１０ヘテロアルキル、またはＡ１－（Ｂ１）ｆ－（Ｃ１）ｇ－（Ｂ２）ｈ－を－（Ｂ３）ｉ－（Ｃ２）ｊ－（Ｂ４）ｋ－Ａ２を連結している化学結合である。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、リンカーは、化学式ＶＩの構造
を含み、化学式中、Ａ１は、リンカーおよびタンパク質結合部分の間の結合であり、
Ａ２は、架橋基およびリンカーの間の結合であり、
ｌは、０、１、２、または３であり、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０、１、または２であり、
Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立に、非存在、Ｏ、Ｓ、－Ｃ≡Ｃ－、ＣＲ９Ｒ１０またはＮＲ１１であり、
各Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および任意選択で置換されているＣ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルである。一部の実施形態では、各Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立に、水素、非置換Ｃ１～Ｃ６アルキル、非置換Ｃ２～Ｃ６アルケニル、非置換Ｃ２～Ｃ６アルキニル、非置換アリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、非置換Ｃ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および非置換Ｃ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルである。
上記の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、または方法のいずれかの一部の実施形態では、リンカーは、構造
を含む。
化学用語
本明細書に記載されるある特定の化合物が１種以上の異なる異性体（たとえば、立体異性体、幾何異性体、互変異性体）および／または同位体（１個以上の原子をその原子の異なる同位体で置き換えたもの、たとえば、水素をジュウテリウムで置き換えたもの）の形態で存在可能であることは、当業者であれば分かるであろう。とくに指定がない限りまたは文脈から明らかでない限り、表される構造は、任意のかかる異性体または同位体の形態を単独または組合せで表すものと理解可能である。
本明細書に記載の化合物は非対称でありうる（たとえば、１つ以上のステレオ中心を有する）。とくに指定がない限り、エナンチオマーやジアステレオマーなどの立体異性体はすべて意図される。非対称置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性形またはラセミ形で単離可能である。光学活性出発材料から光学活性形をいかに調製するかに関する方法は当技術分野で公知であり、たとえば、ラセミ混合物の分割によるものまたは立体選択的合成によるものがある。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合などの多くの幾何異性体もまた、本明細書に記載の化合物中に存在可能であり、かかる安定な異性体はすべて本開示で企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体は記載されており、異性体の混合物としてまたは分離された異性形として単離しうる。
いくつかの実施形態では、本明細書に表される１種以上の化合物はさまざまな互変異性形で存在しうる。文脈から明らかであろうが、明示的に除外されない限り、かかる化合物への参照はかかる互変異性形をすべて包含する。いくつかの実施形態では、互変異性形は、単結合と隣接二重結合との交換およびそれに付随するプロトンの移動から生じる。ある特定の実施形態では、互変異性形は、参照形と同一の実験式および全電荷を有する異性プロトン化状態のプロトトロピー互変異性体でありうる。プロトトロピー互変異性形部分の例は、ケトン－エノールペア、アミド－イミド酸ペア、ラクタム－ラクチムペア、アミド－イミド酸ペア、エナミン－イミンペア、およびプロトンがヘテロ環系の２つ以上の位置を占有可能である環状形、たとえば、１Ｈ－および３Ｈ－イミダゾール、１Ｈ－、２Ｈ－、および４Ｈ－１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－および２Ｈ－イソインドール、ならびに１Ｈ－および２Ｈ－ピラゾールである。いくつかの実施形態では、互変異性形は、平衡状態でありうるかまたは適切な置換により１つの形に立体的にロックしうる。ある特定の実施形態では、互変異性形は、アセタール相互変換、たとえば、以下のスキーム：
に例示される相互変換から生じる。
いくつかの実施形態では、本発明に従って本明細書に記載の化合物の同位体を調製および／または利用しうるとは、当業者であれば分かるであろう。「同位体」とは、同一の原子番号を有するが原子核中の異なる中性子数から生じる異なる質量数を有する原子を意味する。たとえば、水素の同位体としては、トリチウムおよびジュウテリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、同位体置換（たとえば、ジュウテリウムによる水素の置換）は、代謝および／またはキラル中心のラセミ化速度などの分子の物理化学的性質を変化させうる。
当技術分野で公知のように、多くの化学エンティティー（とくに、多くの有機分子および／または多くの低分子）は、たとえばアモルファス形および／または結晶形などの多種多様な固体形（たとえば、多形体、水和物、溶媒和物など）をとりうる。いくつかの実施形態では、かかるエンティティーは、任意の固体形を含めて任意の形で利用しうる。いくつかの実施形態では、かかるエンティティーは、特定の形たとえば特定の固体形で利用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載および／または表される化合物は、塩形で提供および／または利用しうる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載および／または表される化合物は、水和物形または溶媒和物形で提供および／または利用しうる。
本明細書の種々の箇所に、本開示の化合物の置換基がグループまたは範囲で開示される。本開示は、かかるグループおよび範囲のメンバーのあらゆる個別の部分的組合せを含むことがとくに意図される。たとえば、「Ｃ１～６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個別に開示することがとくに意図される。さらに、化合物がグループまたは範囲で置換が開示される複数の位置を含む場合、とくに指定がない限り、本開示は、各位置にメンバーのあらゆる個別の部分的組合せを含有する個別の化合物および化合物のグループ（たとえば、族および亜族）を対象とすることが意図される。
本明細書では、「任意選択的に置換されたＸ」（たとえば、任意選択的に置換されたアルキル）という形の語句は、「Ｘが任意選択的に置換されたときのＸ」（たとえば、「アルキルが任意選択的に置換されたときのアルキル」）と等価であることが意図される。それは、特徴「Ｘ」（たとえばアルキル）自体が任意選択的であることを意味することを意図するものではない。
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、１～２０（たとえば１～１０または１～６）個の炭素を含有する飽和炭化水素基を意味する。いくつかの実施形態では、アルキル基は非分岐状（すなわち線状）である。いくつかの実施形態では、アルキル基は分岐状である。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ－およびｉｓｏ－プロピル、ｎ－、ｓｅｃ－、ｉｓｏ－、およびｔｅｒｔ－ブチル、ネオペンチルなどにより例示され、かつ（１）アルコキシ、（２）アルキルスルフィニル、（３）本明細書に定義されるアミノ（たとえば、非置換アミノ（すなわち－ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち－Ｎ（ＲＮ１）２（化学式中、ＲＮ１はアミノに対して定義した通りである））、（４）Ｃ６～１０アリールＣ１～６アルコキシ、（５）アジド、（６）ハロ、（７）（Ｃ２～９ヘテロシクリル）オキシ、（８）Ｏ－保護基により任意選択的に置換されたヒドロキシル、（９）ニトロ、（１０）オキソ（たとえば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）、（１１）Ｃ１～７スピロシクリル、（１２）チオアルコキシ、（１３）チオール、（１４）Ｏ－保護基により任意選択的に置換された－ＣＯ２ＲＡ’（化学式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（化学式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（化学式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（１５）－Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（化学式中、ＲＢ’およびＲＣ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１６）－ＳＯ２ＲＤ’（化学式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１～６アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、（ｃ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシルからなる群から選択される）、（１７）－ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（化学式中、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１８）－Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（化学式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（化学式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（１９）－ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、かつＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６～１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（２０）－ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１～６アルキルからなる群より選択され、かつＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６～１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群より選択される）、（２１）アミジン、ならびに（２２）トリメチルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、トリイソプロピルシリルなどのシリル基、からなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基、または２個以上の炭素のアルキル基の場合は４個の置換基により任意選択的に置換しうる。いくつかの実施形態では、これらのグループのそれぞれは、本明細書に記載されるようにさらに置換可能である。たとえば、Ｃ１－アルカリールのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換してそれぞれのアリーロイル置換基を与えうる。
本明細書で用いられる「アルキレン」という用語および「アルク－」という接頭辞は、２個の水素原子を除去することにより直鎖状または分岐鎖状飽和炭化水素から誘導される飽和２価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、イソプロピレンなどにより例示される。「Ｃｘ～ｙアルキレン」という用語および「Ｃｘ～ｙアルク－」という接頭辞は、ｘ～ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの例示的な値は、１、２、３、４、５、および６であり、かつｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（たとえば、Ｃ１～６、Ｃ１～１０、Ｃ２～２０、Ｃ２～６、Ｃ２～１０、またはＣ２～２０アルキレン）。いくつかの実施形態では、アルキレンは、アルキル基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。
本明細書で用いられる「アルケニル」という用語は、とくに明記されていない限り、１個以上の炭素－炭素二重結合を含有する２～２０個の炭素（たとえば、２～６または２～１０個の炭素）の１価の直鎖状または分岐鎖状の基を表し、エテニル、１－プロペニル、２－プロペニル、２－メチル－１－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニルなどにより例示される。アルケニルは、シスおよびトランスの両方の異性体を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）または本明細書に記載される例示的なアルキル置換基のいずれかから独立して選択される１、２、３、または４個の置換基により任意選択的に置換しうる。
本明細書で用いられる「アルキニル」という用語は、炭素－炭素三重結合を含有する２～２０個の炭素原子（たとえば、２～４、２～６、または２～１０個の炭素）の１価の直鎖状または分岐鎖状の基を表し、エチニル、１－プロピニルなどにより例示される。アルキニル基は、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）または本明細書に記載される例示的なアルキル置換基のいずれかから独立して選択される１、２、３、または４個の置換基により任意選択的に置換しうる。
本明細書で用いられる「アミノ」という用語は、－Ｎ（ＲＮ１）２（式中、各ＲＮ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ－保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル（たとえば、任意選択的に置換されたアリールアルコキシカルボニル基や本明細書に記載されるいずれかなどのＯ－保護基により任意選択的に置換されたもの）、スルホアルキル、アシル（たとえば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載される他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（たとえば、任意選択的に置換されたアリールアルコキシカルボニル基や本明細書に記載されるいずれかなどのＯ－保護基により任意選択的に置換されたもの）、ヘテロシクリル（たとえばヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（たとえばアルクヘテロアリール）であり、これらの列挙されたＲＮ１基のそれぞれは、各基に対して本明細書に定義されるように任意選択的に置換可能であり、または２つのＲＮ１は、組み合わせて、ヘテロシクリルもしくはＮ－保護基を形成し、かつ各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである）を表す。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち－ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち－Ｎ（ＲＮ１）２）でありうる。好ましい実施形態では、アミノは、－ＮＨ２または－ＮＨＲＮ１（式中、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アシル（たとえば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載される他のもの）、アルコキシカルボニルアルキル（たとえばｔ－ブトキシカルボニルアルキル）、またはアリールであり、かつ各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、またはＣ６～１０アリールでありうる）である。
本明細書に記載される「アミノ酸」という用語は、側鎖とアミノ基と酸基（たとえば、－ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または－ＳＯ３Ｈのスルホ基）とを有する分子を意味し、アミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸基（たとえば側鎖）により親分子基に結合される。本明細書で用いられる場合、最広義の「アミノ酸」という用語は、たとえば、１つ以上のペプチド結合の形成によりポリペプチド鎖中に組込み可能な任意の化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ－アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに共通して見いだされる２０種の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」とは、合成により調製されるかまたは天然源から取得されるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ポリペプチド中のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含めて、以上の一般構造に対して構造修飾を含有しうる。たとえば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造に対してメチル化、アミド化、アセチル化、および／または置換により修飾しうる。いくつかの実施形態では、かかる修飾は、たとえば、それ以外は同じである未修飾アミノ酸を含有するものと比較して修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変化させうる。いくつかの実施形態では、かかる修飾は、それ以外は同じである未修飾アミノ酸を含有するものと比較して修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連活性を有意に変化させない。文脈から明らかであろうが、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離アミノ酸を意味するように用いられる。いくつかの実施形態では、それはポリペプチドのアミノ酸残基を意味するように用いられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、側鎖またはアミノ基がカルボニル基に結合された状態でカルボニル基により親分子基に結合される。いくつかの実施形態では、アミノ酸はα－アミノ酸である。ある特定の実施形態では、アミノ酸はβ－アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はγ－アミノ酸である。例示的な側鎖としては、任意選択的に置換されたアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが挙げられる。例示的なアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシスチン、セリン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。アミノ酸基は、（１）Ｃ１～６アルコキシ、（２）Ｃ１～６アルキルスルフィニル、（３）本明細書に定義されるアミノ（たとえば、非置換アミノ（すなわち－ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち－Ｎ（ＲＮ１）２（式中、ＲＮ１はアミノに対して定義した通りである））、（４）Ｃ６～１０アリールＣ１～６アルコキシ、（５）アジド、（６）ハロ、（７）（Ｃ２～９ヘテロシクリル）オキシ、（８）ヒドロキシル、（９）ニトロ、（１０）オキソ（たとえば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）、（１１）Ｃ１～７スピロシクリル、（１２）チオアルコキシ、（１３）チオール、（１４）－ＣＯ２ＲＡ’（式中、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（１５）－Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ＲＢ’およびＲＣ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１６）－ＳＯ２ＲＤ’（式中、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１～６アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、（ｃ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）ヒドロキシルからなる群から選択される）、（１７）－ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１８）－Ｃ（Ｏ）ＲＧ’（式中、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（１９）－ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’（式中、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１～６アルキルからなる群から選択され、かつＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６～１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群から選択される）、（２０）－ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’（式中、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１～６アルキルからなる群より選択され、かつＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１～２０アルキル（たとえばＣ１～６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２～２０アルケニル（たとえばＣ２～６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６～１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（ｆ２）アミノ－Ｃ１～２０アルキル、（ｇ２）－（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（式中、ｓ１は１～１０（たとえば１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつＲ’はＨまたはＣ１～２０アルキルである）で示されるポリエチレングリコール、および（ｈ２）－ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（式中、ｓ１は１～１０（たとえば、１～６または１～４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０～１０（たとえば、０～４、０～６、１～４、１～６、または１～１０）の整数であり、かつ各ＲＮ１は、独立して、水素または任意選択的に置換されたＣ１～６アルキルである）で示されるアミノ－ポリエチレングリコールからなる群より選択される）、ならびに（２１）アミジンからなる群から独立して選択される１、２、３個の置換基または２個以上の炭素のアミノ酸基の場合は４個の置換基により任意選択的に置換しうる。いくつかの実施形態では、これらのグループのそ
れぞれは、本明細書に記載されるようにさらに置換可能である。
本明細書で用いられる「Ｎ－アルキル化アミノ酸」という用語は、ペプチド結合を形成するアミノ酸の窒素上に任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ６アルキルを含有するアミノ酸を意味する。Ｎ－アルキル化アミノ酸としては、限定されるものではないが、Ｎ－メチル－アラニン、Ｎ－メチル－トレオニン、Ｎ－メチル－フェニルアラニン、Ｎ－メチル－アスパラギン酸、Ｎ－メチル－バリン、Ｎ－メチル－ロイシン、Ｎ－メチル－グリシン、Ｎ－メチル－イソロイシン、Ｎ（α）－メチル－リシン、Ｎ（α）－メチル－アスパラギン、Ｎ（α）－メチル－グルタミンなどのＮ－メチルアミノ酸が挙げられる。
本明細書で用いられる場合「アリール」という用語は、１または２個の芳香環を有する単環式、二環式、または多環式炭素環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２－ジヒドロナフチル、１，２，３，４－テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどにより例示され、かつ（１）Ｃ１～７アシル（たとえばカルボキシアルデヒド）、（２）Ｃ１～２０アルキル（たとえば、Ｃ１～６アルキル、アルコキシ－Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６アルキルスルフィニル－Ｃ１～６アルキル、アミノ－Ｃ１～６アルキル、アジド－Ｃ１～６アルキル、（カルボキシアルデヒド）－Ｃ１～６アルキル、ハロ－Ｃ１～６アルキル（たとえばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ－Ｃ１～６アルキル、ニトロ－Ｃ１～６アルキル、またはＣ１～６チオアルコキシ－Ｃ１～６アルキル）、（３）Ｃ１～２０アルコキシ（たとえばＣ１～６アルコキシ、たとえばペルフルオロアルコキシ）、（４）Ｃ１～６アルキルスルフィニル、（５）Ｃ６～１０アリール、（６）アミノ、（７）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（８）アジド、（９）Ｃ３～８シクロアルキル、（１０）Ｃ１～６アルク－Ｃ３～８シクロアルキル、（１１）ハロ、（１２）Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ１～１２ヘテロアリール）、（１３）（Ｃ１～１２ヘテロシクリル）オキシ、（１４）ヒドロキシル、（１５）ニトロ、（１６）Ｃ１～２０チオアルコキシ（たとえば、チオアルコキシ）、（１７）－（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＡ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１８）－（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）、（１９）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＤ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、および（ｃ）アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（２０）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）、（２１）チオール、（２２）Ｃ６～１０アリールオキシ、（２３）Ｃ３～８シクロアルコキシ、（２４）Ｃ６～１０アリールＣ１～６アルコキシ、（２５）Ｃ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール）、（２６）Ｃ２～２０アルケニル、ならびに（２７）Ｃ２～２０アルキニルからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基により任意選択的に置換しうる。いくつかの実施形態では、これらのグループのそれぞれは、本明細書に記載されるようにさらに置換可能である。たとえば、Ｃ１－アルカリールまたはＣ１－アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換してそれぞれのアリーロイル置換基および（ヘテロシクリル）オイル置換基を与えうる。
本明細書で用いられる「アリールアルキル」基は、本明細書に定義されるアルキレン基により親分子基に結合された本明細書に定義されるアリール基を表す。例示的な非置換アリールアルキル基は、７～３０個の炭素（たとえば、７～１６または７～２０個の炭素、たとえば、Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、Ｃ１～１０アルク－Ｃ６～１０アリール、またはＣ１～２０アルク－Ｃ６～１０アリール）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびアリールはそれぞれ、それぞれの基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。「アルク－」という接頭辞が前に付いた他の基も同様に定義され、この場合、「アルク－」は、とくに断りのない限り、Ｃ１～６アルキレンを意味し、結合される化学構造は、本明細書に定義される通りである。
「アジド」という用語は－Ｎ３基を表し、－Ｎ＝Ｎ＝Ｎとして表すことも可能である。
本明細書で用いられる「炭素環式」および「カルボシクリル」という用語は、環が炭素原子により形成される任意選択的に置換されたＣ３～１２単環式、二環式、または三環式非芳香環構造を意味する。炭素環式構造としては、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、およびシクロアルキニル基が挙げられる。
本明細書で用いられる「カルボシクリルアルキル」基は、本明細書に定義されるアルキレン基により親分子基に結合された本明細書に定義される炭素環式基を表す。例示的な非置換カルボシクリルアルキル基は、７～３０個の炭素（たとえば、７～１６または７～２０個の炭素、たとえば、Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０カルボシクリル、Ｃ１～１０アルク－Ｃ６～１０カルボシクリル、またはＣ１～２０アルク－Ｃ６～１０カルボシクリル）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびカルボシクリルはそれぞれ、それぞれの基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。「アルク－」という接頭辞が前に付いた他の基も同様に定義され、この場合、「アルク－」は、とくに断りのない限り、Ｃ１～６アルキレンを意味し、結合される化学構造は、本明細書に定義される通りである。
本明細書で用いられる「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表し、Ｃ＝Ｏとして表すことも可能である。
本明細書で用いられる「カルボキシ」という用語は、－ＣＯ２Ｈを意味する。
本明細書で用いられる「シアノ」という用語は、－ＣＮ基を表す。
本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、とくに明記されていない限り、３～８個の炭素の１価の飽和または不飽和の非芳香環式炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、二環ヘプチルなどにより例示される。シクロアルキル基が１つの炭素－炭素二重結合を含む場合、シクロアルキル基は「シクロアルケニル」基として参照可能である。例示的なシクロアルケニル基としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが挙げられる。本発明のシクロアルキル基は、（１）Ｃ１～７アシル（たとえばカルボキシアルデヒド）、（２）Ｃ１～２０アルキル（たとえば、アルキル、アルコキシ－Ｃ１～６アルキル、アルキルスルフィニル－Ｃ１～６アルキル、アミノ－Ｃ１～６アルキル、アジド－Ｃ１～６アルキル、（カルボキシアルデヒド）－Ｃ１～６アルキル、ハロ－Ｃ１～６アルキル（たとえばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ－Ｃ１～６アルキル、ニトロ－Ｃ１～６アルキル、またはＣ１～６チオアルコキシ－Ｃ１～６アルキル）、（３）Ｃ１～２０アルコキシ（たとえばＣ１～６アルコキシ、たとえばペルフルオロアルコキシ）、（４）Ｃ１～６アルキルスルフィニル、（５）Ｃ６～１０アリール、（６）アミノ、（７）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（８）アジド、（９）Ｃ３～８シクロアルキル、（１０）Ｃ１～６アルク－Ｃ３～８シクロアルキル、（１１）ハロ、（１２）Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ１～１２ヘテロアリール）、（１３）（Ｃ１～１２ヘテロシクリル）オキシ、（１４）ヒドロキシル、（１５）ニトロ、（１６）Ｃ１～２０チオアルコキシ（たとえばＣ１～６チオアルコキシ）、（１７）－（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＡ’は、（ａ）Ｃ１～６アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１８）－（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６～１０アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）、（１９）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＤ’は、（ａ）Ｃ６～１０アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、および（ｃ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（２０）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６～１０アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）（２１）チオール、（２２）Ｃ６～１０アリールオキシ、（２３）Ｃ３～８シクロアルコキシ、（２４）Ｃ６～１０アリールＣ１～６アルコキシ、（２５）Ｃ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール）、（２６）オキソ、（２７）Ｃ２～２０アルケニル、ならびに（２８）Ｃ２～２０アルキニルにより任意選択的に置換可能である。いくつかの実施形態では、これらのグループのそれぞれは、本明細書に記載されるようにさらに置換可能である。たとえば、Ｃ１－アルカリールまたはＣ１－アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換してそれぞれのアリーロイル置換基および（ヘテロシクリル）オイル置換基を与えうる。
本明細書で用いられる「シクロアルキルアルキル」基は、本明細書に定義されるアルキレン基（たとえば、１～４、１～６、１～１０、または１～２０個の炭素のアルキレン基）により親分子基に結合された本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびシクロアルキルはそれぞれ、それぞれの基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。
本明細書で用いられる「ジアステレオマー」という用語は、互いに鏡像でなくかつ互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
本明細書で用いられる「エナンチオマー」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、一方のエナンチオマーが少なくとも９０％かつ他方のエナンチオマーが多くとも１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学純度またはエナンチオマー過剰率（当技術分野の標準的方法により決定される）を有する本発明の化合物の各個別の光学活性形を意味する。
本明細書で用いられる「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で用いられる「ヘテロアルキル」という用語は、成分炭素原子の１または２個がそれぞれ窒素、酸素、または硫黄により置き換えられた本明細書に定義されるアルキル基を意味する。いくつかの実施形態では、ヘテロアルキル基は、アルキル基に対して本明細書に記載される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。本明細書で用いられる「ヘテロアルケニル」およびヘテロアルキニル」という用語は、それぞれ、成分炭素原子の１または２個がそれぞれ窒素、酸素、または硫黄により置き換えられた本明細書に定義されるアルケニル基およびアルキニル基を意味する。いくつかの実施形態では、ヘテロアルケニル基およびヘテロアルキニル基は、アルキル基に対して本明細書に記載される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。
本明細書で用いられる「ヘテロアリール」という用語は、芳香族である本明細書に定義されるヘテロシクリルのサブセットを表す。すなわち、それらは単環内または多環系内に４ｎ＋２個のπ電子を含有する。例示的な非置換ヘテロアリール基は、１～１２（たとえば、１～１１、１～１０、１～９、２～１２、２～１１、２～１０、または２～９）個の炭素である。ある実施形態では、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基に対して定義される１、２、３、または４個の置換基により置換される。
「ヘテロアリールアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基により親分子基に結合された本明細書に定義されるヘテロアリール基を意味する。例示的な非置換ヘテロアリールアルキル基は、２～３２個の炭素（たとえば、２～２２、２～１８、２～１７、２～１６、３～１５、２～１４、２～１３、または２～１２個の炭素、たとえば、Ｃ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール、Ｃ１～１０アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール、またはＣ１～２０アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびヘテロアリールはそれぞれ、それぞれの基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。ヘテロアリールアルキル基はヘテロシクリルアルキル基のサブセットである。
本明細書で用いられる「ヘテロシクリル」という用語は、とくに明記されていない限り、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有する５員、６員、または７員の環を表す。５員環は、２個の二重結合へのゼロを有する。また、６－および７員環は、３個の二重結合へのゼロを有する。例示的な無置換ヘテロシクリル基は、１～１２（たとえば、１～１１、１～１０、１～９、２～１２、２～１１、２～１０、または２～９）個の炭素である。「ヘテロシクリル」という用語はまた、１個以上の炭素および／またはヘテロ原子が単環の２つの非隣接メンバーを架橋する架橋多環構造を有するヘテロ環式化合物たとえばキヌクリジニル基を表す。「ヘテロシクリル」という用語は、以上のヘテロ環のいずれかが１、２、または３個の炭素環、たとえば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、または他の単環式ヘテロ環、たとえば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルなどに縮合した二環式、三環式、および四環式の基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、１個以上の二重結合が還元されて水素により置き換えられたジヒドロ形およびテトラヒドロ形を含めて、トロパンおよび１，２，３，５，８，８ａ－ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。ヘテロ環式化合物としては、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（たとえば、１，２，３－オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（たとえば、１，２，３－チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニルなどが挙げられる。さらに他の例示的なヘテロシクリルとしては、２，３，４，５－テトラヒドロ－２－オキソオキサゾリル、２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－イミダゾリル、２，３，４，５－テトラヒドロ－５－オキソ－１Ｈ－ピラゾリル（たとえば、２，３，４，５－テトラヒドロ－２－フェニル－５－オキソ－１Ｈ－ピラゾリル）、２，３，４，５－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－１Ｈ－イミダゾリル（たとえば、２，３，４，５－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－５－メチル－５－フェニル－１Ｈ－イミダゾリル）、２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－１，３，４－オキサジアゾリル（たとえば、２，３－ジヒドロ－２－チオキソ－５－フェニル－１，３，４－オキサジアゾリル）、４，５－ジヒドロ－５－オキソ－１Ｈ－トリアゾリル（たとえば，４，５－ジヒドロ－３－メチル４－アミノ－５－オキソ－１Ｈ－トリアゾリル）、１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソピリジニル（たとえば、１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－３，３－ジエチルピリジニル）、２，６－ジオキソ－ピペリジニル（たとえば、２，６－ジオキソ－３－エチル－３－フェニルピペリジニル）、１，６－ジヒドロ－６－オキソピリミジニル、１，６－ジヒドロ－４－オキソピリミジニル（たとえば、２－（メチルチオ）－１，６－ジヒドロ－４－オキソ－５－メチルピリミジン－１－イル）、１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソピリミジニル（たとえば、１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－３－エチルピリミジニル）、１，６－ジヒドロ－６－オキソ－ピリダジニル（たとえば、１，６－ジヒドロ－６－オキソ－３－エチルピリダジニル）、１，６－ジヒドロ－６－オキソ－１，２，４－トリアジニル（たとえば、１，６－ジヒドロ－５－イソプロピル－６－オキソ－１，２，４－トリアジニル）、２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈインドリル（たとえば、３，３－ジメチル－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－インドリルおよび２，３－ジヒドロ－２－オキソ－３，３’－スピロプロパン－１Ｈ－インドール－１－イル）、１，３－ジヒドロ－１－オキソ－２Ｈ－イソ－インドリル、１，３－ジヒドロ－１，３－ジオキソ－２Ｈ－イソ－インドリル、１Ｈ－ベンゾピラゾリル（たとえば、１－（エトキシカルボニル）－１Ｈ－ベンゾピラゾリル）、２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－ベンゾイミダゾリル（たとえば、３－エチル－２，３－ジヒドロ－２－オキソ－１Ｈ－ベンゾイミダゾリル）、２，３－ジヒドロ－２－オキソ－ベンゾオキサゾリル（たとえば、５－クロロ－２，３－ジヒドロ－２－オキソベンゾオキサゾリル）、２，３－ジヒドロ－２－オキソ－ベンゾオキサゾリル、２－オキソ－２Ｈ－ベンゾピラニル、１，４－ベンゾジオキサニル、１，３－ベンゾジオキサニル、２，３－ジヒドロ－３－オキソ，４Ｈ－１，３－ベンゾチアジニル、３，４－ジヒドロ－４－オキソ－３Ｈ－キナゾリニル（たとえば、２－メチル－３，４－ジヒドロ－４－オキソ－３Ｈ－キナゾリニル）、１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－３Ｈ－キナゾリル（たとえば、１－エチル－１，２，３，４－テトラヒドロ－２，４－ジオキソ－３Ｈ－キナゾリル）、１，２，３，６－テトラヒドロ－２，６－ジオキソ－７Ｈ－プリニル（たとえば、１，２，３，６－テトラヒドロ－１，３－ジメチル－２，６－ジオキソ－７Ｈ－プリニル）、１，２，３，６－テトラヒドロ－２，６－ジオキソ－１Ｈ－プリニル（たとえば、１，２，３，６－テトラヒドロ－３，７－ジメチル－２，６－ジオキソ－１Ｈ－プリニル）、２－オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル、１，１－ジオキソ－２Ｈ－ナフト［１，８－ｃ，ｄ］イソチアゾリル、および１、８－ナフチレンジカルボキサミドが挙げられる。追加のヘテロ環式化合物としては、３，３ａ，４，５，６，６ａ－ヘキサヒドロ－ピロロ［３，４－ｂ］ピロール－（２Ｈ）－イル、および２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル、ホモピペラジニル（またはジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが挙げられる。ヘテロ環式基としてはまた、化学式
（式中、
Ｅ’は、－Ｎ－および－ＣＨ－からなる群から選択され、Ｆ’は、－Ｎ＝ＣＨ－、－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－、－ＣＨ＝Ｎ－、－ＣＨ２－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｏ－、－ＯＣＨ２－、－Ｏ－、および－Ｓ－からなる群から選択され、かつＧ’は、－ＣＨ－および－Ｎ－からなる群から選択される）で示される基も挙げられる。本明細書に挙げられたヘテロシクリル基はいずれも、（１）Ｃ１～７アシル（たとえばカルボキシアルデヒド）、（２）Ｃ１～２０アルキル（たとえば、アルキル、アルコキシ－Ｃ１～６アルキル、アルキルスルフィニル－Ｃ１～６アルキル、アミノ－Ｃ１～６アルキル、アジド－Ｃ１～６アルキル、（カルボキシアルデヒド）－Ｃ１～６アルキル、ハロ－Ｃ１～６アルキル（たとえばペルフルオロアルキル）、ヒドロキシ－Ｃ１～６アルキル、ニトロ－Ｃ１～６アルキル、またはＣ１～６チオアルコキシ－Ｃ１～６アルキル）、（３）Ｃ１～２０アルコキシ（たとえばＣ１～６アルコキシ、たとえばペルフルオロアルコキシ）、（４）Ｃ１～６アルキルスルフィニル、（５）Ｃ６～１０アリール、（６）アミノ、（７）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリール、（８）アジド、（９）Ｃ３～８シクロアルキル、（１０）Ｃ１～６アルク－Ｃ３～８シクロアルキル、（１１）ハロ、（１２）Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ２～１２ヘテロアリール）、（１３）（Ｃ１～１２ヘテロシクリル）オキシ、（１４）ヒドロキシル、（１５）ニトロ、（１６）Ｃ１～２０チオアルコキシ（たとえばＣ１～６チオアルコキシ）、（１７）－（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＡ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（１８）－（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＢ’およびＲＣ’は、（ａ）水素、（ｂ）アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）、（１９）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＤ’は、（ａ）Ｃ１～６アルキル、（ｂ）Ｃ６～１０アリール、および（ｃ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から選択される）、（２０）－（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’（式中、ｑは０～４の整数であり、かつＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１～６アルキル、（ｃ）Ｃ６～１０アリール、および（ｄ）Ｃ１～６アルク－Ｃ６～１０アリールからなる群から独立して選択される）、（２１）チオール、（２２）Ｃ６～１０アリールオキシ、（２３）Ｃ３～８シクロアルコキシ、（２４）アリールアルコキシ、（２５）Ｃ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル（たとえばＣ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロアリール）、（２６）オキソ、（２７）（Ｃ１～１２ヘテロシクリル）イミノ、（２８）Ｃ２～２０アルケニル、ならびに（２９）Ｃ２～２０アルキニルからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５個の置換基により任意選択的に置換しうる。いくつかの実施形態では、これらのグループのそれぞれは、本明細書に記載されるようにさらに置換可能である。たとえば、Ｃ１－アルカリールまたはＣ１－アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基によりさらに置換してそれぞれのアリーロイル置換基および（ヘテロシクリル）オイル置換基を与えうる。
本明細書で用いられる「ヘテロシクリルアルキル」基は、本明細書に定義されるアルキレン基により親分子基に結合された本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例示的な非置換ヘテロシクリルアルキル基は、２～３２個の炭素（たとえば、２～２２、２～１８、２～１７、２～１６、３～１５、２～１４、２～１３、または２～１２個の炭素、たとえば、Ｃ１～６アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル、Ｃ１～１０アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル、またはＣ１～２０アルク－Ｃ１～１２ヘテロシクリル）である。いくつかの実施形態では、アルキレンおよびヘテロシクリルはそれぞれ、それぞれの基に対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基によりさらに置換可能である。
本明細書で用いられる「炭化水素」という用語は、炭素原子と水素原子とのみからなる基を表す。
「本明細書で用いられるヒドロキシル」という用語は、－ＯＨ基を表す。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル基は、アルキルに対して本明細書に定義される１、２、３、または４個の置換基（たとえばＯ－保護基）により置換可能である。
本明細書で用いられる「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有しうるとともに、それにより、二重結合異性体（すなわちＥ／Ｚ幾何異性体）やジアステレオマー（たとえばエナンチオマー（すなわち（＋）もしくは（－））またはシス／トランス異性体）などの立体異性体として存在しうると認識される。本発明によれば、本明細書に表される化学構造つまり本発明の化合物は、すべての対応する立体異性体、すなわち、ステレオマー的純粋形（たとえば、幾何学的純粋形、エナンチオマー的純粋形、またはジアステレオマー的純粋形）もエナンチオマー混合物や立体異性体混合物（たとえばラセミ体）も包含する。本発明の化合物のエナンチオマー混合物および立体異性体混合物は、典型的には、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、キラル溶媒中での化合物の結晶化などの周知の方法により、それらの成分のエナンチオマーまたは立体異性体に分割可能である。エナンチオマーおよび立体異性体はまた、周知の不斉合成法によりステレオマー的またはエナンチオマー的に純粋な中間体、試薬、および触媒から取得可能である。
本明細書で用いられる「Ｎ－保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される１または２個のＮ－保護基に結合された本明細書に定義されるアミノ基を意味する。
本明細書で用いられる「Ｎ－保護基」という用語は、合成手順時に望ましくない反応からアミノ基を保護するように意図された基を表す。一般に使用されるＮ－保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。Ｎ－保護基としては、アシル基、アリーロイル基、またはカルバミル基、たとえば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ－ブチルアセチル、２－クロロアセチル、２－ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ－ニトロフェノキシアセチル、α－クロロブチリル、ベンゾイル、４－クロロベンゾイル、４－ブロモベンゾイル、４－ニトロベンゾイル、およびキラル補助剤、たとえば、保護または脱保護Ｄ、Ｌ、またはＤ，Ｌ－アミノ酸、たとえば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなど、スルホニル含有基、たとえば、ベンゼンスルホニル、ｐ－トルエンスルホニルなど、カルバメート形成基、たとえば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ－クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル、２－ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ－ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４－ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４－メトキシベンジルオキシカルボニル、２－ニトロ－４，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５－トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１－（ｐ－ビフェニリル）－１－メチルエトキシカルボニル、α，α－ジメチル－３，５－ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ－ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，－トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４－ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル－９－メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アルカリール基、たとえば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、ならびにシリル基、たとえば、トリメチルシリルなどが挙げられる。好ましいＮ－保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ－ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
本明細書で用いられる「ニトロ」という用語は、－ＮＯ２基を表す。
本明細書で用いられる「Ｏ－保護基」という用語は、合成手順時に望ましくない反応から酸素含有（たとえば、フェノール、ヒドロキシル、またはカルボニル）基を保護するように意図された基を表す。一般に使用されるＯ－保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、１９９９年）（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。例示的なＯ－保護基としては、アシル基、アリーロイル基、またはカルバミル基、たとえば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ－ブチルアセチル、２－クロロアセチル、２－ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ－ニトロフェノキシアセチル、クロロブチリル、ベンゾイル、４－クロロベンゾイル、４－ブロモベンゾイル、ｔ－ブチルジメチルシリル、トリ－ｉｓｏ－プロピルシリルオキシメチル、４，４’－ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４－イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ、および４－ニトロベンゾイル、アルキルカルボニル基、たとえば、アシル、アセチル、プロピオニル、ピバロイルなど、任意選択的に置換されたアリールカルボニル基、たとえば、ベンゾイル、シリル基、たとえば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ－ｉｓｏ－プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）など、ヒドロキシルとのエーテル形成基、たとえば、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル、トリチルなど、アルコキシカルボニル、たとえば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ－イソプロポキシカルボニル、ｎ－ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ－ブチルオキシカルボニル、ｔ－ブチルオキシカルボニル、２－エチルヘキシルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニルなど、アルコキシアルコキシカルボニル基、たとえば、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２－メトキシエトキシカルボニル、２－エトキシエトキシカルボニル、２－ブトキシエトキシカルボニル、２－メトキシエトキシメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、２－ブテノキシカルボニル、３－メチル－２－ブテノキシカルボニルなど、ハロアルコキシカルボニル、たとえば、２－クロロエトキシカルボニル、２－クロロエトキシカルボニル、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニルなど、任意選択的に置換されたアリールアルコキシカルボニル基、たとえば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ－メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４－ジニトロベンジルオキシカルボニル、３，５－ジメチルベンジルオキシカルボニル、ｐ－クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ－ブロモベンジルオキシ－カルボニル、フルオレニルメチルオキシカルボニルなど、および任意選択的に置換されたアリールオキシカルボニル基、たとえば、フェノキシカルボニル、ｐ－ニトロフェノキシカルボニル、ｏ－ニトロフェノキシカルボニル、２，４－ジニトロフェノキシカルボニル、ｐ－メチルフェノキシカルボニル、ｍ－メチルフェノキシカルボニル、ｏ－ブロモフェノキシカルボニル、３，５－ジメチルフェノキシカルボニル、ｐ－クロロフェノキシカルボニル、２－クロロ－４－ニトロフェノキシ－カルボニルなど）、置換アルキル、アリール、およびアルカリールエーテル（たとえば、トリチル、メチルチオメチル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、シロキシメチル、２，２，２，－トリクロロエトキシメチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、エトキシエチル、１－［２－（トリメチルシリル）エトキシ］エチル、２－トリメチルシリルエチル、ｔ－ブチルエーテル、ｐ－クロロフェニル、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－ニトロフェニル、ベンジル、ｐ－メトキシベンジル、およびニトロベンジル）、シリルエーテル（たとえば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、トリフェニルシリル、およびジフェニルメチルシリル）、カーボネート（たとえば、メチル、メトキシメチル、９－フルオレニルメチル、エチル、２、２、２－トリクロロエチル、２－（トリメチルシリル）エチル、ビニル、アリル、ニトロフェニル、ベンジル、メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、およびニトロベンジル）、カルボニル保護基（たとえば、アセタール基およびケタール基、たとえば、ジメチルアセタール、１，３－ジオキソランなど、アシラール基、およびジチアン基、たとえば、１，３－ジチアン、１，３－ジチオランなど）、カルボン酸保護基（たとえば、エステル基、たとえば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ－ブチルエステル、オルトエステルなど）、ならびにオキサゾリン基が挙げられる。
本明細書で用いられる「オキソ」という用語は＝Ｏを表す。
本明細書で用いられる「ペルフルオロ」という接頭辞は、アルキル基に結合された各水素基がフッ化物基により置き換えられた本明細書に定義される任意の基を表す。たとえば、ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどによって例示される。
本明細書で用いられる「保護ヒドロキシル」という用語は、Ｏ－保護基に結合された酸素原子を意味する。
本明細書で用いられる「スピロシクリル」という用語は、両方の末端が親基の同一の炭素原子に結合されてスピロ環式基を形成するＣ２～７アルキレン２価基を表すとともに、両方の末端が同一の原子に結合されたヘテロアルキレン２価基も表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレン基は、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有可能である。いくつかの実施形態では、スピロシクリル基は、２価基が結合された炭素原子を除いて１～７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキル基および／またはヘテロシクリル基に対して任意選択的な置換基として本明細書に提供される１、２、３、または４個の置換基により任意選択的に置換しうる。
本明細書で用いられる「立体異性体」という用語は、化合物（たとえば、本明細書に記載される任意の化学式の化合物）がとりうるすべての可能な異なる異性形さらにはコンフォメーション形、とくに、基本分子構造のすべての可能な立体化学異性形およびコンフォメーション異性形、すべてのジアステレオマー、エナンチオマー、および／またはコンフォーマを意味する。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性形で存在しうるとともに、これらの互変異性形はすべて本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で用いられる「スルホニル」という用語は－Ｓ（Ｏ）２－基を表す。
本明細書で用いられる「チオール」という用語は－ＳＨ基を表す。
定義
本出願では、とくに文脈から明らかでない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味するものと理解しうるし、（ｉｉ）「ｏｒ（または）」という用語は、「ａｎｄ／ｏｒ（および／または）」を意味するものと理解しうるし、（ｉｉｉ）「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（～を含む）」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（～を含む）」という用語は、アイテム化された成分または工程を包含しうるとともに、それ自体で提示されるかまたは１つ以上の追加の成分もしくは工程と一緒に提示されるかを問わないものと理解しうるし、かつ（ｉｖ）「ａｂｏｕｔ（約）」および「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」という用語は、当業者により理解される標準偏差を許容にするものと理解しうるし、かつ（ｖ）範囲が提供される場合、端点が含まれている。
当技術分野で公知のように、「親和性」とは、特定のリガンドがそのパートナーに結合する緊密性の尺度である。親和性はさまざまな方法で測定可能である。いくつかの実施形態では、親和性は定量アッセイにより測定される。いくつかのかかる実施形態では、結合パートナー濃度は、生理学的条件を模倣するようにリガンド濃度よりも過剰に固定しうる。代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、結合パートナー濃度および／またはリガンド濃度は変化させうる。いくつかのかかる実施形態では、親和性は、同等な条件（たとえば濃度）下で参照と比較しうる。
本明細書で用いられる場合、「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」および「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、関連する文脈上適切であれば、当業者により理解される通常の統計的変動を包含することが意図される。ある特定の実施形態では、「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」または「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、それぞれ、とくに明記されていない限りまたはとくに文脈から自明でない限り（たとえば、かかる数が可能な値の１００％を超える場合）、明記された値のいずれの方向にも（それよりも大きい方向にも小さい方向にも）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内に入る値の範囲を意味する。
本明細書で用いられる「結合」という用語が、典型的には、２つ以上のエンティティー間の関連（たとえば、非共有結合または共有結合）を意味することは、理解されよう。「直接」結合は、エンティティー間または部分間の物理的接触を含み、間接結合は、１つ以上の中間エンティティーとの物理的接触による物理的相互作用を含む。２つ以上のエンティティー間の結合は、典型的には、相互作用するエンティティーまたは部分を単離状態またはより複雑な系で研究する場合を含めてさまざまな状況のいずれかで評価可能である（たとえば、担体エンティティーおよび／または生体系または細胞に共有結合または他の形で関連した状態で）。
分子ＸとそのパートナーＹとの親和性は、一般的には、解離定数（ＫＤ）により表現可能である。親和性は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で公知の通常の方法により測定可能である。結合親和性を測定するための特定の例示的かつ典型的な実施形態を以下に記載する。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は、特定の化合物－タンパク質または複合－タンパク質の相互作用の解離平衡定数を意味することが意図される。典型的には、本発明の化合物は、たとえば、プレゼンタータンパク質をアナライトとしてかつ化合物をリガンドとして用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定したとき、約１０－６Ｍ未満、たとえば、約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、もしくは１０－１０Ｍ、またはさらにはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でプレゼンタータンパク質に結合する。本発明のプレゼンタータンパク質／化合物複合体は、たとえば、標的タンパク質をアナライトとしてかつ複合体をリガンドとして用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定したとき、約１０－６Ｍ未満、たとえば、約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、もしくは１０－１０Ｍ、またはさらにはそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）に結合する。
本明細書において使用する場合、用語「架橋基」は、タンパク質または他の分子上の特定の官能基（例えば、第一級アミン、スルフヒドリル）に化学的に付着することができる反応性官能基を含む基を指す。「アミノ酸と化学選択的反応をすることができる部分」は、本明細書において使用する場合、天然または非天然アミノ酸の官能基に化学的に付着することができる反応性官能基を含む部分を指す（例えば、第一級および第二級アミン、スルフヒドリル、アルコール、カルボキシル基、カルボニル、またはトリアゾール形成官能基、例えば、アジドまたはアルキン）。架橋基の例は、スルフヒドリル反応性架橋基（例えば、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、またはビニルスルホンを含む基）、アミン反応性架橋基（例えば、エステル、例えば、ＮＨＳエステル、イミドエステル、およびペンタフルオロフェニルエステル、またはヒドロキシメチルホスフィンを含む基）、カルボキシル反応性架橋基（例えば、第一級もしくは第二級アミン、アルコール、またはチオールを含む基）、カルボニル反応性架橋基（例えば、ヒドラジドまたはアルコキシアミンを含む基）、およびトリアゾール形成架橋基（例えば、アジドまたはアルキンを含む基）を含む。
本明細書において使用する場合、用語「複合体」は、結合相互作用（例えば、非共有結合性相互作用、例えば、疎水性効果相互作用、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、またはπ効果相互作用）によって一緒に結合している、２つもしくはそれよりも多い化合物および／またはタンパク質の群を指す。複合体の例は、プレゼンタータンパク質または標的タンパク質に結合した本発明のコンジュゲートを含む「プレゼンタータンパク質／コンジュゲート複合体」および「標的タンパク質／コンジュゲート複合体」である。 本明細書において使用する場合、用語「コンジュゲート」は、２つもしくはそれよりも多い化合物（例えば、架橋基およびタンパク質、例えば、標的タンパク質またはプレゼンタータンパク質を含む化合物）の接合（例えば、共有結合形成反応による）によって形成される化合物を指す。
本明細書において使用する場合、「結合に関与する」原子は、それが結合している実体の４Å以内にあるか、またはそれが結合している実体の４Å以内にある原子に接続している。
「プレゼンタータンパク質」という用語は、標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）に結合してその活性をモジュレートする複合体を形成するように低分子に結合するタンパク質を意味する。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、比較的豊富なタンパク質である（たとえば、プレゼンタータンパク質は、トリパータイト複合体への関与が細胞内でのプレゼンタータンパク質の生物的役割および／または細胞の生存能もしくは他の属性に実質的に影響を及ぼさない程度に十分に豊富である）。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、細胞内でシャペロン活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、細胞内で複数の天然の相互作用パートナーを有するタンパク質である。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、標的タンパク質に結合してその生物学的活性モジュレートことが知られているかまたはそのように推定される二元複合体を形成するように低分子に結合することが知られているものである。
「プレゼンタータンパク質結合部分」という用語は、化合物が、たとえば、１０μＭ未満（たとえば、５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満）のＫＤで、前記プレゼンタータンパク質に特異的に結合するように、またはたとえば、１μＭ未満（たとえば、０．５μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０１μＭ未満）のＩＣ５０で、プレゼンタータンパク質のペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性を阻害するように、プレゼンタータンパク質への結合に関与する原子およびそれらに結合された部分のグループ（たとえば、２０個の原子に含まれる原子、たとえば、１５個の原子に含まれる原子、１０個の原子に含まれる原子、５個の原子に含まれる原子）を意味する。プレゼンタータンパク質結合部分が、プレゼンタータンパク質と相互作用する化合物中の原子の全体を包含するとは限らないことは、理解されよう。プレゼンタータンパク質結合部分の１個以上の原子が、標的タンパク質結合部分（たとえば、哺乳動物標的タンパク質結合部分や菌類標的タンパク質結合部分などの真核生物標的タンパク質結合部分または細菌標的タンパク質結合部分など原核生物標的タンパク質結合部分）内にありうることもまた、理解されよう。
本明細書において使用する場合、「ＦＫＢＰ結合部分」は、タンパク質のＦＫＢＰファミリー（例えば、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２．６、ＦＫＢＰＰ１３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ５１、またはＦＫＢＰ５２）におけるプレゼンタータンパク質について選択的なプレゼンタータンパク質結合部分を指す。「選択的ＦＫＢＰ結合部分」は、本明細書において使用する場合、ＦＫＢＰファミリーの全ての他のメンバーを超えて、ＦＫＢＰファミリーの１個もしくは複数（例えば、２個、３個、４個、５個）のメンバーに対して特異的である結合部分を指す。「非選択的ＦＫＢＰ結合部分」は、本明細書において使用する場合、ＦＫＢＰファミリーの全てのメンバーについて匹敵する親和性（２倍以内、３倍以内、４倍以内、５倍以内、１０倍以内）を有する結合部分を指す。
用語「タンパク質結合部分」は、タンパク質（例えば、プレゼンタータンパク質または標的タンパク質）への結合に関与する原子の群、およびそれに付着した部分（例えば、２０個の原子以内の原子、例えば、１５個の原子以内の原子、１０以内の原子、５個の原子以内の原子）を指し、化合物は、例えば、１０μＭ未満（例えば、５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満）のＫＤを伴って、前記タンパク質に特異的に結合するか、または例えば、１μＭ未満（例えば、０．５μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０１μＭ未満）のＩＣ５０を伴って、プレゼンタータンパク質のペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性を阻害する。タンパク質結合部分は、タンパク質と相互作用する、化合物中の全原子を必ずしも包含しないことが理解される。
本明細書において使用する場合、用語「反応する」は、同じまたは異なる元素の原子がそれら自体再構成して、新規な物質を形成するプロセスを指す。例えば、２個の原子の間の共有結合の形成、例えば、共有結合を形成させるタンパク質上の反応性アミノ酸と架橋基との間の反応。反応は当技術分野において公知の任意の方法によって測定し得、例えば、反応生成物の形成は、ＬＣ－ＭＳまたはＮＭＲによって決定することができる。
本明細書において使用する場合、用語「反応性アミノ酸」は、特定の官能基（例えば、架橋基）に化学的に付着することができる官能基（例えば、求核性官能基）を含む天然または非天然アミノ酸を指す。反応性アミノ酸の例は、システイン、リシン、セリン、および側鎖上にアジドを有するアミノ酸を含む。「非反応性アミノ酸」は、特定の官能基に化学的に付着することができる官能基を含有しない天然または非天然アミノ酸を指す。非反応性アミノ酸の例は、バリン、アラニン、イソロイシン、テロニン（ｔｈｅｒｏｎｉｎｅ、およびロイシンを含む。
「参照」という用語は、多くの場合、対象の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値と比較される標準または対照の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値を記述するために本明細書で用いられる。いくつかの実施形態では、参照の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値は、対象の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値の検査または決定と実質的に同時に検査および／または決定される。いくつかの実施形態では、参照の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値は、タンジブルメディアで任意選択的に具現化された履歴参照である。典型的には、当業者により理解されるように、参照の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値は、対象の化合物、個体、集団、サンプル、配列、または値の決定または特徴付けに利用されるものと同等の条件下で決定または特徴付けされる。
本明細書において使用する場合、用語「溶媒に曝露されたアミノ酸」は、タンパク質を取り囲んでいる溶媒に到達可能であるアミノ酸を指す。一部の実施形態では、溶媒に曝露されたアミノ酸は、置換されているとき、タンパク質の三次元構造を実質的に変化させないアミノ酸である。
本明細書で用いられる場合、「特異的結合」または「特異的」という用語は、結合剤と標的エンティティーとの間の相互作用を意味する。当業者により理解されるように、代替相互作用の存在下で、たとえば、１０μＭ未満（たとえば、５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満）のＫＤによる結合が有利であれば、相互作用は「特異的」であるとみなされる。多くの実施形態では、特異的相互作用は、標的エンティティーの特定の構造の特徴（たとえば、エピトープ、クレフト、結合部位）の存在に依存する。特異性が絶対的である必要はないことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、特異性は、１つ以上の他の可能な標的エンティティー（たとえばコンペティター）に対する結合剤の特異性と対比して評価しうる。いくつかの実施形態では、特異性は、参照特異的結合剤の特異性と対比して評価される。いくつかの実施形態では、特異性は、参照非特異的結合作用剤の特異性と対比して評価される。
「特異的」という用語は、活性を有する化合物に関連して用いられる場合、化合物が可能性のある標的のエンティティーまたは状態を識別することを意味するものと当業者により理解される。たとえば、いくつかの実施形態では、化合物は、１つ以上の競合する代替標的の存在下でその標的に優先的に結合するのであれば、その標的に「特異的」に結合すると言われる。多くの実施形態では、特異的相互作用は、標的エンティティーの特定の構造の特徴（たとえば、エピトープ、クレフト、結合部位）の存在に依存する。特異性が絶対的である必要はないことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、特異性は、１つ以上の他の可能な標的エンティティー（たとえばコンペティター）に対する結合剤の特異性と対比して評価しうる。いくつかの実施形態では、特異性は、参照特異的結合剤の特異性と対比して評価される。いくつかの実施形態では、特異性は、参照非特異的結合作用剤の特異性と対比して評価される。いくつかの実施形態では、作用剤またはエンティティーは、その標的エンティティーへの結合の条件下で競合する代替標的に検出可能に結合しない。いくつかの実施形態では、結合剤は、競合する代替標的と比較して、より高いオン速度、より低いオフ速度、増加した親和性、減少した解離、および／または増加した安定性で、その標的エンティティーに結合する。
「実質的」という用語は、対象の特性または性質の全体またはほぼ全体の範囲または度合いを呈する定性的条件を意味する。生物学技術分野の当業者であれば、生物学的および化学的な現象が、最終状態に達することおよび／または完全に進行することまたは絶対的結果を達成もしくは回避することは、あってもまれであるものと理解されよう。したがって、「実質的」という用語は、多くの生物学的および化学的な現象に固有の完全性の欠如の可能性を取り込むように本明細書で用いられる。
本明細書で用いられる特定のタンパク質に「実質的に結合しない」という用語は、たとえば、標的に対して１０－４Ｍ以上、代替的に１０－５Ｍ以上、代替的に１０－６Ｍ以上、代替的に１０－７Ｍ以上、代替的に１０－８Ｍ以上、代替的に１０－９Ｍ以上、代替的に１０－１０Ｍ以上、代替的に１０－１１Ｍ以上、代替的に１０－１２Ｍ以上のＫＤまたは１０－４Ｍ～１０－１２Ｍもしくは１０－６Ｍ～１０－１０Ｍもしくは１０－７Ｍ～１０－９Ｍの範囲内のＫＤを有する分子または分子の部分により表すことが可能である。
用語「標的タンパク質」は、疾患、障害または状態と関連する生物学的経路に関与している任意のタンパク質を指す。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ｍＴＯＲまたはカルシニューリンではない。一部の実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質および小分子と共にトリパータイト複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は天然に存在するタンパク質である。いくつかのかかる実施形態では、標的タンパク質は、ある特定の哺乳動物細胞（たとえば、哺乳動物標的タンパク質）、菌類細胞（たとえば、菌類標的タンパク質）、細菌細胞（たとえば、細菌標的タンパク質）、または植物細胞（たとえば、植物標的タンパク質）に天然に見いだされる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、１つ以上の天然プレゼンタータンパク質／天然低分子複合体との天然相互作用により特徴付けられる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、複数の異なる天然プレゼンタータンパク質／天然低分子複合体との天然相互作用により特徴付けられ、いくつかのかかる実施形態では、複合体の一部または全部は、同一のプレゼンタータンパク質（および異なる低分子）を利用する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、シクロスポリン、ラパマイシン、またはＦＫ５０６と、プレゼンタータンパク質（たとえば、ＦＫＢＰ）と、の複合体に実質的に結合しない。標的タンパク質は、天然に存在可能であり、たとえば、野生型でありうる。代替的に、標的タンパク質は、野生型タンパク質と異なりうるが、生物学的機能、たとえば、対立遺伝子変異体、スプライス突然変異体、または生物学的活性断片を依然として維持する。例示的な哺乳動物標的タンパク質は、ＧＴＰアーゼ、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、グアニンヌクレオチド交換因子、熱ショックタンパク質、イオンチャネル、コイルドコイルタンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、転写因子、クロマチンモディファイヤー／リモデラー、古典的タンパク質－タンパク質相互作用ドメインおよびモチーフを有するタンパク質、または疾患、障害、もしくは病態に関連する生物学的経路に関与する任意の他のタンパク質である。
一部の実施形態では、標的タンパク質は、修飾された標的タンパク質である。修飾された標的タンパク質は、タンパク質配列におけるアミノ酸の保存的または非保存的な挿入、欠失、または置換を含むことができる（例えば、Ｄ－アミノ酸、デスアミノ酸）（例えば、ここではこのような変化は、ポリペプチドの生物活性を実質的に変化させない）。特に、本発明のポリペプチドのいずれかのアミノまたはカルボキシ末端への１個もしくは複数のシステイン残基の添加は、例えば、ジスルフィド結合によるこれらのタンパク質のコンジュゲーションを促進することができる。一部の実施形態では、１個もしくは複数の反応性アミノ酸残基（例えば、システイン）は除去され、タンパク質上の可能なコンジュゲーション部位の数を減少させる。アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ここで、残基は、同じ一般タイプもしくは群の別のものによって置き換えられている）または非保存的（すなわち、ここで、残基は、別のタイプのアミノ酸によって置き換えられている）でよい。さらに、非天然アミノ酸（すなわち、天然由来でない保存的アミノ酸置換または天然由来でない非保存的アミノ酸置換）を、天然アミノ酸で代用することができる。 「標的タンパク質結合部分」という用語は、化合物がプレゼンタータンパク質との複合体のときに標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）への結合に関与する環原子およびそれらに結合された部分のグループ（たとえば、２０個の原子に含まれる原子、たとえば、１５個の原子に含まれる原子、１０個の原子に含まれる原子、５個の原子に含まれる原子）を意味する。標的タンパク質結合部分が、標的タンパク質と相互作用する化合物中の原子の全体を包含するとは限らないことは、理解されよう。プレゼンタータンパク質結合部分の１個以上の原子が、標的タンパク質結合部分にも存在しうることもまた、理解されよう。
「従来型の結合ポケット」という用語は、活性が１つ以上の低分子によりモジュレートされたタンパク質に匹敵する生理化学的および／または幾何学的な性質を有するタンパク質構造上のキャビティまたはポケットを意味する。いくつかの実施形態では、従来型の結合ポケットは、１０００Ａ３超の体積を有する明確に規定されたポケットである。当業者であれば、従来型の結合ポケットの概念を熟知しており、さらにそれと「ドラッガビリティー」との関係に気づいている。ある特定の実施形態では、タンパク質は、本明細書に定義されるように、アンドラッガブルであれば、従来型の結合ポケットを有していないとみなされる。
「アンドラッガブル標的」という用語は、薬剤の標的となることが知られているタンパク質ファミリーのメンバーでないおよび／または低分子への高親和性結合に好適な結合部位を有していないタンパク質を意味する。標的タンパク質がアンドラッガブルかを決定する方法は、当技術分野で公知である。たとえば、標的タンパク質がアンドラッガブルであるかは、体積、表面積、親油性表面積、深さ、および／または疎水性比をはじめとするタンパク質上の結合ポケットに対して計算されたパラメータに基づいてドラッガビリティーを評価するドッグサイトスコアラー（ＤＯＧＳＩＴＥＳＣＯＲＥＲ）（登録商標）（ハンブルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｈａｍｂｕｒｇ）、独国ハンブルグ）というプログラムにより用いられるような構造ベースのアルゴリズムを用いて決定しうる。
ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－ＦＫ５０６コンジュゲートのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。レーン１：ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ；レーン２：ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－ＦＫ５０６反応混合物；レーン３：ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－ＦＫ５０６反応混合物＋１００ｍＭのＤＴＴ。 ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２Ｃｌｉｔｅ／ＳＦＡＸ９ＤＳコンジュゲートのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。 ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２複合体形成のＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。ＳＥＣ精製プロファイル。青い点線は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２三元複合体の溶出に対応するピークを示す。 ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２複合体形成のＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。ＳＥＣ溶出ピークのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。青い点線は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２溶出ピークについて集めた画分に対応する。 ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／ＳＦＡＣ４ＤＳ／ＣｙｐＡＣ５２Ｓ複合体の形成を確認する、ＳＥＣプロファイル、および溶出ピークのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。 遊離ＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２タンパク質およびＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅ／Ｃ３－ＳＬＦ／ＦＫＢＰ１２複合体のＳＥＣプロファイルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。 遊離ＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２タンパク質およびＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅ／Ｃ３－ＳＬＦ／ＦＫＢＰ１２複合体のＳＥＣプロファイルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を例示する画像である。 ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるＣ３－およびＣ４－ＳＬＦの架橋効率を例示する画像である。 ＦＫＢＰ１２－化合物１－ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ複合体の結晶構造を例示する画像である。ＦＫＢＰ１２、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃおよびリガンドを示すリボン状の表現。示された３σにおけるＦｏ－Ｆｃ電子密度は、クローズアップ図においてリガンドについて示す。 ＦＫＢＰ１２－化合物１－ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ複合体の結晶構造を例示する画像である。複合体の表面の表現であり、リガンドまたはパートナータンパク質に４Å以内で近接する原子は赤で着色する。 ＣｙｐＡＣ５２Ｓ－ＳＦＡＣ４ＤＳ－ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃの結晶構造を例示する画像である。 ＦＫＢＰ１２－Ｃ３ＳＬＦ－ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの結晶構造を例示する画像である。結晶が、非対称単位のＦＫＢＰ１２－Ｃ３ＳＬＦ－ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの２個の複合体分子を含有することを例示する。 ＦＫＢＰ１２－Ｃ３ＳＬＦ－ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの結晶構造を例示する画像である。ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの埋込面積が４２７Å２であり、Ｃ３－ＳＬＦの埋込面積が６１５Å２であることを例示する。 ＭＣＬ１Ｓ２４５Ｃ／Ｃ３ＳＬＦ／ＦＫＢＰ５２の結晶構造を例示する画像である。 ＣＹＰＡ－Ｗ２１４８７－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ三元複合体のＷ２１４８７に依存する複合体形成の結合曲線を例示する画像である。 ＣＹＰＡ－Ｗ２１４８７－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ三元複合体のＷ２１４８７に依存する複合体形成の結合曲線を例示する画像である。 ＣＥＰ２５０へのＦＫＢＰ１２－化合物１およびＦＫＢＰ１２－化合物２二元複合体の結合についてのＩＴＣ測定を例示する画像である。 ＣＥＰ２５０１１．４およびＣＥＰ２５０２９．２へのＦＫＢＰ１２／化合物１の結合についてのＳＰＲセンサーグラムを例示する画像である。 ＣＥＰ２５０１１．４およびＣＥＰ２５０２９．２へのＦＫＢＰ１２／化合物１の結合についてのＳＰＲセンサーグラムを例示する画像である。 ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰへのＣＹＰＡ／化合物３の結合についてのセンソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）および定常状態フィッティング曲線を例示する画像である。 ＣｙｐＡ：Ｃ３ＤＳ：ＫＲＡＳ複合体形成についての蛍光偏光曲線を例示する画像である。 ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰの２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトル（図１７Ａ）を例示する画像である。 化学量論量のＣＹＰＡの添加を例示する画像である。 ＫＲＡＳおよびＣＹＰＡ単独を例示する画像である。
低分子は標的との相互作用が接着力により駆動され、その強さは接触表面積にほぼ比例するので、その標的化能力は限られている。その小サイズが小さいので、低分子が標的タンパク質と効果的に相互作用するのに十分な分子間接触表面積を構築する唯一の方法は、そのタンパク質にそのまま包み込むことである。実際には、多くの一連の実験および計算の両方のデータから、表面上に疎水性「ポケット」を有するタンパク質のみが低分子に結合できるという見解が支持される。その場合、結合は包込みにより可能になる。
自然は、低分子と標的タンパク質とを疎水性ポケット以外の部位で相互作用させるストラテジーを進化させてきた。このストラテジーは、天然に存在する免疫抑制剤のシクロスポリンＡ、ラパマイシン、およびＦＫ５０６により例示される。これらの薬剤の生物学的活性は、低分子と小さい提示タンパク質との高親和性複合体の形成を必要とする。低分子と提示タンパク質との複合表面は、標的にエンゲージする。したがって、たとえば、シクロスポリンＡとシクロフィリンＡとの間で形成される二元複合体は、高い親和性および特異性でカルシニューリンを標的とするが、シクロスポリンＡもシクロフィリンＡも単独ではカルシニューリンに測定可能な親和性で結合しない。
多くの重要な治療標的は、他のタンパク質との複合体化によりそれらの機能を発揮する。タンパク質／タンパク質相互作用表面は、これらの系の多くで、極性残基の広い環に取り囲まれた疎水性側鎖の内側コアを含有する。疎水性残基は、エネルギー的に有利な接触のほぼすべてに寄与するので、このクラスターは、タンパク質－タンパク質相互作用のエンゲージメント用の「ホットスポット」として表されてきた。重要なこととして、天然に存在する低分子と小さい提示タンパク質との以上に挙げた複合体では、低分子は、ホットスポットと類似の疎水性機能のクラスターを提供し、タンパク質は、主に極性の残基の環を提供する。言い換えれば、提示された低分子系は、天然タンパク質／タンパク質相互作用系で広く利用される表面アーキテクチャーを模倣する。
自然は、提示された低分子－ポータブルホットスポットの標的特異性を進化の多様化により再プログラムする能力を実証してきた。最も良好に特徴付けられた例では、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とＦＫ５０６との間で形成された複合体は、カルシニューリンを標的とする。しかしながら、ＦＫＢＰはまた、関連分子のラパマイシンとの複合体を形成可能であり、しかも複合体は、まったく異なる標的ＴｏｒＣ１と相互作用する。これまでアンドラッガブルであるとみなされた他の標的タンパク質と相互作用してそれをモジュレートできるように、プレゼンタータンパク質／リガンドインターフェースの結合およびモジュレート能力を再プログラムする方法は、これまでのところ、開発されていない。
そのほかに、いくつかの薬剤候補物質は、意図された標的および他の意図されていないタンパク質の両方の活性を同じようにモジュレートすることから、うまく機能しないことが広く認められている。この問題は、標的タンパク質の薬剤結合部位が非標的タンパク質の結合部位に類似している場合にとくに困難なものとなる。ＡＴＰ結合ポケットが非標的インスリンレセプター（ＩＲ）の結合ポケットに構造的に類似しているインスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ－１Ｒ）は、そのような一例である。ＩＧＦ－１Ｒを標的とするように設計された低分子開発候補物質もまた、典型的には、同様にインスリンレセプターもモジュレートする許容できない副作用を有する。しかしながら、ＡＴＰ結合ポケットの周囲の領域には、これらの２つのタンパク質間の構造の非類似性が存在する。かかる知見にもかかわらず、そうした差の利点を生かしてＩＲよりもＩＧＦ－１Ｒに特異的な薬剤を開発する方法は、これまでのところ存在しない。
本開示は、タンパク質－タンパク質インターフェース、例えば、プレゼンタータンパク質（例えば、ＦＫＢＰファミリーのメンバー、シクロフィリンファミリーのメンバー、またはＰＩＮ１）および標的タンパク質の間のインターフェースを分析するのに有用な方法および試薬を提供する。一部の実施形態では、標的および／またはプレゼンタータンパク質は、細胞内タンパク質である。一部の実施形態では、標的および／またはプレゼンタータンパク質は、哺乳動物のタンパク質である。一部の実施形態では、これらの方法および試薬は、プレゼンタータンパク質および小分子と共に複合体を形成することによって、阻害または活性化の影響を受けやすい標的タンパク質を同定するのに有用であり得る。一部の実施形態では、これらの方法および試薬は、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質と共に複合体を形成することによって、標的タンパク質を阻害または活性化することができる化合物を同定することにおいて有用であり得る。化合物およびコンジュゲート
この開示は、タンパク質結合部分（例えば、プレゼンタータンパク質結合部分または標的タンパク質結合部分）および架橋基を含む化合物を提供する。本発明はまた、タンパク質にコンジュゲートしているタンパク質結合部分、例えば、標的タンパク質にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分、またはプレゼンタータンパク質にコンジュゲートしている標的タンパク質結合部分を含むコンジュゲートを特徴とする。
本発明はまた、化学式ＶＩＩの化合物Ａ－Ｌ－Ｂ
（化学式ＶＩＩ）
を特徴とし、化学式中、Ａは、化学式ＶＩＩＩの構造
を含む。
一部の実施形態では、本発明の化合物は、
である。
架橋基
一部の実施形態では、本発明の化合物は、架橋基を含む。架橋基は、タンパク質または他の分子上の特定の官能基（例えば、第一級アミン、スルフヒドリル）に化学的に付着することができる反応性官能基を含む基を指す。架橋基の例は、スルフヒドリル反応性架橋基（例えば、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、またはビニルスルホンを含む基）、アミン反応性架橋基（例えば、エステル、例えば、ＮＨＳエステル、イミドエステル、およびペンタフルオロフェニルエステル、またはヒドロキシメチルホスフィンを含む基）、カルボキシル反応性架橋基（例えば、第一級もしくは第二級アミン、アルコール、またはチオールを含む基）、カルボニル反応性架橋基（例えば、ヒドラジドまたはアルコキシアミンを含む基）、およびトリアゾール形成架橋基（例えば、アジドまたはアルキンを含む基）を含む。
例示的な架橋基は、２’－ピリジルジスルフィド、４’－ピリジルジスルフィドヨードアセチル、マレイミド、チオエステル、アルキルジスルフィド、アルキルアミンジスルフィド、ニトロ安息香酸ジスルフィド、無水物、ＮＨＳエステル、アルデヒド、塩化アルキル、アルキン、およびアジドを含む。
プレゼンタータンパク質結合部分
一部の実施形態では、本発明の化合物は、プレゼンタータンパク質結合部分を含む。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、提供される化合物が、たとえば、１０μＭ未満（たとえば、５μＭ未満、１μＭ未満、５００ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満）のＫＤで、前記プレゼンタータンパク質に特異的に結合するように、またはたとえば、１μＭ未満（たとえば、０．５μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０１μＭ未満）のＩＣ５０で、プレゼンタータンパク質のペプチジル－プロリルイソメラーゼ活性を阻害するように、プレゼンタータンパク質への結合に関与する原子（たとえば、５～２０個の原子、５～１０個の原子、１０～２０個の原子）およびそれらに結合された部分（たとえば、２０個の原子に含まれる原子、たとえば、１５個の原子に含まれる原子、１０個の原子に含まれる原子、５個の原子に含まれる原子）のグループを含み得る。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、プレゼンタータンパク質と相互作用する提供される化合物中の原子の全体を包含しない。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分の１個以上の原子は、プレゼンタータンパク質と相互作用しない。
いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、Ｎ－アシルプロリン部分、Ｎ－アシル－ピペコリン酸部分、Ｎ－アシル３－モルホリノカルボン酸部分、および／またはＮ－アシルピペラジン酸部分を含む（たとえば、いずれかの窒素原子がアシル化されている。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分はＮ－アシル－ピペコリン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分はＮ－アシルプロリン部分を含む。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分はＮ－アシル－３－モルホリノカルボン酸部分を含む。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分はＮ－アシルピペラジン酸部分を含む。
いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分の少なくとも１個の原子は、ＦＫＢＰ１２のＴｙｒ２７、Ｐｈｅ３７、Ａｓｐ３８、Ａｒｇ４１、Ｐｈｅ４７、Ｇｌｎ５４、Ｇｌｕ５５、Ｖａｌ５６、Ｉｌｅ５７、Ｔｒｐ６０、Ａｌａ８２、Ｔｒｙ８３、Ｈｉｓ８８、Ｉｌｅ９２、および／またはＰｈｅ１００の１つ以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）との結合に関与する。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分の少なくとも１つは、ＦＫＢＰ１２のＡｒｇ４１、Ｇｌｎ５４、Ｇｌｕ５５、および／またはＡｌａ８２の少なくとも１つ（たとえば、２、３、または４）との結合に関与する。
いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、化学式ＩＩ～ＩＶ：
で示される構造を有する。
一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質結合部分は、構造
またはその立体異性体を含むか、またはこれらからなる。
プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質結合部分における原子に結合することができる。代わりにまたはさらに、プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質結合部分における２個もしくはそれよりも多い原子に結合することができる。別の代替では、プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質結合部分における１個もしくは複数の原子に付着した置換基に結合することができる。さらに、一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質結合部分における原子に、およびプレゼンタータンパク質結合部分における１個もしくは複数の原子に付着している置換基に結合することができる。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、プレゼンタータンパク質の天然リガンドを模倣する基に結合し、ここで、プレゼンタータンパク質の天然リガンドを模倣する基は、プレゼンタータンパク質結合部分に付着している。一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質はプレゼンタータンパク質に結合し、二元複合体中のプレゼンタータンパク質についてのプレゼンタータンパク質の親和性は、複合体の非存在下でのプレゼンタータンパク質についてのプレゼンタータンパク質の親和性に対して増加する。このような例における結合は典型的には、これらに限定されないが、プレゼンタータンパク質結合部分へのプレゼンタータンパク質の非共有結合性相互作用による。
標的タンパク質結合部分
一部の実施形態では、本発明の化合物は、標的タンパク質結合部分（例えば、真核生物の標的タンパク質結合部分、例えば、哺乳動物の標的タンパク質結合部分または真菌の標的タンパク質結合部分または原核生物の標的タンパク質結合部分、例えば、細菌の標的タンパク質結合部分）を含む。一部の実施形態では、標的タンパク質結合部分は、原子の群（例えば、５～２０個の原子、５～１０個の原子、１０～２０個の原子）を含み、標的タンパク質に特異的に結合するそこに付着した任意の部分（例えば、２０個の原子以内の原子、１５個の原子以内の原子、１０個の原子以内の原子、５個の原子以内の原子）を含み得る。一部の実施形態では、標的タンパク質結合部分は、標的タンパク質と相互作用する、化合物中の複数個の原子を含む。ある特定の実施形態では、標的タンパク質結合部分の１個もしくは複数の原子は、標的タンパク質と相互作用しない。
標的タンパク質は、標的タンパク質結合部分中の原子に結合可能である。代替的にあるいはさらに、標的タンパク質は、標的タンパク質結合部分中の２つ以上の原子に結合可能である。他の選択肢として、標的タンパク質は、標的タンパク質結合部分中の１個以上の原子に結合された置換基に結合可能である。他の選択肢として、標的タンパク質は、標的タンパク質結合部分中の原子と、標的タンパク質結合部分中の１個以上の原子に結合された置換基と、に結合可能である。他の選択肢として、標的タンパク質は、標的タンパク質の天然リガンドを模倣する基に結合し、かつ標的タンパク質の天然リガンドを模倣する基は、標的タンパク質結合部分に結合する。さらに他の選択肢として、標的タンパク質はプレゼンタータンパク質に結合し、二元複合体でのプレゼンタータンパク質に対する標的タンパク質の親和性は、複合体の不在下でのプレゼンタータンパク質に対する標的タンパク質の親和性と対比して増加する。これらの例における結合は、典型的には、限定されるものではないが、標的タンパク質結合部分への標的タンパク質の非共有結合相互作用を介する。
リンカー
本発明の化合物は、タンパク質結合部分（例えば、プレゼンタータンパク質結合部分または標的タンパク質結合部分）を架橋基に接合するリンカー（例えば、部分リンカー）、またはタンパク質結合部分をタンパク質（例えば、プレゼンタータンパク質もしくは標的タンパク質）に接合するリンカーを含む。本発明のリンカー構成要素は、その最も単純なものでは、結合であるが、また、２つの部分を共有結合的に連結しているペンダント基を有する直鎖状、環状、または分岐状分子の骨格を提供し得る。
一部の実施形態では、リンカーの少なくとも１個の原子は、プレゼンタータンパク質および／または標的タンパク質への結合に関与している。ある特定の実施形態では、リンカーの少なくとも１個の原子は、プレゼンタータンパク質および／または標的タンパク質への結合に関与していない。
このように、リンカーは、本明細書に記載のような化合物および／またはコンジュゲート中に含まれるとき、いずれかの部分上に位置している１個もしくは複数の官能基との結合形成を伴う共有結合的手段によって２つ（もしくはそれ超）の部分の連結を達成する。この目的のために用い得る化学反応性官能基の例には、これらに限定されないが、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、炭水化物基、隣接ジオール、チオエーテル、２－アミノアルコール、２－アミノチオール、グアニジニル、イミダゾリル、およびフェノール基が含まれる。
一部の実施形態では、２つ以上の部分の共有結合は、両方の部分に存在するかかる官能基による反応が可能な反応性部分を含有するリンカーを用いて行いうる。たとえば、部分のアミン基は、リンカーのカルボキシル基またはその活性化誘導体と反応しうるので、２つを結合するアミドを形成する。
スルフヒドリル基と反応可能な部分の例としては、ＸＣＨ２ＣＯ－（式中、Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）タイプのα－ハロアセチル化合物が挙げられる。このタイプのものは、ガード（Ｇｕｒｄ）著、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１１巻、ｐ．５３２、１９６７年）に記載されるように、スルフヒドリル基に対して特定の反応性を示すだけでなく、イミダゾリル基、チオエーテル基、フェノール基、およびアミノ基を修飾するためにも使用可能である。Ｎ－マレイミド誘導体もまた、スルフヒドリル基に対して選択性があるとみなされるが、そのほかに、ある特定の条件下でアミノ基とのカップリングに有用でありうる。アミノ基の変換によりチオール基を導入する２－イミノチオランなどの試薬（トラウト（Ｔｒａｕｔ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１２巻、ｐ．３２６６、１９７３年）は、ジスルフィド架橋の形成により結合が行われる場合、スルフヒドリル試薬と見なしうる。
アミノ基と反応可能な反応性部分の例としては、たとえば、アルキル化剤およびアシル化剤が挙げられる。代表的なアルキル化剤としては、
（ｉ）α－ハロアセチル化合物、これは、たとえば、ウォング（Ｗｏｎｇ）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２４巻、ｐ．５３３７、１９７９年に記載されるように、反応性チオール基の不在下でアミノ基に対して特異性を示し、かつＸＣＨ２ＣＯ－（式中、Ｘ＝Ｂｒ、Ｃｌ、またはＩ）タイプである）、
（ｉｉ）Ｎ－マレイミド誘導体、これは、たとえば、スミス（Ｓｍｙｔｈ）ら著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第８２巻、ｐ．４６００、１９６０年、およびバイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、第９１巻、ｐ．５８９、１９６４年に記載されるように、マイケル型反応を介してまたは環カルボニル基への付加によるアシル化を介してアミノ基と反応しうる、
（ｉｉｉ）ハロゲン化アリール、たとえば、反応性ニトハロ芳香族化合物、
（ｉｖ）ハロゲン化アルキル、たとえば、マケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ら著、ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．）、第７巻、ｐ．５８１、１９８８年、
（ｖ）アミノ基とシッフ塩基を形成可能なアルデヒドおよびケトン、形成される付加物は、通常、還元により安定なアミンを与える、
（ｖｉ）エピクロロヒドリンやビスオキシランなどのエポキシド誘導体、これはアミノ基、スルフヒドリル基、またはフェノール性ヒドロキシル基と反応しうる、
（ｖｉｉ）ｓ－トリアジンの塩素含有誘導体類、これはアミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基などの求核剤に対して非常に反応性である、
（ｖｉｉｉ）以上に詳述したｓ－トリアジン化合物に基づくアジリジン、たとえば、ロス（Ｒｏｓｓ）著、ジャーナル・オブ・アドバンスト・キャンサー・リサーチ（Ｊ．Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）第２巻、ｐ．１、１９５４年に記載されており、これは開環によりアミノ基などの求核剤と反応する、
（ｉｘ）スクアリン酸ジエチルエステル、ティーツェ（Ｔｉｅｔｚｅ）著、ヘミッシェ・ベリヒテ（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．）、第１２４巻、ｐ．１２１５、１９９１年に記載されている、および
（ｘ）α－ハロアルキルエーテル、これはベネッシェ（Ｂｅｎｎｅｃｈｅ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、第２８巻、ｐ．４６３、１９９３年に記載されるように、エーテル酸素原子により引き起こされる活性化に起因して通常のハロゲン化アルキルよりも高反応性のアルキル化剤である、
が挙げられる。
代表的なアミノ反応性アシル化剤としては、
（ｉ）イソシアネートおよびイソチオシアネート、とくに芳香族誘導体、これはそれぞれ安定な尿素誘導体およびチオ尿素誘導体を形成する、
（ｉｉ）スルホニルクロリド、これはハージグ（Ｈｅｒｚｉｇ）ら著、バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）、第２巻、ｐ．３４９、１９６４年に記載されている、
（ｉｉｉ）酸ハロゲン化物、
（ｉｖ）活性エステル、たとえば、エステルニトロフェニルエステルまたはＮ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、
（ｖ）酸無水物、たとえば、混合型、対称型、またはΝ－カルボキシ無水物、
（ｖｉ）アミド結合形成用の他の有用な試薬、たとえば、Ｍ．ボダンスキー（Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ）著、ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ）、１９８４年に記載されている、
（ｖｉｉ）アシルアジド、このアジド基は、ウェッツ（Ｗｅｔｚ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第５８巻、ｐ．３４７、１９７４年に記載されるように、亜硝酸ナトリウムを用いて事前に形成されたヒドラジド誘導体から生成される、
（ｖｉｉｉ）イミドエステル、これは、たとえば、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）およびルドウィッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、第８４巻、ｐ．３４９１、１９６２年に記載されるように、アミノ基との反応により安定なアミジンを形成する、および
（ｉｘ）ハロヘテロアリール基、たとえば、ハロピリジンまたはハロピリミジン、
が挙げられる。
アルデヒドおよびケトンは、アミンと反応してシッフ塩基を形成しうるとともに、これは還元的アミノ化により有利に安定化しうる。アルコキシルアミノ部分は、たとえば、ウェブ（Ｗｅｂｂ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、第１巻、ｐ．９６、１９９０年に記載されるように、ケトンおよびアルデヒドと容易に反応して安定なアルコキサミンを生成する。
カルボキシル基と反応可能な反応性部分の例としては、ジアゾアセテートエステルやジアゾアセトアミドなどのジアゾ化合物が挙げられる。これは、たとえば、ヘリオット（Ｈｅｒｒｉｏｔ）著、アドバンス・イン・プロテイン・ケミストリー（Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．）、第３巻、ｐ．１６９、１９４７年に記載されるように、高い特異性で反応してエステル基を生成する。Ｏ－アシルウレア形成およびそれに続くアミド結合形成により反応するカルボジイミドなどのカルボキシル修飾試薬も利用可能である。
たとえば、追加の反応性または選択性を付与するために、所望により、いずれかの部分の官能基を反応前に他の官能基に変換しうることは、分かるであろう。この目的に有用な方法の例としては、ジカルボン酸無水物などの試薬を用いたアミンかカルボキシルへの変換、Ｎ－アセチルホモシステインチオラクトン、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物、２－イミノチオラン、チオール含有スクシンイミジル誘導体などの試薬を用いたアミンからチオールへの変換、α－ハロアセテートなどの試薬を用いたチオールからカルボキシルへの変換、エチレンイミンや２－ブロモエチルアミンなどの試薬を用いたチオールからアミンへの変換、カルボジイミドおよび続いてジアミンなどの試薬を用いたカルボキシルからアミンへの変換、ならびに塩化トシルなどの試薬を用いたアルコールからチオールへの変換、および続いてチオアセテートを用いたエステル交換、および酢酸ナトリウムを用いたチオールへの加水分解が挙げられる。
所望により、本発明に従って、追加の結合材料を導入することなく一方の部分の反応性化学基と他方の部分の反応性化学基とを直接共有結合することを含むいわゆるゼロレングスリンカーを使用しうる。
しかしながら、より一般的には、リンカーは、以上に記載のようにスペーサエレメントにより接続された２つ以上の反応性部分を含む。かかるスペーサの存在は、二官能性リンカーをいずれかの部分内の特定の官能基と反応させて２つの間に共有結合を生成する。リンカー中の反応性部分は、同一であっても（ホモ二官能性リンカー）異なっていてもよく（ヘテロ二官能性リンカーまたはいくつかの類似していない反応性部分が存在する場合は多官能性リンカー）、２つの部分間に共有結合を生成しうるさまざまな可能性のある試薬を提供する。
リンカー中のスペーサエレメントは、典型的には、直鎖または分岐鎖からなり、Ｃ１～１０アルキル、Ｃ２～１０アルケニル、Ｃ２～１０アルキニル、Ｃ２～６ヘテロシクリル、Ｃ６～１２アリール、Ｃ７～１４アルカリール、Ｃ３～１０アルクヘテロシクリル、Ｃ２～Ｃ１００ポリエチレングリコール、またはＣ１～１０ヘテロアルキルを含みうる。
いくつかの場合には、リンカーは化学式Ｖにより記述される。
本発明のコンジュゲートの調製に有用なホモ二官能性リンカーの例としては、限定されるものではないが、エチレンジアミン、プロピレンジアミンおよびヘキサメチレンジアミン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、シクロヘキサンジオール、およびポリカプロラクトンジオールから選択されるジアミンおよびジオールが挙げられる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、結合であるか、または炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、もしくはリン原子から独立して選択される１０個までの原子の直鎖であり、鎖中の各原子は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、クロロ、ヨード、ブロモ、フルオロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、カルボキサミド、シアノ、オキソ、チオ、アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、ホスホリル、およびスルホニルから独立して選択される１個以上の置換基で任意選択的に置換され、かつ鎖中の任意の２個の原子は、それらに結合された置換基と一緒になって環を形成しうるとともに、環は、さらなる置換および／または１つ以上の任意選択的に置換された炭素環、ヘテロ環、アリール環、またはヘテロアリール環への融合を行いうる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、化学式ＸＩＸ：
Ａ１－（Ｂ１）ａ－（Ｃ１）ｂ－（Ｂ２）ｃ－（Ｄ）－（Ｂ３）ｄ－（Ｃ２）ｅ－（Ｂ４）ｆ－Ａ２
化学式ＸＩＸ
（式中、Ａ１は、リンカーとプレゼンタータンパク質結合部分との間の結合であり、Ａ２は、哺乳動物標的相互作用部分とリンカーとの間の結合であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４は、それぞれ独立して、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ２アルキル、任意選択的に置換されたＣ１～Ｃ３ヘテロアルキル、Ｏ、Ｓ、およびＮＲＮから選択され、ＲＮは、水素、任意選択的に置換されたＣ１～４アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～４アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～４アルキニル、任意選択的に置換されたＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択的に置換されたＣ６～１２アリール、または任意選択的に置換されたＣ１～７ヘテロアルキルであり、Ｃ１およびＣ２は、それぞれ独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルから選択され、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、それぞれ独立して、０または１であり、ならびにＤは、任意選択的に置換されたＣ１～１０アルキル、任意選択的に置換されたＣ２～１０アルケニル、任意選択的に置換されたＣ２～１０アルキニル、任意選択的に置換されたＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択的に置換されたＣ６～１２アリール、任意選択的に置換されたＣ２～Ｃ１０ポリエチレングリコール、もしくは任意選択的に置換されたＣ１～１０ヘテロアルキル、またはＡ１－（Ｂ１）ａ－（Ｃ１）ｂ－（Ｂ２）ｃ－と－（Ｂ３）ｄ－（Ｃ２）ｅ－（Ｂ４）ｆ－Ａ２とを結合する化学結合である）の構造を有する。
タンパク質
プレゼンタータンパク質
プレゼンタータンパク質は、低分子に結合して複合体を形成しうるとともに、この複合体は、標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）に結合してその活性をモジュレートしうる。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は哺乳動物プレゼンタータンパク質（たとえば、ヒトプレゼンタータンパク質）である。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は菌類プレゼンタータンパク質である。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は細菌プレゼンタータンパク質である。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は植物プレゼンタータンパク質である。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、比較的豊富なタンパク質である（たとえば、プレゼンタータンパク質は、トリパータイト複合体への関与が細胞内でのプレゼンタータンパク質の生物的役割および／または細胞の生存能もしくは他の属性に実質的に悪影響を及ぼさない程度に十分に豊富である）。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質はより豊富な標的タンパク質である。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、細胞内でシャペロン活性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、細胞内の複数の天然相互作用パートナーを有する。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、標的タンパク質に結合してその生物学的活性モジュレートことが知られているかまたはそのように推定される二元複合体を形成するように低分子に結合することが知られているものである。イムノフィリンは、こうした機能を有することが知られるプレゼンタータンパク質のクラスであり、ＦＫＢＰおよびシクロフィリンを含む。いくつかの実施形態では、参照プレゼンタータンパク質は、ペプチジルプロリルイソメラーゼ活性を呈する。いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、参照プレゼンタータンパク質に対して同等の活性を呈する。ある特定の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、ＦＫＢＰファミリーのメンバー（たとえば、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１２．６、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ１９、ＦＫＢＰ２２、ＦＫＢＰ２３、ＦＫＢＰ２５、ＦＫＢＰ３６、ＦＫＢＰ３８、ＦＫＢＰ５１、ＦＫＢＰ５２、ＦＫＢＰ６０、ＦＫＢＰ６５、およびＦＫＢＰ１３３）、シクロフィリンファミリーのメンバー（たとえば、ＰＰ１Ａ、ＣＹＰＢ、ＣＹＰＣ、ＣＹＰ４０、ＣＹＰＥ、ＣＹＰＤ、ＮＫＴＲ、ＳＲＣｙｐ、ＣＹＰＨ、ＣＷＣ２７、ＣＹＰＬ１、ＣＹＰ６０、ＣＹＰＪ、ＰＰＩＬ４、ＰＰＩＬ６、ＲＡＮＢＰ２、ＰＰＷＤ１、ＰＰＩＡＬ４Ａ、ＰＰＩＡＬ４Ｂ、ＰＰＩＡＬ４Ｃ、ＰＰＩＡＬ４Ｄ、もしくはＰＰＩＡＬ４Ｇ）、またはＰＩＮ１である。「ＦＫＢＰファミリー」は、プロリルイソメラーゼ活性を有するタンパク質のファミリーであり、プロリン残基を含有するタンパク質に対してタンパク質のフォールディングシャペロンとして機能する。このファミリーのタンパク質をコードする遺伝子としては、ＡＩＰ、ＡＩＰＬ１、ＦＫＢＰ１Ａ、ＦＫＢＰ１Ｂ、ＦＫＢＰ２、ＦＫＢＰ３、ＦＫＢＰ４、ＦＫＢＰ５、ＦＫＢＰ６、ＦＫＢＰ７、ＦＫＢＰ８、ＦＫＢＰ９、ＦＫＢＰ９Ｌ、ＦＫＢＰ１０、ＦＫＢＰ１１、ＦＫＢＰ１４、ＦＫＢＰ１５、およびＬＯＣ５４１４７３が挙げられる。
「シクロフィリンファミリー」は、シクロスポリンに結合するタンパク質のファミリーである。このファミリーのタンパク質をコードする遺伝子としては、ＰＰＩＡ、ＰＰＩＢ、ＰＰＩＣ、ＰＰＩＤ、ＰＰＩＥ、ＰＰＩＦ、ＰＰＩＧ、ＰＰＩＨ、ＳＤＣＣＡＧ－１０、ＰＰＩＬ１、ＰＰＩＬ２、ＰＰＩＬ３、ＰＰＩＬ４、Ｐ２７０、ＰＰＷＤ１、およびＣＯＡＳ－２が挙げられる。例示的なシクロフィリンとしては、ＰＰ１Ａ、ＣＹＰＢ、ＣＹＰＣ、ＣＹＰ４０、ＣＹＰＥ、ＣＹＰＤ、ＮＫＴＲ、ＳＲＣｙｐ、ＣＹＰＨ、ＣＷＣ２７、ＣＹＰＬ１、ＣＹＰ６０、ＣＹＰＪ、ＰＰＩＬ４、ＰＰＩＬ６、ＲＡＮＢＰ２、ＰＰＷＤ１、ＰＰＩＡＬ４Ａ、ＰＰＩＡＬ４Ｂ、ＰＰＩＡＬ４Ｃ、ＰＰＩＡＬ４Ｄ、およびＰＰＩＡＬ４Ｇが挙げられる。
一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、シャペロンタンパク質、例えば、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、カルネキシン、カルレティキュリン、ＨＳＰ４７、ＥＲｐ２９、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、およびＥＲｐ５７である。
一部の実施形態では、プレゼンタータンパク質は、本明細書において開示されているＦＫＢＰまたはシクロフィリンの対立遺伝子変異体またはスプライス変異体である。
いくつかの実施形態では、プレゼンタータンパク質は、アミノ酸配列が、ｉ）参照プレゼンタータンパク質のものとの有意な同一性を示し、ｉｉ）参照プレゼンタータンパク質の対応する部分との有意な同一性を示す部分を含み、および／またはｉｉｉ）プレゼンタータンパク質に見いだされる少なくとも１つの特徴的配列を含む、ポリペプチドである。多くの実施形態では、同一性は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であれば、プレゼンタータンパク質を定義する目的では「有意」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、有意な同一性を示す部分は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、３５０、４５０、５００、５５０、６００個、またはそれ以上のアミノ酸の長さを有する。
代表的なプレゼンタータンパク質は、表１に列挙された遺伝子またはそのホモログによりコードされる。いくつかの実施形態では、参照プレゼンタータンパク質は、表１に示される遺伝子セットによりコードされる。また、当業者であれば、表１を参照して、プレゼンタータンパク質全般および／またはプレゼンタータンパク質の特定のサブセットに特徴的な配列を容易に同定可能である。
標的タンパク質
標的タンパク質（たとえば、哺乳動物標的タンパク質や菌類標的タンパク質などの真核生物標的タンパク質または細菌標的タンパク質などの原核生物標的タンパク質）は、疾患病態または疾患病態の症状を媒介するタンパク質である。このため、その活性をモジュレート（阻害または増加）することにより、望ましい治療効果は達成することが可能である。本発明の複合体および方法に有用な標的タンパク質としては、天然ではプレゼンタータンパク質に関連しないもの、たとえば、本発明の化合物との二元複合体の不在下でプレゼンタータンパク質に対して１μＭ超、好ましくは５μＭ超、より好ましくは１０μＭ超の親和性を有するものが挙げられる。代替的に、天然ではプレゼンタータンパク質に関連しない標的タンパク質は、二元複合体の不在下で本発明の化合物に対して１μＭ超、好ましくは５μＭ超、より好ましくは１０μＭ超の親和性を有するものである。他の選択肢として、天然ではプレゼンタータンパク質に関連しない標的タンパク質は、シクロスポリン、ラパマイシン、またはＦＫ５０６と、プレゼンタータンパク質と、の二元複合体に対して１μＭ超、好ましくは５μＭ超、より好ましくは１０μＭ超の親和性を有するもの（たとえば、ＦＫＢＰ）である。さらに他の選択肢として、天然ではプレゼンタータンパク質に関連しない標的タンパク質は、カルシニューリンやｍＴＯＲ以外のものである。本発明の複合体および方法に好適な標的タンパク質の選択は、プレゼンタータンパク質に依存しうる。たとえば、シクロフィリンに対して低親和性を有する標的タンパク質は、ＦＫＢＰに対して高親和性を有することもあり、その場合は後者と一緒には使用されないであろう。
標的タンパク質は、天然に存在可能であり、たとえば、野生型でありうる。代替的に、標的タンパク質は、野生型タンパク質と異なりうるが、生物学的機能、たとえば、対立遺伝子変異体、スプライス突然変異体、または生物学的活性断片を依然として維持する。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はコイルドコイル構造を有する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質はダイマー複合体の一方のタンパク質である。
いくつかの実施形態では、本発明の標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質／化合物複合体の形成の不在下で低分子が典型的にはその部位に対して低いまたは検出不能な結合を示すことを特徴とする１つ以上の表面部位（たとえばフラット表面部位）を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質／化合物複合体の形成の不在下で特定の低分子（たとえば化合物）が低いまたは検出不能な結合（たとえば、同一の化合物を含むプレゼンタータンパク質／化合物複合体で観測される結合の多くとも１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／１００、またはそれ以下の結合）を示す１つ以上の表面部位（たとえばフラット表面部位）を含む。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、いずれの従来型の結合ポケットも欠如した、たとえば、１つ以上の低分子により活性がモジュレートされたタンパク質に匹敵する生理化学的および／または幾何学的な性質を有するタンパク質構造上のキャビティやポケットが欠如した１つ以上の部位により特徴付けられる表面（いくつかの実施形態では全表面）を有する。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、タンパク質－タンパク質相互作用に適した従来型の結合ポケットおよび部位を有する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、アンドラッガブル標的であり、たとえば、標的タンパク質は、薬剤の標的となることが知られているタンパク質ファミリーのメンバーではなく、かつ／または低分子への結合に好適であると期待される（たとえば、本明細書で考察されるように当技術分野で認められた理解に従って）結合部位を有していない。一部の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１個の反応性システインを含む。
いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＧＴＰアーゼ、たとえば、ＤＩＲＡＳ１、ＤＩＲＡＳ２、ＤＩＲＡＳ３、ＥＲＡＳ、ＧＥＭ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＭＲＡＳ、ＮＫＩＲＡＳ１、ＮＫＩＲＡＳ２、ＮＲＡＳ、ＲＡＬＡ、ＲＡＬＢ、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＰ１Ｂ、ＲＡＰ２Ａ、ＲＡＰ２Ｂ、ＲＡＰ２Ｃ、ＲＡＳＤ１、ＲＡＳＤ２、ＲＡＳＬ１０Ａ、ＲＡＳＬ１０Ｂ、ＲＡＳＬ１１Ａ、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＲＡＳＬ１２、ＲＥＭ１、ＲＥＭ２、ＲＥＲＧ、ＲＥＲＧＬ、ＲＲＡＤ、ＲＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＢＴＢ１、ＲＨＯＢＴＢ２、ＲＨＯＢＴＢ３、ＲＨＯＣ、ＲＨＯＤ、ＲＨＯＦ、ＲＨＯＧ、ＲＨＯＨ、ＲＨＯＪ、ＲＨＯＱ、ＲＨＯＵ、ＲＨＯＶ、ＲＮＤ１、ＲＮＤ２、ＲＮＤ３、ＲＡＣ１、ＲＡＣ２、ＲＡＣ３、ＣＤＣ４２、ＲＡＢ１Ａ、ＲＡＢ１Ｂ、ＲＡＢ２、ＲＡＢ３Ａ、ＲＡＢ３Ｂ、ＲＡＢ３Ｃ、ＲＡＢ３Ｄ、ＲＡＢ４Ａ、ＲＡＢ４Ｂ、ＲＡＢ５Ａ、ＲＡＢ５Ｂ、ＲＡＢ５Ｃ、ＲＡＢ６Ａ、ＲＡＢ６Ｂ、ＲＡＢ６Ｃ、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＢ７Ｂ、ＲＡＢ７Ｌ１、ＲＡＢ８Ａ、ＲＡＢ８Ｂ、ＲＡＢ９、ＲＡＢ９Ｂ、ＲＡＢＬ２Ａ、ＲＡＢＬ２Ｂ、ＲＡＢＬ４、ＲＡＢ１０、ＲＡＢ１１Ａ、ＲＡＢ１１Ｂ、ＲＡＢ１２、ＲＡＢ１３、ＲＡＢ１４、ＲＡＢ１５、ＲＡＢ１７、ＲＡＢ１８、ＲＡＢ１９、ＲＡＢ２０、ＲＡＢ２１、ＲＡＢ２２Ａ、ＲＡＢ２３、ＲＡＢ２４、ＲＡＢ２５、ＲＡＢ２６、ＲＡＢ２７Ａ、ＲＡＢ２７Ｂ、ＲＡＢ２８、ＲＡＢ２Ｂ、ＲＡＢ３０、ＲＡＢ３１、ＲＡＢ３２、ＲＡＢ３３Ａ、ＲＡＢ３３Ｂ、ＲＡＢ３４、ＲＡＢ３５、ＲＡＢ３６、ＲＡＢ３７、ＲＡＢ３８、ＲＡＢ３９、ＲＡＢ３９Ｂ、ＲＡＢ４０Ａ、ＲＡＢ４０ＡＬ、ＲＡＢ４０Ｂ、ＲＡＢ４０Ｃ、ＲＡＢ４１、ＲＡＢ４２、ＲＡＢ４３、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＰ１Ｂ、ＲＡＰ２Ａ、ＲＡＰ２Ｂ、ＲＡＰ２Ｃ、ＡＲＦ１、ＡＲＦ３、ＡＲＦ４、ＡＲＦ５、ＡＲＦ６、ＡＲＬ１、ＡＲＬ２、ＡＲＬ３、ＡＲＬ４、ＡＲＬ５、ＡＲＬ５Ｃ、ＡＲＬ６、ＡＲＬ７、ＡＲＬ８、ＡＲＬ９、ＡＲＬ１０Ａ、ＡＲＬ１０Ｂ、ＡＲＬ１０Ｃ、ＡＲＬ１１、ＡＲＬ１３Ａ、ＡＲＬ１３Ｂ、ＡＲＬ１４、ＡＲＬ１５、ＡＲＬ１６、ＡＲＬ１７、ＴＲＩＭ２３、ＡＲＬ４Ｄ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＬ１３Ｂ、ＲＡＮ、ＲＨＥＢ、ＲＨＥＢＬ１、ＲＲＡＤ、ＧＥＭ、ＲＥＭ、ＲＥＭ２、ＲＩＴ１、ＲＩＴ２、ＲＨＯＴ１、またはＲＨＯＴ２である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質、たとえば、ＮＦ１、ＩＱＧＡＰ１、ＰＬＥＸＩＮ－Ｂ１、ＲＡＳＡＬ１、ＲＡＳＡＬ２、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＡＰ８、ＡＲＨＧＡＰ１２、ＡＲＨＧＡＰ２２、ＡＲＨＧＡＰ２５、ＢＣＲ、ＤＬＣ１、ＤＬＣ２、ＤＬＣ３、ＧＲＡＦ、ＲＡＬＢＰ１、ＲＡＰ１ＧＡＰ、ＳＩＰＡ１、ＴＳＣ２、ＡＧＡＰ２、ＡＳＡＰ１、またはＡＳＡＰ３である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、グアニンヌクレオチド交換因子、たとえば、ＣＮＲＡＳＧＥＦ、ＲＡＳＧＥＦ１Ａ、ＲＡＳＧＲＦ２、ＲＡＳＧＲＰ１、ＲＡＳＧＲＰ４、ＳＯＳ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＧＬ１、ＲＧＬ２、ＲＧＲ、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＳＥＦ／ＡＲＨＧＥＦ４、ＡＳＥＦ２、ＤＢＳ、ＥＣＴ２、ＧＥＦ－Ｈ１、ＬＡＲＧ、ＮＥＴ１、ＯＢＳＣＵＲＩＮ、Ｐ－ＲＥＸ１、Ｐ－ＲＥＸ２、ＰＤＺ－ＲＨＯＧＥＦ、ＴＥＭ４、ＴＩＡＭ１、ＴＲＩＯ、ＶＡＶ１、ＶＡＶ２、ＶＡＶ３、ＤＯＣＫ１、ＤＯＣＫ２、ＤＯＣＫ３、ＤＯＣＫ４、ＤＯＣＫ８、ＤＯＣＫ１０、Ｃ３Ｇ、ＢＩＧ２／ＡＲＦＧＥＦ２、ＥＦＡ６、ＦＢＸ８またはＧＥＰ１００である。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、タンパク質－タンパク質相互作用ドメインを有するタンパク質、たとえば、ＡＲＭ、ＢＡＲ、ＢＥＡＣＨ、ＢＨ、ＢＩＲ、ＢＲＣＴ、ＢＲＯＭＯ、ＢＴＢ、Ｃ１、Ｃ２、ＣＡＲＤ、ＣＣ、ＣＡＬＭ、ＣＨ、ＣＨＲＯＭＯ、ＣＵＥ、ＤＥＡＴＨ、ＤＥＤ、ＤＥＰ、ＤＨ、ＥＦ－ｈａｎｄ、ＥＨ、ＥＮＴＨ、ＥＶＨ１、Ｆ－ｂｏｘ、ＦＥＲＭ、ＦＦ、ＦＨ２、ＦＨＡ、ＦＹＶＥ、ＧＡＴ、ＧＥＬ、ＧＬＵＥ、ＧＲＡＭ、ＧＲＩＰ、ＧＹＦ、ＨＥＡＴ、ＨＥＣＴ、ＩＱ、ＬＲＲ、ＭＢＴ、ＭＨ１、ＭＨ２、ＭＩＵ、ＮＺＦ、ＰＡＳ、ＰＢ１、ＰＤＺ、ＰＨ、ＰＯＬＯ－Ｂｏｘ、ＰＴＢ、ＰＵＦ、ＰＷＷＰ、ＰＸ、ＲＧＳ、ＲＩＮＧ、ＳＡＭ、ＳＣ、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＯＣＳ、ＳＰＲＹ、ＳＴＡＲＴ、ＳＷＩＲＭ、ＴＩＲ、ＴＰＲ、ＴＲＡＦ、ＳＮＡＲＥ、ＴＵＢＢＹ、ＴＵＤＯＲ、ＵＢＡ、ＵＥＶ、ＵＩＭ、ＶＨＬ、ＶＨＳ、ＷＤ４０、ＷＷ、ＳＨ２、ＳＨ３、ＴＲＡＦ、ブロモドメイン、またはＴＰＲである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、熱ショックタンパク質、たとえば、Ｈｓｐ２０、Ｈｓｐ２７、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ８４、αＢクリスタリン、ＴＲＡＰ－１、ｈｓｆｌ、またはＨｓｐ９０である。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、イオンチャネル、たとえば、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ３．２、ＩＫＡＣｈ、Ｋｖ１．５、ＴＲＰＡ１、ＮＡｖ１．７、Ｎａｖ１．８、Ｎａｖ１．９、Ｐ２Ｘ３、またはＰ２Ｘ４である。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、コイルドコイルタンパク質、たとえば、ジェミニン、ＳＰＡＧ４、ＶＡＶ１、ＭＡＤ１、ＲＯＣＫ１、ＲＮＦ３１、ＮＥＤＰ１、ＨＣＣＭ、ＥＥＡ１、ビメンチン、ＡＴＦ４、Ｎｅｍｏ、ＳＮＡＰ２５、シンタキシン１ａ、ＦＹＣＯ１、またはＣＥＰ２５０である。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、キナーゼで、たとえば、ＣｙｃｌｉｎＤ１、ＡＢＬ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＢＴＫ、ＥＧＦＲ、ＦＭＳ、ＦＡＫ、ＦＧＦＲ１、２、３、４、ＦＬＴ３、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＮＳＲ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＥＴＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＯＳ、ＳＲＣ、ＳＹＫ、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＫＤＲ、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＰＤＫ１、ＰＫＣ、ＲＨＯ、ＲＯＣＫ１、ＲＳＫ１、ＲＫＳ２、ＲＫＳ３、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１０、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＫ３、ＥＲＫ４、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＫ３Ｂ、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ３、ＡｕｒＡ、ＡｕｒＢ、ＰＬＫ１、ＰＬＫ２、ＰＬＫ３、ＰＬＫ４、ＩＫＫ、ＫＩＮ１、ｃＲａｆ、ＰＫＮ３、ｃ－Ｓｒｃ、Ｆａｋ、ＰｙＫ２、またはＡＭＰＫある。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ホスファターゼ、たとえば、ＷＩＰ１、ＳＨＰ２、ＳＨＰ１、ＰＲＬ－３、ＰＴＰ１Ｂ、またはＳＴＥＰである。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（例えば、ＮＥＤＤ８、ＡＴＧ８タンパク質、ＳＵＭＯタンパク質、ＩＳＧ１５）、活性化酵素（Ｅ１、例えば、ＵＢＡ１、ＵＢＡ２、ＵＢＡ３、ＵＢＡ５、ＵＢＡ６、ＵＢＡ７、ＡＴＧ７、ＮＡＥ１、ＳＡＥ１）、コンジュゲーション酵素（Ｅ２、例えば、ＵＢＥタンパク質、ＡＴＧ３、ＢＩＲＣ６）、ライゲーション酵素（Ｅ３、例えば、ＢＭＩ－１、ＭＤＭ２、ＮＥＤＤ４－１、ベータ－ＴＲＣＰ、ＳＫＰ２、Ｅ６ＡＰ、ＣＢＬ－Ｂ、もしくはＡＰＣ／Ｃ）、およびユビキチンまたはユビキチン様タンパク質プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、クロマチンモディファイヤー／リモデラー、たとえば、遺伝子ＢＲＧ１、ＢＲＭ、ＡＴＲＸ、ＰＲＤＭ３、ＡＳＨ１Ｌ、ＣＢＰ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＭＬＬ、ＮＳＤ１、ＳＥＴＤ２、ＥＰ３００、ＫＡＴ２ＡまたはＣＲＥＢＢＰによってコードされるクロマチンモディファイヤー／リモデラーである。いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、転写因子、たとえば、遺伝子ＥＨＦ、ＥＬＦ１、ＥＬＦ３、ＥＬＦ４、ＥＬＦ５、ＥＬＫ１、ＥＬＫ３、ＥＬＫ４、ＥＲＦ、ＥＲＧ、ＥＴＳ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ２、ＥＴＶ３、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＦＥＶ、ＦＬＩ１、ＧＡＶＰＡ、ＳＰＤＥＦ、ＳＰＩ１、ＳＰＩＣ、ＳＰＩＢ、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ２、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ４、Ｅ２Ｆ７、Ｅ２Ｆ８、ＡＲＮＴＬ、ＢＨＬＨＡ１５、ＢＨＬＨＢ２、ＢＨＬＢＨＢ３、ＢＨＬＨＥ２２、ＢＨＬＨＥ２３、ＢＨＬＨＥ４１、ＣＬＯＣＫ、ＦＩＧＬＡ、ＨＡＳ５、ＨＥＳ７、ＨＥＹ１、ＨＥＹ２、ＩＤ４、ＭＡＸ、ＭＥＳＰ１、ＭＬＸ、ＭＬＸＩＰＬ、ＭＮＴ、ＭＳＣ、ＭＹＦ６、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＨＬＨ１、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、ＯＬＩＧ３、ＳＲＥＢＦ２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ４、ＴＦＡＰ４、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＥＣ、ＵＳＦ１、ＡＲＦ４、ＡＴＦ７、ＢＡＴＦ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＢＰＤ、ＣＥＢＰＧ、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＤＢＰ、ＨＬＦ、ＪＤＰ２、ＭＡＦＦ、ＭＡＦＧ、ＭＡＦＫ、ＮＲＬ、ＮＦＥ２、ＮＦＩＬ３、ＴＥＦ、ＸＢＰ１、ＰＲＯＸ１、ＴＥＡＤ１、ＴＥＡＤ３、ＴＥＡＤ４、ＯＮＥＣＵＴ３、ＡＬＸ３、ＡＬＸ４、ＡＲＸ、ＢＡＲＨＬ２、ＢＡＲＸ、ＢＳＸ、ＣＡＲＴ１、ＣＤＸ１、ＣＤＸ２、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ３、ＤＬＸ４、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＤＭＢＸ１、ＤＰＲＸ、ＤＲＧＸ、ＤＵＸＡ、ＥＭＸ１、ＥＭＸ２、ＥＮ１、ＥＮ２、ＥＳＸ１、ＥＶＸ１、ＥＶＸ２、ＧＢＸ１、ＧＢＸ２、ＧＳＣ、ＧＳＣ２、ＧＳＸ１、ＧＳＸ２、ＨＥＳＸ１、ＨＭＸ１、ＨＭＸ２、ＨＭＸ３、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＯＭＥＺ、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡＢ１３、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＣ１０、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１２、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ１３、ＨＯＸＤ８、ＩＲＸ２、ＩＲＸ５、ＩＳＬ２、ＩＳＸ、ＬＢＸ２、ＬＨＸ２、ＬＨＸ６、ＬＨＸ９、ＬＭＸ１Ａ、ＬＭＸ１Ｂ、ＭＥＩＳ１、ＭＥＩＳ２、ＭＥＩＳ３、ＭＥＯＸ１、ＭＥＯＸ２、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＮＫＸ２－３、ＮＫＸ２－８、ＮＫＸ３－１、ＮＫＸ３－２、ＮＫＸ６－１、ＮＫＸ６－２、ＮＯＴＯ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＯＮＥＣＵＴ２、ＯＴＸ１、ＯＴＸ２、ＰＤＸ１、ＰＨＯＸ２Ａ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ３、ＰＫＮＯＸ１、ＰＲＯＰ１、ＰＲＲＸ１、ＰＲＲＸ２、ＲＡＸ、ＲＡＸＬ１、ＲＨＯＸＦ１、ＳＨＯＸ、ＳＨＯＸ２、ＴＧＩＦ１、ＴＧＩＦ２、ＴＧＩＦ２ＬＸ、ＵＮＣＸ、ＶＡＸ１、ＶＡＸ２、ＶＥＮＴＸ、ＶＳＸ１、ＶＳＸ２、ＣＵＸ１、ＣＵＸ２、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ１、ＰＯＵ２Ｆ２、ＰＯＵ２Ｆ３、ＰＯＵ３Ｆ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＰＯＵ３Ｆ３、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ１、ＰＯＵ４Ｆ２、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＯＵ５Ｆ１Ｐ１、ＰＯＵ６Ｆ２、ＲＦＸ２、ＲＦＸ３、ＲＦＸ４、ＲＦＸ５、ＴＦＡＰ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＧＲＨＬ１、ＴＦＣＰ２、ＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ、ＮＦＩＸ、ＧＣＭ１、ＧＣＭ２、ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ４、ＨＳＦＹ２、ＥＢＦ１、ＩＲＦ３、ＩＲＦ４、ＩＲＦ５、ＩＲＦ７、ＩＲＦ８、ＩＲＦ９、ＭＥＦ２Ａ、ＭＥＦ２Ｂ、ＭＥＦ２Ｄ、ＳＲＦ、ＮＲＦ１、ＣＰＥＢ１、ＧＭＥＢ２、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＳＭＡＤ３、ＣＥＮＰＢ、ＰＡＸ１、ＰＡＸ２、ＰＡＸ９、ＰＡＸ３、ＰＡＸ４、ＰＡＸ５、ＰＡＸ６、ＰＡＸ７、ＢＣＬ６Ｂ、ＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３、ＥＧＲ４、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩ２、ＧＬＩＳ３、ＨＩＣ２、ＨＩＮＦＰ１、ＫＬＦ１３、ＫＬＦ１４、ＫＬＦ１６、ＭＴＦ１、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ４、ＳＣＲＴ１、ＳＣＲＴ２、ＳＮＡＩ２、ＳＰ１、ＳＰ３、ＳＰ４、ＳＰ８、ＹＹ１、ＹＹ２、ＺＢＥＤ１、ＺＢＴＢ７Ａ、ＺＢＴＢ７Ｂ、ＺＢＴＢ７Ｃ、ＺＩＣ１、ＺＩＣ３、ＺＩＣ４、ＺＮＦ１４３、ＺＮＦ２３２、ＺＮＦ２３８、ＺＮＦ２８２、ＺＮＦ３０６、ＺＮＦ４１０、ＺＮＦ４３５、ＺＢＴＢ４９、ＺＮＦ５２４、ＺＮＦ７１３、ＺＮＦ７４０、ＺＮＦ７５Ａ、ＺＮＦ７８４、ＺＳＣＡＮ４、ＣＴＣＦ、ＬＥＦ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１４、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ７、ＳＯＸ８、ＳＯＸ９、ＳＲＹ、ＴＣＦ７Ｌ１、ＦＯＸ０３、ＦＯＸＢ１、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＣ２、ＦＯＸＤ２、ＦＯＸＤ３、ＦＯＸＧ１、ＦＯＸＩ１、ＦＯＸＪ２、ＦＯＸＪ３、ＦＯＸＫ１、Ｆ
ＯＸＬ１、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＯ６、ＦＯＸＰ３、ＥＯＭＥＳ、ＭＧＡ、ＮＦＡＴ５、ＮＦＡＴＣ１、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＴΡ６３、ＲＵＮＸ２、ＲＵＮＸ３、Ｔ、ＴＢＲ１、ＴΒΧ１、ＴΒΧ１５、ＴΒΧ１９、ＴΒΧ２、ＴΒΧ２０、ＴΒΧ２１、ＴΒΧ４、ＴΒΧ５、ＡＲ、ＥＳＲ１、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ２、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＲＧ、ＲＯＲＡ、ＲＸＲＡ、ＲＸＲＢ、ＲＸＲＧ、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、ＶＤＲ、ＧＡＴＡ３、ＧＡＴＡ４またはＧＡＴＡ５、またはＣ－ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｓｔａｔ３、Ｓｔａｔ４、Ｓｔａｔ６、アンドロゲンレセプター、Ｃ－Ｊｕｎ、Ｃ－Ｆｏｘ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、ＭＩＴＦ、Ｈｉｆ－１α、Ｈｉｆ－２α、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ｆ１、ＮＦ－κＢ、Ｓｔａｔ５、またはＥＲ（ｃｏａｃｔ）によりコードされる転写因子である。ある特定の実施形態では、標的タンパク質は、ＴｒｋＡ、Ｐ２Ｙ１４およびｍＰＥＧＳ、ＡＳＫ１、ＡＬＫ、Ｂｃｌ－２、ＢＣＬ－ＸＬ、ｍＳＩＮ１、ＲＯＲγｔ、ＩＬ１７ＲＡ、ｅＩＦ４Ｅ、ＴＬＲ７Ｒ、ＰＣＳＫ９、ＩｇＥＲ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｓｈｎ－３、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＩＬ３１ＲＡ、ＯＳＭＲ、ＩＬ１２ｂｅｔａ１、２、Ｔａｕ、ＦＡＳＮ、ＫＣＴＤ６、ＫＣＴＤ９、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＲＡＬＧＡＰＡ、ＲＡＬＧＡＰＢ、アネキシンファミリーメンバー、ＢＣＯＲ、ＮＣＯＲ、βカテニン、ＡＡＣ、ＰＬＤ１、ＰＬＤ２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ７、ＲａＬＰ１１、ＭＬＬ－１、Ｍｙｂ、Ｅｚｈ２、ＲｈｏＧＤ１２、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ４Ｒ、ＧＣＧＣ（ｃｏａｃｔ）、アディポネクチンＲ２、ＧＰＲ８１、ＩＭＰＤＨ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ２－Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－２２Ｒ、ＴＮＦ－Ｒ、ＴＬＲ４、ＭｙＤ８８、Ｋｅａｐ１、またはＮｒｌｐ３である。
タンパク質変異体
本明細書に記載のようなタンパク質またはポリペプチド変異体は一般に、参照ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のようなプレゼンタータンパク質または標的タンパク質、例えば、哺乳動物のプレゼンタータンパク質または標的タンパク質）のアミノ酸配列と有意な（例えば、８０％もしくはそれ超、すなわち、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ超の）アイデンティティーを示すが、限定された数の特定のアミノ酸変化（例えば、保存的または非保存的な挿入、欠失、または置換）を含むアミノ酸配列を有し、かつ／または参照ポリペプチドに対して１個もしくは複数のアミノ酸変異体または類似体（例えば、Ｄ－アミノ酸、デスアミノ酸）を含む。ある特定の実施形態では、変異体は、関連性のある生物活性（例えば、特定の化合物またはその部分への結合）を参照ポリペプチドと共有する。一部のこのような実施形態では、変異体は、参照ポリペプチドの活性の約５０％以上であり、かつ／または参照ポリペプチドの活性の約０．５分の１以下であるレベルでこのような活性を示す。
一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも（または単に）変異体が、参照ポリペプチドにおける非システイン残基に対応する位置において、多数のシステイン残基を有し、かつ／または１個もしくは複数のシステイン残基を有するという点に関して、参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のようなポリペプチド（例えば、プレゼンタータンパク質および／または標的タンパク質）のいずれかのアミノまたはカルボキシ末端への１個もしくは複数のシステイン残基の添加は、例えば、ジスルフィド結合によるこのようなポリペプチドのコンジュゲーションを促進することができる。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ここで、残基は、同じ一般タイプもしくは群の別のもので置き換えられている）または非保存的（すなわち、ここで、残基は、別のタイプのアミノ酸で置き換えられている）であり得る。一部の実施形態では、天然アミノ酸は、非天然アミノ酸（すなわち、天然由来でない保存的アミノ酸置換もしくは天然由来でない非保存的アミノ酸置換）の代わりに置換されていてもよく、または逆もまた同様である。
合成的に作製されたポリペプチドは、ＤＮＡによって天然にコードされないアミノ酸（例えば、天然由来でないアミノ酸または非天然アミノ酸）の置換を含むことができる。非天然アミノ酸の例は、Ｄ－アミノ酸、アジド含有側鎖を有するアミノ酸、システインの硫黄原子に付着しているアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、ペグ化アミノ酸、化学式ＮＨ２（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（式中、ｎは、２～６である）のオメガアミノ酸、中性非極性アミノ酸、例えば、サルコシン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、およびノルロイシンを含む。フェニルグリシンは、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅの代わりをし得る。シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは、中性非極性であり、システイン酸は、酸性であり、オルニチンは、塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換され、コンホメーション付与特性を保持し得る。
類似体は、置換型突然変異誘発によって生じ、オリジナルのタンパク質の構造（例えば、局所的構造または全般的構造）を保持し得る。「保存的置換」として同定される置換の例は、表２において示す。このような置換が望ましくない変化をもたらす場合、表２において「例示的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスに関連して本明細書にさらに記載されているような、他のタイプの置換が導入され、生成物がスクリーニングされる。
機能または免疫学的アイデンティティーにおける実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはらせん状のコンホメーションとしての、置換の領域におけるタンパク質骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の変化もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対するこれらの効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然由来の残基は、一般の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、
（２）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、
（３）酸性／負に帯電している：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、
（４）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）；
（６）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、（７）極性：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（８）塩基性で正に帯電している：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、および；
（９）電荷を帯びている：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ
他のアミノ酸置換は、表２において列挙する。
変化した反応性アミノ酸プロファイルを有するタンパク質変異体
一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチド変異体は、タンパク質（例えば、本明細書に記載されているタンパク質のいずれかのアミノまたはカルボキシ末端における）への１個もしくは複数の反応性アミノ酸残基（例えば、システイン）の添加を含み得、これは例えば、ジスルフィド結合による、これらのタンパク質のコンジュゲーションを促進するができる。一部の実施形態では、１個もしくは複数の反応性アミノ酸（例えば、システイン）は除去して、タンパク質上の可能なコンジュゲーション部位の数を減少させ得る。アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ここで、残基は、同じ一般タイプもしくは群の別のもので置き換えられている）または非保存的（すなわち、ここで、残基は、別のタイプのアミノ酸で置き換えられている）であり得る。さらに、天然アミノ酸は、非天然アミノ酸（すなわち、天然由来でない保存的アミノ酸置換または天然由来でない非保存的アミノ酸置換）の代わりに置換することができる。
当技術分野において公知のように、例えば、チンＪ．Ｗ．（Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．）著、細胞および動物の遺伝コードの伸長および再プログラム化（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌｓ）、生化学の年次レビュー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第８３巻，ｐ．３７９～４０８に記載されているように、非天然アミノ酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製されたタンパク質中に組み込み得る。例えば、１つの系において、ＵＡＧアンバー（停止）コドンが使用されて、古細菌ｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡを介してピロリジンが組み込まれてきており、ＵＡＧアンバー（停止）コドンをまた使用して、摂食を介してアジドおよびアルキンを組み込むことができる。当技術分野で示されてきた非天然アミノ酸上の他の側鎖は、シクロプロペン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、ビシクロ［６．１．０］ノニン－リシン、クマリン、ｐ－アジドフェニルアラニン、Ｎ６－［（２－プロピンロキシ（propynloxy））カルボニル］－Ｌ－リシン、ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、Ｎ－５－ノルボルネン－２－イルオキシカルボニル－ｌ－リシン、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル－ｌ－リシン、Ｎ－２－アジドエチルオキシカルボニル－ｌ－リシン、Ｎ－Ｌ－チアプロリル－Ｌ－リシン、Ｎ－Ｄ－システイニル－Ｌ－リシン、Ｎ－Ｌ－システイニル－Ｌ－リシン、Ｎ６－［（２－プロピニルオキシ）カルボニル］－Ｌ－リシン、Ｎ６－［（２－アジドエトキシ）カルボニル］－Ｌ－リシン、ベンゾフェノン、４－（６－メチル－ｓ－テトラジン－３－イル）アミノフェニルアラニン、およびシクロオクチンを含む。
複合体
タンパク質上のキャビティまたはポケット中の小分子の間の相互作用によって推進される多くの小分子－タンパク質相互作用と対照的に、天然由来のタンパク質－タンパク質相互作用において、結合事象は典型的には、相互作用タンパク質の平坦表面部位上の疎水性残基によって大いに推進される。一般に、タンパク質の平坦表面部位上の疎水性残基は、疎水性ホットスポットを形成し、ここで、相互作用タンパク質の間のまたは中の結合相互作用の大部分は、ファンデルワールス相互作用である。一部の状況において、小分子は、例えば、タンパク質（例えば、プレゼンタータンパク質）上の疎水的相互作用部位に関与するか、生じさせ、これは、小分子の非存在下では存在しないという点で、小分子は、「移動できるホットスポット」（またはそのポーション）を提供し得る。本開示の態様は、このような状況に特に適用可能である。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のような化合物（および／またはそのタグ付き形態）は、タンパク質と共に複合体（例えば、プレゼンタータンパク質／化合物複合体）を形成し、疑似タンパク質－タンパク質相互作用（例えば、標的タンパク質とのトリパータイト複合体の形成）に関与する。
多くの哺乳動物タンパク質は複数の異なるパートナーのいずれかに結合可能であり、いくつかの場合には、かかる代替結合相互作用はタンパク質の生物学的活性に寄与する。こうしたタンパク質の多くは、ホットスポットタンパク質領域の固有可変性に適合してさまざま構造状況で同一の残基を提示する。より具体的には、タンパク質－タンパク質相互作用は、菌類および細菌の種の選択グループにより生成される天然物のクラスにより媒介可能である。こうした分子は、共通の構造組織を呈するとともに、タンパク質－タンパク質相互作用をモジュレートする能力を提供する機能も結果として呈する。こうした分子は、高度に保存されたプレゼンタータンパク質結合部分と、異なる天然物間で高度の可変性を呈する標的タンパク質相互作用部分と、を含有する。プレゼンタータンパク質結合部分は、プレゼンタータンパク質に対する特異性を付与し、分子をプレゼンタータンパク質に結合させて複合体を形成させる。哺乳動物標的タンパク質結合部分は、標的タンパク質に対する特異性を付与し、二元複合体を標的タンパク質に結合させて、典型的にはその活性をモジュレートする（たとえば、正または負にモジュレートする）。本発明において、二元複合体（例えば、化合物およびプレゼンタータンパク質の間、または化合物および標的タンパク質の間）は、標的タンパク質へとプレゼンタータンパク質結合部分をコンジュゲートするか、またはプレゼンタータンパク質へと標的タンパク質結合部分をコンジュゲートすることによって模倣される。次いで、このように得られた本発明のコンジュゲートは、プレゼンタータンパク質または標的タンパク質に結合し、トリパータイト複合体を模倣する複合体を形成し得る。これらの複合体は、例えば、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間のインターフェースの構造を決定するために使用し得る。さらに、複合体の形成を単純化することによって、例えば、プレゼンタータンパク質結合部分を標的タンパク質にコンジュゲートすることによって、本発明の化合物は、例えば、プレゼンタータンパク質に結合することができる標的タンパク質を同定するために使用し得る。
使用
標的タンパク質の同定
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、および／または方法は、（例えば、小分子の存在下で）プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定するのに有用であり得る。標的タンパク質は、標的部分にコンジュゲートしているプレゼンタータンパク質結合部分を含むコンジュゲートの形成、およびコンジュゲートが、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成しているかを決定することによって同定し得る。
プレゼンタータンパク質および小分子と共に三元複合体を形成する当技術分野において公知の大部分の標的タンパク質は、小分子の作用機序の決定の間に幸運にも同定された。本方法は、標的分子へとプレゼンタータンパク質結合部分を共有結合的にコンジュゲートし、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の両方を同時に結合することができる化合物の同定の前に複合体の形成を可能とすることによって、小分子の存在下で、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質の合理的な同定を可能とする。
プレゼンタータンパク質および同定された標的タンパク質の間の複合体形成を促進するこれらの能力についての小分子のスクリーニングは、次いで、標的タンパク質の生物活性をモジュレートすることができる有望な療法を同定するために行うことができる。
一部の実施形態では、本発明の化合物を使用して、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成することができる標的タンパク質を同定し得る。例えば、標的タンパク質は、本発明の化合物の存在下で、プレゼンタータンパク質／標的タンパク質複合体の形成を可能とする条件下で、１つもしくは複数の標的タンパク質と、標識されたプレゼンタータンパク質（例えば、ビオチンで標識）とを合わせることによって同定し得る。次いで、プレゼンタータンパク質と共に複合体を形成しない標的タンパク質は、除去（例えば、洗い流し）してもよく、次いで、複合体を形成する標的タンパク質は、プレゼンタータンパク質上の標識を使用してプルダウンし、分析し得る。一部の実施形態では、プルダウンした標的タンパク質は、質量分析法によって分析して、これらのアイデンティティーを決定し得る。
化合物の設計
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、および／または方法は、疾患の処置において使用するための、標的タンパク質の生物活性をモジュレートすることができる化合物の設計のために有用であり得る。
例えば、本発明のプレゼンタータンパク質およびコンジュゲートの複合体の形成は、複合体の結晶化および結晶構造決定による、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間のタンパク質－タンパク質インターフェースの構造の決定を促進することができる。本発明の複合体の結晶構造が決定されると、合理的なドラッグデザインのための当技術分野において公知の方法、例えば、構造を新規に構築する計算機化学方法および／または方法、例えば、本発明の複合体の結晶のフラグメント浸漬、ならびにこのように得られた構造の決定を使用したフラグメントベースのドラッグデザインを使用して、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質の間の複合体形成を促進することができる小分子を開発し得る。
次いで、上記のように設計された化合物はスクリーニングして、標的タンパク質の生物活性をモジュレートするこれらの能力を決定してもよく、かつ医薬品化学技術を必要に応じて使用して修飾し、治療的に有用な化合物を生成してもよい。
共有結合性小分子療法の同定
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、および／または方法は、共有結合性相互作用によって標的タンパク質の生物活性をモジュレートすることができる化合物を同定するのに有用であり得る。
例えば、本発明の化合物は、プレゼンタータンパク質の存在下および非存在下での標的タンパク質に共有結合するこれらの能力についてスクリーニングして、プレゼンタータンパク質の存在下でのみで標的タンパク質に選択的に結合することができる化合物を同定し得る。次いで、これらの化合物は、標的タンパク質の生物活性をモジュレートするこれらの能力について試験してもよく、かつ医薬品化学技術を必要に応じて使用して修飾し、治療的に有用な化合物を生成してもよい。
生化学的および／または生物物理学的特性の決定
一部の実施形態では、本発明の化合物、コンジュゲート、複合体、組成物、および／または方法は、タンパク質または複合体の生化学的および／または生物物理学的特性を決定するのに有用であり得る。
例えば、プレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質を含むコンジュゲートと、プレゼンタータンパク質との間の結合の自由エネルギーは、例えば、等温滴定熱量測定によって決定し得る。プレゼンタータンパク質についてのプレゼンタータンパク質結合部分および標的タンパク質を含むコンジュゲートのＫｄは、例えば、表面プラズモン共鳴によって決定し得る。標的タンパク質についての化合物およびプレゼンタータンパク質のＫｉ、Ｋｉｎａｃｔ、および／またはＫｉ／Ｋｉｎａｃｔは、例えば、質量分析法によって決定し得る。
疾患または障害の処置
本明細書に記載されている化合物、コンジュゲート、および複合体は、本明細書に記載されている標的タンパク質に関連する疾患または障害を処置する方法において有用であり得、理論に束縛されるものではないが、標的タンパク質（例えば、真核生物の標的タンパク質、例えば、哺乳動物の標的タンパク質または真菌の標的タンパク質または原核生物の標的タンパク質、例えば、細菌の標的タンパク質）の活性をモジュレート（例えば、正または負にモジュレート）するこれらの能力によって、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質との相互作用によってこれらの望ましい効果を発揮すると考えられる。
キット
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明に係る方法を便利かつ効果的に実施するためのキットに関する。一般的には、医薬パックまたはキットは、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分が充填された１つ以上の容器を含む。かかるキットは、錠剤やカプセル剤などの固体経口製剤の送達にとりわけ適している。かかるキットは、好ましくは、いくつかのユニット投与量を含み、意図されるその使用順序に合った投与量を記したカードを含みうる。所望により、たとえば、被験体がアルツハイマー病に罹患している場合、たとえば、数字、文字、もしくは他の表示の形式で、または投与を行いうる期日を治療スケジュールに指定してカレンダーへの書込みを行って、記憶補助を提供可能である。代替的に、医薬組成物の投与量に類似したまたはそれとは異なる形でプラセボ投与量またはカルシウム食事サプリメント）を含めて、投与量が毎日摂取されるキットを提供可能である。かかる容器に任意選択的に関連付けられるのは、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により指定された形態の注意書きでありうる。この注意書きは、ヒトに投与するための製造、使用、または販売が監督官庁により認可されたことを反映したものである。
医薬組成物
ヒトおよび動物被験体の治療に使用するために、本発明の化合物およびコンジュゲートは、医薬組成物または獣医薬組成物として製剤化可能である。治療される被験体、投与モード、および所望の治療タイプ（たとえば、防止、予防、または治療）に依存して、化合物は、これらのパラメータに合致した方法で製剤化される。かかる技術の概要は、レミングトン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）、第２１版、リッピンコット・ウイリアムズ・アンド・ウイルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、２００５年；およびエンサイクロペディア・オブ・ファーマシューティカル・テクノロジー（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｊ．スワーブリクス（Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ）およびＪ．Ｃ．ボイラン（Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ）編、１９８８－１９９９年、マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされる。
本明細書に記載される化合物は、組成物の全重量の１～９５重量％の合計量で存在しうる。組成物は、関節内、経口、非経口（たとえば、静脈内、筋肉内）、経直腸、皮膚、皮下、局所、経真皮、舌下、経鼻、経腟、小胞内、尿道内、髄腔内、硬膜外、経耳、もしくは経眼の投与、または注射、吸入、または鼻、泌尿生殖器、生殖器、もしくは口腔粘膜との直接接触に好適な剤形で提供しうる。それゆえ、医薬組成物は、たとえば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、サスペンジョン剤、エマルジョン剤、溶液剤、ヒドロゲル剤を含めてゲル剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、硬膏剤、ドレンチ剤、浸透圧送達デバイス、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント、スプレー剤、イオン泳動送達に好適な調製物、またはエアロゾル剤の形をとりうる。組成物は従来の薬務に従って製剤化しうる。
一般的には、治療に使用するために、本明細書に記載される化合物は、単独でまたは１つ以上の他の活性剤と組み合わせて使用しうる。本明細書に記載される化合物と組み合される他の医薬の例は、同一の適応症の治療のための医薬を含むであろう。本明細書に記載される化合物と組み合される可能性のある医薬の他の例は、異なるとはいえ関連のある症状または適応症の治療のための医薬を含むであろう。投与モードに依存して、化合物は、容易な送達を可能にするするのに好適な組成物として製剤化される。組合せ療法の各化合物は、当技術分野で公知のさまざまな方法に製剤化しうる。たとえば、組合せ療法の第１および第２の作用剤は一緒にまたは個別に製剤化しうる。望ましくは、第１および第２の作用剤は、作用剤の同時投与またはほぼ同時投与のために一緒に製剤化される。
本発明の化合物は、当技術分野で周知のように、本明細書に記載される有効量の化合物と薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物として調製および使用しうる。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも２つの異なる薬学的に許容可能な賦形剤または担体を含む。
製剤は、全身投与または局所投与に好適な方式で調製しうる。全身製剤は、注射（たとえば、筋肉内、静脈内、皮下の注射）に供すべく設計されたものを含むか、または経真皮、経粘膜、もしくは経口の投与に供すべく調製しうる。製剤は、一般に、希釈剤さらにはいくつかの場合にはアジュバント、緩衝剤、保存剤などを含む。化合物はまた、リポソーム組成物またはマイクロエマルジョン剤として投与可能である。
注射に供する場合、製剤は、液体溶液剤としてまたはサスペンジョン剤としてまたは注射前に液体中に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体製剤としてまたはエマルジョン剤として従来形で調製可能である。好適な賦形剤としては、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。かかる組成物はまた、種々の量の非毒性補助物質、たとえば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、たとえば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートなども含有しうる。
薬剤のさまざまな持続放出系も考案されてきた。たとえば、米国特許第５，６２４，６７７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
全身投与としては、比較的非侵襲性の方法、たとえば、坐剤、経真皮パッチの使用、経粘膜送達、および鼻腔内投与も挙げられうる。経口投与もまた本発明の化合物に好適である。好適な製剤としては、当技術分野で理解されているように、シロップ剤、カプセル剤、および錠剤が挙げられる。
本明細書に記載される組合せ療法の各化合物は、当技術分野で公知のさまざまな方法で製剤化しうる。たとえば、組合せ療法の第１および第２の作用剤は一緒にまたは分割して製剤化しうる。
個別にまたは分割して製剤化された作用剤は、キットとして一緒にパッケージング可能である。その例としては、限定されるものではないが、たとえば、２丸剤、丸剤＋粉末剤、バイアル中の坐剤＋液体剤、２局所クリーム剤などを含有するキットが挙げられる。キットは、ユニット用量を被験体に投与するのを支援する任意選択的なコンポーネント、たとえば、粉末形を再構成するためのバイアル、注入用のシリンジ、カスタマイズされたＩＶ送達システム、インヘラーなどを含みうる。そのほかに、ユニット用量キットは、組成物の調製および投与のための説明書を含有しうる。キットは、一被験体用の単回使用ユニット用量として、特定被験体用の複数回使用として（一定用量でまたは治療の進行に合わせて個別の化合物の効力が変化するように）製造しうるか、またはキットは、複数被験体への投与に好適なマルチプル用量を含有しうる（「バルクパッケージング」）。キットのコンポーネントは、カートン、ブリスターパック、ボトル、チューブなどとしてアセンブルしうる。
経口使用に供される製剤としては、非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤との混合物として活性成分を含有する錠剤が挙げられる。こうした賦形剤は、たとえば、不活性希釈剤または充填剤（たとえば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンなどのデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、顆粒化剤および崩壊剤（たとえば、微結晶セルロースなどのセルロース誘導体、ジャガイモデンプンなどのデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）、結合剤（たとえば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、ナトリウムアルギネート、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミウニム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）、ならびに滑沢剤、滑剤、および接着防止剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物性油、またはタルク）でありうる。他の薬学的に許容可能な賦形剤は、着色剤、風味剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などでありうる。
２つ以上の化合物は、錠剤、カプセル剤、もしくは他の媒体で一緒に混合しうるか、または分割しうる。一例として、第２の化合物の実質的部分が第１の化合物の放出前に放出されるように、第１の化合物は錠剤の内側にかつ第２の化合物は外側に含有される。
経口使用に供される製剤はまた、咀嚼錠剤として、または活性成分が不活性固体希釈剤（たとえば、ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリン）と混合されるハードゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水もしくは油性媒体、たとえば、ラッカセイ油、流動パラフィン、オリーブ油と混合されるソフトゼラチンカプセル剤としても提供しうる。粉末剤、顆粒剤、およびペレット剤は、従来方式で、たとえば、ミキサー、流動床装置、またはスプレードライ装置により錠剤およびカプセル剤の状態の以上に挙げた成分を用いて調製しうる。
溶解または拡散制御放出は、化合物の錠剤、カプセル剤、ペレット剤、または顆粒剤に適切なコーティングを施すことによりまたは適切なマトリックス中に化合物を組み込むことにより達成可能である。制御放出コーティング剤としては、以上に挙げたコーティング物質の１つ以上、および／または、たとえば、シェラック、ビーワックス、グリコワックス、カスターワックス、カルナウバワックス、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレート、グリセロールパルミトステアレート、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌポリ乳酸、セルロースアセテートブチレート、ポリビニルクロライド、ポリビニルアセテート、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２つのヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル剤、１，３－ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、および／またはポリエチレングリコールが挙げられる。また、制御放出マトリックス製剤では、マトリックス材料として、たとえば、水和メチルセルロース、カルナウバワックスおよびステアリルアルコール、カーボポール９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリン、メチルアクリレート－メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および／またはハロゲン化フルオロカーボンが挙げられうる。
経口投与に供すべく本発明の化合物および組成物を組み込うる液状製剤としては、メンジツ油、ゴマ油、ココヤシ油、ラッカセイ油などの食用油さらにはエリキシル剤および類似の医薬媒体を有する、水性溶液剤、好適に風味付けされたシロップ剤、水性または油性サスペンジョン剤、および、風味付けされたエマルジョン剤が挙げられる。
一般に、ヒトに投与する場合、本発明の組合せの化合物のいずれについてもその経口投与量は、化合物の性質に依存するが、当業者であれば容易に決定可能である。典型的には、かかる投与量は、通常は約０．００１ｍｇ～２０００ｍｇ／日、望ましくは約１ｍｇ～１０００ｍｇ／日、より望ましくは約５ｍｇ～５００ｍｇ／日である。２００ｍｇ／日までの投与量が必要でありうる。
本明細書に記載される組合せ療法の各薬剤の投与は、独立して、１日～１年間にわたり毎日４回でありうるが、さらには被験体の寿命にわたりうる。慢性長期投与が必要となりうる。
実施例１：特定の架橋試薬の合成
（Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）－１－（３－（３－（ピリジン－２－イルジスルファニル）プロパンアミド）フェニル）プロピル（Ｓ）－１－（３，３－ジメチル－２－オキソペンタノイル）ピペリジン－２－カルボキシレート（Ｃ３－ＳＬＦ）の合成：
アニリン１（９０ｍｇ、１７２μｍｏｌ、１当量）、ジスルフィド２（７４ｍｇ、３４３μｍｏｌ、２当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１４９μＬ、１１１ｍｇ、８５８μｍｏｌ、５当量）のＤＮＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１３０ｍｇ、３４３μｍｏｌ、２当量）を加え、反応物を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチル（３×）で抽出した。有機抽出物を水、飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣はシリカゲル勾配溶離（２０％酢酸エチル：８０％ヘプタン→１００％酢酸エチル）上で精製し、表題化合物Ｃ３－ＳＬＦ（５０ｍｇ、４０％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値＝７２２．３（Ｍ＋Ｈ）、観測値＝７２２．３。
（Ｒ）－３－（３，４－ジメトキシフェニル）－１－（３－（４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタンアミド）フェニル）プロピル（Ｓ）－１－（３，３－ジメチル－２－オキソペンタノイル）ピペリジン－２－カルボキシレート（Ｃ４－ＳＬＦ））の合成：
アニリン１（９０ｍｇ、１７２μｍｏｌ、１当量）、ジスルフィド２（７９ｍｇ、３４３μｍｏｌ、２当量）およびジイソプロピルエチルアミン（１４９μＬ、１１１ｍｇ、８５８μｍｏｌ、５当量）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１３０ｍｇ、３４３μｍｏｌ、２当量）を加え、反応混合物を室温にて２４時間撹拌した。反応混合物は水で希釈し、酢酸エチル（３×）で抽出した。水、飽和塩化ナトリウムで有機抽出物を洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣はシリカゲル勾配溶離（２０％酢酸エチル：８０％ヘプタン→１００％酢酸エチル）上で精製し、表題化合物Ｃ４－ＳＬＦ（９８ｍｇ、７７％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値＝７３６．３（Ｍ＋Ｈ）、観測値＝７３６．３。
メチル（Ｓ）－１－（（Ｓ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタンアミド）ブタンアミド）プロパノイル）ヘキサヒドロピリダジン－３－カルボキシレート（ＳＦＡＣ４ＤＳ））の合成：
アミン１は、パケット（Ｐａｑｕｅｔｔｅ）ら著、ＪＡＣＳ、２００２年（１２４巻）、ｐ．４２５７～４２７０によって調製した。アミン１（２０ｍｇ、４９．２μｍｏｌ）のアセトニトリル（１ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（１６．５μＬ、１１８μｍｏｌ、２．４当量）、それに続いて酸塩化物２（１３．８ｍｇ、５９．２μｍｏｌ、１．２当量）を加えた。室温にて１４時間反応混合物を撹拌し、次いで、濃縮し、分取ＴＬＣ（ジクロロメタン：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ、２０：１：０．１）によって残渣を精製し、１４．０ｍｇ（４７％）の生成物を無色の泡として得た。Ｒｆ＝０．５９（ジクロロメタン：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ、１０：１：０．１）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値＝６１８．２（Ｍ＋Ｈ）、観測値＝６１８．２。
メチル（Ｓ）－１－（（Ｓ）－３－（３－ヒドロキシフェニル）－２－（（Ｓ）－３－メチル－２－（３－（２－（ピリジン－２－イルジスルファニル）エトキシ）プロパンアミド）ブタンアミド）プロパノイル）ヘキサヒドロピリダジン－３－カルボキシレート（ＳＦＡＸ６））の合成：
カルボン酸２（７０ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（２０４ｍｇ、０．５４０ｍｍｏｌ、２．００当量）を３ｍＬのアセトニトリル中で混合し、このように得られた懸濁液は室温にて１５分間撹拌した。この期間に続いて、アミン１（１１０ｍｇ、０．２７０ｍｍｏｌ、１．００当量）、それに続いてトリエチルアミン（１１３μＬ、０．８１０ｍｍｏｌ、３．００当量）を加え、混合物は室温にて１８時間撹拌した。次いで、混合物は２０ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムで処理し、２×３０ｍＬポーションの酢酸エチルで抽出した。プールした有機抽出物は２×２０ｍＬポーションのブラインで洗浄し、飽和硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残基はジクロロメタン：ＭｅＯＨ、１００：１～５０：１で溶出するシリカゲルクロマトグラフィーを使用して精製し、７０ｍｇ（４０％）の生成物を無色の油として得た。Ｒｆ＝０．３１（ジクロロメタン：ＭｅＯＨ、２０：１）。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値＝６４８．２（Ｍ＋Ｈ）、観測値＝６４８．２。
Ｎ－（４－（（２Ｓ，１１Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－２６－エチル－２３－（（１Ｒ，２Ｒ，Ｅ）－１－ヒドロキシ－２－メチルヘキサ－４－エン－１－イル）－１４，１７－ジイソブチル－２０－イソプロピル－４，１１，１３，１６，１９，２２，２８，３１－オクタメチル－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３－ウンデカオキソ－１，４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１－ウンデカアザシクロトリトリアコンタン－２－イル）ブチル）－４－（ピリジン－２－イルジスルファニル）ブタンアミド（ＣｓＡ３））の合成
アミン１（１００ｍｇ、９０．５μｍｏｌ）およびカルボン酸２（３１ｍｇ、１３５．２μｍｏｌ、１．５当量）のＮＭＰ（６ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（５１ｍｇ、１３４．１μｍｏｌ、１．４８当量）およびＤＩＰＥＡ（７０μＬ、４０１．９μｍｏｌ、４．４当量）を加えた。反応物は室温にて１時間撹拌し、次いで、水で希釈し、３×３０ｍＬポーションの酢酸エチルで抽出した。機抽出物を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、真空下で濃縮した。粗材料は、１５％アセトニトリル：８５％水（両方とも０．１％ギ酸を含有）から１００％アセトニトリル（０．１％ギ酸を含有）の勾配で溶出するＣ１８媒体上の逆相クロマトグラフィーによって精製した。ＭＳ（ＥＳＩ）計算値＝６５８．９（Ｍ＋２Ｈ）、観測値＝６５９．０。
実施例２：特定のコンジュゲートの合成
一般プロトコル：このプロトコルは、標的タンパク質－化合物コンジュゲートの形成のための方法について記載する。
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物（自社製）および哺乳動物の標的タンパク質（自社製）
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））
実験プロトコル：１：２モル比の標的タンパク質および化合物を、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２％ＤＭＳＯを含有する７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。架橋効率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによってアセスメントする。コンジュゲートは、非架橋標的タンパク質よりゆっくりと移動する。チオール反応性化合物について、標的タンパク質への化合物のＣｙｓ特異的付着は、コンジュゲートをその構成要素に戻す反応混合物への１００ｍＭのＤＴＴの添加の後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってさらに確認することができる。
Ａ．ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－ＦＫ５０６コンジュゲートの形成
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＣ２－ＦＫ５０６（自社製）、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ（自社製；Ｇ１２Ｖ／Ｓ３９Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）。装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））
実験プロトコル：１：２モル比のＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣｌｉｔｅおよびＣ２－ＦＫ５０６を、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。架橋効率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによってアセスメントする。ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ上のシステイン３９へのＣ２－ＦＫ５０６の付着はまた、１００ｍＭのＤＴＴとの反応混合物のインキュベーションによってアセスメントされる。
結果：Ｃ２－ＦＫ５０６は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅと効率的に架橋し、かつシステイン３９に対して特異的である（図１）。
Ｂ．ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２Ｃｌｉｔｅ／ＳＦＡＸ９ＤＳコンジュゲートの形成
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＳＦＡＸ９ＤＳ（自社製）、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２Ｃｌｉｔｅ（自社製；Ｇ１２Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）。
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））
実験プロトコル：１：２モル比のＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２ＣｌｉｔｅおよびＳＦＡＸ９ＤＳを、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。架橋効率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによってアセスメントする。野生型ＣｙｐＡはまた、化合物と架橋した。ＣｙｐＡ上の反応性システインとしてのシステイン５２はセリンに変異させ、プレゼンター架橋を抑止した。
結果：ＳＦＡＸ９ＤＳは、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２Ｃｌｉｔｅタンパク質と効率的に架橋し、ＣｙｐＡＣ５２Ｓは、ＳＦＡＸ９ＤＳに架橋しない（図２）。
実施例３：特定の複合体の形成
一般プロトコル：このプロトコルは、プレゼンタータンパク質、化合物、および哺乳動物の標的タンパク質からなる複合体の形成および単離のための２つの方法を記載する。
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物（自社製）、プレゼンタータンパク質（自社製）および哺乳動物の標的タンパク質（自社製）
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＶ１２０ｍＬ）。
実験プロトコルＡ：事前コンジュゲートされた化合物およびタンパク質
１：２モル比のコンジュゲートおよびプレゼンタータンパク質を、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。純粋な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によって単離する。反応混合物は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で事前に平衡させたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＣＶ１２０ｍＬ）に直接注入する。複合体は、未反応の標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質より高い分子量で溶出する。溶出ピークにおける複合体の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料をアセスメントする。
実験プロトコルＢ：架橋試薬、プレゼンタータンパク質および標的タンパク質
１：２：２モル比の化合物、プレゼンタータンパク質、および標的タンパク質を、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。純粋な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によって単離する。反応混合物は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で事前に平衡させたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＣＶ１２０ｍＬ）に直接注入する。複合体は、未反応の標的タンパク質およびプレゼンタータンパク質より高い分子量で溶出する。溶出ピークにおける複合体の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料をアセスメントする。
Ａ．ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２三元複合体の形成
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＣ２－Ｈｏｌｔ（自社製）、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ（自社製；Ｇ１２Ｖ／Ｓ３９Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）、およびＦＫＢＰ１２（自社製）。
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＶ１２０ｍＬ）
実験プロトコル：１：２：２モル比のＣ２－Ｈｏｌｔ、ＦＫＢＰ１２、およびＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅを、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。純粋な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によって単離する。反応混合物は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で事前に平衡させたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＣＶ１２０ｍＬ）に直接注入する。複合体は、注入後概ね６９ｍＬで溶出し、未反応のＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２は、注入後、それぞれ、概ね７５ｍＬおよび８７ｍＬで溶出する。溶出ピークにおけるＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料をまたアセスメントする。
結果：溶出ピークのＳＥＣプロファイルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／Ｃ２－Ｈｏｌｔ／ＦＫＢＰ１２複合体の形成を確認する（図３Ａおよび３Ｂ）。
Ｂ．ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／ＳＦＡＣ４ＤＳ／ＣｙｐＡＣ５２Ｓ三元複合体の形成
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＳＦＡＣ４ＤＳ（自社製）、ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ（自社製；Ｇ１２Ｖ／Ｓ３９Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）、およびＣｙｐＡＣ５２Ｓ（自社製）。
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＶ１２０ｍＬ）
実験プロトコル：１：２：２モル比のＳＦＡＣ４ＤＳ、ＣｙｐＡＣ５２Ｓ、およびＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅを、２％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。純粋な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によって単離する。反応混合物は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で事前に平衡させたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＣＶ１２０ｍＬ）に直接注入する。複合体は、注入後概ね６９ｍＬで溶出し、未反応のＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９ＣｌｉｔｅおよびＣｙｐＡＣ５２Ｓは、注入後、それぞれ、概ね７５ｍＬおよび８０ｍＬで溶出する。溶出ピークにおけるＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９ＣｌｉｔｅおよびＣｙｐＡＣ５２Ｓの存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料をまたアセスメントする。
結果：溶出ピークのＳＥＣプロファイルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ／ＳＦＡＣ４ＤＳ／ＣｙｐＡＣ５２Ｓ複合体の形成を確認する（図４）。
Ｃ．ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅ／Ｃ３－ＳＬＦ／ＦＫＢＰ１２三元複合体の形成
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＣ３－ＳＬＦ（自社製）、ＰＴＰ１ＢＥ１８６Ｃｌｉｔｅ（自社製；Ｃ３２Ｓ／Ｃ９２Ｖ／Ｃ１２１Ｓ／Ｓ１８７Ｃを含有する残基１～２９３）、およびＦＫＢＰ１２（自社製）。
装置：ミニプロティアン（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ）ＴＧＸゲル（バイオ－ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＶ１２０ｍＬ）
実験プロトコル：１：３：３モル比のＣ３－ＳＬＦ、ＦＫＢＰ１２、およびＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅを、４％ＤＭＳＯを含有する１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中で一緒に混合する。反応物は、３７℃にて３０分間インキュベートし、それに続いて室温で一晩インキュベートする。純粋な複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）精製によって単離する。反応混合物は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で事前に平衡させたスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム（ＣＶ１２０ｍＬ）に直接注入する。複合体は注入後概ね６２ｍＬで溶出し、未反応のＦＫＢＰ１２は、注入後、それぞれ概ね７５ｍＬ（二量体）および９０ｍＬ（モノマー）で溶出する。溶出ピークにおけるＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料をまたアセスメントする。遊離ＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２混合物は、同じ条件下でスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラムに供し、これらの溶出時間を決定する。
結果：概ね６４～６５ｍｌにおいて溶出する遊離ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅを確認する、遊離ＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣｌｉｔｅおよびＦＫＢＰ１２タンパク質（図５Ａ）のＳＥＣプロファイル、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。溶出ピークのＳＥＣプロファイルおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって、ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅ／Ｃ３－ＳＬＦ／ＦＫＢＰ１２複合体の形成を確認し、これは概ね６１ｍｌにおいて溶出する（図５Ｂ）。
実施例４：プレゼンタータンパク質が存在するとき、コンジュゲート形成であるが、これが非存在のとき、コンジュゲート形成ではない
このプロトコルは、コンジュゲート形成のプレゼンター依存性をアセスメントする試みにおける、質量分析法およびゲルシフトアッセイを使用した架橋効率を分析する方法について記載する。
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物（自社製）、ＦＫＢＰ１２（自社製）、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２Ｃ（自社製、残基１～１６９）。
実験プロトコル：ジスルフィド架橋反応の速度論を追跡するために、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ（アドバンスバイオ）ＲＰ－ｍＡｂ Ｃ４カラム（２．１×１００ｍｍ、３．５μｍ）を用い、かつオートサンプラーを備えたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）６２３０ＴＯＦ－ＬＣ／ＭＳおよびアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１２６０ＨＰＬＣ機器を使用した。ＨＰＬＣグレードのアセトニトリルおよび水（それぞれ、１．０ｍＭのギ酸アンモニウムおよび１容量％のギ酸を含有）は、下記のランプを伴って移動相として使用した。０．６ｍｌ／分の流量、水：アセトニトリル＝９５：５、０．０～１３．０分のランピングから、水：アセトニトリル＝５：９５、１３．０～１７．０分。総時間＝１７．０分。
全ての架橋反応は、０．５ｍＬのガラス製インサートを備えた１．５ｍＬのあめ色のガラス製バイアル中で行った。水溶性ペプチド（配列番号１：ＹＱＮＬＬＶＧＲＮＲＧＥＥＩＬＤ）は、内部標準として用いた。内部標準の実際の配列は重要でないが、アミノ酸残基の選択は、架橋アッセイにおける干渉を回避するために重大であった。したがって、プロリン（ＦＫＢＰ１２を妨げる）およびシステイン（ジスルフィド結合形成を妨げる）残基は除外した。全ての反応物および標準液は、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２）緩衝液中で調製した。
全ての反応の前に、一連の標準液（ＦＫＢＰ１２についての標準曲線分析の一例は、下記の表３において示す）を使用して個々の構成要素について標準曲線を得た。標準曲線からのデータを使用して、μｍｏｌのタンパク質試料は面積比（試料：ｓｔｄ）に対してプロットし、線形フィット（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、スロープおよびインターセプトを得た。これらの標準曲線に関わるスロープおよびインターセプトの値は、反応の前および反応の過程の間に、基質および生成物濃度の評価の間に説明された。全ての基質／生成物について、最初の注入に続いてブランク注入を行い、残留タンパク質／試薬の存在を検証した。この分析に基づいて、オートサンプラーのシークエンスは、もしあれば、残留する構成要素の除去のための適当な数のブランク注入を含むように調節することができる。ＭＳスペクトルは、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）マスハンター（ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ）ｖＢ．０７．０ソフトウェアを使用して分析した。
標的タンパク質に対するリガンド架橋のプレゼンター依存性をアセスメントする代表的な実験において、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｇ１２ＣおよびＣ３－またはＣ４－ＳＬＦリガンドは、ＦＫＢＰ１２の存在下または非存在下で、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、３％ＤＭＳＯ中、２μＭのＫＲＡＳ、１０μＭのＦＫＢＰ１２、１０μＭのＣ３－またはＣ４－ＳＬＦの濃度で室温にて４時間インキュベートした。上記の方法を使用したリガンドとのジスルフィド架橋を受けているＫＲＡＳの量の分析。表４において示すように、５倍から１０倍増加した架橋効率が、プレゼンターの存在下で観察された。
質量分析と平行して、Ｃ３－またはＣ４－ＳＬＦとの架橋反応は、架橋反応をより高い濃度で設定した（６０μＭのＫＲＡＳ、１８０μＭのＦＫＢＰ１２、および１８０μＭのＣ３－またはＣ４－ＳＬＦ）ことを除いて、上記の同じ実験条件において、ＦＫＢＰ１２の存在下または非存在下で、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用したゲルシフトアッセイに供し、これらはＭＭＴＳによってクエンチし、反応を終了させた。ＭＳデータと同様に、リガンド架橋効率は、ＦＫＢＰ１２の存在下で有意にブーストされたが、これはＣ４－ＳＬＦについてより明白である（図６）。
実施例５：Ｘ線分析によるプレゼンタータンパク質／標的タンパク質インターフェース構造の決定
このプロトコルは、ＦＫＢＰ１２－Ｃ２Ｈｏｌｔ－ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃの三元複合体の結晶化、およびこの三元複合体の結晶構造についての構造決定方法を記載する。
Ａ．ＦＫＢＰ１２－Ｃ２Ｈｏｌｔ－ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ三元複合体の結晶構造決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のリガンド（Ｃ２Ｈｏｌｔ）（自社製）、ＦＫＢＰ１２（自社製）、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ（自社製、Ｇ１２Ｖ／Ｓ３９Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）。
装置：スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
実験プロトコル：Ｃ ＨｏｌｔおよびＦＫＢＰ１２は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２％ＤＭＳＯ中で３：１および１．５：１の過剰モルでＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅに加え、２０℃にて一晩、または４℃にて３６～７２時間インキュベートした。純粋な複合体は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２中で、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。精製した複合体（１５～２０ｍｇ／ｍｌでの）は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃にて結晶化スクリーニングに供した。結晶は、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５、２０～２２％ＰＥＧ２０，０００を含有するウェル溶液中で成長させた。データ収集のために、結晶は、１５％グリセロールを補充した母液を含有する溶液に移し、次いで、液体窒素中で凍結した。回折データセットは先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＰＳ）において集め、ＨＫＬプログラムで処理した。分子置換ソリューションは、ＦＫＢＰ１２（ＰＤＢ－ＩＤ１ＦＫＤ）およびＫＲＡＳ（ＰＤＢ－ＩＤ３ＧＦＴ）の公表された構造を検索モデルとして使用して、ＣＣＰ４スイートにおけるプログラムＰＨＡＳＥＲを使用して得た。それに続くモデル構成および精密化は、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４およびＣＯＯＴを伴う標準的なプロトコルによって行った。
結果：ＦＫＢＰ１２－Ｃ２Ｈｏｌｔ－ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃの全体的構造：結晶は、非対称単位でＦＫＢＰ１２およびＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃの１個のヘテロ二量体を含有する（図７）。モデルは、ＦＫＢＰ１２の残基Ｍｅｔ１からＧｌｕ１０８、およびＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣのＭｅｔ１からＬｙｓ１６９を含んだ。このように得られた電子密度は、リガンドの配向およびコンホメーションを含む明確な結合モードを示す。タンパク質のシステイン、およびリガンドからの硫黄から生じたジスルフィドについて連続的な電子密度が観察された。
Ｃ２Ｈｏｌｔの結合に関わるＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ残基（４Å距離カットオフ）は、Ｇｌｕ３７、Ｃｙｓ３９、Ｌｅｕ５６、およびＭｅｔ６７である。ＦＫＢＰ１２への結合に関わるＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ残基は、Ｇｌｕ３、Ｌｙｓ５、Ｉｌｅ３６、Ｃｙｓ３９、Ｔｙｒ４０、Ａｒｇ４１、Ａｓｐ５４、Ｇｌｕ６３、Ｔｙｒ６４、Ｍｅｔ６７、およびＡｒｇ７３である。ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃの結合に関わるＦＫＢＰ１２残基は、Ａｒｇ４３、Ｌｙｓ５３、Ｇｌｎ５４、Ｇｌｕ５５、Ｔｈｒ８６、Ｐｒｏ８９、Ｇｌｙ９０、およびＩｌｅ９２である。Ｃ２Ｈｏｌｔの結合に関わるＦＫＢＰ１２残基は、Ｔｙｒ２７、Ｐｈｅ３７、Ａｓｐ３８、Ｐｈｅ４７、Ｇｌｕ５５、Ｖａｌ５６、Ｉｌｅ５７、Ｔｒｐ６０、Ｔｙｒ８３、Ｈｉｓ８８、Ｉｌｅ９１、Ｉｌｅ９２、およびＰｈｅ１００である。
複合体の総埋込面積は、１，９４７Å２である。ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃの埋込面積は、６００Å２であり、このうち、５０１Å２は、ＦＫＢＰ１２（８３％）が寄与し、９９Å２は、Ｃ２Ｈｏｌｔ（１７％）が寄与する。ＦＫＢＰ１２の埋込面積は、７６２Å２であり、このうち、５００Å２は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃ（６６％）が寄与し、２６２Å２は、Ｃ２Ｈｏｌｔが寄与する（３４％）。Ｃ２Ｈｏｌｔの埋込面積は、５８４Å２であり、このうち、１３２Å２は、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃが寄与し（２３％）、４５２Å２は、ＦＫＢＰ１２が寄与する（７７％）。ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣおよびＦＫＢＰ１２の間のタンパク質－タンパク質インターフェースは、３個の分子間Ｈ結合を含む疎水性および極性相互作用の両方によって形成される。Ｃ２ＨｏｌｔおよびＦＫＢＰ１２の間の結合インターフェースは、疎水的相互作用が大きく寄与するが、またリガンドの３個のカルボニル基、ならびにＦＫＢＰ１２のＴｙｒ２７、Ｉｌｅ５７、およびＴｙｒ８３の間の３個のＨ結合が寄与する。Ｃ２Ｈｏｌｔは、設計（９９Å２）によってＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９Ｃとの最小の接触を形成するが、ＫＲＡＳＧＴＰ／Ｓ３９ＣのＧｌｕ３７と１個のＨ結合を形成する。データ収集および最終構造の精密化統計は、下記の表５において列挙する。
Ｂ．ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃ／ＳＦＡＣ４ＤＳ／ＣｙｐＡＣ５２Ｓ三元複合体の結晶構造決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のリガンド（ＳＦＡＣ４ＤＳ）（自社製）、ＣｙｐＡＣ５２Ｓ（自社製）、ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅ（自社製、Ｇ１２Ｖ／Ｓ３９Ｃ／Ｃ５１Ｓ／Ｃ８０Ｌ／Ｃ１１８Ｓを含有する残基１～１６９）。
装置：スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
実験プロトコル：ＳＦＡＣ４ＤＳおよびＣｙｐＡＣ５２Ｓは、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２％ＤＭＳＯ中で２：１および２：１の過剰モルでＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃｌｉｔｅに加え、２０℃にて一晩インキュベートした。純粋な複合体は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２中で、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。精製した複合体（１５ｍｇ／ｍｌでの）は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃にて結晶化スクリーニングに供した。結晶は、０．１Ｍのビス－Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５、２５％ＰＥＧ３３５０を含有するウェル溶液中で成長させた。データ収集のために、結晶は、これを４０％のＰＥＧとするためにさらなるＰＥＧ３３５０を補充した、母液を含有する溶液に移し、次いで、液体窒素中で凍結した。回折データセットはアドバンストライトソース（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＬＳ）で集め、ＨＫＬプログラムで処理した。分子置換ソリューションは、ＣｙｐＡ（ＰＤＢ－ＩＤ１ＣＷＡ）およびＫＲＡＳ（ＰＤＢ－ＩＤ３ＧＦＴ）の公表された構造を検索モデルとして使用して、ＣＣＰ４スイートにおけるプログラムＰＨＡＳＥＲを使用して得た。それに続くモデル構成および精密化は、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４およびＣＯＯＴを伴う標準的なプロトコルによって行った。
結果：ＣｙｐＡＣ５２Ｓ－ＳＦＡＣ４ＤＳ－ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃの全体的構造：結晶は、非対称単位でのＣｙｐＡＣ５２ＳおよびＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃの１個のヘテロ二量体を含有する（図８）。モデルは、ＣｙｐＡの残基Ｍｅｔ１からＧｌｕ１６５、およびＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９ＣのＭｅｔ１からＬｙｓ１６９を含んだ。このように得られた電子密度は、リガンドの配向およびコンホメーションを含めた明確な結合モードを示す。タンパク質のシステイン、およびリガンドからの硫黄から生じたジスルフィドについて連続的な電子密度が観察された。
ＳＦＡＣ４ＤＳの結合に関わるＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃ残基（４Å距離カットオフ）は、Ｇｌｕ３、Ｌｙｓ５、Ｃｙｓ３９、Ａｒｇ４１、Ｌｅｕ５２、Ａｓｐ５４、Ｉｌｅ５５およびＬｅｕ５６である。ＣｙｐＡＣ５２Ｓへの結合に関わるＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃ残基は、Ｇｌｕ３７、Ａｓｐ３８、Ｃｙｓ３９、Ａｒｇ４１、Ｇｌｎ４３、Ｌｅｕ５６、Ａｌａ６６、Ｍｅｔ６７、Ｇｌｎ７０、およびＴｈｒ７４である。ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃの結合に関わるＣｙｐＡＣ５２Ｓ残基は、Ａｒｇ５５、Ｉｌｅ５７、Ａｒｇ６９、Ａｓｎ７１、Ｔｈｒ７３、Ａｌａ８１、Ａｌａ１０３、Ａｒｇ１４８、およびＡｓｎ１４９である。ＳＦＡＣ４ＤＳの結合に関わるＣｙｐＡＣ５２Ｓ残基は、Ａｒｇ５５、Ｐｈｅ６０、Ｍｅｔ６１、Ｇｌｎ６３、Ｇｌｙ７２、Ａｌａ１０１、Ａｓｎ１０２、Ｇｌｎ１１１、Ｐｈｅ１１３、およびＨｉｓ１２６である。
この複合体の総埋込面積は、タンパク質－タンパク質インターフェースにおける部分的な構造的障害によって計算することができない。計算のための無秩序領域を除いて、タンパク質－タンパク質インターフェースにおける埋込面積は１，３５０Å２超であり、このうち、３０％超は、ＳＦＡＣ４ＤＳ（４４３Å２）が寄与する。ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９ＣおよびＣｙｐＡＣ５２Ｓの間のタンパク質－タンパク質インターフェースは、２個の分子間Ｈ結合を含む疎水性および極性相互作用の両方によって形成される。ＳＦＡＣ４ＤＳおよびＣｙｐＡの間の結合インターフェースは、疎水性および極性相互作用の両方が寄与する。リガンドのカルボニルおよびＮ－Ｈ基と、ＣｙｐＡＣ５２Ｓの残基Ａｒｇ５５、Ｇｌｎ６３、Ａｓｎ１０２、およびＨｉｓ１２６との間に６個のＨ結合が存在する。ＳＦＡＣ４ＤＳは、ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９Ｃと共に最小の直接的接触を形成するが、ＫＲＡＳＧＤＰ／Ｓ３９ＣのＡｒｇ４１と共に１個のＨ結合を形成する。最終構造のデータ収集および精密化統計は、下記の表５において列挙する。
Ｃ．ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃ／Ｃ３ＳＬＦ／ＦＫＢＰ１２三元複合体の結晶構造決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のリガンド（Ｃ３－ＳＬＦ）（自社製）、ＦＫＢＰ１２（自社製）、ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅ（自社製、Ｃ３２Ｓ／Ｃ９２Ｖ／Ｃ１２１Ｓ／Ｓ１８７Ｃを含有する残基１～１６９）。
装置：スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、グリフォン（Ｇｒｙｐｈｏｎ）（アートロビンズインストルメンツ（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））
実験プロトコル：Ｃ３ＳＬＦおよびＦＫＢＰ１２は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、４％ＤＭＳＯ中で３：１の過剰モルでＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃｌｉｔｅに加え、４℃にて３６～７２時間インキュベートした。純粋な複合体は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および７５ｍＭのＮａＣｌ中、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。精製した複合体（１５ｍｇ／ｍｌでの）は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃にて結晶化スクリーニングに供した。結晶は、０．２Ｍの酢酸マグネシウム、２０％ｗ／ｖＰＥＧ３３５０を含有するウェル溶液中で成長させた。データ収集のために、結晶は、２５％ＰＥＧ４００を補充した母液を含有する溶液に移し、次いで、液体窒素中で凍結した。回折データセットは先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＰＳ）において集め、ＸＤＳプログラムで処理した。分子置換ソリューションは、ＦＫＢＰ１２（ＰＤＢ－ＩＤ２ＰＰＮ）およびＰＴＰ１Ｂ（ＰＤＢ－ＩＤ２ＮＴ７）の公表された構造を検索モデルとして使用して、ＣＣＰ４スイートにおけるプログラムＰＨＡＳＥＲを使用して得た。それに続くモデル構成および精密化は、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４およびＣＯＯＴを伴う標準的なプロトコルによって行った。
結果：ＦＫＢＰ１２－Ｃ３ＳＬＦ－ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの全体的構造：結晶は、非対称単位でＦＫＢＰ１２－Ｃ３ＳＬＦ－ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの２個の複合体分子を含有する（図９Ａ）。モデルは、ＦＫＢＰ１２の残基Ｇｌｙ２からＧｌｕ１０８、およびＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣのＧｌｕ６からＰｈｅ２８０を含んだ。このように得られた電子密度は、リガンドの配向およびコンホメーションを含めた明確な結合モードを示す。タンパク質のシステイン、およびリガンドからの硫黄から生じたジスルフィドについて連続的な電子密度が観察された。
複合体の総埋込面積は、１，０４２Å２である。ＰＴＰ１ＢＳ１８７Ｃの埋込面積は、４２７Å２である。Ｃ３－ＳＬＦの埋込面積は、６１５Å２である（図９Ｂ）。ＰＴＰ１ＢＳ１８７ＣおよびＦＫＢＰ１２の間のタンパク質－タンパク質インターフェースは、疎水性および極性相互作用の両方によって形成される。
Ｄ．ＭＣＬ１Ｓ２４５Ｃ／Ｃ３ＳＬＦ／ＦＫＢＰ５２三元複合体の結晶構造決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のリガンド（Ｃ３－ＳＬＦ）（自社製）、ＦＫＢＰ５２（自社製、残基１～１４０）、ＭＣＬ１Ｓ２４５Ｃｌｉｔｅ（自社製、Ｓ２４５Ｃ／Ｃ２８６Ｓを含有する残基１７２～３２７）。
装置：スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））、グリフォン（Ｇｒｙｐｈｏｎ）（アートロビンズインストルメンツ（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））
実験プロトコル：Ｃ３ＳＬＦおよびＦＫＢＰ５２は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、７５ｍＭのＮａＣｌ緩衝液、２％ＤＭＳＯ中、３：１の過剰モルでＭＣＬ１Ｓ２４５Ｃｌｉｔｅと混合し、４℃にて２４～４８時間インキュベートした。純粋な複合体は、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および７５ｍＭのＮａＣｌ中、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーによって単離した。精製した複合体（１５ｍｇ／ｍｌでの）は、シッティングドロップ蒸気拡散法を使用して２０℃にて結晶化スクリーニングに供した。結晶は、２．１Ｍのリンゴ酸を含有するウェル溶液中で成長させた。データ収集のために、結晶は２０％グリセロールを補充した母液を含有する溶液に移し、次いで、液体窒素中で急速冷凍した。３．０Å分解能回折データセットは先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）（ＡＰＳ）において測定し、ＸＤＳプログラムで処理した。分子置換ソリューションは、ＦＫＢＰ５２（ＰＤＢ－ＩＤ１Ｎ１Ａ）およびＰＴＰ１Ｂ（ＰＤＢ－ＩＤ３ＭＫ８）の公表された構造を検索モデルとして使用して、ＣＣＰ４スイートにおけるプログラムＰＨＡＳＥＲを使用して得た。それに続くモデル構成および精密化は、ソフトウェアパッケージＣＣＰ４およびＣＯＯＴを伴う標準的なプロトコルによって行った。
結果：結晶は、非対称単位でＭＣＬ１Ｓ２４５Ｃ／Ｃ３ＳＬＦ／ＦＫＢＰ５２の１個の複合体分子を含有する（図１０）。このように得られた電子密度は、リガンドの配向およびコンホメーションを含めた２つのタンパク質の間の明確な結合を明らかにした。タンパク質のシステイン、およびリガンドからの硫黄から生じたジスルフィドについて連続的な電子密度が観察された。複合体の埋込面積は１，４１０Å２であり、このうち、概ね６０％は、ＦＫＢＰ５２（８０４Å２）が寄与し、概ね４０％は、Ｃ３－ＳＬＦ（６０６Å２）が寄与する。制限された分解能によって、タンパク質－タンパク質およびタンパク質－リガンド相互作用における詳細な分析は、実行可能でなかった。
実施例６：ＴＲ－ＦＲＥＴによる複合体形成の決定
ＴＲ－ＦＲＥＴ技術（ＬＡＮＣＥ、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））は、２つの融合タグ付きタンパク質、例えば、タンパク質１／タグＡおよびタンパク質２／タグＢ（ここで、ＡおよびＢは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）、ＦＬＡＧ、ビオチン－ａｖｉ、Ｍｙｃ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）のいずれかであり得る）の二元会合を検出する標準的方法である。この実施例において、この技術は、プレゼンタータンパク質と標的タンパク質との化合物が促進する会合を測定するために使用される。プレゼンタータンパク質／タグＡおよび標的タンパク質／タグＢの混合物は、本発明の化合物を含有する３８４ウェルアッセイプレートに加え、１５分間インキュベートする。抗融合タグＡまたはＢユウロピウム－キレートドナー、および抗融合タグＡまたはＢアロフィコシアニンアクセプターまたはユーライト（Ｕｌｉｇｈｔ）アクセプター試薬の混合物を加え、反応物を２４０分間インキュベートする。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは、励起＝３２０ｎｍ、発光＝６６５／６１５ｎｍを使用してエンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））上で読み取る。三元複合体形成を促進する化合物は、ＤＭＳＯ対照ウェルに対してＴＲ－ＦＲＥＴ比の増加を引き出すものと同定される。
ＴＲ－ＦＲＥＴによるＣＹＰＡ－化合物３－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ複合体形成の決定
Ａｖｉタグ付きシクロフィリンＡおよびＨｉｓタグ付きＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰは増加する濃度のリガンド（化合物３）と混合し、室温にて１５分間インキュベートし、三元複合体の形成を可能とした。次いで、抗Ｈｉｓ Ｅｕ－Ｗ１０２４およびストレプトアビジンＡＰＣの事前混合物を加え、６０分間インキュベートした。ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルは、エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、Ｅｘ３２０ｎｍ、Ｅｍ６６５／６１５ｎｍ）上で読み取る。プレゼンターおよび標的タンパク質を伴わないカウンタースクリーンをまた実行して、化合物単独の寄与を除外する。
試薬および機器
・Ｈｉｓ６－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ（自社製；残基１～１６９）；ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中１．２ｍＭ
・Ａｖｉ－ＣＹＰＡ（自社製；残基１～１６５）；ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中５５６μＭ
・抗Ｈｉｓ Ｅｕ－Ｗ１０２４（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・ストレプトアビジンＡＰＣ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・リガンド（Ｗ２１４８７）、１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭ
・エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・８チャネル少容量カセットを伴うコンビ（Ｃｏｍｂｉ）マルチドロップ（Ｍｕｔｉｄｒｏｐ）液体ディスペンサー
・３８４ウェルプロキシプレート（ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ）（ブラック）
実験プロトコル
１．モスキート（Ｍｏｓｑｕｉｔｏ）を使用して、１００ｎＬ／ウェルの化合物（ＤＭＳＯ中変化する濃度）を３８４ウェルブラックプロキシプレート（ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ）中に分注し、アッセイレディプレート（ＡＲＰ）を作製する。
２．４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡおよび０．００４％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する２×アッセイ緩衝液を作製する。
３．１×アッセイ緩衝液中で２×ＰＲＥ－ＭＩＸ Ａ：１００ｎＭのＨｉｓ６－ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ－ＧＴＰ（１～１６９）および１０００ｎＭのＡｖｉ－ＣｙｐＡ（１～１６５）を作製する。
４．マルチドロップ（ＭｕｔｉＤｒｏｐ）コンビ（Ｃｏｍｂｉ）を使用して、２×ＰＲＥ－ＭＩＸ ＡをＡＲＰ、５μｌ／ウェル中に分注する。室温にて１５分インキュベートする。
５．２×ＰＲＥ－ＭＩＸ Ｂ：１０ｎＭの抗Ｈｉｓ Ｅｕ－Ｗ１０２４および４０ｎＭのＳＡ ＡＰＣを作製する。
６．マルチドロップ（ＭｕｔｉＤｒｏｐ）コンビ（Ｃｏｍｂｉ）を使用して、２×ＰＲＥ－ＭＩＸ ＢをＡＲＰ、５μｌ／ウェル中に分注する。コンビ（Ｃｏｍｂｉ）上で短時間振盪し、室温で６０分インキュベートする。
７．エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）上で読み取る（Ｅｘ：３２０ｎｍ；Ｅｍ１：６１５ｎｍ；Ｅｍ２：６６５ｎｍ）。
８．ドットマティクス（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用してデータを処理する。４パラメータ非線形フィットを使用して曲線をフィットさせ、三元複合体の形成についてのＥＣ５０値を決定する。
結果：結合曲線（図１１）は、２．１μＭの計算したＥＣ５０値を伴う、ＣＹＰＡ－化合物３－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ三元複合体の化合物３に依存する複合体形成を示す。
実施例７：増幅発光近接ホモジニアスアッセイによる複合体形成の決定
アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）技術（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））は、２つの融合タグ付きタンパク質、例えば、タンパク質１／タグＡおよびタンパク質２／タグＢ（ここで、ＡおよびＢは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）、ＦＬＡＧ、ビオチン－ａｖｉ、Ｍｙｃ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）のいずれかであり得る）の二元会合を検出する標準的方法である。この実施例において、この技術は、プレゼンタータンパク質と標的タンパク質との化合物が促進する会合を測定するために使用される。プレゼンタータンパク質／タグＡおよび標的タンパク質／タグＢの混合物は本発明の化合物を含有する３８４ウェルアッセイプレートに加えられ、１５分間インキュベートする。抗融合タグＡまたはＢアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）ドナービーズおよび抗融合タグＡまたはＢアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）アクセプタービーズの混合物を加え、反応物を２４０分間インキュベートする。アルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）シグナルは、励起＝６８０ｎｍ、発光＝５８５ｎｍを使用してエンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））上で読み取る。三元複合体形成を促進する化合物は、ＤＭＳＯ対照ウェルに対してアルファスクリーン（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）シグナルの増加を引き出すものと同定される。
アルファＬＩＳＡによるＣＹＰＡ－化合物３－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ複合体形成の決定
Ａｖｉタグ付きシクロフィリンＡおよびＨｉｓタグ付きＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰは増加する濃度のリガンド（化合物３）と混合し、室温にて６０分間インキュベートし、三元複合体の形成を可能とした。次いで、ニッケルキレートドナービーズおよびストレプトアビジンアクセプタービーズの事前混合物を加え、６０分間インキュベートした。アルファＬＩＳＡ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）シグナルは、エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、Ｅｘ６８０ｎｍ、Ｅｍ６１５ｎｍ）上で読み取る。プレゼンターおよび標的タンパク質を伴わないカウンタースクリーンをまた実行して、化合物単独の寄与を除外する。
試薬および機器：
・Ｈｉｓ６－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ（自社製；残基１～１６９）；ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中１．２ｍＭ
・Ａｖｉ－ＣＹＰＡ（自社製；残基１～１６５）；ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中５５６ｕＭ
・ニッケルキレートドナービーズ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・ストレプトアビジンアクセプタービーズ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・リガンド（Ｗ２１４８７）、１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭ
・エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））
・８チャネル少容量カセットを伴うコンビ（Ｃｏｍｂｉ）マルチドロップ（Ｍｕｔｉｄｒｏｐ）液体ディスペンサー
・アルファプレート（ａｌｐｈａＰｌａｔｅ）－３８４プレート（ホワイト）
実験プロトコル：
１．モスキート（Ｍｏｓｑｕｉｔｏ）を使用して、１００ｎＬ／ウェルの化合物（ＤＭＳＯ中変化する濃度）を３８４ウェルブラックプロキシプレート（ＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ）中に分注し、アッセイレディプレート（ＡＲＰ）を作製する。
２．４０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００４％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有する２×アッセイ緩衝液を作製する。
３．１×アッセイ緩衝液中で２×ＰＲＥ－ＭＩＸ Ａ：３００ｎＭのＨｉｓ６－ＫＲａｓ Ｇ１２Ｃ－ＧＴＰ（１～１６９）および３００ｎＭのＡｖｉ－ＣｙｐＡ（１～１６５）を作製する。
４．マルチドロップ（ＭｕｔｉＤｒｏｐ）コンビ（Ｃｏｍｂｉ）を使用して、２×ＰＲＥ－ＭＩＸ ＡをＡＲＰ、５μｌ／ウェル中に分注する。室温にて６０分インキュベートする。
５．２×ＰＲＥ－ＭＩＸ Ｂ：３０μｇ／ｍｌのストレプトアビジンアクセプタービーズおよび３０μｇ／ｍｌのニッケルキレートドナービーズを作製する。
６．マルチドロップ（ＭｕｔｉＤｒｏｐ）コンビ（Ｃｏｍｂｉ）を使用して、２×ＰＲＥ－ＭＩＸ ＢをＡＲＰ、５μｌ／ウェル中に分注する。コンビ（Ｃｏｍｂｉ）上で短時間振盪し、室温で６０分インキュベートする。
７．エンビジョン（ＥｎＶｉｓｉｏｎ）上で読み取る（Ｅｘ：６８０ｎｍ；Ｅｍ１：６１５ｎｍ）。
８．ドットマティクス（Ｄｏｔｍａｔｉｃｓ）を使用してデータを処理する。４パラメータ非線形フィットを使用して曲線をフィットさせ、三元複合体の形成についてのＥＣ５０値を決定する。
結果：結合曲線（図１２）は、０．９９μＭの計算したＥＣ５０値を伴う、ＣＹＰＡ－化合物３－ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ三元複合体の化合物３に依存する複合体形成を示す。
実施例８：等温滴定熱量測定による複合体形成の決定
等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、２つのタンパク質、またはリガンドへのタンパク質の二元相互作用と関連する熱変化を直接測定するために使用される確立された生物物理学的技術である。熱変化の測定は、会合定数（Ｋａ）、反応化学量論（Ｎ）、および結合エンタルピーの変化（ΔＨ）の正確な決定を可能とする。ギブスエネルギー変化（ΔＧ）およびエントロピー変化（ΔＳ）はまた、関係：ΔＧ＝－ＲＴｌｎＫａ＝ΔＨ－ＴΔＳ（式中、Ｒは、気体定数であり、Ｔは、絶対温度である）を使用して決定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの結合（例えば、非共有結合または共有結合）を測定するために使用される。
ＩＴＣによるＦＫＢＰ１２－化合物１およびＣＥＰ２５０の間の結合の速度論および熱力学の決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物１および化合物２（自社製）、タンパク質緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）、アッセイ緩衝液（タンパク質緩衝液＋１％ＤＭＳＯ）、ＦＫＢＰ１２（自社製）、ＣＥＰ２５０２９．４（自社製、残基１９８２～２２３１）およびＣＥＰ２５０１１．４（自社製、残基２１３４～２２３１）。
装置：ＭｉｃｒｏＣａｌ（商標）ＩＴＣ２００（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））。機器パラメータは、表６において示す。
実験プロトコル：ＦＫＢＰ１２ストック溶液をアッセイ緩衝剤で１０μＭに希釈する（最終１％ＤＭＳＯ）。化合物を２０μＭになるようにＦＫＢＰ１２に添加し（最終１％ＤＭＳＯ）、５～１０分のプレインキュベーション時間の後、二元複合体をＩＴＣ装置の反応セルに充填する。ＣＥＰ２５０タンパク質ストックをアッセイ緩衝剤中５０μＭになるように希釈し、２０μＭ化合物を追加し（最終１％ＤＭＳＯ）、その後、注入シリンジに充填する。シリンジから反応セルに注入する際、操作アーチファクトおよび滴定剤の希釈に伴う熱を決定するために、化合物の不在下で対照実験も行う。より詳細な実験パラメータは、以下の表７に示される。
データフィッティング：以下の手順に従ってオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）ＩＴＣ２００ソフトウェアによりデータのフィッティングを行った。
１）生データの読込み。
２）「ｍＲａｗｌＴＣ」：積分ピークおよびベースラインを調整してすべてのピークを積分する。
３）「ΔＨ」－データ管理：不良データを除去し（注入＃１および他のアーチファクト）、直線を差し引く（バックグラウンド除去）。
４）「ΔＨ」－モデルフィッティング：部位モデルの１セットを選択し、χ２がさらに減少しなくなるまでレーベンバーグ・マーカートアルゴリズムを用いてフィッティングを行い、「ｄｏｎｅ」で終了する（パラメータＮ、Ｋａ、およびΔΗはフィッティング基づいて計算する）。
結果：ＦＫＢＰ１２－化合物１およびＦＫＢＰ１２－化合物２二元複合体とＣＥＰ２５０との結合のＩＴＣ測定は、以下の表８および図１３にまとめる。全体として、ＣＥＰ２５０１１．４およびＣＥＰ２５０２９．４に結合するＦＫＢＰ１２－化合物１およびＦＫＢＰ１２－化合物２二元複合体のデータは、類似の相互作用パラメータを示す。Ｋｄ値はすべての組合せで類似していた。すべての相互作用は、ほとんど同一の熱力学的プロファイルを示し、結合は、純粋エンタルピー結合モードにより特徴付けられる（－Ｔ＊ＡＳ項は正であり、ギブズ自由エネルギーに寄与しない）。すべての相互作用に対する結合化学量論比は、Ｎ＝０．５～０．６であり、ＣＥＰ２５０１１．４／化合物１／ＦＫＢＰ１２の結晶構造で実証されるように２種のＦＫＢＰ１２分子に結合する１種のＣＥＰ２５０ホモ二量体に対して１：２の結合比を支持する。
実施例９：表面プラズモン共鳴によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の速度論の決定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、２つのタンパク質、またはリガンドへのタンパク質の二元相互作用と関連する速度論を測定するために使用される生物物理学的技術である。典型的には、二元相互作用ペアの１つの構成要素は、融合タグを介して活性化センサーチップのフローセル上に固定化されている。次いで、増加する濃度の第２の構成要素（分析物）を活性表面上に一定の時間の間注入する。会合相の間のＳＰＲシグナル（共鳴単位、ＲＵで表す）の増加、および解離相の間のＳＰＲシグナルの減少は相互作用を示し、結合モデルにフィットさせ、関連するＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ値を決定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明のコンジュゲートの結合についての速度論を測定するために使用され、ここで、（ｉ）コンジュゲートは、融合タグを介してチップ上に固定化されており、表面上にプレゼンタータンパク質を注入するか、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質は、融合タグを介してチップ上に固定化されており、表面上にコンジュゲートを注入する。
ＳＰＲによるＦＫＢＰ１２－化合物１およびＣＥＰ２５０の間の結合の速度論の決定
このプロトコルは、固定化されたＦＫＢＰ１２－化合物１の二元複合体（リガンド）へのＣＥＰ２５０（分析物）の結合についての速度論（ＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）を決定する方法として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する。
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物１（自社製）、１０×ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＢＲ－１００６－７１）、アッセイ緩衝液（１×ＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液、１％ＤＭＳＯ、１μＭの化合物１）、１２×ＨＩＳタグ付きＦＫＢＰ１２（自社製）、ＣＥＰ２５０２９．２（残基１９８２～２２３１）およびＣＥＰ２５０１１．４（残基２１３４～２２３１）（自社製）。
装置：ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）Ｘ１００（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
装置：ＮＴＡセンサーチップ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ＢＲ－１０００－３４）
実験プロトコル：実験は２５℃にて行う。１２ＸＨＩＳタグ付きＦＫＢＰ１２のストック溶液は、１μＭの化合物１を含有するアッセイ緩衝液中で１００ｎＭに希釈する（最終１％ＤＭＳＯ）。概ね２００～４００ＲＵのＦＫＢＰ１２は、活性化ＮＴＡチップの２つのフローセルの１つ上に固定化されている。第２のフローセルは、センサーチップへの分析物の非特異的相互作用についての参照として活性化されない。１μＭの化合物１（最終１％ＤＭＳＯ）を含有する同じアッセイ緩衝液に段階希釈した様々な濃度のＣＥＰ２５０（１ｎＭ～１μＭ範囲）は、１０μｌ／分の流量でＦＫＢＰ１２表面および参照表面上に注入する。表面は、３５０ｍＭのＥＤＴＡを伴う分析物の注入の間に再生成される。
データフィッティング：データフィッティングのためにビアエバルエーション（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ）ソフトウェアプログラムを使用する。全てのデータは、参照フローセルおよび緩衝液注入の両方に対して参照分を差し引く。速度論的分析のために、データは１：１相互作用モデルにローカルフィッティングする。
結果：ＳＰＲセンサーグラムは、図１４において示す。５．４ｎＭおよび０．２９ｎＭの解離定数（ＫＤ）は、それぞれ、ＣＥＰ２５０１１．４およびＣＥＰ２５０２９．２へのＦＫＢＰ１２／化合物１の結合について決定した。
実施例１０：バイオ層インターフェロメトリーによるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の速度論の決定
バイオ層インターフェロメトリー（inferometry ）（ＢＬＩ）は、２つのタンパク質、またはリガンドへのタンパク質の二元相互作用と関連する速度論を測定するために使用される生物物理学的技術である。典型的には、二元相互作用ペアの１つの構成要素は、融合タグを介してバイオセンサーチップ上に固定化されている。次いで、増加する濃度の第２の構成要素（分析物）は、バイオセンサーチップ上で一定の時間の間注入する。会合相の間のＢＬＩシグナル（光学的厚さ、ｎｍで表す）の増加、および解離相の間のＢＬＩシグナルの減少は相互作用を示し、結合モデルにフィットさせ、関連するＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ値を決定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明のコンジュゲートの結合についての速度論を測定するために使用され、ここで、（ｉ）融合タグを介してチップ上にコンジュゲートが固定化されており、表面上にプレゼンタータンパク質を注入するか、または（ｉｉ）融合タグを介してチップ上にプレゼンタータンパク質が固定化されており、表面上にコンジュゲートを注入する。
ＢＬＩによるＣＹＰＡ－化合物３およびＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰの間の結合の速度論の決定
このプロトコルは、固定化されたＣＹＰＡ－化合物３二元複合体（リガンド）へのＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ（分析物）の結合についての解離定数（ＫＤ）を決定する方法としてバイオ層インターフェロメトリー（ＢＬＩ）を利用する。
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物３（自社製）、フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）速度論緩衝液（フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）株式会社、メンローパーク、ＣＡ）、アッセイ緩衝液（速度論緩衝液、１％ＤＭＳＯ、２μＭの化合物３）、Ａｖｉタグ付きＣＹＰＡ（自社製）、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰ（残基１～１６９）（自社製）。 装置：オクテットレッド（Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ）９６機器（フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）株式会社、メンローパーク、ＣＡ）
装置：ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ））
実験プロトコル：ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーは、０．６ｎｍの充填シグナルまで１０μＭのＡｖｉ－ＣＹＰＡタンパク質を含有する溶液中で２５℃にてコーティングした。タンパク質の充填は、長期に亘る安定性、およびベースラインドリフトが存在しないことを示した。三元複合体の形成は、１：２希釈系列で２００μＭから開始するＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰタンパク質濃度を伴う用量応答実験において評価した。陰性対照について、Ａｖｉ－ＣＹＰＡタンパク質でコーティングしたセンサーは、スクリーニング緩衝液（２μＭの化合物３を補充）のみを含有するウェル中に浸漬した。補正した結合応答センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）は記録および分析した。
データフィッティング：フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）オクテットレッド（Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ）機器上の分析は、フォルテバイオ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）ソフトウェアを使用して行った。分析は、非特異的結合、バックグラウンド、およびシグナルドリフトを説明し、ウェルベースおよびセンサー可変性を最小化させる。三元複合体の用量依存的形成が観察され、対応する平衡解離定数（ＫＤ）が決定された。
結果：センソグラム（Ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）および定常状態フィッティング曲線は、図１５において示す。４４μＭの解離定数（ＫＤ）は、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰへのＣＹＰＡ／化合物３の結合について決定した。
実施例１１：架橋試薬のためのＦＫＢＰ１２結合標的タンパク質のプロテオミクス
同定試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物（自社製）、Ｎ末端ビオチン－ＦＫＢＰ１２（自社製）、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ライセート（自社製）。
実験プロトコル：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ライセートは、氷上の超音波処理（２０％パワーで４、１０秒パルス）を使用して、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．５％オクチル－ｂ－グルコシド、およびＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））からなる溶解緩衝液を使用して調製した。ライセートは遠心分離によって最初に清浄にしたが、このように得られた上清は氷上の０．２ｍｍのシリンジフィルターを通過させる。Ｎ末端ビオチン標識ＦＫＢＰ１２は、４ｍＭの最終濃度まで５００ｍｌのライセートに加え、ピペット処理によって混合し、次いで、化合物を１０ｍＭの最終濃度まで加え、反応物はピペット処理によって混合した。６０ｍＬの５０％スラリーアガロース－ストレプトアビジン樹脂（溶解緩衝液中で事前に平衡）を加えたが、反応は１時間穏やかに揺り動かしながら４℃にて進行させる。インキュベーションの後、樹脂を穏やかにペレット化し、添加、遠心分離、および吸引によって氷上の１ｍＬの溶解緩衝液で４回洗浄し、次いで、同じ物理的様式で、洗剤を伴わない１ｍＬの溶解緩衝液でさらに４回洗浄した。保持されたタンパク質は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の８Ｍの尿素、ｐＨ８．０を使用して樹脂から溶出させ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０で７Ｍの尿素に希釈し、エンドプロテアーゼＬｙｓ－Ｃをタンパク質消化のために３７℃にて２時間添加した。次に、試料を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を使用して０．８Ｍの尿素に希釈し、トリプシンを加え、試料をさらに１６時間３７℃にて消化させた。消化が完了した後、Ｃ１８ＳＰＥフィルターを使用してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために試料を調製し、このフィルターの上に、試料を充填し、洗浄し、溶出させ、スピードヴァク（ｓｐｅｅｄ－ｖａｃ）において乾燥させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のめに１０ｍｌの５％アセトニトリル、５％ギ酸緩衝液に最終的に懸濁させた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、トップ２０データ依存型取得方法、およびＨＰＬＣのための８～３５％アセトニトリル勾配を使用して、サーモ－フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）ＬＴＱ－ベロス－プロオービトラップ（Ｖｅｌｏｓ－Ｐｒｏ ＯｒｂｉＴｒａｐ）質量分析計上で行った。シークエスト（Ｓｅｑｕｅｓｔ）アルゴリズムを使用してペプチド配列を割り当てたが、同定したタンパク質は、候補標的タンパク質を同定するために対照試料（ＤＭＳＯのみ）と比較する。
結果：上記のプロトコルを使用して、＞１００個の標的タンパク質が、架橋化合物の存在下でプレゼンタータンパク質に結合することができると同定されてきた。同定された標的タンパク質は、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、ＤＮＡ結合タンパク質、熱ショックタンパク質、ＤＮＡヘリカーゼ、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、および種々のタンパク質結合タンパク質を含む。
実施例１２：蛍光偏光によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
蛍光偏光（ＦＰ）の技術は、蛍光標識分子が偏光によって励起されるとき、これは分子旋光度と反比例する偏光の程度を伴って光を発光するという観察に基づいている。小分子は励起状態の間に急速に回転し、発光によって、低い偏光値を有する。第２の分子への標識分子の結合によって形成される大きな複合体は、励起状態の間に僅かに回転し、したがって、高い偏光値を有する。蛍光のこの特性は、より大きなタンパク質との標識リガンドの相互作用を測定するために使用することができ、かつ直接および競合結合アッセイの基礎を提供する。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの結合を測定し、かつ標的タンパク質との三元複合体形成を確立するために使用される。
ＦＰによるＣｙｐＡ：Ｃ３ＤＳ：ＫＲＡＳ複合体形成の決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中のＣ３ＤＳ（自社製）、タンパク質緩衝液（１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、アッセイ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、ＣＹＰＡ（自社製）、Ｍａｎｔ－ＧＭＰ－ＰＮＰ充填ＫＲＡＳ（１～１６９残基）。
装置：スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）
実験プロトコル：ＫＲＡＳストック溶液は、アッセイ緩衝液（最終１％ＤＭＳＯ）中で０．８μＭの最終濃度まで充填する。化合物（Ｃ３ＤＳ）は１０μＭの最終濃度まで加え、反応混合物は３８４ウェルコスタール（Ｃｏｓｔａｒ）ブラックプレートに分注する。ＣＹＰＡはプレートのウェル中に段階希釈し、室温にて１５分間インキュベートする。化合物の非存在下での対照実験はまた、化合物の非存在下でのＫＲＡＳへのＣＹＰＡの会合を決定するために実行する。反応混合物は３５５ｎｍにおいて励起し、発光シグナルは４５５ｎｍにおいて記録する。シグナルは垂直平面および平行平面において測定し、偏光は下記の等式を使用して記録する。
ＦＰ（偏光単位×１０＾－３）＝シグナル（平行）－シグナル（垂直）／［シグナル（平行）＋シグナル（垂直）］
結果：代表的な曲線は図１６において示し、ＥＣ５０（ＫＲＡＳのＦＰシグナルを５０％増進するのに必要とされる濃度）を列挙する表は下記で列挙する。曲線は４パラメータ式にフィットさせたが、得られたＥＣ５０は、ＣＹＰＡおよびＫＲＡＳの間の結合を増進させることについてのリガンドＣ３ＤＳの効果を示す。
実施例１３：核磁気共鳴によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は、三次元構造を解明し、かつタンパク質およびタンパク質－リガンド複合体のダイナミクスを研究するために使用される技術である。さらに、これは、タンパク質－リガンド相互作用におけるリガンド結合部位を同定するために使用することができる。いくつかの利用可能なＮＭＲアプローチのうち、タンパク質構造をベースとするリガンドスクリーニング（高度に感受性である２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトル）、およびリガンド（薬物）結合に関わる重大な残基の同定は、このような研究のための最も感受性の方法である。タンパク質のＮＭＲ試料中への逐次的に増加する濃度のリガンドの添加、および２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣの収集は、化学シフト摂動（ＣＳＰ）と称される原子レベルの高度に分解された残基の摂動情報を提供し、これは利用可能な任意の他の生物物理学的技術では可能でないリガンド結合部位の同定についてのより正確な情報を直接的に提供する。このアプローチでは、タンパク質または二元タンパク質複合体へのリガンド結合の弱い、中間の、および強い親和性を研究することができ、この情報は既存の構造的、動的、および速度論情報に直接連結させることができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物（薬物）またはコンジュゲートの結合（例えば、非共有結合性もしくは共有結合性）を示すために使用される。
溶液ＭＲ分光法による三元複合体におけるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）－シクロフィリン－化合物３結合の決定
試薬：１００％ＤＭＳＯ中の化合物３（自社製）、タンパク質緩衝液（５０ｍＭのＴＲＩＳ－ｄ１１、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１ｍＭのＴＣＥＰ－ｄ１６、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、ＫＲＡＳのＮＭＲ試料中の添加物（９３％Ｈ２Ｏおよび７％Ｄ２Ｏ中の１００μＭのＤＳＳ）、アッセイ緩衝液（ＤＭＳＯ（≦５％）中のタンパク質緩衝液＋増加する当量の薬物）、ＧＭＰ－１５Ｎ－ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）－１６（Ｎ－Ｈｉｓ、残基１～１６９、自社製）、非標識（ＵＬ）シクロフィリン（ＣＹＰＡ；残基１～１６５）（自社製）。
装置：５ｍｍのＣＰＴＣＩ１Ｈ－１３Ｃ／１５Ｎ／Ｄ Ｚ－ＧＲＤ Ｚ４４９０９／００２６凍結探針（ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ））を備えたブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）アヴァンス（Ａｖａｎｃｅ）８００ＭＨｚ分光計。高精度の５ｍｍＮＭＲチューブは、これらの実験において使用する。
ＮＭＲデータプロセシングおよび分析：プロセシングのためにトップスピン（Ｔｏｐｓｐｉｎ）ｖ３．１およびＮＭＲＰｉｐｅ／ＮＭＲＤｒａｗ、ならびにデータ分析のためにＣＣＰＮＭＲ「分析」プログラムを実行するリナックス（Ｌｉｎｕｘ）コンピュータ。
実験プロトコル：タンパク質緩衝液中の０．７２ｍＭのＧＭＰ－１５Ｎ－ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）－１６ストック溶液は、６００μｌ（ＮＭＲ添加物を含めた）中の０．１８ｍＭのＮＭＲ試料を調製するために使用した。ＤＳＳは、化学シフト参照のための内部標準として使用した（０．０ｐｐｍでの１Ｈピーク）。１５Ｎ ＫＲＡＳの２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルを集めた（データサイズ、２０４８×１２８）。タンパク質緩衝液中の１当量（０．１８ｍＭ）のＣＹＰＡは、（０．４ｍＭのストック溶液から）ＮＭＲ試料中に加え、１０分間撹拌した。最終ＮＭＲ試料容量は、６００μｌに維持した。二元複合体（１５Ｎ－ＫＲＡＳ＋ＵＬ－ＣＹＰＡ）の２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルは、他の取得パラメータを同じに維持しながら集めた（データサイズ２０４８×１２８）（ＫＲＡＳ１Ｈ－１５Ｎ相関クロスピークのみは、スペクトルにおいて可視である）。１００％ＤＭＳＯ中の２０ｍＭの化合物３のストック溶液は、ＮＭＲ滴定のために使用した。ＮＭＲ試料中に化合物３を逐次的に加え、二元複合体（１５Ｎ－ＫＲＡＳ＋ＵＬ－ＣＹＰＡ）のＮＭＲ試料中で（１５Ｎ－ＫＲＡＳ濃度のそれに対して）その０．５当量、１．０当量、２．５当量、および５．０当量を得た。各段階において、取得パラメータを同じに維持しながら、６００μｌの試料容量を維持した。化合物３添加の各段階において、２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルは、ＫＲＡＳ残基の化学シフト摂動（ＣＳＰ）を調査するために取得した。全てのスペクトルは、互いに重ねた。それぞれの化合物３滴定ポイントにおける有効なＣＳＰは、二元複合体（ＫＲＡＳ＋ＣＹＰＡ）に対する三元複合体（ＫＲＡＳ＋ＣＹＰＡ＋化合物３）におけるＫＲＡＳの各残基の化学シフトの差異を使用して決定する。それに続いて、各ＫＲＡＳ残基の加重平均化学シフト（Δδ加重）は、下記の式を使用して決定する：
Δδ加重＝［（Δ１Ｈ）２＋（Δ１５Ｎ／５）２］１／２
総平均から１標準偏差超のΔδ加重を引き出す残基は、有意に摂動されていると考えられ、結合部位マッピングにおいて使用される。別々の滴定実験において、本発明者らは、ＤＭＳＯ当量を逐次的に加え（上記の実験におけるのと同等の溶媒濃度を満たすため）、ＤＭＳＯ添加からの寄与を減算することによって、二元複合体（ＫＲＡＳ＋ＣＹＰＡ）に対する２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルを集めた。第２の対照実験において、本発明者らは、（ＣＹＰＡの非存在下で）異なる当量において化合物３で滴定した１５Ｎ－ＫＲＡＳの一連の２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルを集めた。
有効なＣＳＰは、作表および分析する。ＫＲＡＳの薬物結合残基（ＣＹＰＡの存在下）は、タンパク質表面上にマッピングする。解離定数、ＫＤを決定する。
実験およびプロセシングパラメータ：
スペクトルデータサイズ：２０４８（１Ｈ次元）×１２８（１５Ｎ次元）
スキャンの数：４
温度：２９８Ｋ
クワドラチャ検出モード：ＤＱＤ（１Ｈ）およびエコー－アンチエコー（Ｅｃｈｏ－ＡｎｔｉＥｃｈｏ）（１５Ｎ）
データサイズは、間接次元内で前向後向線形予測を適用することによって拡張した。データセットは、フーリエ変換の前に各次元において１回ゼロ補充することによって外挿した。
結果：ＫＲＡＳＧ１２Ｃ－ＧＴＰの２Ｄ１Ｈ－１５Ｎ ＴＲＯＳＹ－ＨＳＱＣスペクトルは、図１７Ａにおいて示す。化学量論量のＣＹＰＡを加えることは、ＫＲＡＳアミド骨格クロスピークに対して効果を有せず（図１７Ｂ）、ＫＲＡＳおよびＣＹＰＡが直接相互作用しないことを示す。ＣＹＰＡ：ＫＲＡＳの１：１試料へのＷ２１４８７の滴定は、ＫＲＡＳとの直接の相互作用を示す明確な化学シフトを引き出す（図１７Ｃ）。
実施例１４．マイクロスケール熱泳動によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）は、分子の分子特性、例えば、サイズ、定方向温度勾配におけるその移動性に対するコンホメーションにおける変化を相関させることによる、生体分子相互作用の特性決定のための技術である。勾配の生成は、赤外レーザーによって誘発される。生体分子の動きは、共有結合的に付着したフルオロフォアまたはそれどころか変化蛍光を使用して分子を標識することによって特性決定されることが多い。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの結合を測定し、かつ標的タンパク質との三元複合体形成を確立するために使用され、ここで、（ｉ）コンジュゲートは、フルオロフォアで標識されており、プレゼンタータンパク質は滴定されるか、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質は、フルオロフォアで標識されており、コンジュゲートは滴定される。
実施例１５．第２次高調波発生技術によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
第２次高調波発生（ＳＨＧ）は、水溶液中のコンホメーション変化をリアルタイムで測定するために使用することができる光学現象である。ＳＨＧシグナル強度は、表面に連結されたタンパク質を標識した色素の平均角度配向に対して感受性であり、シグナル変化の大きさは角度変化の量と直接相関する。異なるコンホメーションは、結合によるシグナル変化の大きさ、ベースラインに対するシグナル（表面生成正シグナル変化に対してより垂直配向、逆の場合も同じ）および速度論によって分類することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの結合を測定し、かつ標的タンパク質との三元複合体形成を確立するために使用され、ここで、（ｉ）色素標識されたコンジュゲートは、融合タグを介して表面上に固定化されており、プレゼンタータンパク質は、表面上に注入されるか、または（ｉｉ）色素標識されたプレゼンタータンパク質は、融合タグを介して表面上に固定化されており、コンジュゲートは、表面上に注入される。
実施例１６．示差走査蛍光分析によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）は、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）を測定するために使用される溶液をベースとする生物物理学的技術である。典型的な実験において、目的のタンパク質は、蛍光色素（例えば、ＳＹＰＲＯオレンジ）の存在下で上昇する熱（典型的には、４℃～９５℃）に供される。蛍光強度は温度の関数としてプロットされ、Ｔｍは蛍光シグナルの負の派生最小から計算する。標的タンパク質について、小分子の存在下での熱シフト（ΔＴｍ）は、小分子がタンパク質に結合し、安定化させるかをアセスメントするために測定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの熱シフト（例えば、非共有結合または共有結合）を測定するために使用され、ここで、（ｉ）コンジュゲートは蛍光色素で標識されており、プレゼンタータンパク質は滴定されるか、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質は蛍光色素で標識されており、コンジュゲートは滴定される。
実施例１７．ナノＤＳＦによるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
ナノＤＳＦは、変化トリプトファンまたはチロシン蛍光を使用してタンパク質のＴｍを測定するための高度なＤＳＦ方法である。典型的な実験において、目的のタンパク質は上昇する熱（典型的には、４℃～９５℃）に供され、内因性トリプトファンまたはチロシン残基の蛍光強度は温度の関数としてモニターされる。Ｔｍは、トリプトファン蛍光強度の変化から、または３３０ｎｍおよび３５０ｎｍでのトリプトファン発光の速度から計算することができ、これはアンフォールディングによるトリプトファン発光のシフトを説明する。標的タンパク質について、小分子の存在下でのΔＴｍは、小分子がタンパク質に結合し、かつ安定化させるかをアセスメントするために測定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの熱シフト（例えば、非共有結合または共有結合）を測定するために使用され、ここで、（ｉ）コンジュゲートの蛍光は測定され、プレゼンタータンパク質は滴定されるか、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質の蛍光はモニターされ、コンジュゲートは滴定される。
実施例１８．示差光散乱による複合体形成の決定
動的光散乱（ＤＬＳ）は、ランダムなブラウン運動を起こしている散乱強度における時間依存的変動を測定するために使用される確立された生物物理学方法である。拡散係数および粒径情報は、これらの変動の分析から得ることができる。さらに具体的には、この方法は、水溶液中のタンパク質の半径および分子量を含めたサイズの特徴を測定する能力を提供する。この実施例において、この方法は、（ｉ）本発明のコンジュゲートの結合によるプレゼンタータンパク質、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質への結合による本発明のコンジュゲートにおける、半径または分子量における変化を測定するために使用される。
実施例１９．音波音響技術によるコンジュゲートおよびタンパク質の間の結合の決定
表面音波（ＳＡＷ）技術は、バイオセンサーに沿って進む表面音波の相におけるシフトのモニタリングによる、結合に誘発されるコンホメーション変化のリアルタイム検出のために使用される生物物理学的方法である。これは、２つのタンパク質またはリガンドへのタンパク質の二元相互作用と関連する速度論を測定するために使用することができる。典型的には、二元相互作用ペアの１つの構成要素は、融合タグを介してバイオセンサー上に固定化されている。次いで、第２の構成要素（分析物）の増加する濃度は、バイオセンサー上に一定の時間の間注入する。会合相の間のシグナルの増加（波相または振幅における変化によって測定）、および解離相の間のシグナルの減少は、相互作用を示し、かつ結合モデルにフィットさせて、関連するＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ値を決定することができる。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明のコンジュゲートの結合についての速度論を測定するために使用され、ここで、（ｉ）コンジュゲートは、融合タグを介してバイオセンサーチップ上に固定化されており、プレゼンタータンパク質は表面上に注入されるか、または（ｉｉ）プレゼンタータンパク質。
実施例２０：小角Ｘ線散乱による複合体形成の決定
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）は、平均粒径および形状に関してタンパク質の構造を決定するために使用する溶液をベースとする方法である。これは、１～２５ｎｍの分解能範囲、およびサイズが１５０ｎｍまでの部分的規則系における反復距離の構造上の情報を送達することができる。超小角散乱（ＵＳＡＳ）は、さらにより大きな次元を分解することができる。典型的な散乱実験において、タンパク質またはタンパク質複合体の溶液は、Ｘ線（典型的には、概ね０．１５ｎｍの波長λを伴う）に曝露される。散乱強度Ｉ（ｓ）は、運動量輸送の関数として記録する（ｓ＝４πｓｉｎθ／λ、式中、２θは、入射放射および散乱放射の間の角度である）。溶液の強度から、溶媒のみからの散乱を減算する。次いで、Ｘ線散乱曲線（散乱角に対する強度）は、タンパク質またはタンパク質複合体の低分解能モデルを生じさせるために使用する。この実施例において、この方法は、プレゼンタータンパク質への本発明の化合物またはコンジュゲートの三元複合体（例えば、非共有結合または共有結合）の存在を同定するために使用する。
他の実施形態
その詳細な説明と併せて本開示を記載してきた一方で、上記の説明は、本開示の範囲を例示するが、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を制限しないことを意図することを理解すべきである。他の態様、利点、および変更は、下記の特許請求の範囲内である。 当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている本発明による特定の実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができる。本発明の範囲は、上記の説明に制限されることを意図せず、むしろ添付の特許請求の範囲において記載されている通りである。 特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、逆のことが示されない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り、１つもしくは複数を意味し得る。群の１つもしくは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または記載内容は、群メンバーの１つ、複数、または全部が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する場合、逆のことが示されない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り、満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する実施形態を含む。本発明は、群メンバーの複数、または全てが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられているか、またはその他の点で関連する実施形態を含む。
用語「含むこと」はオープンであることを意図し、さらなる要素またはステップを含むことを許容するが、含むことを必要としないことがまた留意される。用語「含むこと」が本明細書において使用されるとき、用語「からなること」がこのようにまた包含および開示される。
範囲が与えられる場合、エンドポイントが含まれる。さらに、他に示さない限り、または文脈および当業者の理解からその他の点で明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態において任意の特定の値、または記述した範囲内の部分範囲を想定することができることを理解すべきである。 さらに、従来技術の範囲内にある本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つもしくは複数から明確に除外し得ることを理解すべきである。このような実施形態は当業者には公知であると見なされるため、たとえ、除外が本明細書において明確に記載されなくてもこのような実施形態は除外し得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意のポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるタンパク質；生成の任意の方法；使用の任意の方法）は、従来技術の存在に関連するかどうかを問わず、何らかの理由によって、任意の１つもしくは複数の特許請求の範囲から除外することができる。

Claims (13)

  1. プレゼンタータンパク質結合部分および架橋基を含む化合物または医薬的に許容可能な塩において、前記架橋基が、アミノ酸と化学選択的反応をすることができる部分であり、前記プレゼンタータンパク質結合部分は、化学式ＩＶの構造

    を有し、式中、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、およびＺ６は、それぞれ独立に、ヒドロキシル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキルであるか、あるいはＺ３およびＺ４またはＺ５およびＺ６は合わさって、これらが付着している原子と共に、任意選択で置換されている１０～４０メンバーの大環状分子を形成し、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、またはＲ５の少なくとも１つは、前記架橋基への付着点を含み、ｅは、０、１、２、３、または４であり、Ｒ５は、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ６は、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキルであり、各Ｒ７は、独立に、ヒドロキシル、シアノ、任意選択で置換されているアミノ、ハロゲン、チオール、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６ヘテロアルキニル、任意選択で置換されているＣ３～Ｃ１０カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリル、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ８は、水素、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および任意選択で置換されているＣ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記架橋基は、化学式Ｉの構造を有し、

    式中、波線は、前記化合物の残部への前記架橋基の付着点を示し、
    ａは、０、１、または２であり、
    ＲＡは、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６ヘテロアルキル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリール、または任意選択で置換されているＣ２～Ｃ９ヘテロアリールである、化合物または医薬的に許容可能な塩。
  2. ＲＡがピリジルである、請求項１に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  3. 前記架橋基が、構造

    を含み、式中、波線は前記化合物の残部への前記架橋基の付着点を示す、請求項２に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  4. ＲＡがメチルである、請求項１に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  5. 前記架橋基が、構造

    を含み、式中、波線は前記化合物の残部への前記架橋基の付着点を示す、請求項４に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  6. 前記プレゼンタータンパク質結合部分が、構造

    を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  7. 前記タンパク質結合部分および前記架橋基が、リンカーを介して接合し、
    前記リンカーが、化学式Ｖの構造
    Ａ１－（Ｂ１）ｆ－（Ｃ１）ｇ－（Ｂ２）ｈ－（Ｄ）－（Ｂ３）ｉ－（Ｃ２）ｊ－（Ｂ４）ｋ－Ａ２
    化学式Ｖ
    を有し、式中、Ａ１は、前記リンカーおよびタンパク質結合部分の間の結合であり、Ａ２は、前記架橋基および前記リンカーの間の結合であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４は、それぞれ独立に、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ２アルキル、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ３ヘテロアルキル、Ｏ、Ｓ、およびＮＲＮから選択され、ＲＮは、水素、任意選択で置換されているＣ１～４アルキル、任意選択で置換されているＣ２～４アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～４アルキニル、任意選択で置換されているＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択で置換されているＣ６～１２アリール、または任意選択で置換されているＣ１～７ヘテロアルキルであり、Ｃ１およびＣ２は、それぞれ独立に、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルから選択され、ｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋは、それぞれ独立に、０または１であり、Ｄは、任意選択で置換されているＣ１～１０アルキル、任意選択で置換されているＣ２～１０アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～１０アルキニル、任意選択で置換されているＣ２～６ヘテロシクリル、任意選択で置換されているＣ６～１２アリール、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ１０ポリエチレングリコール、または任意選択で置換されているＣ１～１０ヘテロアルキル、またはＡ１－（Ｂ１）ｆ－（Ｃ１）ｇ－（Ｂ２）ｈ－を－（Ｂ３）ｉ－（Ｃ２）ｊ－（Ｂ４）ｋ－Ａ２を連結している化学結合である、請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  8. 前記リンカーが、化学式ＶＩの構造

    を有し、式中、Ａ１は、前記リンカーおよびタンパク質結合部分の間の結合であり、
    Ａ２は、前記架橋基および前記リンカーの間の結合であり、
    ｌは、０、１、２、または３であり、
    ｍは、０または１であり、
    ｎは、０、１、または２であり、
    Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立に、非存在、Ｏ、Ｓ、－Ｃ≡Ｃ－、ＣＲ９Ｒ１０またはＮＲ１１であり、各Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立に、水素、任意選択で置換されているＣ１～Ｃ６アルキル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルケニル、任意選択で置換されているＣ２～Ｃ６アルキニル、任意選択で置換されているアリール、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、任意選択で置換されているＣ６～Ｃ１０アリールＣ１～Ｃ６アルキル、および任意選択で置換されているＣ３～Ｃ７カルボシクリルＣ１～Ｃ６アルキルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  9. 前記リンカーが、構造

    を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩。
  10. 構造

    を有する化合物または医薬的に許容可能な塩。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  12. 標的タンパク質をモジュレートする方法に用いるための請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩、または請求項１１に記載の組成物であって、前記方法が、前記標的タンパク質と、モジュレーション量の前記化合物または前記医薬的に許容可能な塩または前記組成物とを接触させることを含むものである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩、または請求項１１に記載の組成物。
  13. プロリルイソメラーゼ活性を阻害する方法に用いるための請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩、または請求項１１に記載の組成物であって、前記化合物または医薬的に許容可能な塩と前記プロリルイソメラーゼとの間の複合体の形成を可能とする条件下で、前記プロリルイソメラーゼを発現している細胞と、前記化合物または医薬的に許容可能な塩、または前記組成物とを接触させ、それによって、プロリルイソメラーゼ活性を阻害する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物または医薬的に許容可能な塩、または請求項１１に記載の組成物。
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