FI98197C - Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI98197C
FI98197C FI883597A FI883597A FI98197C FI 98197 C FI98197 C FI 98197C FI 883597 A FI883597 A FI 883597A FI 883597 A FI883597 A FI 883597A FI 98197 C FI98197 C FI 98197C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
antibody
tumor
enzyme
pva
cells
Prior art date
Application number
FI883597A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI98197B (fi
FI883597A (fi
FI883597A0 (fi
Inventor
Mark G Saulnier
Joseph P Brown
Peter D Senter
David E Kerr
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/211,301 external-priority patent/US4975278A/en
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI883597A0 publication Critical patent/FI883597A0/fi
Publication of FI883597A publication Critical patent/FI883597A/fi
Publication of FI98197B publication Critical patent/FI98197B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI98197C publication Critical patent/FI98197C/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6899—Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy [ADEPT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

98197
Menetelmä sytotokslsten aineiden kasvainsolulhln toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi 5 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää sytotoksls ten aineiden kasvainsolulhln toimittamiseen käyttökelpoisten vasta-aine-entsyymikonjugaattien valmistamiseksi. Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut, sytotokslsten aineiden toimittamiseen käyttökelpoiset kasvaln-10 spesifiset vasta-aine-entsyymikonjugaatit sitoutuvat kas-vainsoluihin ja pystyvät muuttamaan heikosti toksisen esi-lääkkeen kasvaimen alueella vasta-aineeseen sidotun entsyymin läsnä ollessa aktiiviseksi sytotoksiseksi lääkkeeksi. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut vasta-aine-15 entsyymikonjugaatit voittavat monet syöpien ja muiden kas vainten hoidossa nykyisin käytettävien vasta-ainevälit-teisten lääkkeentoimitussysteemien haitat.
Immunokonjugaattien käyttö sytotokslsten aineiden selektiivisessä toimituksessa kasvainsolulhln syövän hoi-20 dossa on alalla tunnettu. Sytotokslsten aineiden toimitus kasvainsolujen alueelle on hyvin toivottua, koska näiden aineiden kokonaisvaltainen anto johtaa usein normaalien solujen tappoon kehon sisällä yhtä hyvin kuin eliminoitavaksi tarkoitettujen kasvainsolujen tappoon. Niin ollen 25 nykyisin käytettyjen kasvaimen vastaisen lääkkeen toimi- t 4 4 : .* tussysteemien mukaisesti sytotoksinen aine konjugoidaan • · *.V kasvainspesifiseen vasta-aineeseen muodostamaan immunokon- ϊ^ϊ jugaatti, joka sitoutuu kasvainsolulhln ja siten "toimit taa" sytotoksisen aineen kasvaimen alueelle. Näissä koh- . 30 dennussysteemeissä käytetyt imiiiunokon jugaatit sisältävät • · · .·;·. vasta-aine-lääkekonjugaatit [katso esim. R. W. Baldwin et • · · ai., "Monoclonal Antibodies for Cancer Treatment", • *
Lancet, sivut 603 - 605 (maaliskuun 15, 1986)] ja vasta-aine-toksiinikonjugaatit [katso esim. P. E. Thorpe, "Anti-35 body Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A ,··, Review", teoksessa Monoclonal Antibodies '84; Biological 2 98197 and Clinical Applications, A. Pinchera et al. (toim.), sivut 475 -506 (1985)].
Sekä polyklonaalisia että monoklonaalisia vasta-aineita on käytetty näissä inununokonjugaateissa [katso 5 esim. K. Ohkawa et ai., "Selective In Vitro and In Vivo Growth Inhibition Against Human Yolk Sac Tumor Cell Lines by Purified Antibody Against Human alfa-Fetoprotein Conjugated with Mitomycin C via Human Serum Albumin", Cancer Immunol. Immunother. 23 (1986) 81 - 86, ja G. F. 10 Rowland et al., "Drug Localisation and Growth Inhibition Studies of Vindesine-Monoclonal Anti-CEA Conjugates in a Human Tumour Xenograft", Cancer Immunol. Immunother. 21 (1986) 183 - 187]. Näissä inununokonjugaateissa käytetyt lääkkeet sisältävät daunomysiinin [katso esim. J. Gallego 15 et al., "Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-Tumour Activity", Int. J. Cancer 33 (1984) 737 - 744, ja R. Arnon et al., "In Vitro and In Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-Tumour Antibodies", Immunological Rev. 62 (1982) 20 5-27], metotreksaatin [N. Endo et al., "In Vitro Cyto toxicity of a Human Serum Albumin-Mediated Conjugate of Methotrexate with Anti-MM46 Monoclonal Antobody", Cancer
* * I
. Research 47 (1987) 1 076 - 1 080], mitomysiini C:n (K. Oh kawa et al., supra) ja vindesiinin (G. F. Rowland et al., ;·/ 25 supra). Vasta-aine-toksiinikonjugaateissa käytetyt toksii- * · · ·* nit sisältävät bakteeritoksiineja, kuten kurkkumätätoksii- .*.* nin, ja kasvien toksiineja, kuten risiinin [katso esim. F.
*.·.* L. Moolten et al., "Antibodies Conjugated to Potent
Cytotoxins as Specific Antitumor Agents", Immunol. Rev. 62 : 30 (1982) 47 - 73].
• · ·
Huolimatta tutkimusmäärästä, joka on suunnattu im- « .* . munokonjugaattien käyttämiseksi terapeuttisiin tarkoituk- • · siin, useita näihin toimitustapoihin liittyviä rajoituksia on tullut ilmeisiksi [katso esim. M. J. Embleton, 35 "Targeting of Anti-Cancer Therapeutic Agents by Monoclonal Antibodies", Biochemical Society Transactions 14, sivut 98197 3 393 - 395 (615. kokous, Belfast, 1986)]. Ensiksikin niin suurta lääkemäärää, joka on toimitettava kohdekasvainso-luun solun tappamiseksi, ei usein saada, mikä johtuu rajoituksista, jotka johtuvat solujen pinnalla olevien, kas-5 vaimeen assosioituneiden antigeenien määrästä ja lääke-molekyylien määrästä, joka voidaan sitoa mihin tahansa tiettyyn vasta-ainemolekyyliin. Tämä rajoitus on johtanut voimakkaampien sytotoksisten aineiden, kuten kasvitoksiinien, käyttöön näissä konjugaateissä ja polymeerisidottu-10 jen vasta-aine-lääkekonjugaattien kehittämiseen, joilla konjugaateilla on erittäin korkea lääkemultiplisiteetti-suhde [katso esim. P. E. Thorpe, supra, sivut 475 - 506 ja R. W. Baldwin et ai., "Design and Therapeutic Evaluation of Monoclonal Antibody 791T/36-Methotrexate Conjugates", 15 teoksessa Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, sivut 215 - 231 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]. Kuitenkin vaikka käytetään suuria lääkemäärien suhteita tai vahvoja toksiineja, monet immunokonjugaatit yhä osoittavat suboptimaa-lista sytotoksista aktiivisuutta eivätkä kykene tappamaan 20 täydellisesti annoksilla, joilla kaikki käytettävissä olevat antigeenikohdat ovat kyllästettyjä.
Toiseksi on havaittu, että immunokonjugaatin syto-toksinen aktiivisuus on usein riippuvainen sen sisäänotos- , . ta kasvainsoluun, jota sisäänottoa välittää konjugaatin
' * I
·;'t· 25 vasta-ainekomponentti [katso esim. J. M. Lambert et ai., « · · : ·' "Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human • · \V Lymphoid Cells", J. Biol. Chem. 260(22) (1985) 12 035 - • * ;.V 12 041]. Tämä sisäänotto on ratkaisevaa, kun käytetään vasta-aine-lääkekonjugaattia, jossa lääkkeen vaikutuskohta : 30 on solun sisällä tai kun käytetään vasta-aine-toksiini- «·« ·*£' konjugaatteja. Kuitenkaan verrattomasti suurinta osaa kas- , , vaimeen assosioituneista antigeeneistä, ja niin ollen nii- * t * hin antigeeneihin sitoutuneista vasta-aine-lääke-tai vas-ta-aine-toksiinikonjugaateista, ei oteta sisään. Ne konju-' 35 gaatit, jotka otetaan sisään, kuljetetaan usein solun ly- sosomiin, jossa lääke tai toksiini hajotetaan [katso E. S.
4 98197
Vitetta et al., Science 238 (1987) 1 098 - 1 104], Sen mukaisesti vaikka vasta-aine-lääke- tai vasta-aine-toksii-nikonjugaatilla saattaa olla erinomaiset kasvaimeen si-toutumisominaisuudet, konjugaatti voi kuitenkin olla ra-5 joitetusti sytotoksisesti hyödyllinen, mikä johtuu sen kyvyttömyydestä saavuttaa sen vaikutuskohde solun sisällä.
Lisäksi on näytetty hyvin toteen, että kasvainsolu-populaatiot ovat usein heterogeenisiä antigeenlekspression suhteen [katso esim. A. P. Albino et ai., "Heterogeneity 10 In Surface Antigen And Glycoprotein Expression Of Cell Lines Derived From Different Melanoma Metastases Of The Same Patient", J. Exp. Med. 154 (1981) 1 764 - 1 778]. Edelleen on näytetty toteen, että antigeenipositiiviset kasvainsolut voivat tuottaa antigeeninegatiivisia jälke-15 Iäisiä [katso esim. M. Yeh et ai., "Clonal Variation For Expression Of A Human Melanoma Antigen Defined By A Monoclonal Antibody", J. Immunol. 126(4) (1981) 1 312 -1 317]. Niin ollen missä tahansa kasvainsolupopulaatiossa on tietty määrä soluja, jossa ei ole antigeeniä, jolle 20 tietty immunokonjugaatti on spesifinen. Näin ollen immuno- konjugaatti ei kykene sitoutumaan näihin soluihin ja välittää niiden tappoa.
j'·.. Näiden haittojen johdosta nykyisin käytettävillä kasvaimen vastaisen lääkkeen tai toksiinin toimitussystee- : 25 meillä on ollut rajoitettu määrä menestystä, varsinkin kun • « · ’•V niitä on käytetty in vivo hoidossa.
• · *. I Yllä keskusteltujen immunokonjugaattien lisäksi on • · · I I tutkittu vasta-aine-entsyymikonjugaatteja in vitro yhdessä i « · '·*·' toisen kohdentamattoman entsyymin kanssa jodidin tai ars- 30 fenamiinin muuttamiseksi niiden myrkyllisiksi muodoiksi vasta-ainevälitteisen sytotoksisuuden vahvistamiseksi • · · V · [katso esim. C. W. Parker et ai., "Enzymatic Activation
And Trapping Of Luminol-Substituted Peptides And Proteins. A Possible Means Of Amplifying The Cytotoxicity Of Anti-35 Tumor Antibodies", Proc. Natl. Acad. Scl. USA 72(1) (1975) 338 - 342, ja G. W. Philpott et al., "Affinity Cytotoxi- 98197 5 city Of Tumor Cells With Antibody-Glucose Oxidase Conjugates, Peroxidase, And Arsphenamine", Cancer Research 34 (1974) 2 159 -2 164].
Näiden in vitro tutkimusten mukaisesti glukoosiok-5 sidaasientsyymi kiinnitetään vasta-aineeseen ja käytetään yhdessä kohdentamattoman peroksidaasientsyymin kanssa muuttamaan jodidi tai arsfenamiini sytotoksiseksi jodiksi tai arsenikaaliksi, vastaavassa järjestyksessä. Tämä lähestymistapa ei niin ollen vaadi ainoastaan glukoosioksi-10 daasin kohdistamista kasvainsoluihin vasta-aineen avulla vaan vaatii myös kahden muun kohdentamattoman aineen läsnä olon kasvaimen alueella. Todennäköisyys, että nämä kaikki kolme ainetta ovat läsnä in vivo kasvaimen alueella samaan aikaan, on pieni, ja siksi tämä lähestymistapa to-15 dennäköisesti ei ole terapeuttisesti tärkeä.
F. Jansen et al.'n Ca-patentti 1 216 791, myönnetty tammikuun 20, 1987, esittää ammoniumioneja substraateista vapauttamaan kykenevän entsyymin konjugoimisen vasta-aineeseen. Ammonium-ionien on sitten sanottu vahvistavan 20 tiettyjen kasvaimen alueelle kohdistettujen immunotoksii-nien sytotoksista vaikutusta.
Lopuksi EP-84 302 218.7 esittää menetelmän sairaiden solujen populaation, kuten kasvaimen, hoitamiseksi, jossa menetelmässä vasta-ainetta käytetään kohdistamaan :25 ei-metabolisoituva antigeeni kasvainsoluihin. Antigeeni • · « *!V akkumuloituu ainakin osaan kasvainsoluja, jotka sitten • · *. I hajoavat vapauttaen antigeenin kaikkialla läsnä olevaan, • · · * * kasvaimen alueella muodostuneeseen nappaavaan fibonektii- • · · *·*·* nimatriisiin. Tässä vaiheessa keksinnön menetelmässä lisä- 30 tään jodia sisältävä ligandi, joka on spesifinen matrii-siin kiinnitetylle antigeenille sitoutuen siihen. Sytotok- • · · V ' sinen jodi toimii sitten tappaen kasvainsolut sillä koh dalla. Tässä hakemuksessa esitetään monia vaihtoehtoisia suoritustapoja, joista yksi ehdottaa vasta-aine-entsyymi- I f . 35 konjugaatin käyttöä entsyymin kohdistamiseksi kasvaimen .alueelle ja ei-kuolettavan substraatin lisäämisen, jonka - 98197 6 entsyymi voi muuttaa sytotoksiseksi aineeksi (katso EP-hakemus, sivut 34 - 35). Kuitenkaan missään tässä hakemuksessa ei ole mitään esitystä siitä, miten tällainen suoritustapa tulee tehdä. Samalla tavalla Hellström et 5 ai., "Antibodies For Drug Delivery", teoksessa Controlled Drug Delivery (2. painos), Robinson ja Lee (toim.), sivu 639 (1987), ehdottavat, että "lääkkeitä, jotka ovat myrkyttömiä, kunnes ne 'aktivoidaan' aineella (esim. entsyymillä), joka on sijoitettu kasvaimeen, voidaan pitää toi-10 sena lähestymistapana...".
Tähän mennessä kukaan ei ole kuitenkaan esittänyt tai ehdottanut, kuinka tässä esitetty lähestymistapa voidaan suorittaa, eikä kukaan ole myöskään todella yrittänyt tätä lähestymistapaa lääkkeen kohdistamisessa.
15 Esillä oleva keksintö omistautuu yllä mainituille ongelmille esittämällä menetelmän sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisten vasta-aine-entsyymikonjugaattien valmistamiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti entsyymi, joka kykenee muuttamaan heikosti 20 sytotoksisen tai ei-sytotoksisen esilääkkeen aktiiviseksi sytotoksiseksi lääkkeeksi, konjugoidaan kasvainspesifiseen vasta-aineeseen. Tätä vasta-aine-entsyymikonjugaattia annetaan kasvaimen omaavalle nisäkäsisännälle, ja se sitoutuu vasta-aineen spesifisyydestä johtuen niiden kasvainso-25 lujen pinnalle, joissa on kasvainantigeenia, jolle vasta- • · « 98197 7 tigeenikohtaa vastaan tehdyn vasta-aineen, voidaan käyttää muuttamaan esilääke sytotoksisemmiksi muodoiksi.
Niinpä esillä oleva keksintö koskee menetelmää sy-totoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyt-5 tökelpoisen vasta-aine-entsyymikonj ugaatin valmistamiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että kasvainsolujen pinnalla olevan antigeenin kanssa reagoiva kasvainspesi-finen monoklonaalinen vasta-aine konjugoidaan entsyymiin, joka kykenee muuttamaan heikosti sytotoksisen esi lääkkeen, 10 jolla on kaava 0 OH 0 15 (I) H3c-n—η 20 jossa: R1 on H, ja R3 on OH tai OCH3; tai R1 on OH ja R3 on 0CH3; ja 25 R2 on H tai OH, « 4 · 'lY sen aktiivisemmaksi vastaavaksi emolääkkeeksi suorittaen • · ♦ *. ;* vaihe, jossa kasvainspesifinen monoklonaalinen vasta-aine • · · *·’·’ ja entsyymi saatetaan reagoimaan heterobifunktionaalisten *.*·" aineiden kanssa niin, että vasta-aineen ja entsyymin vä- 30 lille muodostuu tioeetteri- tai disulfidisidos.
Tämän keksinnön edullisen suoritustavan mukaisesti s"rvalmistetaan penisilliini-V-amidaasientsyymiä ("PVA) sisältävää vasta-aine-entsyymikonjugaattia, jota käytetään yhdessä uuden esilääkkeen, N-(p-hydroksifenoksiasetyyli)-35 adriamysiinin, kanssa aiheuttamaan kasvainsolun kuolema.
8 98197 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja immunokon-jugaatteja ja esilääkkeitä voidaan käyttää kasvainten vastaisissa koostumuksissa, kuten niissä, jotka sisältävät farmaseuttisesti tehokkaan määrän ainakin yhtä keksinnön 5 mukaisesti valmistettua immunokonjugaattia tai esilääkettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa. Lisäksi immu-nokonjugaatteja ja esilääkkeitä voidaan käyttää yhdistelminä, ja nisäkästä hoidetaan farmaseuttisesti tehokkaalla määrällä tällaisia yhdistelmiä.
10 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut immunokonjugaatit tai esilääkkeet sekä niitä sisältävät farmaseuttiset koostumukset ja yhdistelmät antavat edullisesti suhteellisen yksinkertaisen ja suoran menetelmän sytotoksisten lääkkeiden toimittamiseksi kasvainsoluihin 15 sallien kohonneen selektiivisen sytotoksisuuden samalla välttäen heterogeenisesta antigeeniekspressiosta, antigee-ni/vasta-aineen sisäänotosta ja lääkkeen riittämättömästä voimakkuudesta aiheutuneet ongelmat, jotka kuuluvat luonnostaan tavanomaisiin, vasta-ainevälitteisiin immunotera-20 piatekniikoihin.
Kuvio 1 kuvaa esilääkkeiden aktivaatioon käytettyä strategiaa kasvainsoluissa, jotka sitovat vasta-aine-ent-syymikonjugaatteja.
Kuvio 2 kuvaa seuraavia SDS-polyakrylamidigeeliana-25 lyysejä (5 - 12,5-%:inen gradienttigeeli, ei-pelkistävä): *!V (A) 96.5-AP-immunokonjugaatti; (B) L6-AP-immunokonjugaat- ; ti; (C) AP; (D) monoklonaalinen vasta-aine 96.5; ja (E) • · · *·*·* monoklonaalinen vasta-aine L6.
• · *·*·* Kuvio 3 kuvaa adriamysiiniesilääkkeen ("APO") ke- 30 miallisen rakenteen ja sen valmistuksen adriamysiinistä.
« *.j.: Kuvio 4 on vertaileva graafinen esitys vapautuneen : adriamysiinin määrästä ajan funktiona APOtn reagoidessa ,<' ; Δ: vapaan penisilliini-V-amidaasientsyymin tai 0 ja keksinnön mukaisesti valmistetun L6-PVA-konjugaatin kanssa « · 35 konsentraatioissa 10 ja 100 pg kokona!sproteiinia/ml, vas- • 98197 9 taavassa järjestyksessä. Reaktion kulkua seurattiin HPLC:llä.
Kuvio 5 kuvaa L6-monoklonaalisen vasta-aineen ja L6-PVA- ja lF5-PVA-konjugaattien suhteellista sitoutumista 5 H2981-kasvainsoluihin.
Kuvio 6 on vertaileva graafinen esitys 3H-tyraidii-nin inkorporaation inhibitiomäärästä H2981-kasvainsolujen DNA:hän, joita soluja käsiteltiin O: adriamysiinillä (ADM), ·: APOilla, Δ: L6-PVA+AP0:lla tai i: 1F5-PVA+ 10 APOilla. Diagramma osoittaa sytotoksisen aktiivisuuden kohoamista, joka havaittiin, kun kasvainsoluja esikäsitel-tiin L6-PVA-konjugaatilla, mitä seurasi APO-käsittely verrattuna aktiivisuuteen, joka havaittiin käsittelemällä AP0:lla yksinään.
15 Kuvio 7 kuvaa L6- ja lF5-monoklonaalisten vasta- aineiden ja keksinnön mukaisesti valmistettujen L6-PVA- ja lF5-PVA-konjugaattien suhteellista sitoutumista Daudi-lym-foomasoluihin.
Kuvio 8 on vertaileva graafinen esitys 3H-tymidii-20 nin inkorporaation inhibitiomäärästä Daudi-lymfoomasolujen DNA:hän, joita soluja käsiteltiin ·: ADM:llä, 0: AP0:lla, : L6-PVA+APO:11a tai D: 1F5-PVA+APO:11a. Diagramma osoittaa sytotoksisen aktiivisuuden kohoamisen, joka havaittiin, kun kasvainsoluja esikäsiteltiin lF5-PVA-konjugaa-25 tiliä, mitä seurasi APO-käsittely, verrattuna sytotoksi-seen vaikutukseen, joka havaittiin käsiteltäessä soluja *. ; ainoastaan AP0:lla.
• · · ·*·* Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä • ψ 9 * · ·*·' valmistettujen immunokonjugaattien avulla sytotoksisia ai- 30 neita voidaan toimittaa kasvainsoluihin ja saada aikaan parannettu selektiivinen kasvainsolu j en tappo syöpien, kuten karsinoomien ja melanoomien, sekä myös muiden kasvainten hoitamiseksi.
Nisäkäsisännälle, jolla on kasvain, annetaan vas- « i . 35 ta-aine-entsyymikonjugaattia, joka koostuu kasvainspesifi- 9019/ 10 sestä vasta-aineesta, joka on liitetty entsyymiin, joka kykenee muuttamaan esilääkkeen, joka on vähemmän sytotok-sinen kasvainsoluille kuin emolääke, aktiivisemmaksi emo-lääkkeeksi. Annettaessa isännälle konjugaatin vasta-aine-5 komponentti, joka reagoi kasvainsoluista löytyvän antigeenin kanssa, kohdistaa konjugaatin kasvaimen alueelle ja sitoutuu kasvainsoluihin. Vasta-aineen voidaan näin ollen katsoa toimittavan entsyymi kasvaimen alueelle. Sitten isännälle annetaan esilääkettä, joka on entsyymin subst-10 raatti, ja se muutetaan kasvaimen alueella entsyymin toimesta aktiiviseksi sytotoksiseksi lääkkeeksi. Lääke aktivoidaan näin ollen solun ulkopuolella, ja se voi diffun-doitua kaikkiin alueella oleviin kasvainsoluihin, nimittäin niihin soluihin, jotka omaavat tietyn kasvainantigee-15 nin, jolle konjugaatin vasta-aine on spesifistä ja joihin vasta-aine on sitoutunut, kuin myös niihin soluihin, jotka ovat tämän antigeenin suhteen negatiivisia mutta ovat silti läsnä kasvaimen alueella (katso kuvio 1). Näin voitetaan nykyiset kasvainantigeenin heterogeenisyydestä ja an-20 tigeeni/vasta-aineen sisäänottotarpeesta aiheutuvat ongelmat, jotka liittyvät tavanomaisiin immunokonjugaattivä-litteisiin lääkkeen toimitustekniikoihin.
Lisäksi koska esillä oleva menetelmä ei vaadi, että lääke on suoraan sidottu vasta-aineeseen ja siten rajoita 25 lääkkeen määrää, joka voidaan toimittaa, yleistä ongelmaa 4 i 4 "V lääkkeen vahvuudesta kasvaimen alueella ei synny. Tosi- • · 1 asiassa kasvaimen alueella olevien aktiivisten lääkemole- • · 9 *;*·* kyylien määrä moninkertaistuu, koska konjugaatin vasta- » · · *·*·* aineeseen sidottu entsyymi voi läpikäydä useita substraa- 30 tin muutosprosesseja yhä uudelleen muuttaen esilääkkeen » i.:.: aktiiviseksi lääkkeeksi. Lisäksi aktiivinen lääke vapaute- i:: taan spesifisesti kasvaimen alueella eikä muissa kudoksis- ; sa. Tämä johtuu siitä, että entsyymin konsentraatio kas- ‘ vaimen alueella on korkeampi kuin sen konsentraatio muissa I * 35 kudoksissa, koska kasvainsolut peittyvät vasta-aine-ent-syymikonj ugaatilla.
11 - 98197
Keksinnön immunokonjugaatin vasta-ainekomponentti on vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti kasvainspesifi-seen antigeeniin. Esimerkkejä sellaisista vasta-aineista ovat, mutteivät rajoitu mainittuihin, ne, jotka sitoutuvat 5 spesifisesti antigeeneihin, joita löydetään karsinoomista, melanoomista, lymfoomista ja luun sekä pehmeän kudoksen sarkoomista kuin myös muista kasvaimista. Vasta-aineita, jotka jäävät sitoutuneiksi solun pinnalle pidemmiksi ajoiksi tai jotka otetaan sisään hyvin hitaasti, pidetään 10 edullisina. Nämä vasta-aineet voivat olla polyklonaalisia tai edullisesti monoklonaalisia, voivat olla koskemattomia vasta-ainemolekyylejä tai fragmentteja, jotka sisältävät vasta-aineen aktiivisen sitomiskohdan, esim. Fab tai F(ab')2/ ja joita voidaan tuottaa käyttäen alalla hyvin 15 vakiintuneita tekniikoita [katso esim. R. A. DeWeger et ai., "Eradication Of Murine Lymphoma And Melanoma Cells By Chlorambusil-Antibody Complexes", Immunological Rev. 62 (1982) 29 - 45 (tuotettu kasvainspesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita ja käytetty konjugaateissa); M. Yeh et ai., 20 "Cell Surface Antigens Of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibodies", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (1979) 2 927; J. P. Brown et al., "Structural Characterization Of Human Melanoma-Associated Antigen p97 With Monoclonal Antibodies", J. Immunol. 127(2) (1981) 539 - 546 25 (tuotettu kasvainspesifisiä monoklonaalisia vasta-ainei- « > i *!*.* ta); ja J. P. Mach et al., "Improvement Of Colon Carcinoma • · * \ Imaging: From Polyclonal Anti-CEA Antibodies And Static • · · *·*·' Photoscanning To Monoclonal Fab Fragments And ECT", teok- « « * V.‘ sessa Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And The- 30 rapy, R. W. Baldwin et al. (toim.), sivut 53 - 64, Aca-*.·,· demic Press, 1985 (tuotettu vasta-ainefragmentteja ja käy- •*ttetty kasvainsolujen paikallistamiseen)]. Lisäksi, jos käytetään monoklonaalisia vasta-aineita, vasta-aineet voivat olla hiiri- tai ihmisalkuperää tai kimeerisiä vasta- * 1 · i 1 , 35 aineita [katso esim. V. T. Oi, "Chimeric Antibodies", Bio- ..y Techniques. 4(3) (1986) 214 - 221].
t I
98197 12
Keksinnön mukaisesti valmistetun immunokonjugaatin entsyymikomponentti on entsyymi, Joka kykenee toimimaan mainitulla esilääkkeellä sillä tavalla, että se muuttaa sen aktiivisemmaksi, sytotoksisemmaksi muodoksi. Termi 5 "esilääke" tässä hakemuksessa käytettynä viittaa farmaseuttisesti aktiivisen aineen prekursori- tai johdannais-muotoon, joka on vähemmän sytotoksinen kasvainsoluille verrattuna emolääkkeeseen ja joka kyetään aktivoimaan tai muuttamaan entsymaattisesti aktiivisemmaksi emomuodoksi 10 [katso esim. D. E. V. Wilman, "Prodrugs In Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14, sivut 375 - 382 [615. kokous, Belfast 1986), ja V. J. Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach To Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, R. Borchardt et al.
15 (toim.), sivut 247 - 267 (Humana Press 1985)].
Tämän keksinnössä käyttökelpoisia entsyymejä ovat mm. penisilliiniamidaasit, kuten penisilliini-V-amidaasin tai penisilliini-G-amidaasin, jotka ovat käyttökelpoisia muutettaessa lääkkeet, jotka ovat niiden amiinin typpien 20 suhteen fenoksiasetyyli- tai fenyyliasetyyliryhmäjohdannaisia, vastaavassa järjestyksessä, vapaiksi lääkkeiksi. Vaihtoehtoisesti entsymaattista aktiivisuutta omaavia vasta-aineita, jotka tunnetaan alalla myös abtsyymeinä, voidaan käyttää muutettaessa esilääkkeitä vapaiksi, aktiivi-25 siksi lääkkeiksi [katso esim. R. J. Massey, Nature 328 *!*.* (1987) 457 - 458]. Vasta-aine-abtsyymikonjugaatit voidaan • · · ·. ;* valmistaa tässä kuvatulla tavalla abtsyymin toimittamisek- • · · *·** si kasvainsolupopulaatioon.
*·*.* Tässä keksinnössä käytetyt entsyymit voivat olla 30 kovalenttisesti sidottuja keksinnössä käytettyihin vasta- aineisiin alalla hyvin tunnetuilla tekniikoilla, kuten käyttämällä heterobifunktionaalisia ristisidosreagensseja SPDP:tä (N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaat-! ti) tai SMCC:tä (sukkinimidyyli-4-(N-maleimidometyyli)syk- . * 35 loheksaani-l-karboksylaatti) [katso esim. P. E. Thorpe et ,,'j’ al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Anti- 13 - 98197 body-Toxin Conjugates", Immunological Rev. 62 (1982) 119 -158; J. M. Lambert et al., supra, sivulla 12 038; 6. F. Rowland et al., supra, sivuilla 183 - 184 ja J. Gallego et al., supra, sivuilla 737 - 738]. Vaihtoehtoisesti voidaan 5 rakentaa fuusioproteiineja, jotka koostuvat ainakin vasta-aineen antigeeniä sitovasta alueesta liitettynä ainakin entsyymin funktionaalisesti aktiiviseen alueeseen käyttämällä alalla hyvin tunnettuja yhdistelmä-DNA-tekniikoita [katso esim. M. S. Neuberger et al., Nature 312 (1984) 10 604 - 608]. Nämä fuusioproteiinit toimivat olennaisesti samalla tavalla kuin tässä kuvatut vasta-aine-entsyymikon-jugaatit.
Tämän keksinnön edullisen suoritustavan mukaisesti penisilliiniamidaasientsyymi kiinnitettiin kovalenttisesti 15 monoklonaaliseen vasta-aineeseen, L6:een, IgG2a-vasta-ai-neeseen, joka sitoutuu ihmisen keuhkokarsinoomasolujen glykoproteiiniantigeeniin [I. Hellström et al., "Antitumor Effects Of L6, An IgG2a Antibody That Reacts With Most Human Carcinomas", Proc. Natl. Acad. Scl. USA 83 (1986) 20 7059 - 7 063], ja tuloksena syntynyttä immunokonjugaattia käytettiin muuttamaan uusi adriamysiiniesilääke aktiiviseksi kasvaimen vastaiseksi lääkkeeksi, adriamysiiniksi. Tietty käytetty amidaasi oli Fusarium oxysporum -lajista eristetty penisilliini-V-amidaasi ("PVA"), joka hydrolysoi 25 fenoksiasetyylisidoksia. Niin ollen tietty käytetty esi- 'IV lääke oli N-(p-hydroksifenoksiasetyyli)adriamysiini • · · *. * ("APO"), jonka amidaasi hydrolysoi vapauttaen vahvan kas- • · · ’·’·* vaimen vastaisen aineen, adriamysiinin. L6-PVA-immunokon- • · * V.‘ jugaatti ei osoittanut mitään entsymaattisen aktiivisuuden 30 häviämistä verrattaessa ei-konjugoidun entsyymin vastaa- V.· vaan, ja suurin osa L6-vasta-aineen sitoutumisaktiivisuu- desta säilyi konjugaatissa.
In vitro tutkimustemme mukaisesti ihmisen keuhko-kasvainsolujen käsittely L6-PVA-konjugaatilla, mitä seura-. 35 si solujen altistus APO-esilääkkeelle, johti sytotoksisuu- teen, joka oli verrattavissa siihen, joka havaittiin kä- 98197 14 siteltäessä soluja adriamysiinillä yksinään. Mikä tärkeää, APO-esilääke yksinään osoitti paljon pienempää sytotoksi-suutta kasvainsoluja kohtaan.
Samanlaiset in vitro tutkimukset suoritettiin myös 5 käyttäen lF5-PVA-konjugaattia, jossa PVA-entsyymi oli kon-jugoitu lF5:een, monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka reagoi lymfoomasoluista löytyvän antigeenin kanssa. Daudi-lymfoomasolujen käsittely lF5-PVA-konjugaatilla, jota seurasi solujen altistus APO:lle, johti sytotoksisuuteen, 10 joka oli verrattavissa siihen, joka havaittiin käsittelemällä adriamysiinillä yksinään, kun taas solujen käsittely AP0:lla yksinään johti hyvin vähäiseen sytotoksisuuteen.
Tässä kuvattujen tietojen mukaan on ilmeistä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettu immunokonjugaatti/-15 esilääkeyhdistelmä antaa selektiivisen tavan kasvainsolu-jen tappamiselle, kun annetaan esilääkettä, jolla on pienentynyt sytotoksinen aktiivisuus, esilääkkeen muuttuessa korkeasti sytotoksiseen tilaan kasvainsolujen alueella siellä läsnäolevan, vasta-aineen avulla kohdistetun ent-20 syymin, johdosta. Lisäksi saavutettu sytotoksisuus on tullut tavanomaisia vasta-ainekohdistustekniikoita paremmaksi, koska kasvaimen alueella vapautettua aktiivista lääkettä ei haittaa fysikaaliset rajoitukset, jotka ottavat osaa vasta-aine-lääke-konjugaatti toimitussysteeroeihin, 25 kuten yllä on keskusteltu. Sen vuoksi on selvää, että tä- ”V män keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettu immuno- • · · \ 1 konjugaatti/esilääkeyhdistelmä parantaa selektiivistä sy- • · · • · · ’‘ totoksisuutta kasvainsolujen suhteen syöpien ja muiden • · * ’·*·* kasvainten hoidossa.
30 Eräs mahdollisuus hyödyntää tämän keksinnön mukai- ·.:.· sella menetelmällä valmistettu immunokonjugaatti/esilää- • · · :.ί ϊ keyhdistelmää on käyttää immunokonjugaattijoukkoa, jossa konjugaattien vasta-ainekomponentin spesifisyys vaihte-! lee, ts. käyttää joukkoa immunokonjugaatteja, joilla kul- . 35 lakin on vasta-aine, joka sitoutuu spesifisesti tutkitun . kasvaimen eri antigeeniin. Näiden immunokonjugaattien ent- 15 - 98197 syymikomponentti voi olla sama tai voi vaihdella. Tällainen käyttö voi olla erikoisen käyttökelpoinen tilanteissa, joissa eri antigeenien määrät kasvaimen pinnalla ovat tuntemattomia ja halutaan olla varmoja, että riittävästi 5 entsyymiä on kohdistettu kasvaimen alueelle. Kun käytetään konjugaattijoukon, jolla on erilaiset antigeenispesifi-syydet kasvaimelle, lisääntyy todennäköisyys saada aikaan riittävästi entsyymiä kasvaimen alueelle, jotta esilääke muuttuu. Lisäksi tällainen käyttö on tärkeä, jotta saavu-10 tetaan korkea spesifisyystaso kasvaimelle, koska todennäköisyys, että normaalikudos omaa kaikki samat kasvaimeen liittyvät antigeenit, on pieni [vertaa I. Hellström et ai., "Monoclonal Antibodies To Two Determinants Of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically In Complement-Depen-15 dent Cytotoxicity", J. Immunol. 127(1) (1981) 157 - 160].
Esillä olevan keksinnön mukaisia immunokonjugaatte-ja voidaan käyttää farmaseuttisissa koostumuksissa ja yhdistelmissä syöpien ja muiden kasvainten hoitamiseksi. Tällaiset yhdistelmät koostuvat keksinnön mukaisesti val-20 mistetuista vasta-aine-entsyymikonjugaateista ja vastaavasta esilääkkeestä käytettäväksi kasvainten hoitamiseksi, jossa nisäkäsisäntää hoidetaan farmaseuttisesti hyväksyt-tävällä tavalla farmaseuttisesti tehokkaalla määrällä vas-ta-aine-entsyymikonjugaattia tai -konjugaatteja ja farma-25 seuttisesti tehokkaalla määrällä esilääkettä. Yhdistelmä • · « • · · ’!*.* on käyttökelpoinen minkä tahansa nisäkkään hoidossa, mu- • · · *. ** kaan lukien ihmiset, koirat, kissat ja hevoset.
• · ·
Edullisesti vasta-aine-entsyymikonjugaattia anne-*.*·* taan ennen esilääkkeen antamista isännälle. Riittävän ajan 30 pitää antaa kulua konjugaatin ja esilääkkeen antamisen välillä, jotta sallitaan entsyymin kohdistuminen ja si-:T: joittuminen konjugaatin vasta-aineen avulla kasvaimen ,·! . alueelle. Sellainen riittävä aika voi vaihdella 12 tunnis ta yhteen viikkoon riippuen käytetystä konjugaatista.
4 · 35 Konjugaatit ja esilääkkeet voidaan antaa käyttäen tavanomaisia antotapoja mukaan lukien anto laskimoon, vat- 98197 16 saonteloon, suun kautta, imusuonistoon ja suoraan kasvaimeen. Laskimoon antamista suositellaan.
Koostumusten - käsittäen immunokonjugaatit tai esi-lääkkeet - annosmuodot voivat olla erilaisia käsittäen mm.
5 nestemäiset liuokset tai suspensiot, tabletit, pillerit, pulverit, peräpuikot, polymeeriset mikrokapselit tai mik-rovesikkelit, liposomit ja injektoitavat tai infusoitavat liuokset. Suositeltava muoto riippuu antotavasta ja terapeuttisesta sovellutuksesta. Esimerkiksi vasta-aine-ent-10 syymikonjugaatin anto suun kautta voi olla epätoivottava, koska konjugaatin proteiinit ovat taipuvaisia hajoamaan vatsassa, jos ne otetaan suun kautta, esim. tablettimuodossa.
Konjugaatti- tai esilääkekoostumukset sisältävät 15 edullisesti myös tavanomaisia farmaseuttisesti hyväksyttäviä, alalla tunnettuja kantajia ja adjuvantteja, kuten ihmisen seerumialbumiinia, ioninvaihtajia, alumiinia, lesitiiniä, puskuriaineita, kuten fosfaatteja, glysiiniä, sor-baattia, kaliumsorbaattia, ja suoloja ja elektrolyyttejä, 20 kuten protamiinisulfaattia.
Kaikkein tehokkain antomuoto ja annosjärjestelmä riippuu taudin vakavuudesta ja kulusta, potilaan terveydentilasta ja responssista hoidolle ja hoitavan lääkärin päätöksestä. Sen mukaisesti immunokonjugaattien ja esi-25 lääkkeiden annokset tulisi titrata potilaalle yksilölli- *!V sesti.
• · · • · ; Vasta-aine-entsyymikonjugaatin tehokas annos voi • · · olla noin 1,0 - 100 mg/m2. Esilääkkeen tehokas annos riip-'·'·* puu tietystä käytetystä esilääkkeestä ja emolääkkestä, 30 josta se on peräisin. Koska esilääke on vähemmän sytotok-sinen kuin emolääke, voidaan käyttää suurempia annoksia :T: kuin niitä, jotka emolääkkeelle on alalla havaittu. Adria- . mysiiniesilääkkeiden tehokas annos voi olla välillä noin 15 - 150 mg/m2.
* 35 Jotta tässä kuvattu keksintö olisi täydellisemmin ymmärrettävissä, annetaan seuraavat esimerkit. On ymmär- • 98197 17 rettävä, että nämä esimerkit on tarkoitettu ainoastaan kuvaaviin tarkoituksiin eikä niitä pidä tulkita millään tavalla tämän keksinnön piiriä rajoittaviksi.
Esimerkki 1 5 Seuraava esimerkki osoittaa keksinnön mukaisesti valmistettujen immunokonjugaattien ja esilääkkeiden käytön suhteellisen ei-sytotoksisen esilääkkeen muuttamisessa aktiiviseksi kasvaimen vastaiseksi aineeksi, joka osoittaa in vitro sytotoksisuutta kasvainsoluja vastaan. Tämän esi-10 merkin mukaisesti käytetään L6-penisilliini-V-amidaasi- immunokonjugaattia (tästä lähtien merkitty "PVA") muuttamaan adriamysiinin N-fenoksiasetyylijohdannainen tunnetuksi kasvaimen vastaiseksi aineeksi adriamysiiniksi.
Vasta-aine-penisilliini-V-amidaasi-konjugaattien 15 valmistus
Valmistettiin L6-PVA-immunokonjugaatti ja 1F5-PVA-konjugaatti. L6 on IgG2a-alaluokkaa oleva monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen ja sitoutuu ihmisen keuhko-karsinoomasolujen glykoproteiiniantigeeniin [katso I.
20 Hellström et ai., (1986), supra]. 1F5 on monoklonaalinen
IgG2a-vasta-aine, joka on spesifinen normaalien ja pahanlaatuisten B-solujen CD-20-antigeenille [katso E. A. Clark et ai., "Role Of The Bp35 Cell Surface Polypeptide In Human B-Cell Activation", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 25 (1985) 1 766 - 1 770]. L6-hybridooma, joka tuottaa L6-mo- * » 4 *Γ.* noklonaalista vasta-ainetta, talletettiin American Type *. * Culture Collection (ATCC) -kokoelmaan koodinumerolla HB8677 « « · *;*·’ samalla, kun jätettiin EP-hakemus 207 963, julkaistu tam- t « · *·*' mikuun 14, 1987. lF5-hybridooma, joka tuottaa 1F5- mono- 30 klonaalista vasta-ainetta, talletettiin ATCC:hen helmikuun 12, 1988 ATCC-koodinumerolla HB9645. 96.5-monoklonaalista ' I : vasta-ainetta on kaupallisesti saatavissa.
.·] : Käytetty amidaasientsyymi oli penisilliini-V-ami- ! daasi, joka oli eristetty Fusarium oxysporum -homeviljel- . 35 mästä D. A. Lowe et al'n., "Enzymatic Hydrolysis Of Peni cillin V to 6-Amino-penicillanic Acid By Fusarium oxyspo- 98197 18 rum", Biotechnology Letters 8(3) (1986) 151 - 156, esittämien menetelmien mukaisesti. Fusarium oxysporum -kannat, joista tämä entsyymi voidaan eristää, on talletettu ATCCrhen. Niin ollen PVA on helposti saatavissa oleva ent-5 syymi, joka muuttaa penisilliini-V:n penisillaanihapoksi. Spesifisemmin PVA hydrolysoi penisilliini-V:n fenoksiase-tyyliamidisidoksen tuottaen penisillaanihappoa. Entsyymiä, joka reagoi fenoksiasetamidien kanssa, voidaan niin ollen käyttää katkaisemaan tunnettujen sytotoksisten aineiden 10 esilääkkeitä, jotka aineet ovat fenoksiasetaatin tai p-hydroksifenoksiasetaatin johdannaisia.
Vasta-aine-PVA-konjugaatit valmistettiin sitomalla PVA kovalenttisesti monoklonaaliseen vasta-aineiseen L6 tai 1F5 tioeetterisidoksella käyttäen menetelmää, joka on 15 samanlainen kuin ovat kuvanneet J. M. Lambert et ai., "Purified Immunotoxins That Are Reactive With Human Lymphoid Cells", J. Biol. Chem. 260(22) (1985) 12 035 - 12 041. Konjugaatit valmistettiin seuraavasti: 2-iminotiolaania (50 mM 0,5 M trietanolamiinihydrokloridissa, jossa oli 20 10 mM EDTA:ta, pH 8,0) lisättiin 8,0 mg/ml vasta-ainetta sisältävään liuokseen (50 mM trietanolamiinihydrokloridi ja 1 mM EDTA, pH 8,0) niin, että 2-iminotiolaanin lopullinen konsentraatio oli 1,3 mM. 90 minuutin jälkeen 0°C:ssa reaktio lopetettiin geelisuodatuksella Sephadex 6-25:llä 25 käyttäen eluanttina fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta *IV (PBS), pH 7,2. Vasta-aineiden reaktio 2-iminotiolaanin • · *. I kanssa sai aikaan sulfhydryyliryhmiä, joiden määrän mitat- • · » tiin käyttäen Ellman'in reagenssia [katso P. W. Riddles et | · · ai., "Ellman's Reagent: 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic 30 Acid)-A Reexamination", Analytical Biochemistry, 94 (1979) 75 - 81]. Sulfhydryyliryhmien määrä mitattiin olevan vä-:T: Iillä 1-2.
; PVA-entsyymi liuotettiin sitten konsentraatioksi 9 mg/ml PBS:ään ja käsiteltiin SMCC:llä (Pierce Chemical . 35 Co., 100 mM DMF:ssä) niin, että lopullinen konsentraatio oli 5 mM. SMCC-käsittely liitti entsyymiin maleimidoryh- 19 - 98197 miä. 30 minuutin jälkeen 30 °C:ssa modifioitu entsyymi puhdistettiin geelisuodatuksella G-25 PD-10 Sephadex'lla (Pharmacia, Uppsala, Sweden) ja eluoitiin PBS:llä. Modifioitu PVA lisättiin sitten kunkin tioloidun vasta-aineen 5 liuokseen molaarisessa suhteessa 3:1. Kukin reaktioseos kyllästettiin typellä ja jätettiin huoneen lämpötilaan kolmeksi tunniksi ja sitten inkuboitiin 4 °C:ssa vielä 18 tuntia. Tässä pisteessä lisättiin 2-aminoetaanitiolia (loppukonsentraatio 1 mM) kuhunkin liuokseen kaikkien rea-10 goimattomien maleimidien blokkaamiseksi.
Kukin reaktioseos ajettiin sitten geelisuodatuspyl-vään (G-25) läpi käyttäen eluanttina 20 mM:sta Tris-pus-kuria, pH 7,2, jossa oli 50 mM NaCl:a. Tuloksena syntyneet seokset puhdistettiin DEAE-Sephadex pylväissä (2,5 x 15 10 cm). Fraktioita seurattiin 280 nm:ssa. Kummankaan seok sen reagoimaton vasta-aine ei sitoutunut pylvääseen, ja konjugaatti ja reagoimaton PVA eluoitiin 20 mM:lla Tris-puskurilla, pH 7,2, jossa oli 0,5 M NaCl:a. PVA:ta ja kon-jugaattia sisältävät fraktiot konsentroitiin sitten käyt-20 täen Amicon YM-30 -ultrasuodatussuodatinta ja puhdistettiin Sephacryl S-300 -pylväässä (2,5 x 95 cm) käyttäen PBS:ää eluanttina. Fraktioita seurattiin 280 nm:ssa, ja ne, jotka sisälsivät puhdasta konjugaattia SDS-PAGE:lla (4 - 12-%:inen gradienttigeeli) määritettynä, yhdistet-25 tiin.
***.’ Uuden adriamysilnlesllääkkeen valmistus \ ;* Kunkin yllä valmistetun vasta-aine-PVA-konjugaat- • « · tin annettiin sitten reagoida uuden adrlamysiiniesilääk- • ♦ keen kanssa. Tarkemmin sanottuna käytetty esilääke oli N-30 (p-hydroksifenoksiasetyyli)adriamysiini (tästä lähtien merkitty "APO"), jossa adriamysiini on asyloitu aminosoke- rikohtaan p-hydroksifenoksiasetaatilla, kuten on kuvattu kuviossa 3.
Tämä adriamysiiniesilääke syntetisoitiin seuraavas- ' 35 ti: 98197 20 10 ml:aan tetrahydrofuraania laitettiin 84 mg (0,5 mmol) p-hydroksifenoksiasetaattia, 57 mg (0,5 mmol) N-hydroksisukkinimidiä ja 100 mg (0,49 mmol) disyklohek-syylikarbodi-imidiä. Tätä seosta sekoitettiin kaksi tun-5 tia, jolloin liuos suodatettiin, ja suodos lisättiin 200 mg:aan (0,35 mmol) adriamyslinihydrokloridia. Reaktio-seokseen lisättiin 0,1 ml trietyyliamiinia ja sekoitusta jatkettiin neljä tuntia. Reaktioseos suodatettiin sitten lasivillan läpi ja haihdutettiin jäännökseksi korkeassa 10 vakuumissa. Tuloksena syntynyt seos puhdistettiin silika-geeli-60-pylväässä (2,5 x 20 cm) eluoiden 95:5 diklorome-taanirmetanolilla. Yhdistetyt fraktiot puhdistettiin uudelleen samanlaisessa pylväässä, jolloin saatiin 70 mg (0,1 mmol, 30 %:n saanto) puhdasta N-(p-hydroksifenoksiok-15 siasetyyli)adriamysiiniä.
FAB MS m/e 694,2125 (M+H)*. Laskettu yhdisteelle C35H36N014: 694,2136.
360 MHz XH NMR (CDC13) 1,06 (d, 3H, sokeri CH3), 1,5 - 2,2 (m, 6H, sokeri H), 3,0 (q, 2H) 4,0 (s, 3H, OCH3), 20 4,35 (s, 2H, COCHzO), 4,8 - 5,0 (m, 3H), 5,2 ja 5,4 (s, 1H), 6,6 - 6,8 (dd, 4H, fenoksi ArH), 7,4 - 7,9 (m, 3H, 2,3,4H), 9,0 (s, 1H, Ar'OH), 11,61 ja 12,39 (s, 1H, ArOH).
On ymmärrettävä, että muita adriamysiinin fenoksi- , , ·. asetyyliamidijohdannaisia voidaan syntetisoida käyttäen »tl 25 oleellisesti samaa menetelmää kuin yllä on kuvattu. Esi- i « · **V merkiksi N-(fenoksiasetyyliJadriamysiiniä voidaan synte- c * · *. tisoida, kuten on kuvattu tässä osassa, jossa p-hydroksi- f · · ·’·* fenoksiasetaatti on korvattu 0,5 mmol:11a (76 mg) fenok- *.V siasetaattia.
30 Vasta-aine-penisilliini-V-amidaasi-konjugaatin sjj reaktio adriamysiiniesilääkkeen kanssa :T: Vasta-aine-PVA-konjugaatin L6-PVA kyky muuttaa uusi . esilääke APO adriamysiiniksi mitattiin seuraavasti: joko ( I · ' I a) PVA:ta yksinään (lopullinen konsentraatio 50 pg/ml), b)
• « I I I
35 100 pg/ml L6-PVA-konjugaattia (lopullinen PVA konsentraa tio 25 pg/ml) tai c) 10 pg/ml L6-PVA:ta (lopullinen PVA- • # 98197 21 konsentraatio 2,5 pg/ml) lisättiin PBS:ssä olevaan APO-liuokseen (0,1 ml). Kutakin reaktiota seurattiin HPLC:llä käyttäen Phenominex C-18-pylvästä (3 pm, 4,5 x 100 mm) ja 20 - 60-%:sta, 0,1 % H3P04:ää sisältävää vedessä 5 olevaa tetrahydrofuraanieluutiogradienttia (1,0 ml/min, seurattiin aallonpituudella 495 nm). Näissä olosuhteissa adriamysiini eluoitui 8,9 minuutin kohdalla ja APO eluoi-tui 12,2 minuutin kohdalla. Tulokset esitetään kuviossa 4.
Kuten kuvio osoittaa, PVA oli todella hydrolysoinut 10 APO:n amidiryhmän, mitä osoittaa adriamysiinin muodostumi nen. Käytetyissä olosuhteissa PVA:n aiheuttaman APO:n hyd-rolyysin puoliintumisaika oli noin 20 minuuttia. Lisäksi havaittiin, että 40 minuutin sisällä reaktion alusta joko entsyymi yksinään tai vasta-aine-PVA-konjugaatti kykeni 15 aiheuttamaan ainakin 80-%:sen APO:n hydrolyysin adriamy-siiniksi. Konjugaatti pitoisuutena 10 pg/ml (2,5 pg/ml PVA:ta) kykeni aiheuttamaan tämäntasoisen hydrolyysin 120 minuutissa. Lopuksi näiden tutkimusten perusteella on selvää, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla vasta-20 aine-PVA-konjugaatilla ei ole mitään havaittavaa entsy-maattisen aktiivisuuden häviämistä entsyymin vasta-aineeseen kiinnittymisen johdosta, minkä todistaa seikka, että konjugaatilla ja vapaalla entsyymillä on samanlaiset kyvyt hydrolysoida APO adriamysiiniksi.
25 Uuden adriamysiiniesilääkkeen seerumistabiilisuus ·”.· APO:n stabiilisuus ihmisen seerumissa määritettiin • · · ·’ käyttäen HPLC:tä ja mittaamalla AP0:n häviämisnopeus ja *.*.· adriamysiinin muodostumisnopeus. Niin ollen APO-liuosta • · ·*.·.· (10 mM dimetyyliformamidissa) lisättiin tuoreeseen ihmisen 30 seerumiin niin, että lopullinen konsentraatio oli 0,1 mM.
: Pieniä määriä (50 ui) laimennettiin metanolilla (50 ui) ··· ' :*·*: seerumiproteiinien saostamiseksi. Sitten nämä näytteet sentrifugoitiin ja analysoitiin HPLC:llä, kuten on kuvattu ; juuri yllä. Yhtään APO:n hydrolyysiä adriamysiiniksi ei 35 tapahtunut kahdessa tunnissa.
98197 22
Vasta-aine-PVA-konjugaattien sitoutuminen H2981-kasvainsoluihin L6-PVA- ja lF5-PVA-konjugaattien kyky sitoutua H2981-kasvainsoluihin määritettiin. H2981-solulinja saa-5 tiin primaarisesta ihmisen keuhkoadenokarsinoomasta [katso I. Hellström et ai., "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinomas", Cancer Res. 46(8) (1986) 3 917 - 3 923]. L6-vasta-aineen tiedetään sitoutuvan vahvasti H2981-soluihin (kyllästys 10 pg/ml:ssa), kun taas 10 1F5 osoittaa hyvin vähäistä sitoutumista näihin soluihin.
Immunokonjugaatit tai vapaat vasta-aineet sarjalaimennet-tiin epätäydelliseen modifioituun Dulbecco'n alustaan (IMDM, Gibco), ja 100 μ1:η määriä inkuboitiin 4 °C:ssa 106 solun kanssa 30 minuuttia. Solut pestiin ja inkuboitiin 15 50 pl:ssa FITC-vuohen anti-hiiri-vasta-aineetta (Tago, laimennettu 1:12,5) vielä 30 minuuttia 4 °C:ssa. Solut pestiin ja analysoitiin Coulter Epics-C-fluoresenssisolulas-kijalla. Kuolleet solut jätettiin pois ja saatiin log-kes-kiarvo kunkin näytteen vihreän fluoresenssin voimakkuudes-20 ta. Tämä määrä muutettiin lineaariseen asteikkoon ja suhteet negatiivisen kontrollin (solut + FITC-vuohi anti-hiiri- vasta-aine) ja kaikkien testinäytteiden välillä laskettiin. Sitoutumiskokeen tulokset on kuvattu kuviossa 5.
Facs-analyysi osoitti, että sekä L6- että L6-PVA- 25 konjugaatti sitoutuvat vahvasti kasvainsoluihin, kun taas ***.’ lF5-PVA-konjugaatti ei osoita mitään merkittävää sitoutu- • · · 98197 23
Keksinnön vasta-aine-PVA-konjugaatti/adriamysiini-esilääkeyhdistelmän In vitro sytotoksisuus H2981-kasvaln-soluille
Keksinnön vasta-aine-PVA/adriamysiiniesilääkeyh-5 distelmän in vitro sytotoksinen vaikutus H2981-kasvainso-luja kohtaan määritettiin käyttäen 3H-tymidiinin sisäänot-to-koetta. Käyttämämme kologeeninen sytotoksisuuskoe oli pesäkeinhibitiokoe, jonka ovat kuvanneet I. Hellström et ai., "Colony Inhibition And Cytotoxicity Assays", teok-10 sessa In Vitro Methods In Cell-Mediated Immunity, Bloom ja Glade (toim.), sivut 409 - 414 (1971). Lyhyesti kuvattuna H2981-kasvainsolut maljattiin 96-kuoppaisille mikrotiitte-rilevyille IMDM:ssä (10 000 solua/kuoppa), ja niiden annettiin kiinnittyä 18 tuntia 37 °C:ssa. Sitten lisättiin 15 vasta-aine-PVA-konjugaatit L6-PVA tai 1F5-PVA vasta-aine-konsentraationa 10 pg/ml, ja levyjä inkuboitiin 30 minuuttia 4 °C:ssa. Sitten kuopat pestiin neljä kertaa IMDMtllä, ja AP0:a lisättiin eri konsentraatioina IMDMrssä. Kahden tunnin kuluttua kuopat pestiin uudelleen, IMDM:ää lisät-20 tiin, ja solut jätettiin 18 tunniksi 37 °C:een. Tässä vaiheessa lisättiin 3H-tymidiiniä (1 pCi per kuoppa), ja kuuden tunnin kuluttua levyt jäädytettiin -70 °C:ssa solujen irrottamiseksi. Sulatuksen jälkeen solut kerättiin lasi-kuitusuodattimille. 3H-tymidiinin inkorporaatio mitattiin 25 Beckman 3801 tuikelaskijalla ja verrattiin soluihin, joita ”*.* oli käsitelty AP0:lla tai adriamysiinillä (ADM) yksinään.
• · · \ Tätä koetta käyttäen määritimme 3H-tymidiinin inkor- i · · *·'.· poraation inhibition kasvainsolujen DNA:han ja niin ollen • · V.· APO-esilääkkeen sytotoksisen vaikutuksen soluihin ilman 30 solujen esikäsittelyä tai esikäsiteltäessä soluja L6-PVA- :^: tai lF5-PVA-konjugaateilla. Näiden yhdistelmien sytotok- ·*:*: sisia vaikutuksia verrattiin sytotoksisuuteen, joka ha- * valttiin käsiteltäessä soluja emolääkkeellä, adriamysiinillä, yksinään. Kuten kuviossa 6 on esitetty, kasvainso-35 luilla, joita ei ollut käsitelty millään konjugaatilla, 98197 24 adriamysiini oli IC50-arvolla 38 nM merkittävästi myrkyl-lisempi kuin APO IC50-arvolla 2 μΜ. Tätä odotettiinkin aiempiin raportteihin perustuen, jotka osoittavat, että adriamysiiniamidit ovat vähemmän myrkyllisiä kuin adria-5 mysiini [katso esim. Y. Levin ja B.A. Sela, FEBS Letters 98 (1979) 119 Ja R. Baurain et ai., J♦ Med. Chem. 23 (1980) 1 171 (1980)]. Solujen esikäsittely L6-PVA:lla paransi AP0:n sytotoksisuutta 20-kertaisesti tasolle, joka oli verrattavissa siihen, joka nähtiin adriamysiinillä 10 yksinään. Solujen esikäsittely lF5-PVA:lla ei vaikuttanut APO:n myrkyllisyyteen yhtään. Nämä tulokset osoittavat, että L6-PVA-konjugaatti kykenee hydrolysoimaan suhteellisen ei-sytotoksisen esilääkkeen APO:n tappamaan kasvain-soluja laajuudessa, joka on verrannollinen adriamysiinin 15 käyttöön yksinään, ja että tämä sytotoksisuus on antigee-nispesifinen, minkä osoittaa seikka, että lF5-PVA-konju-gaatti, joka ei sitoudu merkittävästi tähän tiettyyn kas-vainsolulinjaan, ei osoittanut mitään sellaista sytotok-sisuutta.
20 Vasta-aine-PVA-konjugaattien sitoutuminen Daudl- lymfoomasolulhin Määritettiin myös keksinnön L6-PVA- ja lF5-PVA-kon-jugaattien kyky sitoutua tunnettuun Daudi-solulinjaan. Tämä solulinja on Burkitt'in lymfoomasolulinja, joka on 25 talletettu ATCC:hen (ATCC-numero CCL 213), joka ekspressoi ·*·.· CD-20 antigeeniä, johon lF5-vasta-aine sitoutuu. Sitoutu- • · · : ·* miskoe suoritettiin, kuten edellä on kuvattu sitoutumisel- • · V.: le H2981-kasvainsoluhin paitsi, että käytetyt solut olivat • ·
Daudi-soluja, ja tulokset kuvataan kuviossa 7.
30 Tässä esimerkissä lF5-monoklonaalinen vasta-aine ja : lF5-PVA-konjugaatti molemmat sitoutuvat vahvasti lymfooma- • · · ·*;*: soluihin. Niin ollen tämä tutkimus jälleen osoittaa, ettei konjugointimenetelmä ei merkittävästi vaikuttanut konju-gaattien sitoutumiskykyyn.
35 Lisäksi, kuten kuvio osoittaa, L6-vasta-aine ja L6- ·· PVA-konjugaatti eivät sitoutuneet sanottavasti Daudi-so- il iftikiitfc m i M ? 98197 25 luihin. Tätä odotettlinkin, koska Daudi-kasvainsoluissa ei ole antigeeniä, jonka kanssa L6-vasta-aine reagoi. Niin ollen tämä tutkimus yhdessä tässä aiemmin kuvattujen si-toutumistutkimusten kanssa selvästi osoittaa tämän keksin-5 nön mukaisesti valmistettujen konjugaattien sitoutumiss-pesifisyyden, nimittäin L6:tta sisältävät konjugaatit sitoutuvat spesifisesti L6-positiivisiin kasvainsoluihin ja lF5:ttä sisältävät konjugaatit sitoutuvat spesifisesti CD-20-positiivisiin kasvainsoluihin.
10 Keksinnön vasta-aine-PVA-konjugaatti/adriamysiini- esilääkeyhdistelmän in vitro sytotoksisuus Daudi-soluille Sitten testasimme L6-PVA- tai lF5-PVA-konjugaatin in vitro sytotoksisen vaikutuksen Daudi-soluille yhdessä APO-esilääkkeen kanssa.
15 3H-tymidiinikoe suoritettiin oleellisesti, kuten edellä H2981-kasvainsoluijen yhteydessä on kuvattu pienin modifikaatioin johtuen siitä seikasta, etteivät Daudi-so-lut ole kiinnittyviä. Niin ollen noin 250 000 Daudi-solua IMDMrssä maljattiin kuhunkin 96-kuoppaisen mikrot!itteri-20 levyn kuoppaan ja vasta-aine-entsyymikonjugaatti lisättiin. Reaktioseosta inkuboitiin 4 °C:ssa 30 minuuttia. Sitoutumaton vasta-aine-entsyymikonjugaatti poistettiin sentrifugoimalla 500 x g viisi minuuttia ja poistamalla supernatantti. Solut suspendoitiin uudelleen IMDM:ään, ja 25 pesumenetelmä toistettiin kolme kertaa kaiken sitoutumat- • ♦ ·
***.* toman konjugaatin poistamiseksi. Sitten lisättiin APO
• « · \ ** IMDM:ssä kahdeksi tunniksi ja pestiin kerran, kuten yllä • · ♦ *·*·* on kuvattu. Loppuosa menetelmästä suoritettiin, kuten * · edellä on kuvattu.
30 Tätä koetta käyttäen määritettiin 3H-tymidiinin in- i.:.: korporaation inhibitio Daudi-solujen DNA:hän ja niin ol-
Ien APO-esilääkkeen sytotoksisen vaikutuksen soluille ilman solujen esikäsittelyä tai käsiteltäessä soluja L6-PVA-tai lF5-PVA-konjugaatilla. Näiden yhdistelmien sytotoksi-35 siä vaikutuksia verrattiin sytotoksisuuteen, joka havaittiin käsiteltäessä soluja adriamysiinillä yksinään. Kuten 26 ybi y/ kuviossa 8 on esitetty, Daudi-soluissa, joita ei ollut käsitelty millään konjugaatilla, adriamysiini oli merkittävästi myrkyllisempi kuin ΆΡΟ. Solujen esikäsittely 1F5-PVA-konjugaatilla paransi merkittävästi APO-esilääkkeen 5 sytotoksisuutta tasolle, joka on verrattavissa siihen, joka nähdään adriamysiinillä yksinään, kun taas esikäsittely L6-PVA-konjugaatilla ei johtanut mihinkään sellaiseen parannukseen.
On huomattava, että näistä sitoutumis- ja sytotok-10 sisuustutkimuksista saadut tulokset ovat vastakkaisia tuloksille, jotka saatiin näillä konjugaateilla aiemmin tässä esimerkissä kuvatuissa tutkimuksissa H2981-kasvainso-luja käyttäen, joissa L6-PVA plus APO-yhdistelmä osoitti parantuneita sytotoksisia vaikutuksia mutta 1F5-PVA plus 15 APO- yhdistelmä ei osoittanut. Tätä odotettiinkin, kun otetaan huomioon konjugaattien L6- ja lF5-vasta-aineiden erilaiset spesifisyydet, ja tämä osoittaa selvästi syto-toksisten vaikutusten spesifisyyden, joka saatiin näillä konjugaatti/esilääkeyhdistelmillä.
20 Lisäksi tämä tutkimus osoittaa lF5-PVA-konjugaatin käyttökelpoisuuden yhdessä APO:n kanssa sytotoksisten vaikutusten aikaansaamiseksi kasvainsoluissa in vitro. Niin ollen tämän esimerkin in vitro sytotoksisuustutkimukset osoittavat esillä olevan keksinnön mukaisten vasta-aine-25 entsyymikonjugaattien soveltuvuuden mille tahansa konju- • · ♦ *!1.1 gaatille, joka sisältää vasta-aineen, joka on reaktiivinen • · · *. 1 kasvaimeen assosioituneelle antigeenille, hoidettaessa * · · kasvaimia, joiden kanssa se vasta-aine reagoi.
« · < • · · • · « • · · • · · • · · 11 au, I Hill 1,14-M · · · · • · · • · ·

Claims (4)

98197 27
1. Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonju-5 gaatin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kas-vainsolujen pinnalla olevan antigeenin kanssa reagoiva kasvainspesifinen monoklonaalinen vasta-aine konjugoidaan entsyymiin, joka kykenee muuttamaan heikosti sytotoksisen esilääkkeen, jolla on kaava 10 o on 0
15 R3 0 OH i (I) „p/ jossa: R1 on H, ja R3 on OH tai 0CH3; tai R1 on OH ja R3 on 0CH3; ja R2 on H tai OH, 25 sen aktiivisemmaksi vastaavaksi emolääkkeeksi suorittaen : vaihe, jossa kasvainspesifinen monoklonaalinen vasta-aine • · ; V ja entsyymi saatetaan reagoimaan heterobifunktionaalisten aineiden kanssa niin, että vasta-aineen ja entsyymin vä- jY: lille muodostuu tioeetteri- tai disulfidisidos. • *
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kasvainspesif inen monoklonaa- • · · 4·|·φ linen vasta-aine on hybridoomasolulinjan L6, jonka ATCC- II· talletusnumero on HB 8677, tuottama monoklonaalinen vasta-aine ja entsyymi on penisilliini-V-amidaasi. 35 t 2 < I 98197 28
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että kasvainspesifinen monoklonaa-linen vasta-aine on hybridoomasolulinjan 1F5, jonka ATCC-talletusnumero on HB 9645, tuottama monoklonaalinen vasta- 5 aine ja entsyymi on penisilliini-V-amidaasi.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että esilääke on N-(p-hydroksi-fenoksiasetyyli)adriamysiini. ··· « » · • · « m Ψ • · • · I ♦ · • · « ♦ · • · s : : • ♦ • « « » · · ·· · ··« » » » • « » « • · · 98197 29
FI883597A 1987-08-04 1988-08-01 Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi FI98197C (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8138287A 1987-08-04 1987-08-04
US8138287 1987-08-04
US16106888A 1988-02-26 1988-02-26
US16106888 1988-02-26
US21130188 1988-06-29
US07/211,301 US4975278A (en) 1988-02-26 1988-06-29 Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI883597A0 FI883597A0 (fi) 1988-08-01
FI883597A FI883597A (fi) 1989-02-05
FI98197B FI98197B (fi) 1997-01-31
FI98197C true FI98197C (fi) 1997-05-12

Family

ID=27373967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI883597A FI98197C (fi) 1987-08-04 1988-08-01 Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP0540859B1 (fi)
JP (2) JP2738414B2 (fi)
KR (1) KR930006757B1 (fi)
AT (2) ATE162196T1 (fi)
AU (1) AU614532B2 (fi)
CA (1) CA1336887C (fi)
DE (2) DE3856112T2 (fi)
DK (1) DK175406B1 (fi)
EG (1) EG18751A (fi)
ES (1) ES2068191T3 (fi)
FI (1) FI98197C (fi)
GR (1) GR3015065T3 (fi)
HU (1) HU207230B (fi)
IE (2) IE68309B1 (fi)
IL (1) IL87319A (fi)
NO (1) NO178138C (fi)
NZ (1) NZ225599A (fi)
PT (2) PT88187B (fi)
YU (1) YU150888A (fi)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5851527A (en) * 1988-04-18 1998-12-22 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of therapeutic agents
KR0185967B1 (ko) * 1989-01-23 1999-05-01 에프. 쥐. 엠. 헤르만스; 에이. 쥐. 제이. 베르미렌 치료용 약물의 부위 특이적 생체내 활성작용
AU633867B2 (en) * 1989-02-02 1993-02-11 Eli Lilly And Company Delivery of cytotoxic agents
GB8907617D0 (en) * 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8919607D0 (en) * 1989-08-30 1989-10-11 Wellcome Found Novel entities for cancer therapy
DE3935016A1 (de) * 1989-10-20 1991-04-25 Behringwerke Ag Glycosyl-etoposid-prodrugs, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung in kombination mit funktionalisiertem tumorspezifischen enzym-konjugaten
DE4106389A1 (de) * 1991-02-28 1992-09-03 Behringwerke Ag Fusionsproteine zur prodrug-aktivierung, ihre herstellung und verwendung
US6610299B1 (en) 1989-10-19 2003-08-26 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US7241595B2 (en) 1989-10-20 2007-07-10 Sanofi-Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US6475486B1 (en) 1990-10-18 2002-11-05 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates
US5270196A (en) * 1989-10-20 1993-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Arylsulfatase from streptomyces
FI94362C (fi) * 1989-10-20 1995-08-25 Squibb Bristol Myers Co Oleellisesti puhdistettu sulfataasi, menetelmä sen valmistamiseksi ja sitä tuottava Streptomyces-kanta
EP0505357B1 (en) * 1989-12-11 1999-03-10 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of diagnostic or therapeutic agents
CA2069439A1 (en) * 1989-12-15 1991-06-16 Susumu Iwasa Monoclonal antibodies, their production and use
GB9001641D0 (en) * 1990-01-24 1990-03-21 Imp Cancer Res Tech Compounds
KR920007937B1 (ko) * 1990-01-30 1992-09-19 현대자동차 주식회사 밸브시트용 철(Fe)계 소결합금
DE4002888A1 (de) * 1990-02-01 1991-08-08 Behringwerke Ag Anthracyclin-glycosyl-prodrugs, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung in kombination mit funktionalisierten tumorspezifischen enzymkonjugaten
KR100208957B1 (ko) * 1990-04-25 1999-07-15 로렌스 티. 마이젠헬더 신규한 cc-1065 유사체
AU649275B2 (en) * 1990-11-06 1994-05-19 Bristol-Myers Squibb Company Prodrugs for beta-lactamase and uses thereof
GB9200417D0 (en) * 1992-01-09 1992-02-26 Bagshawe Kenneth D Cytotoxic drug therapy
DE4233152A1 (de) 1992-10-02 1994-04-07 Behringwerke Ag Antikörper-Enzym-Konjugate zur Prodrug-Aktivierung
EP0647450A1 (en) * 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
US5459248A (en) * 1993-11-04 1995-10-17 Bristol-Myers Squibb Company Process of preparing etoposide phosphate and etoposide
DE4417865A1 (de) * 1994-05-20 1995-11-23 Behringwerke Ag Kombination von Tumornekrose-induzierenden Substanzen mit Substanzen, die durch Nekrosen aktiviert werden, zur selektiven Tumortherapie
US5516679A (en) * 1994-12-23 1996-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum
DE19720312A1 (de) * 1997-05-15 1998-11-19 Hoechst Ag Zubereitung mit erhöhter in vivo Verträglichkeit
GB9712370D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Aepact Ltd Therapeutic systems
JPH1160499A (ja) * 1997-08-22 1999-03-02 Hiroshi Maeda 抗腫瘍剤
US6159706A (en) * 1997-12-23 2000-12-12 Newbiotics, Inc. Application of enzyme prodrugs as anti-infective agents
GB2348203B (en) 1998-11-04 2002-06-19 Imp College Innovations Ltd Solube beta-forms of prion proteins, methods of preparation and use
AU777970C (en) 1999-05-07 2006-08-17 F. Hoffman-La Roche Ag Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
US7514067B2 (en) 2000-04-25 2009-04-07 President And Fellows Of Harvard College Methods for tumor diagnosis and therapy
WO2001093826A1 (fr) * 2000-06-06 2001-12-13 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Preparations polymere synthetiques biocompatibles
US7445802B2 (en) 2000-12-26 2008-11-04 Yeda Research And Development Co. Ltd Site-specific in situ generation of allicin using a targeted alliinase delivery system for the treatment of cancers, tumors, infectious diseases and other allicin-sensitive diseases
DE60237915D1 (en) * 2001-12-03 2010-11-18 Universitaetsklinikum Charite Podophyllotoxine als antiproliferative mittel
US6756397B2 (en) * 2002-04-05 2004-06-29 Immunogen, Inc. Prodrugs of CC-1065 analogs
EP1735350B1 (en) * 2004-04-15 2010-08-25 Genencor International, Inc. Anti-cea scfv - beta-lactamase constructs (cab molecules) in adept
WO2008024103A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-28 Essential Skincare, Llc Compositions to reduce or prevent skin cancer
CN112272673A (zh) * 2018-01-04 2021-01-26 上海晟顺生物科技有限公司 单域抗体-胞嘧啶脱氨酶融合蛋白

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1578734A (fi) * 1967-11-28 1969-08-22
FR2122695A5 (en) * 1971-01-20 1972-09-01 Rhone Poulenc Sa Antibiotics duborimycin and 27706rp - by reduction of daunorubicin and adriamycin
FR2397425A1 (fr) 1977-07-11 1979-02-09 Rhone Poulenc Ind Nouveaux derives de la daunorubicine, leur preparation et les compositions qui les contiennent
CA1168150A (en) * 1981-12-18 1984-05-29 The Governors Of The University Of Alberta Targeting conjugates of albumin and therapeutic agents
FR2523445A1 (fr) * 1982-03-17 1983-09-23 Sanofi Sa Nouveaux conjugues associant, par liaison covalente, une enzyme et un anticorps, et associations medicamenteuses utilisant lesdits conjugues
EP0142905A2 (en) 1983-03-30 1985-05-29 Bio-Response Inc. Therapeutic substance for treating diseases such as cancer
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
EP0202245A1 (en) * 1984-11-23 1986-11-26 Sri International C-glycosidic adriamycin analogs
US4906562A (en) 1984-12-21 1990-03-06 Oncogen Monocolonal antibodies and antigen for human non-small cell lung carcinomas
DE3500023A1 (de) * 1985-01-02 1986-07-10 Farmitalia Carlo Erba S.p.A., Mailand/Milano 4'-desoxyanthracyclinester
FR2584294B1 (fr) 1985-07-08 1992-02-21 Berdal Pascal Compositions pharmaceutiques a visee cytotrophique
GB8528761D0 (en) * 1985-11-22 1985-12-24 Axon Healthcare Ltd Enzyme-coupled antibodies
GB8705477D0 (en) * 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems

Also Published As

Publication number Publication date
GR3015065T3 (en) 1995-05-31
ATE162196T1 (de) 1998-01-15
NO178138C (no) 1996-01-31
JPH02223532A (ja) 1990-09-05
KR930006757B1 (ko) 1993-07-23
NO883414D0 (no) 1988-08-02
EP0302473B1 (en) 1995-02-15
JPH10130295A (ja) 1998-05-19
HU207230B (en) 1993-03-29
ES2068191T3 (es) 1995-04-16
PT101702B (pt) 1999-11-30
JP3127136B2 (ja) 2001-01-22
IL87319A0 (en) 1990-02-09
DE3853028D1 (de) 1995-03-23
ATE118354T1 (de) 1995-03-15
NZ225599A (en) 1991-09-25
EP0302473A3 (en) 1990-01-17
PT88187A (pt) 1989-06-30
NO178138B (no) 1995-10-23
NO883414L (no) 1989-02-06
EP0540859A1 (en) 1993-05-12
IE882379L (en) 1989-02-04
IL87319A (en) 1995-08-31
FI98197B (fi) 1997-01-31
AU2020188A (en) 1989-05-25
EP0302473A2 (en) 1989-02-08
DK434188D0 (da) 1988-08-03
DE3853028T2 (de) 1995-12-14
JP2738414B2 (ja) 1998-04-08
DK434188A (da) 1989-02-05
EG18751A (en) 1993-12-30
EP0540859B1 (en) 1998-01-14
DE3856112T2 (de) 1998-08-27
DE3856112D1 (de) 1998-02-19
FI883597A (fi) 1989-02-05
KR890003408A (ko) 1989-04-14
DK175406B1 (da) 2004-09-27
PT88187B (pt) 1995-12-29
YU150888A (en) 1990-06-30
FI883597A0 (fi) 1988-08-01
IE950981L (en) 1989-02-04
IE68309B1 (en) 1996-06-12
PT101702A (pt) 1996-01-31
CA1336887C (en) 1995-09-05
HUT47437A (en) 1989-03-28
AU614532B2 (en) 1991-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI98197C (fi) Menetelmä sytotoksisten aineiden kasvainsoluihin toimittamiseen käyttökelpoisen vasta-aine-entsyymikonjugaatin valmistamiseksi
US4975278A (en) Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
FI102355B (fi) Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjug aattien valmistamiseksi
US20210024646A1 (en) Targeted cd73 antibody and antibody-drug conjugate, and preparation method therefor and uses thereof
JP3234980B2 (ja) 新規な二官能性化合物を含むコンジュゲートの製法
US4880935A (en) Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
JP5314590B2 (ja) カンプトテシン結合部分
KR20160042871A (ko) 폴리펩티드의 효소적 콘쥬게이션
KR20140035393A (ko) 단백질-활성제 접합체 및 이의 제조 방법
US5514794A (en) Antibody-drug conjugates
JP2024514174A (ja) リンカー、コンジュゲート及びその用途
KR0185967B1 (ko) 치료용 약물의 부위 특이적 생체내 활성작용
Griffin et al. Selective cytotoxicity of a ricin A-chain-anti-carcinoembryonic antigen antibody conjugate for a human colon adenocarcinoma cell line
CA2010164C (en) Anthracycline immunoconjugates having a novel linker and methods for their production
NO178341B (no) Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive anthracyclinderivater
JP2023516952A (ja) 最適化された薬物コンジュゲーションのための改変された結合ポリペプチド
MXPA96001871A (en) Polymeric profarmacos for the beta-lactamasa yusos de los mis
WO1992014758A1 (en) Conjugate molecules

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY

MA Patent expired