JPH02223532A - 腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給するためのプロドラッグと組合せた抗体−酵素結合体 - Google Patents

腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給するためのプロドラッグと組合せた抗体−酵素結合体

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JPH02223532A
JPH02223532A JP63194308A JP19430888A JPH02223532A JP H02223532 A JPH02223532 A JP H02223532A JP 63194308 A JP63194308 A JP 63194308A JP 19430888 A JP19430888 A JP 19430888A JP H02223532 A JPH02223532 A JP H02223532A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術的分野 本発明は抗体一酵素結合体およびプロドラッグの組合せ
使用により腫瘍細胞障害性物質を供給する新規な方法に
関する。より詳しくは、本発明は腫瘍細胞に結合する腫
瘍特異性抗体一酵素結合体の投与、および腫瘍部位にお
いて抗体結合酵素の存在下に活性細胞障害性薬物に転化
されるプロドラッグの追加投与により腫瘍の部位に細胞
障害性薬物を供給する方法に関する。本発明の方法、抗
体一酵素結合体およびプロドラッグは癌および他の腫瘍
の治療に現在使用される抗体仲介薬物供給系の欠点の多
くを克服する。
発明の背景 癌の治療において腫瘍細胞に細胞障害性物質を選択的に
供給するだめの免疫結合体の使用が知られている。腫瘍
細胞の部位に対する細胞障害性物質の供給は、これらの
物質の全身性投与がしばしば体内の正常細胞および排除
しようとする腫瘍細胞の死を生ずるので非常に望ましい
。従って、現在使用される抗腫瘍薬物供給系によれば、
細胞障害性物質を腫瘍特異性抗体に結合させて腫瘍細胞
に結合させ、それにより腫瘍部位に細胞障害性物質を「
供給する」免疫結合体を形成させる。これらの標的指向
系に使用される免疫結合体には抗体薬物結合体〔例えば
、ボルドウィン（Ｒ，Ｗ。
Ｂａｌｄｗｉｎ　）ほか、「癌治療に対する単クローン
性抗体」、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ　）、ｐｐ６０３
〜０５（１９８６年３月１５日）参照〕および抗体毒素
結合体〔例えば、ソープ（Ｐ、　Ｅ、　Ｔｈｏｒｐｅ　
）、「癌療法における細胞障害性物質の抗体担体：総説
」、「モノクローナル・アンテイボディーズ１８４：バ
イオロジカル・アンド・クリニカル・アブリケーション
ズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ八ｎｔｉｂｏｃｌｉへｓ８　
４　　：　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ａｎｄ　　Ｃｌ
１ｎｉｃａｌ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）Ｊピンチ
エラ（八、　Ｐｉｎｃｈｅｒａ　）ほか１扁、ｐｐ４７
５〜５０６　（１９８５）参照〕が含まれる。
多クローン性抗体および単クローン性抗体の両方がこれ
らの免疫結合体に利用された〔例えば、オーカワ（Ｋ、
　Ｏｈｋａｗａ　）ほか、「ヒト血清アルブミンにより
マイトマイシンＣと結合したヒトαフェトプロティンに
対する精製抗体によるヒト卵黄嚢腫瘍細胞系に対する選
択的試験管内および生体内増殖阻止」、カンサー・イム
ノロジー・アンド・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、）。
２３、ｐｐｇ　１〜８６　　（１９８６）およびローラ
ンド（Ｇ、Ｆ、　Ｒｏｗｌａｎｄ　）ほか、「ヒト腫瘍
異種移植片におけるビンデシン−単りローン性抗ＣＥΔ
結合体の薬物局在化および増殖阻止研究」、カンサー・
イムノロジー・アンド・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、）、　２
１、ｐｐ１８３〜８７　（１９８６）参照〕。これらの
免疫結合体に使用された薬物にはダウノマイシン〔例え
ば、ガレゴ（Ｊ、　Ｇａｌｌｅｇｏ　）ほか、「抗腫瘍
活性を有する４ダウノマイシン−単りローン性抗体７９
１Ｔ／３６結合体の調製」、インタナショナル・ジャー
ナル・オブ・カンザー（ｔｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ
　）　。
３３、ｐｐ７３７〜４４　　（１９８４）およびデシン
（Ｒ，Δｒ、ｎｏｎ　）ほか、「ダウノマイシンと抗腫
瘍抗体との結合体の試験管内および生体内効力」、イム
ノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
　Ｒｅｖ、）６２、ｐｐ５〜２７　（１９８２）参照〕
、メトトレキサート〔エンド−（Ｎ、　Ｅｎｄｏ）ほか
、「メトトレキサートと抗ＭＭ４．６単りローン性抗体
とのヒト血清アルブミン仲介結合体の試験管内細胞毒性
」、カンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ　）　。
４７、ｐｐ１０７６〜８０　　（１９８７））、マイト
マイシンＣ〔オーカワ（Ｋ、　０ｈｋａｉｙａ　）ほか
、前掲〕、およびビンデシン〔ローランド（Ｇ、Ｆ。
Ｒｏｉｖｌａｎｄ　）ほか、前掲〕が含まれる。抗体−
毒素結合体に使用された毒素には細菌毒素例えばジフテ
リア毒素および植物毒素例えばりシンが含まれる〔例え
ば、ムールテン（Ｐ、　Ｌ、　Ｍｏｏｌｔｅｎ　）ほか
、「特異性抗腫瘍物質としての強力細胞毒に結合した抗
体」、イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｒｅｖ、）、　６２、ｐ　ｐ、　　４７〜７３　（１９
８２）参照〕治療目的に対する免疫結合体の使用を指向
する多くの研究にもかかわらず、これらの供給法に含ま
れる若干の制限が明らかになった〔例えば、エンブレト
ン（Ｍ、　Ｊ、　Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）、　　ｒ単りロー
ン性抗体による抗癌治療剤の標的指向」、バイオケミカ
ル・ソサイエティー・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉ
ｏｎｓ）、　　ｌ　４、ｐｐ３９３〜３９５〔第６１５
会議（６１５ｔｈＭｅｅｔｉｎｇ、　Ｂｅ１ｆａｓｔ）
　　１９８６）参照〕。第１に、細胞の表面上の腫瘍関
連抗原の数および所与抗体分子に結合できる薬物分子の
数により課せられる制約のため、細胞を殺害を行なうた
めに標的腫瘍細胞に供給されることが必要である多量の
薬物がしばしば得られることができない。この制約がこ
れらの結合体中の一層強力な細胞障害性物質例えば植物
毒素の使用、および非常に高い薬物多重比を有するポリ
マー結合抗体−薬物結合体の開発をもたらした〔例えば
、ソープ（Ｐ、　Ｅ、　Ｔｈｏｒｐｅ　）前掲、ｐｐ４
７５〜５０６およびボルドウィン（ＲｏＷ、　Ｂａｌｄ
ｗｉｎ　）ほか、「単りローン性抗体７９１Ｔ／３６−
メドトレキサート結合体の設計および治療評価」、モノ
クローナル・アンティボディーズ・アンド・カンサー・
セラピー（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、　ｐ　ｐ
　２１５〜３１、アラン・Ｒ・リス社（Ａｌａｎ　Ｒ，
Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、）（１９８５）参照〕。しかし、大
薬物装填比または強力毒素の使用でも、多くの免疫結合
体はなお次善的細胞障害活性を示し、すべての利用可能
抗原部位が飽和される用量で完全な殺害を行なうことが
できない。
第２に、免疫結合体の細胞障害活性がしばしば結合体の
抗体成分により仲介された腫瘍細胞中へのその取込みに
依存する〔例えば、ランベルト（Ｊ、　Ｍ、　ｌａｍｂ
ｅｒｔ　）ほか、「ヒトリンパ系細胞と反応性である精
製免疫毒素」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６０　
　（Ｎ［Ｌ２２）ｐｐ１２０３５〜１２０４１（１９８
５）参照〕。この内在化は薬物が細胞内作用部位を有す
る抗体−薬物結合体を用いるとき、または抗体−毒素結
合体を用いるときに決定的である。しかし大多数の腫瘍
関連抗原、従ってこれらの抗原に結合した抗体−薬物ま
たは抗体−毒素結合体は内在化されない。内在化される
結合体はしばしば細胞のりソソームに輸送され、そこで
薬物または毒素が分解されるＣビテッタ（Ｅ、　Ｓ。
Ｖｉｔｅｔｔａ　）　ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　）、　　２３８、ｐｐ１０９８〜１１０４　（１９
８７）参照〕。従って、抗体−薬物または抗体−毒素結
合体が優れた腫瘍結合特性を有することができるけれど
も、それにも力弓わらず結合体は細胞内のその作用部位
に到達できないために限定された細胞障害利用性を有す
ることができる。
さらに、腫瘍細胞集団はしばしは抗原発現に関して不均
一である〔例えば、アルピノ（Ａ、Ｐ。
Ａｌｂｉｎｏ　）ほか、「同一患者の種々の黒色腫転移
由来の細胞系の表面抗原および糖タンパク質発現の不均
一性」、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
ィシン（Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）、　１５４、ｐｐ１
７６４〜７８　　（１９８１）参照〕。さらに、抗原陽
性腫瘍細胞が抗原陰性後代を生ずることができることが
示された〔例えば、イエ−（Ｍ、　Ｙｅｈ）ほか、「単
クローン性抗体により示されたヒト黒色腫抗原の発現に
対するクローン変異」、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　１２６（Ｎｏ、４）
　、　ｐｐ、　１３１２〜１７（１９８１）参照〕。従
って、腫瘍細胞の任意の集団中に特定免疫結合体が特異
的である抗原を有しない一定数の細胞が存在する。従っ
て、免疫結合体はこれらの細胞に結合してそれらの殺害
を仲介することができない。
これらの欠点のために、現在利用される抗腫瘍薬物また
は毒素の供給系は、殊に生体内治療に用いたときに限定
量の達成を有した。
前記免疫結合体に加えて、抗体一酵素結合体が抗体仲介
細胞毒性を増幅させるためにヨウ化物またはアルスフエ
ナミンをそれらの毒性形態に転化する第２非標的指向酵
素と組合せて試験管内で研究された〔例えば、パーカー
（Ｃ，Ｗ、　Ｐａｒｋｅｒ　）ほか「ルミノール置換ペ
プチドおよびタンパク質の酵素活性化および捕捉。抗腫
瘍抗体の細胞毒性を増幅する可能な手段」、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　）ＵＳＡ、　　７２（Ｎｏ、１）、ｐｐ、３３８
〜４２　　（１９７５）およびフィルポット（Ｇ、　Ｗ
、　Ｐｈ１ｌｐｏｔｔ）ほか、「抗体グルコースオキシ
ダーゼ結合体、ペルオキシダーゼおよびアルスフエナミ
ンによる腫瘍細胞のアフィニティー細胞毒性」、カンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　
　３４、ｐｐ、２１５９〜６４（１９７４）参照〕。
これらの試験管内研究によれば、酵素グルコースオキシ
ダーゼが抗体に結合され、ヨウ化物またはアルスフエナ
ミンをそれぞれ細胞障害性ヨウ素またはヒ素に転化する
非標的指向化ペルオキシダーゼ酵素と組合せて使用され
る。従って、この方法は抗体でグルコースオキシダーゼ
を腫瘍細胞に標的指向させるだけでなく、また２つの他
の非標的指向化物質が腫瘍部位に存在することを必要と
する。これらの物質の３つすべてが生体内に、腫瘍部位
に同時に存在する可能性は小なく、従ってこの方法は治
療に重要であるとは思われない。
ヤンセン（Ｆ、　Ｊａｎｓｅｎ　）ほかに対し１９８７
年１月２０日に発行されたカナダ国特許第Ｌ２１６，７
９１号には基質からアンモニウムイオンを遊離できる酵
素の抗体に対する結合が開示されている。次いでアンモ
ニウムイオンが腫瘍部位を標的した一定免疫毒素の細胞
障害性作用を増強するといわれる。
最後に、欧州特許出願第８４．３０２２１８．７号には
抗体が腫瘍細胞に対する非代謝性抗原の標的指向に使用
される疾患細胞集団例えば腫瘍を治療する方法が開示さ
れている。抗原は少くとも一部の腫瘍細胞内に蓄積し、
次いでそれが溶解して腫瘍部位に形成された汎在フィブ
ロネクチン捕捉マトリックス中へ抗原を遊離する。発明
の方法におけるこの時点で、マトリックスに結合した抗
原に特異性でそれに結合するヨウ素含有配位子が投与さ
れる。次いで細胞障害性ヨウ素がその部位に作用して腫
瘍細胞を殺す。多くの他の態様がこの出願に開示され、
その１つは抗体一酵素結合体を腫瘍部位に対する酵素の
標的指向に使用すること、および酵素が細胞障害性物質
に転化できる非致死基質を添加することを示唆している
〔欧州特許出願、ｐｐ、３４〜３５参照〕。しかし、そ
の出願のどこにもこの態様がいかに実施されるか開示し
ていない。同様に、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ
　）ほか、「薬物供給のための抗体」、コンドロールド
・ドラグ・デリベリ−（（：０ｎｉｒ０１］、ｅｄ　Ｄ
ｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ　）　（２版）、ロビンソンほ
か（Ｒｏｂｉｎｓｏｎａｎｄ　Ｌｅｅ　）　ｋＡ、ｐ、
６３９　（１９８７）　、は「腫瘍に局在化された物質
（例えば酵素）による「活性化」まで非毒性である薬物
を他の方法として考えることができる」ことを示唆して
いる。
しかし今日まで、こ＼に提供される方法がどのように実
施できるかだれも開示または示唆しておらず、また薬物
を標的指向させるこの方法をだれも実際に試みなかった
。
発明の概要 本発明は抗体一酵素結合体およびプロドラッグの組合せ
使用により細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給する新規な
方法を提供することにより前記問題を処理する。本発明
によれば、貧または非細胞障害性プロドラッグを活性細
胞障害性薬物に転化できる酵素が腫瘍特異性抗体に結合
される。この抗体一酵素結合体が腫瘍をもつ哺乳動物宿
主に投与され、抗体特異性に基いて抗体が特異性である
腫瘍抗原を有する腫瘍細胞の表面に結合する。次いでプ
ロドラッグが宿主に投与され、腫瘍部位で抗体結合酵素
の作用により一層活性な細胞障害性薬物に転化させる。
本発明はまた、一連のプロドラッグを単一抗体結合酵素
により活性化させる細胞障害性薬物を腫瘍細胞に供給す
る方法を包含する。さらに、一連の異なる免疫結合体、
すなわち種々の酵素を含む腫瘍特異性抗体を本発明に従
って使用し、腫瘍の治療のために多くの種々のプロドラ
ッグをそれらの一層細胞障害性の形態に転化させること
ができる。あるいは、結合体の抗体成分の特異性が異な
る、すなわち各免疫結合体が腫瘍細胞上の異なる抗原部
位に対する抗体を含む一連の異なる免疫結合体を本発明
に従って用いて、プロドラッグまたは多（のプロドラッ
グを一層活性な細胞障害性形態に転化させることができ
る。
本発明の好ましい態様によれば、酵素、アルカリ性ホス
ファクーゼ（ｒＡＰＪ）を含む抗体−酵素結合体が腫瘍
細胞の殺害を行なうために新規プロドラッグ、エトポシ
ド−４′−ホスフェートまたは７−（２’−アミノエチ
ルホスフェート）マイトマイシンあるいはそれらの組合
せとともに使用された。本発明の他の態様によれば、酵
素ペニシリンＶアミダーゼ（ｒＰＶ△」）を含む抗体酵
素結合体が腫瘍細胞の殺害を行なうために新規プロドラ
ッグ、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アド
リアマイシンとともに使用された。
本発明のなお他の態様によれば、腫瘍細胞を殺すための
、酵素シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を含む抗体一酵素
結合体のプロドラッグ、５−フルオロシトシンと組合せ
た使用に関する。
本発明の免疫結合体およびプロドラッグは抗腫瘍組成物
例えば本発明の少くとも１種の免疫結合体またはプロド
ラッグの薬学的に有効な量および薬学的に許容される担
体を含む組成物で使用することができる。さらに、免疫
結合体およびプロドラッグは組合せて哺乳動物を本発明
の組成物の薬学的に有効な量で処置する段階を含む哺乳
動物における腫瘍を治療する方法に使用することができ
る。
有利には、本発明の方法、免疫結合体、プロドラッグ、
薬学的組成物および組合せは、細胞障害性形態物を腫瘍
細胞に供給し、高い選択的細胞毒性を可能にし、普通の
抗体指向免疫療法技術に固有の不均一抗原発現、抗原／
抗体内在化および不十分な薬物抗力の問題を回避する比
較的簡単で直接的な方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は抗体一酵素結合体を結合する腫瘍細胞において
プロドラッグを活性化するために用いる方策を示す。
第２図は（Ａ）９６．５−ＡＰ免疫結合体；　（Ｂ）Ｌ
６−ＡＰ免疫結合体、（Ｃ）ＡＰｉ　　（Ｄ）単クロー
ン性抗体９６．５ｉおよび（Ｅ）単クローン性抗体Ｌ６
の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析（５〜１２．５
％勾配ゲル、非還元性）を示す。
第３図は本発明のエトボキシドボスフェートおよびエト
ポシドチオホスフェ−トプロドラソグの調製および加水
分解を示す。
第４図は（Ａ）エトポシド−４′−ホスフェート単独す
なわちＡＰまたはＡＰ−Ｌ６結合体の存在しない；　（
Ｂ）工１〜ボシド単独；　（Ｃ）エトポシド−４′−ホ
スフェートプロドラッグとＡＰとの反応の５分後に生じ
た生成物、および（Ｄ）エトポシド−４′−ホスフェー
トプロドラッグと本発明の１．、６−Ａ　Ｐ結合体との
反応の５分後に生じた生成物の高圧液体クロマトグラフ
ィー（ＩＩＰＬＣ）（２５４ｎｍでモニター）を示す。
第５図はエトポシド−４′−ホスフェートまたはエトポ
シド−４′−チオホスフェートのアルカリ性ホスファタ
ーゼに対する暴露による時間に関するエトポシド遊離の
割合を示す比較図である。
第６図はＬ６および９６．５単クロ一ン性抗体並びに本
発明のＬ６−ＡＰおよび９６．５−ＡＰ結合体のＨ３３
４７腫瘍細胞に対する比較結合を示す。
第７図はＬ６および１Ｆ５単クワクローン性抗体に本発
明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体のＨ３３４７
腫瘍細胞に対する比較結合を示す。
第８図はエトポシドまたば工１〜ボシドホスフエートプ
口ドラソグのモル濃度に対する殺された腫瘍細胞の割合
を示す比較図である。グラフは比較的細胞障害性でない
プロドラッグと本発明のＬ６ＡＰ結合体または９６．５
−ＡＰ結合体との反応から生ずる高割合の殺害を示す。
第９図は◎：エトポシド、■：ＥＰ、口：Ｌ６ＡＰ＋Ｅ
Ｐ、または■：　１Ｆ５−ＡＰ＋ＥＰで処理したＨ３３
４７腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈチミジン取込みのパー
セント阻止を示す比較図である。グラフはＥＰ単独で処
理したときに認められる活性に比べて腫瘍細胞をＬ６−
ＡＰおよびＥＰで処理したときに認められた細胞障害活
性の増加を示す。
第１０図は非処置または本発明の結合体で処置した腫瘍
中のホスファターゼ活性の分析を示す。
第１０Ａ図は非処置マウスと比較した２４時間早（本発
明のＬ６−ＡＰ結合体で処置したマウス中の時間に関す
るＨ　３３４７腫瘍の全ホスファターゼ活性を示す。第
１０Ｂ図は非処置あるいはＬ６ＡＰまたは１Ｆ５−ＡＰ
前処理マウスのヘマトキシリンおよびエオシンまたはＡ
Ｐ基質で染色した腫瘍断面を示す。暗黒色領域が高いホ
スファターゼ活性を示す。
第１１図は・：非処置あるいは○：エトポシド、■：Ｅ
Ｐ、口：　１Ｆ５−ＡＰ士ＢＰまたはム：Ｌ６Ａ　Ｐ　
−１−Ｂ　Ｐで処置したマウス中の時間に関する腫瘍容
積を示す比較図である。矢印は薬物処置の開始を示し、
適用できる場合に結合体を１８〜２４時間早く投与した
。グラフはＬ　６−ＡＰおよびＥＰ処装で認められた顕
著な抗腫瘍効果を示す。
第１２図は新規プロドラッグ、７−（２’−アミノエチ
ルホスフェ−１へ）マイトマイシン（ｒＭＯＰＪ）を含
む本発明により用いたマイトマイシン誘４体の化学構造
を示す。
第１３図はＭＯＰとアルカリ性ホスファターゼ酵素との
反応を時間に関して示す。反応の経過はＨＰ　Ｌ　Ｃに
よりＭＯＨＸＭＯＰのマイトマイシンアルコール誘導体
、の遊離についてモニターした。
第１４図はＬ６および１Ｆ５単クワクローン性抗体に本
発明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合体のＨ２９８
１腫瘍細胞に対する比較結合を示す。
第１５図はム：エトポシド、■：ＥＰ、口：ＡＰ＋ＥＰ
、・：Ｌ６−ＡＰ＋ＥＰ、または○：１Ｆ５ＡＰ＋ＥＰ
で処理したＨ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チ
ミジン取込みのパーセント阻止を示す比較図である。グ
ラフは腫瘍細胞を本発明のＬ６−ＡＰ結合体で前処理し
たときに認められた、ＥＰ単独に比べた細胞障害活性の
増加を示す。
第１６図はロ：マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、ム：ＭＯ
Ｈ，■：ＭＯＰ、△：ＭＯＰ＋ＡＰ。
・：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰまたは１Ｆ５−ＡＰ→−ＭＯＰ
で処理したＨ　２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−
チミジン組込みのパーセント阻止を示す比較図である。
グラフはＭＯＰ単独で処理したときに認められる活性に
比べて腫瘍細胞を本発明のＬ６−ＡＰ結合体で前処理し
次にＭＯＰ処理したときに認められた細胞障害性活性の
増加を示す。
第１７図ばム：ＭＭＣ１口：ＭＯＨ，■：Ｍｏｐ。
・：Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰまたは○：１Ｆ５−ＡＰ十ＭＯ
Ｐで処理したＯＥＭ細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チミジン
取込みのパーセント阻止を示す比較図である。このグラ
フはＬ６抗原の存在しないＣＥＭ細胞で有意な増大が認
められないので第１６図に認められた増大された細胞毒
性の特異性を示す。
第１８図は・：非処置（対照）、あるいは■：ＭＯＨ，
○：ＭＯＰ、Ａ：　１Ｆ５−Ａｐ＋ＭＯＨまたは口：　
Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰＩＩで処置したマウス中の時間に関
する腫瘍容積を示す比較図である。
矢印は間をあけた薬物処置を示し、適用できる場合に結
合体は各薬物処置より１８〜２４時間早く投与した。グ
ラフはＬ６−ＡＰ＋ＭＯＰによる腫瘍の処置で認められ
た顕著な腫瘍効果を示す。
第１９図は一二非処置（対照）、あるいは口：ＭＯＰ／
ＥＰ、○：　Ｉ　Ｆ５−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＥＰまたは・：
　Ｌ６−ＡＰ＋ＭＯＰ／ＢＰで処置したマウス中の時間
に関する腫瘍容積を示す比較図である。矢印は間をあけ
た薬物処置を示し、適用できる場合に結合体は各薬物処
置より１８〜２４時間早く投与した。グラフは本発明の
Ｌ６−ＡＰ結合体およびプロドラッグ、ＭＯＰおよびＥ
Ｐの糺合せによる腫瘍の処置で認められた顕著な抗腫瘍
効果を示す。
第２０図は本発明のアドリアマイシンプロドラッグ（ｒ
ＡＰＯＪ）の化学構造およびそのアドリアマイシンから
の調製を示す。
第２１図はＡＰＯと△：遊離ペニシリン■アミダーゼ酵
素または○およびロ：木発明のＬ６ＰＶＡ結合体のそれ
ぞれ１０および１００μｇ全タンパク質／ｍｌとの反応
で遊離されたアトレアマイシンの割合を時間に関して示
す比較図である。
反応の経過はＨＰＬＣによりモニターした。
第２２図はＬ６単クローン性抗体並びに本発明のＬ６−
ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のＨ２９８１腫瘍細
胞に対する比較結合を示す。
第２３図は○：アドレスアマイシン（ＡＤＭ）、・：Ａ
ＰＯ、△：Ｌ６−ＰＶＡ＋ＡＰ○またはム：　１Ｆ５−
ＰＶＡ＋ＡＰ○で処理したＨ　２９８１腫瘍細胞のＤＮ
Ａ中への３Ｈ−チミジン取込みのパーセント阻止を示す
比較図である。グラフはＡＰＯ単独で処理したときに認
められた活性に比べて腫瘍細胞をＬ６−ＰＶＡ結合体で
前処理し次いでＡＰＯで処理したときに認められた細胞
障害活性の増加を示す。
第２４図はＬ６および１ＦＳ単クワクローン性抗体に本
発明のＬ６−ＰＶＡおよびＩ　Ｆ　５−ＰＶＡ結合体の
ドーグ（Ｄａｕｄｉ　）　リンパ腫細胞に対する比較結
合を示す。
第２５図は・：ＡＤＭ、○：ＡＰＯ，■：Ｌ６ＰＶＡ＋
ＡＰ○またはロ：１Ｆ５−ＰＶＡ十ＡＰＯで処理したド
ーグリンパ腫細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チミジン取込み
のパーセント阻止を示す比較図である。グラフはＡＰＯ
単独で細胞を処理して認められた細胞障害性効果に比べ
て腫瘍細胞を１．Ｆ５−ＰＶＡ結合体で前処理し次いで
Δｐ。
処理したときに認められた細胞障害活性の増加を示す。
第２６図は５−フルオロシトシン（ｒ５−ＦＣＪ）およ
び５−フルオロウラシル（ｒ５−ＦＵ）の化学構造を示
す。５−ＦＣは本発明の方法により５ＦＵに転化される
プロドラッグである。
第２７図はシトシン（ｃｙｔｏ）の・：ＣＤ、Ｏ：Ｌ６
−ＣＤまたは■：１Ｆ５−ＣＤとの反応で、あるいは５
ＦＣの口：ＣＤ、ム：Ｌ６−ＣＤまたは△：１Ｆ５−Ｃ
Ｄとの反応で形成された生成物の量を時間に関して示す
比較グラフである。基質としてシトシンを用いて形成さ
れた生成物はウラシルであり、基質として５−ＦＣを用
いて形成された生成物は５−ＦＵであった。反応の経過
は分光測光でモニターした。
第２８図はＬ６単クローン性抗体並びに本発明のＬ６−
ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に
対する比較結合を示す。
第２９図は・：５−ＦＵ、口：５−ＦＣ，○：Ｌ６−Ｃ
Ｄ＋５−ＦＣまたは■：１Ｆ５−ＣＤ＋５−ＦＣで処理
したＨ２９８１腫瘍細胞のタンパク質中への３Ｈ−ロイ
シン取込みのパーセント阻止を示す比較図である。グラ
フは５−ＦＣ単独で処理して認められた活性に比べて腫
瘍細胞をＬ６ＣＤ結合体で前処理し次に５−ＦＣ処理し
たときに８忍められた細胞障害性活性の増加を示す。
発明の詳細な説明 本発明は細胞障害性物質を腫瘍細胞に供給する新規な方
法に関し、癌例えば癌腫および黒色腫、並びに他の腫瘍
の治療における腫瘍細胞の高い選択的殺害を与える。
本発明の方法によれば、抗体一酵素結合体が腫瘍をもつ
捕乳動物宿主に投与される。この抗体酵素結合体は、親
薬物よりも腫瘍細胞に対する細胞障害性の低いプロドラ
ッグを一層活性な親化合物に転化できる酵素に結合した
腫瘍特異性抗体からなる。宿主中に導入されると腫瘍細
胞上に認められる抗原と反応性である結合体の抗体成分
が結合体を腫瘍の部位に向かわせて腫瘍細胞に結合する
。従って抗体が腫瘍の部位に酵素を供給すると考えるこ
とができる。次いで酵素に対する基質であるプロドラッ
グが宿主に導入され、腫瘍部位で酵素により活性な細胞
障害性薬物に転化される。
従って薬物が細胞外で活性化され、その部位ですべての
腫瘍細胞、すなわち結合体の抗体が特異性であり抗体が
結合する特定腫瘍抗原をもつ細胞並びにその抗原に陰性
であるがしかしそれにもか＼わらず腫瘍の部位に存在す
る細胞、中へ拡散することができる（第１図参照）。従
って、本発明の方法は腫瘍抗原不均一性および普通の免
疫結合体薬物供給技術に関連する抗原／結合体の内在化
する必要性の現在の問題を克服する。
さらに、この方法は薬物が抗体に直接結合する必要がな
く、従って供給できる薬物の量が制限されないので腫瘍
部位における薬物抗力の陳腐な問題を生じない。事実こ
の方法は、結合体の抗体結合酵素が多くの基質の代謝回
転を行なうことができプロドラッグを活性薬物に反復転
化するので、腫瘍部位に存在する活性薬物分子の数を増
幅する。
さらに、この方法は他の組織における遊離と対照して腫
瘍部位に特異的に活性薬物を遊離できる。
これは、腫瘍細胞が抗体一酵素結合体でコートされるた
めに腫瘍部位における酵素の濃度が他の組織におけるそ
の濃度より高いためである。
本発明の免疫結合体の抗体成分には腫瘍関連抗原に特異
的に結合する任意の抗体が含まれる。そのような抗体の
例には癌腫、黒色腫、リンパ腫、並びに骨および軟組織
肉腫並びに他の腫瘍上に認められる抗原に特異的に結合
するものが含まれ、しかしそれらに限定されない。細胞
表面に結合して長時間保持されるかまたは非常に徐々に
内在化される抗体が好ましい。これらの抗体は多クロー
ン性または、好ましくは単クローン性であることができ
、無傷抗体分子あるいは抗体の活性結合領域を含むフラ
グメント例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｚであること
ができ、よく確立された技術を用いて製造することがで
きる〔例えば、デウエガー（Ｒ，Δ。
ＤｅＷｅｇｅｒ）ほか、「クロラムブシルー抗体複合体
によるマウスリンパ腫および黒色腫細胞の根絶」、イム
ノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｒｅｖ、　）、　　６２、ｐ　ｐ、　　２９〜４５　　
（１９８２）（腫瘍特異性多クローン性抗体が生成され
、結合体に使用される）；イエ−（Ｍ、　Ｙｅｈ　）ほ
か、「単クローン性抗体により確認されたヒト黒色腫の
細胞表面抗原」、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　）＋　　
７　６　　、　ｐ、２９２７（１９７９）；ブラウン（
Ｊ、　Ｐ、　Ｂｒｏｗｎ　）ほか、［単クローン性抗体
によるヒト黒色腫関連抗原ｐ９７の構造確認」、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
Ｌ　１２７　（ｈｈ２）　、Ｉ）　ｐ。
５３９〜５４１　　（１９８１）（生成された腫瘍特異
性単クローン性抗体）；およびマーク（Ｊ、Ｐ。
Ｍａｃｈ　）ほか、［結腸癌映像化の改良：多クローン
性抗ＣＥＡ抗体および静止フォトスキャンニングから単
りローン性ＦａｂフラグメントおよびＢＣＴに」、モノ
クローナル・アンティボディーズ・フォ・カンサー・デ
テクション・アンド・セラビー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
　Ａｎｔｉｂｏｃｌｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄ
ｅｔｅｔｉｏｎＡｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　）＋ボルドウ
ィン（Ｂａｌｄｗｉｎ　）　ほか編、ｐ＋ｐ、５３〜６
４、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ　）　　（１９８５）　　（抗体フラグメントの生
成および腫瘍細胞への局在化に対する使用）参照〕。さ
らに、単クローン性抗体が使用されれば、抗体はマウス
またはヒト由来またはキメラ抗体であることができる〔
例えば、オイ（Ｖ、　Ｔ。
Ｏｌ）「キメラ抗体」、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ　）、　４　　（Ｎｏ、３）　、ｐｐ
、　　２１４〜２２１　　（１９８６）参照］。
本発明の免疫結合体の酵素成分にはプロドラッグにそれ
をその一層活性な細胞障害性形態に転化するように作用
することができる任意の酵素が含まれる。本明細書に用
いた「プロドラッグ」という語は親薬物に比べて腫瘍細
胞に対する細胞障害性が低く、−層活性な親形態に酵素
的に活性化または転化されることができる薬学的に活性
な物質の前駆物質または誘導体形態を示す〔例えば、ウ
ィルマン（Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｗｉｌｍａｎ、　ｒ癌化学療法
におけるプロドラッグ」、バイオケミカル・ソサイエテ
ィー・トランスアクションズ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
＋５ｏｃｉｅｔｙ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　）、　
　］　４、ｐｐ、３７５−３８２〔第６１５会議（６１
５ｔｈ　Ｍｅｅｔ、ｉｎｇ。
Ｂｅ１ｆａｓｔ　）　　１９８６　）およびステラ（Ｖ
、　Ｊ、　５ｔｅｌｌａ）ほか、「プロドラッグ：標的
指向薬剤供給に対する化学的方法」、ブイレフテッド・
ドラッグ・プリヘリ−（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｄｒｕｇ　
Ｄｅｒｉｖｅｒｙ　）＋　ポルチャー　ｈ　（Ｒ，Ｂｏ
ｒｃｈａｒｄｔ）ほか編、ｐｐ、２４７〜２６７、ヒュ
マナ・プレス（ＩｌｕｍａｎａＰｒｅｓｓ　）１９８５
参照〕。
本発明の方法に有用な酵素にはホスフェート含有プロド
ラッグの遊離薬物への転化に有用なアルカリ性ホスファ
ターゼ、サルフェート含有プロドラッグの遊離薬物への
転化に有用なアリールスルファターゼ、非毒性５−フル
オロシトシンの抗癌薬５−フルオロウラシルへの転化に
有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラッ
グの遊離薬物への転化に有用なプロテアーゼ例えばセラ
チアプロテアーゼ、サーモリジン、ズブチリシン、カル
ボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプシ
ンＢおよびＬ）　、Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラ
ッグの転化に有用なり一アラニルカルポキシベプチダー
ゼ、グリコシル化プロドララグの遊離薬物の転化に有用
な炭水化物開裂酵素例えばβ−ガラクトシダーゼおよび
ノイラミニダーゼ、β−ラクタムで誘導体化した薬物の
遊離薬物への転化に有用なβ−ラクタマーセ、並びにペ
ニシリンアミダーゼ例えばそれらのアミン窒素において
フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれぞ
れ誘導体化した薬物の遊離薬物への転化に有用なペニシ
リンアミダーゼまたはペニシリンＧ−アミダーゼが含ま
れ、しかしそれらに限定されない。あるいはまたアブチ
ーム　（ａｂｚｙｍｅ）として知られる酵素活性を有す
る抗体を本発明のプロドラッグの遊離活性薬物への転化
に使用することができる〔例えば、マセイ（Ｒ，Ｊ、　
Ｍａｓｓｅｙ）。
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、　　３２８、ｐｐ、４
５７〜４５８　（１９８７）参照〕。抗体−アブチーム
結合体は腫瘍細胞集団に対するアブチームの供給のため
にこＸに記載のように調製することができる。
同様に、本発明のプロドラッグには前記プロドラッグ、
例えばホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェー
ト含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、
ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラ
ッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プ
ロドラッグ、場合により置換されていることができるフ
ェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは場合によ
り置換されていることができるフェニルアセトアミド含
有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび結合体の
酵素により一層活性な細胞障害性遊離薬物に転化される
ことができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグが
含まれ、しかしそれらに限定されない。本発明に用いる
プロドラッグに誘導体化できる細胞障害性薬物の例には
エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ　）　、テニポシド（
ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ　）、アドリアマイシン、ダウノ
マイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉ
ｎ　）、アミノプテリン、ダウノマイシン、マイトマイ
シン、シス−プラチナム（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ　
）およびシスーブラチナム類似体、ブレオマイシン、ニ
スペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎ）〔米国特許筒
４，６７５，１８７号参照〕、５−フルオロウラシル、
メルフアラン並びに他の関連ナイト口ジエンマスタード
が含まれ、しかしそれらに限定されない。
本発明の酵素は、よく知られた技術例えばヘテｌコニ官
能橋かけ剤、５ＰＤＰ〔３−（２−ピリジルジチオ）プ
ロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル〕またはＳＭＣＣＣ４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１〜カル
ボン酸スクシンイミジル〕の使用により本発明の抗体に
共有的に結合さゼることができる〔例えば、ソープＣＰ
、　Ｅ、　Ｔｈｏｒｐｅ）ほか、「抗体−毒素結合体の
調製および細胞障害性」、イムノロジカル・レビューズ
（ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖ、　）＋　　６２
、ｐｐ、１１９〜５８　（１９８２）；ランヘルｌ□　
（Ｊ、Ｍ、Ｌａｍｂｅｒｔ）ほか、前掲、ｐ、１２０３
８；ローランド（Ｇ、Ｆ、　Ｒｏｗｌａｎｄ　）ほか、
前掲、ｐｐ、１８３〜８４およびガレゴ（Ｊ、　Ｇａｌ
ｌｅｇｏ　）ほか、前掲、ｐｐ、７３７〜３８参照〕。
あるいは、本発明の酵素の少くとも機能的に活性な部分
に結合した本発明の抗体の少くとも抗原結合領域を含む
融合クンバク質を、よ（知られた組換えＤＮＡ技術を用
いて構築することができる〔例えば、ノイハーガ−（Ｍ
、　３．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ほか、ネーチ＋　　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）。
３１２、ｐｐ、６０４〜６０８　（１９８４）参照］。
これらの融合タンパク質はこ−に記載する抗体酵素結合
体と実質的に同様に作用する。
本発明の好ましい態様によれば、ヒト癌抗原に特異性の
抗体が酵素、アルカリ性ホスフ了ターゼに結合され、本
発明の方法によりエピポドフィロトキシングルコシドの
４′−ホスフェート誘導体の活性抗癌薬への転化に使用
された。そのような誘導体にはエトポシド−４′−ホス
フェート、エトポシド−４′−チオホスフェートおよび
テニポシドー４′−ホスフェートが含まれる（これらの
誘導体の構造には第３図参照：テニポシド誘導体は示さ
れた構造の糖部分上のメチル基の代りに２チエニル基を
有する）。本発明の他の態様はホスフェート部分がグル
コシド上の他のヒドロキシル基に配置されたグルコシド
のホスフェート誘導体を含むことができる。しかし、よ
り好ましい態様によれば、本発明においてプロドラッグ
として使用されるホスフェート誘導体はエトポシド−４
′ホスフェ−１・またはエトポシド−４′−チオホスフ
ェートである。
本発明によって、アルカリ性ホスファクーゼＡＰを、単
クローン性抗体Ｌ６、ヒト肺癌細胞上の糖タンパク質抗
原に結合するＩｇＧ２ａ抗体〔ヘルストロム（１，ｌｌ
ｅｌｌｓｔｒｏｍ　）ほか、「多くのヒト癌腫と反応す
るＩｇＧ２ａ抗体、Ｌ６の抗腫瘍効果」、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　）ＵＳＡ、　　　８　３　
、　ｐｐ、　　　７０５９〜６３　（１９８６））、に
共有的に結合させた。生した免疫結合体は非結合酵素と
比べたときに酵素活性の低下を示さなかった。さらに、
Ｌ６抗体の結合活性の大部分が免疫結合体中に保存され
た。
試験管内細胞毒性検定を用いて我々は、ヒト癌腫細胞系
の細胞をＬ　６−ＡＰ免疫結合体で処理し、次いで細胞
をエトポシドホスフェ−トプロドラソグに暴露すると、
これらの癌細胞に対するエトポシド単独の使用に匹敵す
る細胞毒性を生じたことを実証した。対照的に、エトポ
シドホスフェート単独はわずかの細胞毒性を示した。
さらに、我々のヌードマウスにおける生体内研究はＬ６
−ＡＰ免疫結合体がＬ６陽性腫瘍異種移植片に局在化す
ることを示した。これらの腫瘍の組織学的評価は、標的
指向ＡＰ酵素が腫瘍塊全体に分布したことを示した。
さらに、Ｌ６−ＡＰ免疫結合体は、結合体を皮下Ｌ６陽
性腫瘍をもつヌードマウスに投与し、次いでエトポシド
ホスフェートプロドラッグで処置した治療実験において
強い生体内抗腫瘍活性を示した。この処置の抗腫瘍効果
は若干の腫瘍の完全な退行を包含し、プロドラッグまた
は親薬物単独による処置の効果より優れていた。
本発明の他の好ましい態様によれば、Ｌ６ＡＰ免疫結合
体を新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグの活
性マイトマイシン薬物への転化に用いた。エトポシドホ
スフェートプロドラッグの場合のように、結合体のＡＰ
酵素がプロドラッグからホスフェート基を除去し、活性
抗腫瘍物質を遊離する。本発明のマイトマシンホスフェ
−１〜プロドラツグはマイトマイシンＣまたはポリフィ
ロマイシンのＮ７−Ｃ１−８アルキルホスフ工−ト誘導
体またはその薬学的に許容される塩であることができる
。Ｎ７は親薬物のマイトサン（ｍ１ｔｏｓａｎｅ　）の
７位に結合した窒素原子を示す。
より好ましい態様によれば、使用される誘導体は７−（
２’−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン（ｒ
ＭＯＰＪ）である（マイトマイシンＣおよびニナトリウ
ム塩形態のＭＯＰの構造には第１２図参照、ＭＯＰに相
当するポルフィロマイシン誘導体はマイトマイシンＣの
アジリジン窒素上にメチル基を有する）。あるいは、Ｍ
ＯＰ化合物は９ａ−メトキシ−’１−（（（ホスホノオ
キシ）エチル〕アミノ〕マイトサンニナトリウム塩と称
することができる。本発明の他の態様はプロドラッグと
してＮ７−アルキルマイトマイシンホスホロチオアート
類の使用を含むことができる。
試験管内研究は、ヒト肺腫瘍系の細胞をＬ６ＡＰ免疫結
合体により処理し、次に細胞をＭＯＰに暴露すると、認
められている抗腫瘍物質のマイトマイシン単独の腫瘍細
胞に対する使用に匹敵する細胞毒性を生じたことを示し
た。マイトマイシンホスフェートプロドラッグ単独の腫
瘍細胞に対する使用はわずかの細胞毒性を生じた。同様
に、Ｌ６−ＡＰ免疫結合体は、ヒト肺腫瘍をもつヌード
マウスに結合体を投与し、次いでマイトマイシンホスフ
ェートプロドラッグで処置した治療試験において顕著な
生体内抗腫瘍効果を示した。この抗腫瘍効果はプロドラ
ッグ単独、親薬物単独または非結合性抗体−ＡＰ結合体
とともに与えたプロドラッグの使用で認められたものよ
り大きかった。
本発明のなお他の態様において、ペニシリンアミダーゼ
酵素をＬ６単クローン性抗体に共有的に結合させ、生じ
た免疫結合体を新規アドリアマイシンプロドラッグの活
性抗腫瘍薬アドリアマイシンへの転化に用いた。用いた
特定アミダーゼはフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から分離されたフェ
ノキシアセチルアミド結合を加水分解するペニシリンＶ
アミダーゼ（ｒＰＶＡＪ　）であった。従って、用いた
特定のプロドラッグはＮ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシ
アセチル）アドリアマイシン（ｒＡＰ○」）であり、そ
れはアミダ−ゼにより加水分解されて強力な抗腫瘍物質
、アドリアマイシン、を遊離した。Ｌ６−ＰＶＡ免疫結
合体は非結合酵素と比べたときに酵素活性の低下を示さ
ず、Ｌ６抗体の結合活性の大部分が結合体中に保存され
た。
我々の試験管内研究によれば、ヒト肺腫瘍細胞をＬ６−
ＰＶＡ結合体で処理し、次いで細胞をＡＰＯプロドラッ
グに暴露すると細胞をアドリアマイシン単独で処理して
認められたものに匹敵する細胞毒性を生じた。重要なこ
とには、ＡＰＯプロドラッグ単独が腫瘍細胞に対し非常
に少ない細胞毒性を示した。
同様の試験管内研究はまた、ＰＶＡ酵素を１Ｆ５、リン
パ腫細胞に認められる抗原と反応性の単クローン性抗体
、に結合させた１Ｆ５−ＰＶＡ結合体を用いて行なった
。ドージリンパ腫細胞を１Ｆ５ＰＶＡ結合体で処理し、
次いで細胞をＡＰＯに暴露するとアドリアマイシン単独
で処理して認められたものに匹敵する細胞毒性を生じた
が、ＡＰＯ単独による細胞の処理は非常に小さい細胞毒
性を生じた。
新規アドリアマイシンプロドラッグ、Ｎ−（ｐヒドロキ
シフェノキシアセチル）アドリアマイシンの合成および
使用がこ＼に記載されているけれども、本発明には実質
的に同様に誘導できる他の関連アドリアマイシンプロド
ラッグの合成および使用が含まれることを理解すべきで
ある。例えばプロドラッグ、Ｎ−（フェノキシアセチル
）アドリアマイシンはまた、そのプロドラッグがこ−に
記載したプロトコルを用い、しかし反応物ｐヒドロキシ
フェノキシ酢酸（後記実施例４参照）をフェノキシ酢酸
にかえることにより合成できるので本発明の範囲内にあ
る。さらに、本発明のアドリアマイシンプロドラッグに
はアドリアマイシンの、例えばフェニル環の異なる位置
で置換した他のＮ−ヒドロキシフェノキシアセチル誘導
体、並びにこ−に記載したヒドロキシル基以外の置換基
ヲフェニル環上に含むＮ−フェノキシアセチル誘導体が
含まれることを理解すべきである。
さらに、この態様は免疫結合体の酵素成分として他のア
ミダーゼ、例えばペニシリンＧアミダーゼ、並びに個々
のアミダーゼがプロドラッグを活性抗腫瘍形態に加水分
解できるように相応する誘導体にした他のプロｌζラッ
グを包含する。例えば、ペニシリンＧアミダーゼを酵素
として用いるとき、プロドラッグがフェニルアセチルア
ミドのフェノキシアセチルアミド基とは対照的に）含む
べきであり、これはペニシリンＧアミダーゼがこの型の
アミド結合を加水分解するからである〔例えば、マルゴ
リン（　Ａ．　Ｌ．　Ｍａｒｇｏｌｉｎ　）ほか、ビオ
シミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｂｉｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ．　　八ｃｔａ）、６１６　、　ｐｐ．
　　　２８３　　〜８９（１　９　８　０）参照〕。従
って、本発明の他のプロドラッグにはＮ　−　（ｐ−ヒ
ドロキシフェニルアセチル）アドリアマイシン、Ｎ−（
フェニルアセチル）アドリアマイシンおよびアドリアマ
イシンの他の適当に置換したＮ−フェニルアセチル誘導
体が含まれる。
本発明が親薬物のアミン基をフェノキシ酢酸、フェニル
酢酸または他の関連酸のカルボキシル基と反応させるこ
とにより誘導される任意のプロドラッグを含むことを理
解すべきである。従って、誘導体にでき、こ＼に記載し
たアドリアマイシンプロドラッグと実質的に同様に作用
するアドリアマイシン以外のアントラシタリン類のプロ
ドラッグは本発明の範囲内に属する。例えば、本発明に
従って製造し、使用できる他のプロドラッグにはアント
シタリン例えばダウノマイシンおよびカルミノマイシン
のヒドロキシフェノキシアセチルアミド誘導体、ヒドロ
キシフェニルアセチルアミド誘導体、フェノキシアセチ
ルアミド誘導体およびフェニルアセチルアミド誘導体が
含まれる。他のアミン含有薬物例えばメルフアラン、マ
イトマイシン、アミノプテリン、ブレオマイシンおよび
ダウノマイシンもまたこ＼に記載のように変性して本発
明のプロドラッグを生成させることができる。
従って、本発明が式Ｉおよび■： （式中、 ＲＩが１１であり、Ｒ３がＯＨまたはＯ　Ｃ　Ｈ　３で
あるか、あるいは Ｒ１がＯＨであり、Ｒ３がＯＣＨ３であり、Ｒ２はＨま
たはＯＨである） （式中、 ＲＩがＨであり、Ｒ３がＯ　ＨまたはＯ　Ｃ　Ｈ　３で
あるか、あるいは Ｒ１がＯＨであり、Ｒ３が○Ｃ　Ｈ　３であり、Ｒ２は
ＨまたはＯＨである） を有する化合物を包含することが明らかである。
本発明のなお他の好ましい態様には酵素、シトシンデア
ミナーゼ（「ＣＤ」）のし６単クロ一ン性抗体に対する
結合体が含まれる。そのデアミナセ酵素は５−フルオロ
シトシン（ｒ５−ＦＣＪ）、抗腫瘍活性のない化合物、
の強力な親抗腫瘍薬、５−フルオロウラシル（ｒ５−Ｆ
ＵＪ）への転化を触媒する（第２６図参照）。従って、
本発明のＬ６−ＣＤ免疫結合体をプロドラッグ５−ＦＣ
の５−ＦＵへの転化に用いると試験管内で腫瘍細胞に対
する有意な細胞障害効果を生じた。
前記本発明の免疫結合体に対して真実であったように、
Ｌ６−ＣＤ結合体は結合に基く酵素または結合活性の有
意な低下を示さなかった。さらに、我々の試験管内研究
は、ヒト肺腫瘍細胞をＬ６ＣＤ結合体で処理し、次いで
細胞をプロドラッグ５−ＦＣに暴露すると、細胞を強力
な抗腫傷薬５ＦＵ単独で処理してＳ忍められたものに等
しい細胞障害効果を生じたことを示した。これらの腫瘍
細胞のプロドラッグ単独による処理は有意でない細胞障
害効果を生じた。
こ５に記載した広範なデータから、本発明の免疫結合体
／プロドラッグの組合せが、細胞障害活性の低下したプ
ロドラッグが投与されて抗体標的指向酵素の存在に基き
プロドラッグが腫瘍細胞の部位で高細胞障害性状態に転
化される腫瘍細胞を殺す選択的機構を与えることが明ら
かである。さらに、この方法により達成される細胞毒性
は、腫瘍部位で遊離された活性薬物が前記のように抗体
薬物結合体供給系に伴なう物理的制約により妨げられな
いので普通の抗体標的指向技術に比ベーζ増大される。
従って、本発明の方法が癌および他の腫瘍の治療におい
て腫瘍細胞に関する選択的細胞毒性を増大する方法を提
供することが明らかである。
本発明の方法の他の態様によれば、若干のプロドラッグ
および単に単一の抗体一酵素結合体を用いる組合せ化学
療法の方法が提供される。この態様によれば、すべて免
疫結合体中の同一酵素に対する基質である多数のプロド
ラッグが使用される。
従って、特定の抗体一酵素結合体が多数のプロドラッグ
を細胞障害性形態に転化し、腫瘍部位に高い高腫瘍活性
を生ずる。例えば、ヒト肺腫瘍をもつヌードマウスに本
発明のＬ６−ＡＰ免疫結合体を投与し次いで一緒に与え
た新規プロドラッグの組合せ、すなわちエトポシドホス
フェートプロドラッグおよびマイトマイシンホスフェー
トプロドラッグで処置した生体内研究で顕著な抗腫瘍効
果が得られた。同様に、エトポシドホスフェート、アド
リアマイシンホスフェート　（米国特許第４、１．８５
．１１１号参照）および５−フルオロウリジンモノホス
フェート〔例えば、ヘイデルバーガー（Ｃ，Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇｅｒ）ほか、「フッ素化ピリミジンおよびそ
れらのヌクレオシド」、アトパンシス・イン・エンチモ
ロジー・アンド・リレーテッド・エリアズ・オブ・モレ
キュラー・バイオロジ（Ａｄｖ。
ＩＥｎｚｙｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ、　Ａｒｅａｓ　Ｍｏ
ｌ、　Ｂｉｏｌ、）、　５４、ｐｐ。
５７〜１１９（１９８３）参照〕の、抗腫瘍抗体ＡＰ結
合体による処置後の投与が腫瘍の部位に強力な抗腫傷薬
、すなわちエトポシド、アドリアマイシンおよび５−フ
ルオロウリジン、の組合せの形成を生ずる。
他の態様によれば、結合体の酵素成分が変化する多くの
異なる免疫結合体が使用される。各免疫結合体はそのそ
れぞれのプロドラッグまたはプロドラッグ類を腫瘍部位
で細胞障害性形態に転化させるために使用できる。例え
ば、抗腫瘍抗体をＡＰに結合させて１結合体を形成する
ことができ、シトシンデアミナーゼに結合させて他の結
合体を形成することができる。次いで両免疫結合体を、
腫瘍をもつ宿主に投与すると抗体特異性により腫瘍部位
で腫瘍抗原に結合する。プロドラッグ、エトポシドホス
フェートおよび５−フルオロシトシンを投与するとエト
ポシドおよび５−フルオロウラシル（ともに強力な抗腫
瘍物質）の形成を腫瘍部位で生ずる。
本発明のなお他の態様には結合体の抗体成分の特異性が
変動する多くの免疫結合体の使用が含まれ、すなわち、
それぞれが問題の腫瘍上の異なる抗原に特異的に結合す
る抗体を有する多くの免疫結合体が使用される。これら
の免疫結合体の酵素成分は同一であることができ、また
は異なることができる。この態様は、腫瘍の表面上の種
々の抗原の量が未知であり、十分な酵素を腫瘍部位に標
的指向させることを確実にすることを望む状態において
殊に有用であることができる。腫瘍に対して異なる抗原
特異性をもつ多くの結合体の使用はプロドラッグまたは
一連のプロドラッグの転化に十分な酵素を腫瘍部位に得
る可能性を増大する。
さらにこの態様は、正常組織が同様の腫瘍関連抗原のす
べてをもつ可能性が低い〔ヘルストロム（１，Ｉ（ｅｌ
］ｓｔｒｏｍ　）ほか、「黒色腫抗原ｐ９７の２決定基
に対する単クローン性抗体の補体依存性細胞毒性におけ
る相乗的な作用」、ジャーナル・オブ・イムノロジー（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　　１２７　　（隘１）、
ｐｐ、１５７〜１６０　（１９８１）参照〕ので腫瘍に
対する高度の特異性の達成に重要である。
本発明はまた癌および他の腫瘍を治療するための薬学的
組成物、組合せおよび方法を包含する。
より詳しくは、本発明は哺乳動物宿主を薬学的に有効な
量の抗体一酵素結合体または結合体類、並びに薬学的に
有効な量のプロドラッグまたはプロドラッグ類で薬学的
に許容される方法で処置する腫瘍の治療法に使用する本
発明の抗体一酵素結合体およびプロドラッグまたはプロ
ドラッグ類を含む組合せを包含する。本発明の組合せお
よび方法はヒト、イヌ、ネコおよびウマを含めて任意の
動物の治療に有用である。
好ましい態様によれば、抗体一酵素結合体がプロドラッ
グの導入の前に宿主に投与される。結合体およびプロド
ラッグの投与の間に結合体の抗体が腫瘍部位に標的指向
し、酵素を局在化させる十分な時間を許容すべきである
。そのような十分な時間は使用される結合体により１２
時間〜１週間の範囲内にあることができる。
本発明の結合体およびプロドラッグは静脈内、腹腔内、
経口、リンパ管内または腫瘍内の直接投与を含み、それ
らに限定されない普通の投与方法を用いて投与すること
ができる。静脈内投与が好ましい。
免疫結合体またはプロドラッグを含む本発明の組成物は
液体溶液または懸濁液、錠剤、火剤、粉末、ＩＪＪＪ、
ポリマーマイクロカプセルまたはマイクロヘシクル、リ
ポソーム、および注射可能または注入可能溶液を含み、
しかしそれらに限定されない種々の剤形であることがで
きる。好ましい形態は投与および治療適用の方法による
。例えば、抗体一酵素結合体の経口投与は、結合体タン
パク質が経口的に、例えば錠剤形態で摂取されれば胃中
で分解する傾向であるので有利でないかもしれない。
結合体またはプロドラッグ組成物はまた、好ましくは普
通の薬学的に許容される担体および公知の佐剤例えばヒ
ト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン
、緩衝物質例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソ
ルビン酸カリウムおよび塩または電解質例えば硫酸プロ
タミンを包含する。
本発明の組成物の投与および用法の最も有効な方法は疾
患の状態および経過、患者の健康、治療に対する応答、
並びに処置医師の判断に依存する。
従って、免疫結合体およびプロドラッグの用量は個々の
患者に対し決定すべきである。
それにもか＼わらず、本発明の抗体一酵素結合体の有効
量は約１．０〜約１００ｍｇ／ｎ（の範囲内にあること
ができる。本発明のプロドラッグの有効量は使用される
個々のプロドラッグ、誘導される親薬物に依存する。プ
ロドラッグは親薬物より細胞障害性が少ないので、親薬
物に認められる量以上の用量を用いることができる。例
えば、エトボシドブロドラソグの有効量は約７５〜５０
０ｍｇ／イの範囲内にあることができる。マイトマイシ
ンホスフェートプロドラッグの有効量は約５０〜１＋　
ＯＯＯｍｇ／　ｍの範囲内にあることができる。アドリ
アマイシンプロドラッグの有効量は約１５〜１５０ｍｇ
／ｒｒ＋の範囲内にあることができる。また５〜フルオ
ロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッ
グの有効量は約６００〜２，０００ｍｇ／ｒｄの範囲内
にあることができる。
こ＼に記載した本発明が一層十分に理解されるために次
の実施例が示される。これらの実施例は単に例示目的の
ためであり、決して本発明の範囲を限定すると解すべき
でないことを理解すべきである。
実施例１ 次の実施例は本発明の免疫結合体および方法の抗体結合
アルカリ性ホスファターゼによるエトポシドホスフェー
トプロドラソグのエトポシドへの転化に対する使用並び
に生ずる腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性および本発
明の方法の使用による生体内抗腫瘍効果を示す。
本発明の抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合の　　製 この実施例において、酵素、アルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）に結合した単クローン性抗体Ｌ６．９６．５ま
たは１Ｆ５を含む３免疫績合体を調製して研究した。Ｌ
６はヒト肺癌細胞上の糖タンパク質抗原に対し特異性で
それに結合するＴｇＧ２ａのサブクラスの単クローン性
抗体である〔ヘルストロム（１，ｔｌｅｌｌｓｔｒｏｍ
　）ほか、（１９８６）前掲参照〕。９６．５はｐ９７
　（黒色腫関連抗原）に対し特異性である単クローン性
ＩｇＧ２ａ抗体である〔ブラウン（Ｊ、　Ｐ、　Ｂｒｏ
ｗｎ　）ほか、「ヒト黒色腫関連抗原ｐ９７の単クロー
ン性抗体による構造確認」、ジャーナル・オフ・イムノ
ロジ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、　　１２７　（〜２
）　、Ｉ）＋）、　　５３９〜４６　（１９８１）参照
〕。１Ｆ５は正常および腫瘍Ｂ細胞上のＣＤ−２０抗原
に特異性である単クローン性１ｇＧ２ａの抗体である〔
クラーク（Ｈ，Δ、　Ｃ１ａ、ｒｋ）ほか、「ヒトＢ細
胞活性化におけるＢｐ３５細胞表面ポリペプチドの役割
」、プロシーディングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オフ゛・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　　８２、ｐｐ、１７６６〜７０
（１９８５）参照〕。Ｌ６６単クロ一ン性抗を産生ずる
Ｌ６ハイブリドーマは、１９８７年１月１４日に公表さ
れた欧州特許出願第２０７９６３号の提出に関連してア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）に受託番号ＨＢ８６７７で寄託された。１ＦＳ単ク
コクローン性抗体生ずる１Ｆ５ハイブリドーマは１９８
８年２月１２日にＡＴＣＣ階ＨＢ　９６４５でＡＴＣＣ
に寄託された。９６，５単クロ一ン性抗体は市販されて
いる。
抗体一酵素結合体はランバー）　（Ｊ、　Ｍ、　Ｌａｍ
ｂｅｒｔ）ほか、「ヒ）　ＩＪンパ系細胞と反応性の精
製免疫毒素」、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケ
ミストリー　（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、）、
　　２６０　　（Ｎｏ、２２）、ｐｐ、１２０３５〜１
２０４１　　（１９８５）に記載されたものに類似する
方法を用いてチオエーテル結合によりＡＰを単クローン
性抗体Ｌ６．９６．５または１Ｆ５に共有的に結合させ
ることにより調製した。１実験プロトコルによれば、結
合体Ｌ６ＡＰおよび９６．５−ＡＰは次のように調製さ
れた：我々は２−イミノチオラン（０，５Ｍ）リエタノ
ールアミン塩酸塩と１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０中
５０ｍＭ）をＬ６または９６．５抗体の８．０ｍｇ／ｍ
β溶液（５０ｍＭ）リエタノールアミン塩酸塩および１
ｍＭ−ＥＤＴＡ中ｐＨ８，０）に２−イミノチオランの
最＃濃度が１．３ｍＭであるように加えた。０℃で８０
分後に、ｐＩＩ７．２のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
を溶離剤として用いるセファデックス（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　）　Ｇ−２５上のゲル濾過により反応を停止させた
。抗体と２−イミノチオランとの反応はスルフヒドリル
基を導入し、その数はエルマン（Ｂｌｌｍａｎ）の試薬
〔リドレス（Ｐ、　Ｉｌｌ。
Ｒｉｄｄｌｅｓ）ほか、「エルマンの試薬：５．５’　
−ジチオビス（２−二トロ安息香酸）−再試験」、アナ
リテイカル・バイオケミストリ＝（八ｎａｌｙｔｉｃａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、９４、ｐｐ、　　７
５〜８１　　（１９７９）参照〕を用いて１．９〜３．
５であると測定された。
１００ｍＭＵン酸塩緩衝液、ｐＨ７，０中のアルカリ性
ホスファターゼ〔仔つシ腸、バーリンガー・ランバイム
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製、１０
ｍｇ／ｍｊ！’］に４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（
スルホ−３ＭＣＣ）　　［ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅ
ｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）製、ジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ）中２０ｍＭ］を、最終スルホＳＭ
ＣＣの濃度が２．４ｍＭであるように加えた。
３０℃で３０分後に、修飾された酵素をＧ−２５セフア
デツクス上のゲル濾過により精製し、ＰＢＳで溶出させ
た。
次いで修飾されたＡＰをチオール化抗体に２＝１のモル
比に加えた。ＡＰとスルホＳＭＣＣとの反応はマレイミ
ド基を酵素中へ導入し、それが各修飾抗体上のスルフヒ
ドリル基と反応すると抗体とＡＰとの間にチオエーテル
結合の形成を生じた。
残留未反応チオールをブロックするために反応時間１時
間後にヨードアセトアミド（最終濃度１ｍＭ）をタンパ
ク質溶液に加え、結合体をセファクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ　）　Ｓ　−３００カラム上でＰＢＳを溶離剤と
して用いて精製した。フラクションを２８０ｎｍでモニ
ターし、各フラクション（６４，０００倍に希釈）のＡ
Ｐ活性をｐ−ニトロフェニルボスファートを基質として
用いてｐｌＩ９．５で検定した〔チイセン（Ｐ、　Ｔｉ
ｊｓｓｅｎ）　、ラボラトリ−・テクニクス・イン・バ
イオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジ
ー（Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｉ
ｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　）　、ｐｐ、　　３６６〜６７
、エルセビーア・フ゛レス（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅ
ｓｓ）　　（Ｌ　９８５　）　〕、適当な水準のＡＰ−
抗体比を有する結合体を含むフラクションを５〜１２．
５％勾配ゲル上の５ＤＳＰＡＧＥにより決定しく第２図
参照）、次いでプールした。タンパク質濃度は、抗体お
よびＡＰの０．１％溶液がそれぞれ１．４および０．７
６０Ｄを吸収する２８０ｎｍで測定した。ゲル上の結合
体の分析はそれらが主に抗体と酵素との１＝１比からな
ることを示した。ゲルに用いた変性条件下で、分子量１
４０　ｋｄのホモダイマーとして天然に存在するＡＰが
７０ｋｄの単一バンドとして移動する。この７０ｋｄタ
ンパク質ハンドはこれらのカラム中のゲル上に観察され
、それはまた酵素のサブユニットの１つが共有的に結合
した抗体一酵素結合体から解離したので高分子量の結合
体バンドを含有した（第２図レーンＡおよびＢ参照）。
５３００七フアクリル力ラム上のゲル濾過は結合体調製
物中に遊離酵素が存在しなかったことを示した。
我々はまた本発明のＬ　６−ＡＰおよび１Ｆ５ＡＰ結合
体の調製に第２の類似の実験プロトコルを用い、抗体を
イミノチオラン（０，５ｍＭ）で修飾して単一遊離チオ
ール基を導入し、ＡＰを４（Ｎ−マレイミドメチル）−
シクロヘキサン−１カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭ
ＣＣ）　　（ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　　Ｌ　Ｌ）製〕でＳＭＣＣの最終
濃度が０．１ｍＭであるように修飾した。次いで修飾タ
ンパク質を混合し、生した結合体をＳ−３００セフアク
リル上のケル濾過により精製した。次の５ＤＳＰＡＧＥ
分析ばこれらの結合体調製物が非結合タンパク質および
凝集体を含まないことを示した。
前記のように、調製物のタンパク質濃度は、抗体（分子
量：１６０ｋｄ）およびＡＰ（分子量＝１４０ｋｃｌ）
の１ｍｇ／ｍｆｆ溶液がそれぞれ１．４および０．７６
０Ｄ単位を吸収する２８０ｎｍにおける吸光度により測
定した。
プロドラッグ、エトポシドホスフェートおよびエトボシ
ドチオポスフェ−１・の８周 本発明の方法の次の段階によれば、各抗体一酵素結合体
を新規エトポシドホスフェートまたはエトボシドチオホ
スフェートプロドラソグと反応させた。より詳しくは、
用いたプロドラッグはそれぞれ第３図に示される式を有
するエトポシドの４′リン酸二ナトリウムエステルおよ
び工ｌ・ボシドの４′−チオリン酸二ナトリウムエステ
ルであった。
エトポシドホスフェートおよびエトポシドチオホスフェ
ートはエトポシドとそれぞれ塩化ホスホリルまたは塩化
チオホスホリルとを反応させ、それぞれジクロロホスフ
ェートまたはジクロロチオホスフェ−１・中間体を生成
させることにより合成した。リン酸化反応は適当な無水
有機溶媒、例えばアセトニトリル、中で好ましくは第三
級アミン塩基例えばＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミ
ンの存在下に行なわれる。反応の経過は薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）によりモニターし、それにより最適
反応時間を生成物の出現または出発物質の消失あるいは
その両方により判断することができる。我々の経験によ
れば、反応は用いた含リン試薬の性質により約４〜約７
２時間要することができる。ジクロロホスフェートまた
はジクロロチオホスフェート中間体のそれぞれリン酸ま
たはチオリン酸ニナトリウムブロドラソグへの加水分解
は水中の炭酸水素ナトリウムの溶液（２０〜５０倍過剰
）を反応混合物に直接添加し、混合物を室温でそれぞれ
１．５または３時間かくはんすることにより行なった。
酢酸エチルおよび水で分配させ、次いで水−メタノール
を用いて水層の逆相クロマトグラフィーを行なうと、凍
結乾燥または真空中の水性媒質の蒸発後に所望のプロド
ラッグが得られる。
本発明の方法に１プロドラツグとして用いたエトポシド
の４′−リン酸二ナトリウム誘導体の調製のより詳しい
説明は次のとおりである：エトポシド〔ブリストル・マ
イヤーズ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｃｏ、　）
製、２．３０ｇ、３．９１ミリモル）の乾燥アセトニト
リル（２１０ｍｊり中の磁気かくはん懸濁液を温ためて
は＼゛完全溶液を与え、室温に冷却し、Ｎ、Ｎ−ジイソ
プロピルエチルアミン（２，３６ｍ１．１３．５ミリモ
ル）を加えた。次いで混合物を０℃に冷却し、塩化ホス
ホリルＰ　ＯＣＩＩ　３（６６６ｍｇ、４．３４ミリモ
ル）をシリンジにより３０秒にわたって加えた。混合物
を徐々に２〜３時間にわたって室温になし、室温で６３
時間かくはんした。この時間の終りに反応混合物に炭酸
水素すトリウム（６゜Ｏｇ、７１．４ミリモル）の脱イ
オンＨ２０（１１０ｍｆｆ）中の溶液を加え、混合物を
室温で８０分間かくはんし、次いで飽和水性炭酸水素ナ
トリウム（２０ｎｌ）、脱イオンＨｚＯ（１，２５ｍ６
）および酢酸エチル（３５０ｍｎ）で分配させた。有機
層をさらに脱イオンＨｚＯ（Ｉ　Ｘ　５０　＋＋＋７り
で抽出し、水層を合せて酢酸エチル（２５０ｍβ）で洗
浄し、次いで室温で１時間、０．５　ｍｍの真空にかけ
て溶解溶媒を除去した。次いで水性部分を、メタノール
中で充填しＨ２Ｏと平衡させたシリカゲルに結合したオ
クタデシルシラン（Ｃ−１８）１５ｃｍを含む直径４ｃ
ｍ０カラムに適用した。すべての水性部分を適用した後
、カラムをＨ２Ｏ（１７５ｍりで溶離して無機塩を除き
、次いで生成物を水中の２０％メタノールで？容出させ
た。０．５トルで溶媒を濃縮すると純エトポシドホスフ
ヱート化合物７４４ｍｇ（３６％）が無色固体として得
られた。
あるいは、凍結乾燥すると純化合物が非常に綿毛状の低
密度固体として得られる。
他の態様によれば、本発明のエトポシドホスフェートプ
ロドラソグが次のように調製された：エトポシド（１０
，５０ｇ、　１７．８４ミリモル、Ｐ２Ｏ，上で８０°
Ｃ１０，５）ルで乾燥）の乾燥アセトニトリル（４５０
ｍβ）中の磁気かくはん懸濁液にジイソプロピルエチル
アミン（４，２０ｍ１．２４．１ミリモル）を加えた。
次いでクロロリン酸ジフェニル（２，００ｍｌ２．９．
６５ミリモル）をシリンジにより加えた。混合物をＮ２
下に５０℃で２時間かくはんし、その時点でエトポシド
がすべて溶解した。さらにクロロリン酸ジフェニル（１
，８０ｍｌ１．８．６８ミリモル）を加え、反応混合物
を４５℃で７２時間保持した。さらにアミン塩基（０，
７５ｎｌ、４．３ミリモル）およびクロロリン酸ジフェ
ニル（０，８０ｍ７類、３．８６ミリモル）を加えた後
、混合物を４０〜４５℃で２７時間かくはんし、さらに
クロロリン酸ジフェニル（０，４０ｍｎ＞を加え、４０
〜４５°Ｃで２２時間維持した。
次いでイソプロパツール（２０ｎｌ）を加え、溶媒を真
空で蒸発させ、固体残留物をＣＨＣＨ２Ｃ６２（５００
りに熔解し、Ｈ２Ｏ（４００ｍｌｌ　）で分配させた。
水層をさらにＣＨｚＣ７！ｚ　（１００ｍｎ）で抽出し
、有機抽出物を合せてブライン（２５０ｍ４）で洗浄し
、乾燥した（Ｎａ２Ｓ０４／Ｍｇ５０４）。回転蒸発し
、ＣＨ２Ｃｌ−ｚ中の２〜３％ＣＨ３０Ｈを用いるシリ
カゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによりエトポ
シド−４′リン酸ジフェニル１２．５ｇ（８５％）が無
色固体として得られた。
次に、新開封びん〔アルドリッチ・ケミカル社（八１ｄ
ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製〕の酸化白金
（０，１９８ｇ、０．８７ミリモル）をエトポシド４′
リン酸ジフエニル（０，７９ｇ、０．９６２ミリモル）
の無水エタノール９５ｎｌ中の溶液に加えた。
溶液をバー（Ｐａｒｒ）装置で４５〜５０ＰＳ■で室温
で４時間水素化した。反応混合物を、エタノールを溶離
剤として用いてセライトのパッドに通して濾過した。真
空で濃縮し、Ｐ２Ｏ５上で真空で１４時間乾燥するとエ
トポシド−４′−リン酸が白色固体（０，６２７ｇ、９
４％）として得られた。
ＦＡＢ　ＭＳ　ｍ／ｅ　　６６９　（Ｍ＋Ｉｌ）”ＩＲ
（ＫＢｒ）　３４４０．２９３０．１７７８．１６０４
．１４９８　ｃｍ−’Ｉｔ　ＮＭ＋？　（ＤＭＳＯ−ｃ
１６）δ５．９３　（ｓ、　ＩＩＩ）、　６．４６　（
ｓ。
ｉｌ＋）、　６．１２　（ｓ、　２１１）、　５．９４
　（ｍ、　２Ｈ）、　５．１７　（ｂｓ。
ＩＨ）、　４．８６　（ｄ、　Ｊ＝３．９３Ｈｚ、　１
ｔｌ）、　４．６４　（ｑ、　Ｊ＝７．５゜５．８１１
ｚ　　ＩＩＩ）、　４．５１−４．４２　（ｍ、　２Ｈ
）、　４．２０　（ｄ、　Ｊ＝１０．７Ｈｚ、　ｌ１ｌ
）、　４．０１　（ｄｄ、　Ｊ＝１．２．１．５．３Ｈ
ｚ、　ＩＨ）。
３．５１　（ｓ　　６１１Ｌ　３．５１−２．７５　（
ｍ、　７Ｈ）、　２．８３　（ｍ、　ＩＨ）。
１．１６　（ｄ、　Ｊ＝５．ｌ１１ｚ、　３Ｈ）。
１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ６）　　δ１７４．５．１
５１．２．１５１．１゜１４７．７．１４６．２．１２
６．１．１３２．３．１２８．８．１０９．８゜１０９
．７．１０７．９．１０１．５．１０１．２．９８．５
．８０．０．７４．３゜７２．７．７１．７．６７．６
．６７．２．６５．７．５５．８．４３．０゜３７．１
　２０．２．１Ｂ、５゜ 元素分析：計算値（Ｃ２ｑＨ３３０＋　６Ｐ）　：０．
８５χＨ２０：ｃ、　５０．９５；　Ｌ　５．１１゜ 測定値：　Ｃ，５１，４２，１＋、　４．９７゜次いで
エトポシド−４′−リン酸生成物２．９０ｇ（４，３４
ミリモル）に脱イオンＨｚＯ（５０ｍｊりおよび固体炭
酸水素ナトリウム（３，ＯＯｇ、３７．７ミリモル）を
加えることによりエトポシド−４′−リン酸をそのニナ
トリウム塩に転化した。混合物を室温で０．５時間かく
はんし、その時間の間にＣＯ□の発生が止んだ。次いで
この混合物を前記態様に記載したようにＣ−１８カラム
に直接適用した。カラムを初めに脱イオンＨ２０（３０
０ｍβで溶離して過剰の塩を除き、次いで４：１のＨｚ
　Ｏ／　ＣＨ３０Ｈで溶出させると凍結乾燥後に純エト
ポシド−４′−リン酸二ナトリウム塩１．９０ｇ（６１
％）が綿毛状の白色固体として得られた。
エトポシドの４′−リン酸またはチオリン酸二ナトリウ
ム誘導体は低細胞障害活性を有するエトポシドの高水溶
性プロドラッグを表わす。しかし、これらの化合物とア
ルカリ性ホスファターゼとの反応はボスフェートまたは
チオホスフェート部分を除去し、それぞれ強力な抗癌薬
、エトポシドを残す（第３図参照）。
エトポシド−４′−ホスフェートおよびエトポシド−４
′−チオボスフェートをそれぞれアルカリ性ホスファタ
ーゼと反応させた実験は両プロドラッグが酵素に対する
基質であることを示した。
第５図に示されるように、エトポシドホスフェ−１・は
エトボシドチオホスフエートプロドラソグよりも速やか
に酵素によって加水分解される。しかし、エトポシドチ
オホスフェートは一定条件のもとてその加水分解に対す
る高い安定性に基く特定の有用性を有することができる
。
抗体−アルカリ性ホスファクーゼ結合体とエトボシドホ
スフェートプロドラソグとの　広本発明の結合体は、結
合体および遊離酵素が基質ｐ−二トロフェニルホスファ
ート〔チイセン（Ｐ、　Ｔｉｊｓｓｅｎ）　、前掲〕ま
たはエトポシドホスフェ−（・に対し等しい活性を示す
事実により証明されるので酵素の抗体に対する結合に基
く酵素活性の明らかな低下を示さなかった。
例えばＡＰ単独または前記のように製造された抗体酵素
結合体Ｌ６−ＡＰ（最終ＡＰｉＭｉ度５μｇ／ｍｊ２＞
を、Ｍ　ｇ　Ｃｊ２２　（１ｍ　Ｍ　）およびＺ　ｎ　
Ｃｊ２２（０，１ｍＭ）をｐＨ７，０で含むトリス緩衝
液（１００ｒｎＭ）中のエトポシド−４′−ホスフェー
ト（０，１ｍＭ）の溶液に加えた。反応はＩＢＭ　　Ｃ
Ｉ８カラム（３μ、４．５Ｘ１００龍）および５０％水
性メタノールを遊離剤として用いるＨＰＬＣによりモニ
ターした（０．５ｍｊｌ！／分、２５４ｎｍでモニター
）。反応の開始の５分以内に、遊離酵素形態またはＬ６
抗体一酵素結合体の部分として、ＡＰがエトポシド−４
７−ホスフェートの少なくとも８５％をエトポシドに加
水分解した（第４０および４Ｈ図参照）。図が示すよう
に、結合体中の抗体に対する結合に基＜ＡＰ酵素活性の
低下がなかった。酵素が存在しないときにホスフェート
の加水分解が起こらなかった（第４Ａ図参照）。エトポ
シドホスフェートまたはエトポシドチオホスフェートの
水溶液は室温で少くとも８時間、および４℃で数日間安
定であった。
抗体−アルカリ性ホスファターゼ結合体のＨ３３４，７
腫　細　に対する結合 第６図はＬ６−ＡＰおよび９６．５−ＡＰ結合体並びに
Ｌ６および９６．５抗体の転移ヒト結腸癌細胞系Ｈ３３
４７（シュデイ・アンダーソン（ＪｕｄｙＡｎｄｅｒｓ
ｏｎ　）により提供された、腫瘍遺伝子）の腫瘍細胞に
対し結合する能力の試験を行なった結合体結合検定の結
果を示す。
結合検定は次のように行なった：免疫結合体または遊離
抗体は不完全変性ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ（
Ｇｉｂｃｏ）　〕中に系列希釈し、１００μβ分割量を
４℃で１０６細胞とともに３０分間インキユヘーヒトた
。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣヤギ抗マウス抗体〔タボ（Ｔ
ａｇｏ）製、ｔ：ｉｚ、ｓ希釈）５０μｌとともに４℃
でさらに３０分間インキユヘーヒトた。細胞を洗浄し、
コールタ・エピソクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ　
）　−Ｃ螢光細胞アナライザーで分析した。死細胞をゲ
ートし、各試料の平均対数縁螢光強度を得た。この数を
直尺に変換し、陰性対照（細胞＋ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウ
ス抗体）と全試験試料との間の比を計算した。
第６図は抗体の結合能力の大部分が結合体中に保存され
たこと、すなわち結合が抗体結合能力に影響を与えなか
ったことを示す。さらに、同図は抗体の結合の特異性、
すなわち９６．５遊離抗体および９６．５−ＡＰ結合体
がともにＬ６６抗およびＬ６−ＡＰ結合体よりも腫瘍細
胞に対し非常に弱く結合したことを示す。この結果は、
Ｈ３３４７腫瘍細胞がヒト腫瘍からでありＬ６６抗が癌
腫抗原に対し特異的であるが９６．５抗体が黒色腫抗原
に対し特異的であることを考慮すると予期することがで
きる。
Ｌ６、Ｌ６−ＡＰ、１Ｆ５およびＩ　Ｆ　５−ＡＰを用
いた同様の結合実験もまたＬ６およびＬ６ＡＰがＨ３３
４７癌腫細胞系に結合しく１０μｇ／ｍｐ抗体で飽和）
、１Ｆ５または１Ｆ５−ＡＰにより非常にわずかの結合
が認められるかまたは検出可能な結合が認められなかっ
たことを示した（第７図参照）。この結果はまた結合体
の結合の特異性を示し、Ｌ　６−　Ａ、　Ｐ結合体がＬ
６陽性腫瘍細胞系に結合し、Ｂ　ＩＪンバ腫細胞に対す
る特異性を有する１Ｆ５−ＡＰ結合体が結合を示さなか
った。
本発明の結合体／プロドラッグ組合せの試験管内毒性 次に本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害性
効果がクローン原性細胞毒性検定または３Ｈ−デミジン
取込み検定を用いて試験管内で示された。
用いたクローン原性細胞毒性検定はへルストロム（１，
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、「コロニー阻止および細胞
毒性検定」、イン・ビトロ・メソーズ・イン・セル・メ
ゾイエ−テッド・イムニティ　（Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）　、ブルームはか（Ｂｌｏｏｍ　ａ
ｎｄ　Ｇｌａｄｅ　）　Ｗ、ｐｐ、４０９〜１４（１９
７１）により記載されたコロニー阻止検定であった。細
胞毒性の検出に用いた細胞は前記Ｈ３３４７腫瘍細胞で
あった。Ｌ６−ＡＰおよび９６．５−ＡＰ結合体の両方
を、それらのプロドラッグを遊離薬物の転化する能力に
ついて試験した。
簡単に記載すると、Ｈ３３４７細胞（１０６／ｍＡ）を
ＩＭＤＭ増殖培地（抗体濃度を基にして各免疫結合体１
０μｇ／　ｍｌｌを含む）中に懸濁させ、３７℃で３０
分間インキュへ一トシた。細胞を２回洗浄し、再びＩＭ
ＤＭ中に懸濁し、培地中の薬物またはプロドラッグを加
えた。３７℃でインキュベーションを１５時間続けた。
２回洗浄した後、細胞を塗布しコロニーの数（〉８細胞
／コロニー）を７〜１０日後に計数した。
検定の結果は第８図に示される（パーセント阻止は６試
料の平均である）。図に示されるように、エトポシド（
ＩＣ５０＝０．２０μＭ）はエトポシド４′−ホスフェ
ート（ＥＰ）（ＩＣ５１１＝５．８μＭ）よりも非常に
細胞障害性であった。プロドラッグ単独は非常に小さい
細胞障害活性を示した。
Ｈ３３４７細胞をＬ６−ＡＰ結合体で処理し、次にエト
ポシドホスフェートに暴露するとプロドラッグ単独で認
められたものに比べて細胞障害活性の非常大きい増加を
生じ、増大した細胞障害活性はエトポシド単独で認めら
れた細胞障害活性に匹敵した。細胞の９６．５−ＡＰ結
合体およびエトポシドボスフェートによる処理はプロド
ラッグ単独で認められたものに比し細胞障害活性の非常
に小さい増加を示した。この結果は前記のようにＨ３３
４７に結合する９６．５−ＡＰ結合体の量の少ないこと
に帰着させることができる（第６図参照）。結合体は細
胞の結合体単独による処理が細胞の死を生じなかったの
でそれ自体細胞障害性ではない。
本発明の結合体の細胞障害効果はまた３Ｈ−チミジン取
込み検定を用いて調べた。この検定によれば、１０％ウ
シ胎仔血清を有するＩＭＤＭｏ、１ｍで中の１０６Ｈ３
３４７細胞の懸濁液を結合体５μｇ／ｍβの存在下に４
℃で１時間インキュベートした。細胞を１０％ウシ胎仔
血清含有培地で２回洗浄し、再懸濁しくｌ　ｍｌ！中）
、９６ウエルミクロクイタープレート中へ塗布した（１
０．０００細胞／ウエル）。次いでＩＭＤＭ中の薬物ま
たはプロドラッグを加え、インキュベーションを３７℃
で６時間行なった。細胞を２回洗浄し、インキュベーシ
ョンをさらに１２時間続け、次いで３１１チミジン（１
，０μＣｉ／ウエル）で６時間標識した。プレートを一
２０°Ｃで凍結して細胞を分離し、細胞をガラス繊維デ
ィスク上に収集した。フィルターをベックマン（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ　）　３８０１シンチレーシヨンカウンター上
で計数した。
この検定を用いて我々は腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−
チミジン取込みの阻止、従ってエトポシドあるいはプロ
トラグＥＰのＬ　６−　Ａ　Ｐまたは１Ｆ５−ＡＰ結合
体の不在または存在下の細胞に対する細胞障害効果を測
定した。第９図に示されるように、エトポシド（ｒＣｓ
ｏ−１μＭ）はＥＰ（１００μＭで３５％阻止）より１
００倍以上も毒性であった。ＥＰ暴露前の１Ｆ５−ＡＰ
による細胞の前処理は細胞毒性の増大を何ら生しなかっ
た。しかし、細胞障害活性の驚くべき増加が細胞を初め
にＬ６−ＡＰに、次いでＥＰに暴露したときに認められ
た。従って、試験管内細胞毒性の測定に用いた再検定に
おいて、本発明の結合体／プ０ドラツグの組合せの細胞
障害効果はエトポシド単独のそれに匹敵し、ＥＰ細胞毒
性がＨ３３４７細胞の対照結合体、９６．５−　Ａ　Ｐ
および１Ｆ−５ＡＰのそれぞれによる処理によって同様
に増大されなかった事実により示されるように、この効
果は抗原特異性であった。
マウスの　　　種　　　中の　人　の局在次に生体内局
在化研究を行ない本発明の結合体が腫瘍中にいかに速や
かにかつどの程度に蓄積するかを見出した。この情報は
我々の腫瘍療法研究における抗体一酵素結合体とプロド
ラッグとの投与の間の時間の適切な間隔の決定に有用な
ことを証明するであろう。
初めにＢａ１ｂ／ｃ　　ｎｕ／ｎｕめすマウス（４〜６
週令）　〔ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎ
ｃｅＳｔ、　Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｆｌｏｒｉｄａ
　）から入手〕に、左右の後部側腹に１０７Ｈ３３４７
腫瘍細胞を皮下（ｓ、ｃ、　）注射した。腫瘍細胞はト
リプシン（０，５ｇ／Ａ）およびＥＤＴＡ　（０，２ｇ
／６）で２分間処理することにより懸濁させた試験管内
培養から得た。細胞はＩＭＤＭで２回洗浄し、１０％ウ
シ胎仔血清を有するＩＭＤＭ中で３７℃で１時間インキ
ュベートした。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に懸濁し、注射
前に４℃で保持した。こ＼に記載した局在化および療法
研究は腫瘍が２２５ｍｍ３の平均大きさに達したときに
開始した。
我々の局在化研究のために、ヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅ
ｎ）法〔フレイカー（Ｐ、　Ｊ、Ｆｒａｋｅｒ）ほか、
バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）　　
８０　＼ｐｐ、　　８４９　Ａ＋８５７　　（１９７８
）参照〕を用いてＬ６およびＬ６−ＡＰを＋２Ｊで標識
し、１Ｆ５および１Ｆ５−ＡＰを１３１１で標識した。
局在化実験の２日前に動物を０．５％（Ｖ／Ｖ）ルゴー
ルヨウ素液上に置いた。各マウスに次の溶液：ＰＢＳ、
ｐＨ７，２，０，２ｍｊ！中のＬ６−ＡＰ　（５μＣｉ
　）および１Ｆ５−ＡＰ（２，５μＣｉ）またはＰＢＳ
０．２ｍｎ中のＬ６（５μＣｉ　）および１Ｆ５（２，
５μＣｉ　）の組合せ、のいずれかの１０１００１Ｉ各
車クロン性抗体基準）をｉ、　ｐ、注射した。周期的間
隔で、マウスを麻酔し、眼窩叢を経て採血し、剖検した
。
組織を計量し、次いでガンマカウンターで計数した。局
在化は＋２Ｊ　　Ｌ６局在化と１３１１　　１Ｆ５のそ
れとの比較により、すなわち種々の組織中のカウントの
特異性（ＩＺ５Ｔ）と非特異性（＋３１■）との取込み
の比の測定により決定した。
腫瘍および肝臓の取込みに対する結果が表１に要約され
る。
表１ ■　　　肛尿　　■　　肚服 ２時間　１．６（８，０）　　４．９（２，０）　　１
．５（７，５）　　５．２（０，７）２４時間　３．６
（１２，０）　　２．３（１，４）　　１．０（１０，
０）　　１．３（１，３）４８時冊　４．０（８，０）
　　２．５（１，３）　　０．５（５，０）　　０．８
（１，０）括弧内の数字はＬ６／１Ｆ５またはＬ６−Ａ
Ｐ／１Ｆ５−ＡＰの比を示す 表に示されるように、非結合し６は２４時間内に腫瘍に
効率よく局在し、そこに少くとも４８時間保持された。
この期間の間腫瘍中のＬ６と１Ｆ５との比は８〜１５の
範囲内にあったが肝臓中の比は全く低かった（１．３〜
１．４）。Ｌ６−ＡＰに対する腫瘍中の特異的取込みの
最大水準は約２４時間に起こり、その時点でＬ６−ＡＰ
と１Ｆ５ＡＰとの比は１０．０であった。これらの結果
はＬ６−ＡＰ結合体力月Ｆ５−ＡＰよりはるかに良好に
腫瘍内に局在化したが、しかし非結合し６はど良好でな
かったことを示す。
次に我々は腫瘍中の天然ホスファターゼ活性の量および
本発明の結合体を用いてＡＰを腫瘍に標的指向させるこ
とによりこの活性を高めることができる程度を測定した
。Ｌ６−ＡＰ１００μｇ（Ｌ６基準）で２４時間処置し
たマウスから腫瘍を切除し、次のようにｐ−ニトロフェ
ニルホスファートを基質として用いて全ホスファターゼ
活性を測定した：切除細胞を洗浄し、次にＮａ　Ｃｊｌ
！（１００ｍＭ）およびＭｇ　ＣＩｔ　２　（５ｍＭ）
を含むｐ）１９．５のトリス（１００ｍＭ）中でｐ−ニ
トロフェニルホスファート（Ｉｍｇ／ｎｕ）とともに２
３℃で穏やかに回転した。反応の経過は４１０ｎｍで遊
離されたｐ−ニトロフェノールを測定することによりモ
ニターし、結果を腫瘍重量に対して補正した。Ｌ６−Ａ
Ｐ結合体を受けたマウスの腫瘍が非処置マウスの腫瘍中
に認められたホスファターゼ活性の水準の１０倍程度を
示したことが認められた（第１０Ａ図参照）。
腫瘍のホスファターゼ活性のより詳細な組織学的分析を
、非処置あるいは２４時間早＜Ｌ６ＡＰまたは１Ｆ５−
ＡＰ３００μｇ（抗体基準）で前処置したマウスから得
た腫瘍の断面で行なった。ホスファターゼ活性は免疫組
織学により次のように酵素活性の部位における黒色沈殿
を析出したホスファターゼ基質を用いて評価した：切除
細胞を一２８℃で速やかに凍結し、８μｍ系列断面をラ
イヘルド・ユング（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ　）　
ミクロトームを用いて調製した。ホスファターゼ活性を
ヘクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ＋Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ）のＡＰ基質
キットで測定し、結果をヘマトキシンおよびエオシン（
］Ｈ−４、第１０Ｂ図参照）で染色した断面と比較した
。
第１０Ｂ図に示されるように、非処置または１Ｆ５−Ａ
Ｐで処置したマウスの腫瘍中にわずかの酵素活性が検出
された。しかし、Ｌ６−ＡＰを受けたマウス中でホスフ
ァターゼ活性が非常に高められ、腫瘍全体に分布したこ
とを知見できた。
顕微鏡評価はＬ６−ＡＰ処置マウス中の腫瘍細胞の大部
分がホスファターゼ活性に対し高陽性に染められたこと
を示した。
本発明の結合体／エトポシドホスフエートプロドラソグ
組合せの生　　　腫瘍効 療法実験はｓ、　ｃ、腫瘍約２２５ｍｍ３容積を有した
ヌードマウスで行なった。結合体、Ｌ６−ＡＰおよび１
Ｆ５−ＡＰをＥＰ処装の１８〜２４時間前に投与（ｉ、
　ｐ、　）　した。腫瘍増殖を非処置マウスおよびエト
ポシドまたはＥＰ単独の最大許容量で処置したマウス中
のそれに比較した。
より詳しくは、両側Ｈ３３４７腫瘍を有する８ヌードマ
ウスの群をエトポシド（２：３のＤＭＳＯ：Ｈ２Ｃ中の
エトポシド１．２　ｍｇを含有する０、２ｍｊりあるい
はＥＰ（Ｈ２Ｃ中のＥ　Ｐ　２　ｍｇを含有する０、２
ｍＡ）単独あるいはＬ６−ＡＰ（ＰＢＳ中の３００μｇ
抗体を含有する０、１ｍｊｌりまたは１Ｆ５−ＡＰ（Ｐ
　Ｂ　Ｓ中の３００μｇ抗体を含有する０、１ｍｊｉり
次いでＥＰ処装、で処置した。各試験には非処置マウス
の１対照群が包含された。腫瘍容積を腫瘍移植抜挿々の
日に次式を用いて評価した：〔（垂直幅２／２））Ｘ最
大長さ これらの試験の結果は第１１図に示される。エトポシド
は用いた用量で腫瘍増殖に対し非常に小さい効果を有し
、−層高い用量は十分に許容されなかった。プロドラッ
グＥＰは動物に対する毒性が少なく、従って投与できた
高用量がエトポシドそのもので認められたよりも大きい
抗腫瘍効果を生じた。同程度の抗腫瘍活性が対照結合体
１Ｆ５ＡＰをＥＰ処装の前に受けたマウスに認められた
。しかし、マウスをＬ６−ＡＰ、次にＥＰで処置したと
きに一層顕著な抗腫瘍効果が認められた。
Ｌ６−ＡＰ単独は腫瘍増殖に効果を有しなかった（デー
タは示されない）。
各個々の腫瘍の療法に対する応答の概要が表２に示され
る。Ｌ６−ＡＰおよびＥＰで処置した８マウス中の１６
腫瘍中６腫瘍が完全な退行を経験し、他の２つが処置の
開始時より大きさが小さくなった。他の処置プロトコル
のいずれも完全または部分応答が認められなかった。
表２ 腫瘍増殖に対する種々の処置の結果 応　　　　　答 物　質　　　　進行　　不変　　部分　　完全な　　し
　　　　　　　　　　１６　　　　　　０　　　　　　
０　　　　　　０エトポシド　　　１２　　　４　　　
０　　　０ＥＰ　　　　　　　　６　　　１０　　　０
　　　０１Ｆ５−ＡＰ＋ＢＰ　　　　　９　　　７　　
　０’　　　０Ｌ６−ＡＰ＋ＢＰ　　　　　　３　　　
５　　　２　　　６データは腫瘍移植２３日後の各群中
の１６腫瘍の応答を示す。
＊応答：進行−腫瘍増殖経続；不変−追加の腫瘍増殖な
し；部分−大きさの減少；完全−見掛は上腫瘍をなくす
る退行。
この実施例は明らかに腫瘍特異性抗体一酵素結合体およ
び、酵素により比較的細胞障害性でない形態から強力な
細胞障害性形態に転化されることができるプロドラッグ
を用いて細胞障害性抗腫瘍薬を腫瘍細胞に供給する本発
明の方法の適用可能性を示す。
実施例２ この実施例は比較的細胞障害性でないマイトマイシンホ
スフェートプロドラッグを活性マイトマイシン薬物に転
化し腫瘍細胞に対して試験管内細胞毒性を生ずる本発明
の免疫結合体および方法の使用を示す。さらに、実施例
１に示したように、次の実施例は生体内腫瘍細胞に対す
る細胞障害性抗腫瘍薬の供給に対する本発明の免疫結合
体、プロドラッグおよび方法の適用可能性を示す。
この実施例は実施例１に記載したように調製したＬ６−
ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体を用いる。本発明の
この態様によれば、これらの抗体酵素結合体のそれぞれ
を新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグと反応
させた。より詳しくは、用いたプロドラッグはマイトマ
イシンＣのＮ’　　Ｃ＋−ｅアルキルリン酸のニナトリ
ウム塩であった。この反応の結果遊離された抗腫瘍物質
はマイトマイシンアルコール誘導体であった。本発明の
Ｌ６−ＡＰ／マイトマイシンホスフェートヒトドラッグ
組合せは試験管内で腫瘍細胞に対する細胞毒性およびマ
ウス中の顕著な生体内抗腫瘍効果を生じた。
新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグの製 新規マイトマイシンホスフェートプロドラッグ、７−（
２’−アミノエチルホスフェート）マイトマイシン（以
下ｒＭＯＰＪとして示す）はマイトマイシンＣ（ＭＭＣ
）の２−アミノエチルホスフェート誘導体であり、次の
ように調製したニリン酸二水素２−アミノエチル（５６
曙、０．４ミリモル）の水（０，３５ｍｊりおよびトリ
エチルアミン（０，３ｍｌ類、２ミリモル）中の溶液を
メタノール（６ｍｊり中のマイトマイシンＡ（以下ｒＭ
ＭＡｌとして示す）（１４−０■、０．４ミリモル）に
加え、反応を室温で一夜進行させた。次いで飽和水性炭
酸水素ナトリウム１．４ｍｌを加え、溶液を水と塩化メ
チレンとの間に分配させた。水相を濃縮乾燥し、メタノ
ール数部を加えて蒸発させた。残留物をメタノールに吸
収させ、濾過し、２Ｘ１０ｃｍＣ−１８（逆相）シリカ
カラムに適用した。生成物を水で溶出させ、揮発性物質
をすべて蒸発させた。前記のようにメタノールを加えて
蒸発させ、残留物をデシケータ中五酸化リンで高真空下
に２４時間乾燥した。マイトマイシンホスフェ−Ｉ・誘
導体ＭＯＰが微細青色粉末として得られた（１９０ｍｇ
、９７％）。
３６０　ＭＨｚ　　’　Ｈ−ＮＭＲ（ＤｚＯ）δ１．９
４　（ｓ、　３Ｈ，ＣＨ３）。
２．９−３．１　（ｍ、　４Ｈ）、　３．２０　（Ｓ、
　ＱＣ）＋３）、　３．２８　（Ｓ。
ＬＨ）、３．３６　　（ｓ、ＬＨ）、３．５−３．６５
　　（ｍ、４１１）、４．１４．２５　（ｍ　　２１１
）　　４．５０−４．５７　（ｄｄ、　ＬＨ，１Ｏ−ｔ
ｌ）。
従って、ＭＯＰはＭＭＡの７−メトキシ基をリン酸２−
アミノエチルで置換することにより調製された（第１２
図参照）。生成物は炭酸水素す１−リウムによる処理で
水溶性二ナトリウム塩に転化された。
相当する公知マイトマイシンアルコール誘導体、７−１
（２−ヒドロキシエチル）アミノクー９ａメトキシマイ
トサン（以下ｒ　Ｍ　ＯＨＪとして示す）はイエンガー
（Ｂ、　Ｓ、　Ｉｙｅｎｇａｒ　）ほか、「マイトマイ
シンＣおよび７位に置換エチルアミンを有するポルフィ
ロマイシン類似体」、ジャーナル・オブ・メデイシナル
・ケミストリー（Ｊ、　Ｍｅｄ。
Ｃｈｅｍ、　）、２６、ｐｐ、　１６〜２０　（１９８
３）の方法に従ってＭＭＡ　（１００ｒｒｇ、　０．２
８６ミリモル）とエタノールアミン（２６ｍｇ、０．４
２９ミリモル）との反応により調製した。生成物は微細
青色粉末として得られた（５８■、５４％）。
マイトマイシンホスフェートプロドラッグの反応および
′ 次いでＭＯＰプロドラッグをそのＡＰとの反応性につい
て試験した。ＭＯＰ　（１ｍＭ）の１００ｍＭ）リス、
ｐＨ７，２緩衝液中の溶液に室温で仔つシ腸またはヒト
胎盤ＡＰを加えた（最終濃度１μｇ／ｍｊり。反応の経
過はＣ−１８カラム（４，６Ｘ　１５０ｍｍ）および次
の条件を用いてＨＰＬＣによりモニターした：検出２８
０ｎｍ；８分にわたり酢酸塩緩衝液（１００ｍＭ、　ｐ
Ｈ５，２）中の３０〜９５％メタノール、１５分後回平
衡；流量０．８ｍｊ！／分。これらの条件下に、ＭＭＣ
は７．０分で溶出し、ＭＯＨは８．５分で溶出し、ＭＯ
Ｐは４．０分で溶出した。第１３図に示されるように、
ＭＯＰプロドラッグ上のリン酸基はＡＰで速やかに開裂
された。ＨＰ　Ｌ　Ｃは相当するアルコールＭＯＨが形
成されたことを確認するのに役立った。
用いた反応条件のもとてＭＯＰの加水分解に対する半減
期は約１０分であり、反応は４０分以内に完了した。
ＭＯＰおよびＢＰのヒト血清中の安定性は、ＨＰ　Ｌ　
Ｃを用いてプロドラッグの消失の速度並びにＭＯＨおよ
びエトポシドの形成の速度の両方を測定することにより
測定した。従って、例えばＭＯＰの溶液（１００ｍＭ）
リス、ｐＨ７，２中１ｍＭ）を最終薬物濃度が０．１ｍ
Ｍであるように新ヒト血清に加えた。分割量（０，２５
ｍｊりをメタノール（０，’２５ｍｊ２）およびＥＤＴ
Ａ　（１００ｍＭで５０μｌ）で希釈して血清タンパク
質を沈殿させ、反応を停止させた。試料を遠心分離し、
前記のようにＨＰＬＣにより分析した。ＥＰの５０％加
水分解が１時間後に起こったこと、しかし、ＭＯＰの単
に２５％が４時間後に加水分解したことが認められた。
完全な加水分解は血清にＡＰを加えることにより速やか
に達成できた。
Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する抗体−アルカリ性ボスファ
ターゼ結合　の結合 次いで本発明のＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ抗体一酵
素結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に結合する能力を測定し
た。Ｈ２９８１細胞系は肺の一次ヒト腺癌から確立され
た〔ヘルストロム（Ｔ。
Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ　）ほか、「ヒト肺癌に対して生じ
た単クローン性マウス抗体」、カンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒＲｅｓ、　）　、４６　　（ｍ８）　、ｐｐ
、　　３９１７〜２３（１９８６）参照〕。Ｌ６抗体は
Ｈ２９８１細胞に強く結合する（１０μｇ／ｍβで飽和
）ことが知られているが、］、　Ｆ　５はこれらの細胞
に対し非常にわずかの結合を示す。
結合検定は実施例１に記載したように行なった。
ＦＡＣ３分析はＬ６およびＬ６−ＡＰが細胞に強く結合
したが、１Ｆ５および１Ｆ５−ＡＰに対して非常に弱い
結合が示されたことを示した（第１４図参照）。
Ｈ２９８１腫瘍細胞に対する本発明の結合体／プロドラ
ッグ組合せの試験　　細胞毒 本発明の結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害効果が
実施例１に記載した３Ｈ−チミジン取込み検定により試
験管内で示され；この場合に試験管内細胞毒性に対する
試験にＨ２９８１腫瘍細胞を用い、Ｃ２Ｍ細胞を対照と
して用いた。Ｔ細胞全細胞系、ＣＥＭはＡＴＣＣがら入
手され、Ｌ６または１ＦＳ単クコクローン性抗体合しな
い。プロドラッグＥＰおよびＭＯＰのＬ６−ＡＰまたは
１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体の不在または存在下の腫瘍細胞
に対する細胞障害効果を分析した。これらの組合せの細
胞障害効果はまた各親薬物単独の細胞障害効果と比較し
た。
簡単に記載すると、１０％ウシ胎仔血清を含むＩ　ＭＤ
Ｍｏ、　１　ｍｊ２中の１０’Ｈ２９８１またはＯＥＭ
細胞の懸濁液を結合体１０μｇ／ｍｊ！の存在下に４℃
で１時間インキュベートした。細胞を１０％ウシ胎仔血
清を含む培地で２回洗浄し、リン酸塩緩衝食塩水ｐＨ７
，２（ＰＢＳ）１　ｍβ中に再び懸濁し、９６ウエルミ
クロタイタープレートに塗布した（１０，０００細胞／
ウエル）。次いでＰＢＳ中のプロドラッグを加え、３７
℃でインキュベーションを１時間（ＭＯＰに対し）また
は５時間（ＥＰに対し）行なった。次いで細胞を２回洗
浄し、インキュベーションを合計２４時間（３１１チミ
ジン１．０μＣ４／ウエルによる６時間標識を含む）続
けた。プレートを一７０°Ｃで凍結して細胞を分離し、
融解後細胞をガラス繊維ディスク上に収集した。フィル
ターをヘソクマン３８０１シンナレーションカウンター
で計数し、結合体／プロドラッグ組合せの細胞障害効果
をプロドラソグまたは親薬物単独による細胞の処理で認
められた細胞毒性と比較した。結果は第１５〜１７図に
示される。
第１５図に示されるように、エトポシド（２μＭのＩＣ
５ｏ）はＥＰ（３０μＭで２０％殺害）よりもＨ２９８
１細胞に対し有意に一層毒性であった。細胞のプロドラ
ッグ暴露の前の１Ｆ、５ＡＰによる前処理は細胞毒性の
非常にわずかの増大を生じた。しかし、細胞障害活性の
驚くべき増加が細胞を初めにＬ６−ＡＰに次いでＢＰに
暴露したときに認められた。細胞障害効果は工ｊ・ボン
ド単独のそれに匹敵した。
同様の結果がマイトマイシン誘導体を用いて認められた
。第１６図に示されるように、ＭＭＣおよびＭ　ＯＨは
Ｈ２９８１細胞に対して等しく細胞障害性であり、約１
μＭのＩＣ，。値を有した。ホスフェートプロドラッグ
ＭＯＰはおそら（それが細胞に滲透する能力を欠くため
に非常に低い細胞障害性（１０μＭで５％細胞殺害）で
あった。しかし、ＭＯＰの活性は腫瘍細胞を本発明のし
６ＡＰ結合体に予め暴露したときにＭＯＨおよびＭＭＣ
に匹敵した。非結合性結合体１Ｆ５−ＡＰがプロドラッ
グの細胞障害活性に有意に影響を与えなかったので、こ
の増大は抗原特異性であった。
Ｌ６−ＡＰも１Ｆ５−ＡＰもＯＥＭ細胞に対するＭＯＰ
の細胞障害効果を驚くほど増大せず、これらの結合体の
この細胞系に結合しない事実と矛盾しない（第１７図参
照）。従って、これらの結果は試験したプロドラッグの
それぞれのホスフェート基が薬物を不活性にすることお
よび腫瘍細胞の表面に結合した抗体一酵素結合体により
プロドラッグ、ＢＰおよびＭＯＰのフォスフェート基が
加水分解されると活性細胞障害性薬物を生ずることを示
す。
本発明の結合体／マイトマイシンプロドラッグ組合せの
生体内　腫瘍　果 本発明のＬ６−ＡＰ結合体と組合せたＭＯＰの生体内抗
腫瘍活性の調査に先立って、プロドラッグおよびその遊
離された活性誘導体Ｍ　ＯＪ（０）相対毒性をＢａｌ　
ｂ／　ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスで測定した。薬、λ０６ 物を４日離して２等用量で投与（ｉ、　ｐ、　）　Ｌ、
ＭＯＨおよびＭＯＰに対しそれぞれ４５および９０ｍｇ
薬物／　ｋｇ体重のしＤ５ｏ値が得られた。また−層少
い用量を長時間にわたり用いてかなり多量の薬物を投与
できることが認められた。ＭＯＨ４０＋ｎｇ／ｋｇおよ
びＭＯＰ　１００　ｍｇ／ｋｇまでの合計量が、４等用
量で２５日の期間にわたって投与すれば十分に許容され
た。これらの研究は有意に多くのマイトマイシンプロド
ラッグがその低い毒性のために許容されたことを示した
。
次いで生体内源から得たＨ２９８１腫瘍を移植した（ｓ
、Ｃ８、右後側腹部）ライフ・サイエンシス（Ｌｉｆｅ
　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｓｔ、Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、
　Ｆｌａ、　）から得たヌードＢａｔ　ｂ／　ｃ　　ｎ
ｕ／ｎｕめすマウス（６マウス毎処置群）で療法研究を
行なった。試験は腫瘍が約１００＋ｎｍ’の容積に達し
たときに行なった。Ｌ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ結合
体（ＰＢＳ中の２５０μｇ抗体を含む０．１ｍＡ）をＭ
ＯＰ（Ｈ２Ｏ中の０．６ｍｇＭ０Ｐを含む０．２ｍｊｌ
りによる処置の１８〜２４時間前にそれぞれ投与（ｉ、
ｐ、）した。腫瘍増殖は非処置マウスおよび最大許容量
のＭＯＰ（ＨｚＯ中の０．６ｍｇＭ０Ｐを含む０．２ｍ
１）またはＭ　ＯＨ（Ｈ２０中の０．１ｎｗＭＯＨを含
む０．２ｍｊりで処置したマウス中に認められたものと
比較した。
第１８図に示されるように、ＭＯＨおよびＭＯＰはとも
に生体内で有意な抗腫瘍活性を有した。
７５０ｍ’の平均腫瘍容積に達するまでに要した時間は
ＭＯＨで処置したマウスで４５日、ＭＯＰプロドラッグ
で処置したマウスで６３日、および対照群で２７日であ
った。前記のようにＭＯＰプロドラッグは動物に対する
毒性が少なく、従って投与できた高い用量がＭＯＨ誘導
体で認められたよりも大きい抗腫瘍効果を生じた。非結
合性結合体１Ｆ５−ＡＰがＭＯＰの活性を多少増大した
けれども、−層顕著な効果がＭＯＰ処置前にＬ６−ＡＰ
を受けた群に認められた。図に示されるように、７０日
で、Ｌ６−ＡＰ結合体で前処置（次いでＭＯＰ処置）し
た腫瘍はＩ　Ｆ　５−ＡＰ結合体で前処置した腫瘍の大
きさの約１／３であった。さらに、表３に示されるよう
に、移植の６３日後までにＬ６−ＡＰ＋ＭＯＰ処置マウ
ス中６腫瘍中３つが完全退行を経験し、残り３腫瘍は処
置の着手から大きさの増加がなかった。対照的に１Ｆ５
ＡＰ＋ＭＯＰ処置群中の５腫瘍中の３つは実際に大きさ
が進行し、５腫瘍中の２つが不変であり、部分または完
全退行がなかった。
、表−」− 対照 ＯＨ ０Ｐ １Ｆ５−八Ｐ＋ＭＯＰ Ｌ６−八Ｐ＋ＭＯＰ ３／に れらの試験は明らかに本発明の標的指向酵素／ＭＯＰ組
合せの生体内における特異性および増大した抗腫瘍効果
を示す。
実施例３ この実施例は本発明の免疫結合体、プロドラッグおよび
方法の、腫瘍細胞に対する多くの異なる薬物の供給に対
する適用可能性を示す。抗体−アルカリ性ホスファター
ゼ結合体Ｌ　６−ＡＰをプロドラッグＥＰおよびＭＯＰ
と組合せた使用が高い生体内抗腫瘍活性を示した。従っ
て、本発明は腫瘍に対する組合せ化学療法に対する単一
の抗体標的指向酵素とプロドラッグのパネルとの使用を
提供する。
プロドラッグ、ＥＰおよびＭＯＰ、はそれぞれ実施例１
および２に記載したように調製した。
Ｌ６−ＡＰおよび１Ｆ５−ＡＰ免疫結合体の調製は実施
例１に記載されている。ヌードマウスにおける生体内研
究は実施例１および２に記載したように行なった。従っ
て、Ｈ２９８１腫瘍を移植したヌードマウスをＭＯＰ／
ＥＰ　（Ｈ２Ｏ中のＥＰ１■およびＭ　ＯＰ　０．３　
ｍｇを含む０．２ｍ６）で処置する１８〜２４時間前に
Ｌ６−ＡＰまたは１Ｆ５ＡＰ結合体に前暴露した。腫瘍
増殖を非処置マウスおよびＭＯＰ／ＥＰ組合せ単独で処
置したマウス中に認められたものと比較した。
第１９図に示されるように、ＭＯＰ／ＥＰ組合せ単独お
よびＭＯＰ／ＥＰ組合せプラス１Ｆ５ＡＰ処置の抗腫瘍
活性はおよそ等しかった。また表４に示されるように、
これらの２群中の腫瘍のすべて並びに非処置対照マウス
の腫瘍はサイズが成長した。しかし、腫瘍をもつマウス
のＬ６ＡＰ結合体による前処置、次いでＭＯＰ／ＢＰ組
合せは顕著な抗腫瘍応答を生じた。第１９図に示される
ように、第７０日にＬ６−ＡＰで前処置（次いで組合せ
たＭＯＰ／ＥＰ処置）した腫瘍は１Ｆ５−ＡＰ結合体で
前処置した腫瘍の大きさの約１／３であった。さらに、
移植６３日後までにマウスのＬ　６−ＡＰ前処置群中の
６腫瘍中の１つは完全に退行し、６腫瘍中の３つは増殖
を停止し、６腫瘍中の２つのみが大きさで進行した。
表４ 対照　　　６７６ Ｍ０Ｐ／ＥＰ　　　５１５ １Ｆ５−ＡＰ　　　６／６ ＋ＭＯＰ／ＢＰ Ｌ６−ＡＰ　　　　２／６　　３／６ ＋ＭＯＰ／ＢＰ 従って、これらの生体内研究は腫瘍に対する組合せ療法
に対する本発明の結合体、プロドラッグおよび方法の適
用可能性を示す。
あるいは、本発明の結合体例えばＬ６−ＡＰをプロドラ
ッグの他の組合せ、例えばＥＰ、アドリアマイシン−１
４−ホスフェートおよび５−フルオロウリジンモノホス
フェ−１・とともに用いて腫癌細胞に多くの異なる細胞
障害性物質を供給することができる。
再び、抗体一酵素結合体Ｌ６−ＡＰおよびプロドラッグ
、エトポシド−４′−ホスフェートの８周製は実施例１
に記載されたとおりである。アドリアマイシン−１４−
ホスフェートは、１９８０年１月２２日にドセソプ（Ｊ
、　Ｂ、　Ｄｕｃｅｐ　）に対して発行された米国特許
第４，１８５，１１１号に記載されたように調製される
。５−フルオロウリジンモノホスフェートはロビンス（
Ｍ、　Ｊ、　Ｒｏｂｉｎｓ）ほか、カナジアン・ジャー
ナル・オブ・ケミストリー（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ
、　）、５３、ｐｐ、　　１３０２〜１３０６　（１９
７５）に記載されたように調製される。
Ｌ６−ＡＰと上記３プロドラツグとの反応は次のように
行なわれる：ＡＰ単独またはＬ６−ＡＰ結合体（最終Ａ
Ｐ濃度５μｇ／ｍｌを、ＭｇＣｆ２（１ｍＭ）およびＺ
ｎ（１１２（０，１ｍＭ）をｐ）１７．０で含むトリス
緩衝液（１００ｍＭ）中のエトポシド−４′−ホスフェ
ートまたはアドリアマイシン１４−ホスフェート（０，
１ｍＭ）の溶液に加える。５−フルオロウリジンプロド
ラッグに対しては反応条件はリン酸塩緩衝液（１００ｍ
Ｍ）　、ｐＨ８，０中の５−フルオロウリジン（３μＭ
）の溶液を必要とする。Ｌ６−ＡＰと、エトポシドホス
フェートまたは５−フルオロウリジンプロドラッグとの
反応は実施例１に記載したようにモニターする。Ｌ６−
ＡＰとアドリアマイシン−１４−ホスフェートとの反応
はＨＰＬＣによりＩＢＭ　　Ｇ１８カラム（３μ、４．
５Ｘ１００龍）および溶離剤として３％酢酸アンモニウ
ムを含む水中の６５％メタノール（０，５ｍｊ２／分、
４９５ｎｍでモニター）を用いてモニターする。
抗体−ＡＰ結合体と各プロドラッグとの反応はホスフェ
ート部分の加水分解による除去を生じ、遊離薬物を遊離
する〔例えば、マコム（Ｒ，Ｂ。
ＭｃＣｏｍｂ）ほか、アルカリン・ホスファターゼ（Ａ
ｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）　、プレナ
ム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ）　、（１９７９）参照）。
本発明のＬ６−ＡＰ結合体の存在下の３プロト１１３、
ｆ、、、、：、 ラッグのそれぞれの腫瘍細胞に対する細胞毒性は前記実
施例１に記載したコロニー阻止検定を用いて示すことが
できる。結合体によりプロドラッグのそれぞれからホス
フェート部分が除去されるとエトポシド、アドリアマイ
シンおよび５−フルオロウリジンが遊離される。３薬物
のそれぞれが強力な抗腫瘍物質であることが示された〔
例えば、オドウヤー（Ｐ、　Ｊ、　Ｏ’Ｄｗｙｅｒ　）
ほか、「工トポシト：活抗体癌薬の現状」、ニュー・イ
ングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン（Ｎｅｗ　
ＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ　）　、３１２　、ｐｐ、　　６９２〜７００　（１
９８５）；エンブレトン（Ｍ、　Ｊ。
Ｅｍｂｌｅｔｏｎ）ほか、「抗癌物質の抗体標的指向」
、モノクローナル・アンティボデイズ・フオ・カンサー
・デテクション・アンド・セラピー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌΔｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　）　、ボル
ドウィンはか（１？、　Ｗ。
Ｂａｌｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｖ、　Ｓ、　Ｂｙｅｒｓ　）
　編、ｐｐ、３２１〜２２、アカデミツ・プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）（１９８５）；米国特許節
、類、１８５，１１１号、前掲；クルソケはか（Ｓ、　
Ｔ、　Ｃｒｏｏｋｅ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｄ、　Ｒｅ１ｃｈ
）編、アントラシフリンズ二カーレント・ステータス・
アンド・ニュー・デベロープメンツ（八ｎｔｈｒａｃｙ
ｃｌｉｎｅｓ：　　Ｃｕｒｒｅｎｔ　　５ｔａｔｕｓ　
　Ａｎｄ　　ＮｅｗＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）　、ア
カデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）　（１９８０）　：およびハイデ
ルバーガー（Ｃ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ　）ほか、
「フッ素化ピリミジンおよびそれらのヌクレオシド」、
アトパンシス・イン・エンチモロジー・アンド・リレー
テッド・エリアズ・オブ・モノキュラー・バイオロジー
（八ｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｒｅ１ａｔ。
八ｒｅａｓ　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　）　　、　
５　４　、　ｐｐ、　　　５　７〜１　１　９（１９８
３）参照〕。
従って、エトポシド、アドリアマイシンおよび５−フル
オロウリジンのプロドラッグは本発明の抗体−アルカリ
性ホスファターゼ結合体により腫瘍の部位に相当する公
知抗腫瘍物質を遊離させるために一緒にまたは連続的に
用いることができる。
例えば、互いに組合せて投与した抗腫瘍物質が相乗的に
作用できることが示された〔例えば、エンフアルジニ（
Ｓ、　Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ　）ほか、［癌化学療法の
マニュアルＪＵＴＣＣテクニカル・レポート・シリーズ
（Ｕ　Ｔ　ＣＣＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　５
ｅｒｉｅｓ）、５６（１９８１）参照〕。従って本発明
のこの態様は腫瘍に対する組合せ化学療法のための方法
を提供する。
実施例４ 次の実施例は比較的細胞障害性でないプロドラッグを腫
瘍細胞に対する細胞毒性を試験内で示す活性抗腫瘍物質
に転化する本発明のなお他の免疫結合体およびプロドラ
ッグの使用を示す。この実施例によれば、Ｌ６−ペニシ
リンＶアミダーゼ（以下ｒＰＶＡＪとして示す）免疫結
合体がアドリアマイシンのＮ−フェノキシアセチル誘導
体の公知抗腫瘍物質アドリアマイシンへの転化に使用さ
れる。
本発明の抗体−ペニジリン■アミダーゼ結合体の８周製 この実施例において、Ｌ６−ＰＶＡ免疫結合体および１
．Ｆ５−ＰＶＡ免疫結合体を調製した。抗体Ｌ　６およ
び１Ｆ５並びにそれらの源は前に記載した。用いたアミ
ダーゼ酵素は、ロウエ（Ｄ、　Ａ。
Ｌｏｗｅ）ほか、「フサリウム・オキシスボルムによる
ペニシリン■の６−アミノペニシラン酸への酵素加水分
解」、バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）　、８　　（３）　
、ｐｐ。
１５１〜５６（１，９８６）により開示された方法に従
いフサリウム・オキシスボルムの真菌培養から分離した
ペニシリンＶアミダーゼであった。この酵素を分離でき
るフサリウム・オキシスボルム株はＡＴＣＣに寄託され
ている。従って、ＰＶＡはペニシリン■をペニシラン酸
に転化する入手の容易な酵素である。より詳しくは、Ｐ
ＶＡはペニシリン■のフェノキシアセチルアミド結合を
加水分解してペニシラン酸を生ずる。従って、フェノキ
シアセトアミドと反応する酵素をフェノキシ酢酸または
ｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸で誘導体にした公知細胞
障害性物質のプロドラッグの開裂に使用することができ
る。
本発明のこの態様の抗体−ｐｖΔ結合体は実施例１のＡ
Ｐ結合体に対して記載したと実質に同様の方法で調製し
た。抗体Ｌ６および１Ｆ５を記載のようにイミノチオラ
ンと反応させ、各抗体上に導入されたスルフヒドリル基
の数が１〜２の間にあると測定された。
次いでＰＶＡ酵素をＰＢＳ中に９　ｔｒｙ　／　ｍ　ｊ
！で溶解し、ＳＭＣＣ（ピアス・ケミカル社（Ｐｉｅｒ
ｃｅＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製、ＤＭＦ中１００ｍ
Ｍ）を最終濃度が５ｍＭであるように加えた。ＳＭＣＣ
による処理は酵素上にマレイミド基を導入した。３０°
Ｃで３０分後、修飾された酵素をＧ−２５ＰＤ１０セフ
アデツクス〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉｄ。
Ｕｐｓａｌｌａ、　５ｉｉｅｄｅｎ　）製〕上のゲル濾
過により精製し、ＰＢＳで溶出させた。次いで修飾され
たＰＶＡを各チオール化抗体の溶液に３：１のモル比に
加えた。各反応混合物を窒素で飽和し、室温で３時間放
置し、４°Ｃでさらに１８時間インキュベートした。こ
の時点で２−アミノエタンチオール（最終濃度１ｍＭ）
を各溶液に加え、他の未反応マレイミドをブロックした
。
次いで各反応混合物を、５０ｍＭ−ＮａＣｊ！を有する
２０ｍＭ）リス、ｐ　Ｈ７，２を溶離剤として用いてゲ
ル濾過カラム（Ｇ−２５）に通した。生じた混合物をＤ
ＥＡＥセファデックスカラム（２，５Ｘ１０ｃｍ）で精
製した。フラクションを２８０ｎｍでモニターした。各
混合物の未反応抗体はカラムに結合せず、結合体および
未反応ＰＶＡを０．５ＭＮａＣ１を有する２０ｍＭ）リ
ス、ｐＨ７，２で溶出させた。ＰＶ’Ａおよび結合体を
含むフラクションを次いでアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　
ＹＭ　−３０限外濾過フイルターを用いて濃縮し、セフ
ァクリル８３００カラム（２，５Ｘ　９５ｃｍ）上でＰ
ＢＳを溶離剤として用いて精製した。フラクションば２
８０ｎｍでモニターし、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（４〜１２
％勾配ゲル）により測定して純結合体を含むフラクショ
ンをプールした。
アドリアマイシンプロドラッグの　製 次いで上記調製抗体−ＰＶＡ結合体のそれぞれを新規ア
ドリアマイシンプロドラッグと反応させた。より詳しく
は、用いたプロドラッグは、アトリアマイシンが第２０
図に示されるようにアミノ糖部位においてｐ−ヒドロキ
シフェノキシ酢酸でアシル化されているＮ−（ｐ−ヒド
ロキシフェノキシアセチル）アドリアマイシン（以下ｒ
ＡＰ○」として示す）であった。
このアドリアマイシンプロドラッグは次のように調製し
た： テトラヒドロフラン１０ｍｊ２中へｐ−ヒドロキシフェ
ノキシ酢酸８４ｍｇ　　（０，５ミリモル）、Ｎヒドロ
キシスクシンイミド５７ｍｇ（０，５ミリモル）および
ジシクロへキシルカルボジイミド１００ｍｇ　　（０，
４９ミリモル）を入れた。この混合物を２時間かくはん
し、その時間で溶液を濾過し、濾液をアドリアマイシン
塩酸塩２００ｍｇ（０，３５ミリモル）に加えた。トリ
エチルアミン０、］ｍｊ！を反応混合物に加え、かくは
んを４時間続けた。次いで反応混合物をガラスウールに
通して濾過し、高真空下に蒸発させて残留物を得た。
生じた混合物をシリカゲル６０カラム（２，５Ｘ２０ｃ
ｍ’）上で精製し、９５：５のジクロロメタン：メタノ
ールで溶出させた。フラクションをプールし、再び同種
のカラム」二で精製すると純Ｎ（ｐ−ヒドロキシフェノ
キシアセチル）アドリアマイシン７０ｍｇ　　（０，１
ミリモル、３０％収率）が得られた。
ＦＡＢ　ＭＳ　ｍ／ｅ　６９４．２１２５　（Ｍ＋Ｈ）
＋、計算値（Ｃ３５Ｈｆｆ６ＮＯ＋４）、　６９４．２
１３６．　３６０　ＭＨｚ　　１１　ＮＭＲ（ＣＤＣｊ
２　、）　　δ１．０６　（ｄ、　３１１．糖ＣＩ＋３
）、　１．５−２．２（ｍ、　６Ｈ，糖１１）、　３．
０　（ｑ、　２１１）　４．０　（ｓ、　３１Ｌ　ＯＣ
Ｈい。
４．３５　（ｓ、　２Ｈ，Ｃ０Ｃｔｌ□Ｏ）、　４．８
−５．０　（ｍ、　３Ｈ）、　５．２および５．４　（
ｓ、　１ｌｌ）、　６．６−６．８　（ｄｄ、　４１＋
、　　フェノキシＡｒＨ）、　７．４−７．９　（ｍ、
　３１１．２，３．４−Ｉｆ）、　９．０　（ｓｌｔＬ
　Ａｒ’　ＯＨ）、　１１．６１および１２．３９　（
ｓ、　１．ｔｌ、　Ａｒ０Ｈ）　。
アドリアマイシンの他のフェノキシアセチルアミド誘導
体を上記と実質的に同様の操作を用いて合成できること
を理解すべきである。例えばＮ（フェノキシ）アドリア
マイシンを、ｐ−ヒドロキシフェノキシ酢酸の代りにフ
ェノキシ酢酸０．５ミリモル（７６ｍｇ）を用いて本節
に記載したように合成することができる。同様に、Ｎ−
（ｐヒドロキシフェノキシアセチル）メルフアランまた
はダウノマイシンプロドラッグあるいはＮ−（フェノキ
シアセチル）メルフアランまたはダウノマイシンプロド
ラッグを、メルフアラン１００ｍｇまたはダウノマイシ
ン２００ｍｇ　　（０，３５ミリモル）を用いてこの合
成プロトコルにより合成することができる。
抗体−ペニジリンＶアミダーゼ結合体とアドリアマイシ
ンプロドラッグとの　応 抗体−ＰＶＡ結合体ＬＶ−ＰＶＡの新規プロドラッグＡ
Ｐ○をアドリアマイシンに転化する能力を次のように測
定した：　ａ）　Ｐ　Ｖ　Ａ単独（最終濃度５０μｇ／
ｍｊ２）　、ｂ）Ｌ６−ＰＶＡ結合体１００μｇ／ｍ１
ｌ（最終ｐ　Ｖ　Ａ濃度２５　、！／　ｇ／ｍｌ！＞　
、またはＬ　６−ＰＶＡ　１０　ＩＩ　ｇ／ｍｊ！　（
最ＲＰ　Ｖ　Ａ　Ｎｌｓ度２．５μｇ／ｍＡ）をＰＢＳ
中のＡＰＯ（０，１ｍＭ）の溶液に加えた。各反応をＨ
ＰＬＣによりフェノミネソクス（Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ
）　　ＣＩ　８カラム（３μｍ、　４．５　Ｘ　１００
ｍｍ）および０．１％Ｈ３Ｐ０゜を有する水中の２０〜
６０％テトラヒドロフランの勾配溶離（０，１ｍ１ｌ／
分、４９５ｍｍでモニター〉を用いてモニターした。こ
れらの条件のもとてアドリアマイシンは８．９分で溶出
し、ＡＰＯは１２．２分で溶出した。結果は第２１図に
示される。
図に示されるように、ＡＰＯのアミド基がアドリアマイ
シンの発生によって示されるようにＰＶＡによって実際
に加水分解された。用いた条件のもとてＰＶＡによるＡ
ＰＯの加水分解に対する半減期は約２０分であった。さ
らに、反応開始の４０分以内に酵素単独または抗体−Ｐ
ＶＡ結合体がＡＰＯの少くとも８０％のアドリアマイシ
ンへの加水分解を行なうことができたことが認められた
。
結合体は１０　Ｉ　ｇ／ｍｊ！　（ＰＶＡ２．５　、ｊ
ｌ　ｇ／ｍ１．＞でこの水準の加水分解を１２０分以内
に行なうことができた。最後に、これらの研究から結合
体および遊離酵素がＡＰＯのアドリアマイシンへの加水
分解に類似する能力を示した事実により明らかなように
、本発明の抗体−ＰＶＡ結合体が抗体に対する酵素の結
合に基く酵素活性の明らかな低下を示さなかったことが
明らかである。
本発明の新規アトリアマイシンプロドラッグの血ＡＰＯ
のヒト血清中の安定性を、ＨＰＬＣを用いてＡＰＯの消
失の速度およびアドリアマイシンの形成の速度を測定す
ることにより測定した。従って、ＡＰＯの溶液（ジメチ
ルホルムアミド中１０ｍＭ）を新鮮なヒト血清に最終濃
度が０．１　ｍＦであるように加えた。分割量（５０μ
β）をメタノール（５０μρ）で希釈して血清タンパク
質を沈殿させた。次いでこれらの試料を遠心分離し、す
ぐ前に記載したようにＨＰＬＣにより分析した。
ＡＰＯのアドリアマイシンへの加水分解は２時間以内に
起こらなかった。
抗体−ＰＶＡ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に対す結合 本発明のＬ　６−　Ｐ　Ｖ　Ａおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結
合体のＨ２９８１腫瘍細胞に結合する能力を実施例１お
よび２に記載したように測定した。結合検定の結果は第
２２図に示される。
ＦＡＣ３分析はＬ６およびＬ６−ＰＶＡ結合体がともに
腫瘍細胞に強く結合し、１Ｆ５−ＰＶＡ結合体が有意量
の結合を示さなかったことを示した。この結合研究は第
１に酵素に対する結合が本発明の免疫結合体の抗体成分
の結合能力に実質的に影響を与えなかったことを示す。
第２に、この検定はまた結合体の結合の特異性を示し；
Ｌ６ＰＶＡ結合体がＬ６陽性Ｈ２９８１腫瘍細胞に結合
し、１Ｆ５抗体が腫瘍細胞に対する特異性を欠くために
１Ｆ５−ＰＶＡ結合体が実質的に結合を示さなかった。
本発明の抗体−ＰＶＡ結合体／アドリアマイシンプロド
ラッグ組合せのＨ２９８１腫瘍細胞に対する一験　　　
胞毒 本発明の抗体−ＰＶＡ／アドリアマイシンプロドラッグ
組合せのＨ２９８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞障害
効果を、実施例１および２に記載した″Ｉ］−チミジン
取込み検定を用いて測定した。
簡単に記載すると、Ｈ２９８１腫瘍細胞をＩＭＤＭ中で
９６ウエルミクロタイタープレート中に置き（１０，０
００細胞／ウエル）、３７℃で１８時間β１２５ 付着させた。次いで抗体−ＰＶＡ結合体、Ｌ６ＰＶＡま
たはＩ　Ｆ　５−ＰＶＡ、を抗体１０μｇ／ｍｎの濃度
で加え、プレートを４°Ｃで３０分間インキュへ一トシ
た。次いでウェルをＩＭＤＭで４回洗浄し、ＡＰＯをＩ
ＭＤＭ中の種々の濃度で加えた。２時間後にウェルを再
び洗浄し、Ｉ　ＭＤＭを加え、細胞を３７℃で１８時間
放置した。その時点で３Ｈ−チミジンを加え（１ｐＣｉ
毎ウエル）、６時間後にプレートを一７０℃で凍結し、
細胞を分離した。融解後細胞をガラス繊維ファイバー上
に収集した。３Ｈ−チミジンをベックマン３８０１シン
チレーシヨンカウンター中で測定し、ＡＰＯまたはアド
リアマイシン（ＡＤＭ）単独で処理した細胞と比較した
。
この検定を用いて我々は腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−
チミジン取込みの阻止、従ってプロドラッグ、ＡＰＯ＋
７）Ｌ６−ＰＶＡまたはＩ　Ｆ　５−ＰＶＡ結合体によ
る細胞の前処理を有しまたは有さない細胞に対する細胞
障害効果を測定した。これらの組合せの細胞障害効果を
親薬物アドリアマイシン単独による細胞処理で認められ
た細胞毒性と比較した。第２３図に示されるように、結
合体による処理のない腫瘍細胞に対して３８ｎＭのＩＣ
５ｏを有するアドリアマイシンが２μＭのＩＣ３゜を有
するＡＰＯより有意に一層毒性であった。これはアドリ
アマイシンアミドがアドリアマイシンよりも毒性が低い
ことを示す以前の報告に基いて予期された〔例えば、レ
ビンほか（Ｙ、Ｌｅｖｉｎ　ａｎｄ　Ｂ、Ａ。
５ｅｌａ）　、Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓレターズ（ＦＢＢＳ　Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ）、９８、ｐ、１１９　（１９７９）およ
びボーレイン（ＲｏＢａｕｒａｉｎ）ほか、ジャーナル
・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ、　Ｍｅｄ、
Ｃｈｅｍ、）、２３、ｐ。
１１７１　　（１９８０）参照〕。
細胞のＬ６−ＰＶＡによる前処理はＡＰＯの細胞毒性を
アドリアマイシン単独に認められたものに匹敵する水準
に２０倍も増大した。細胞の１Ｆ５−ＰＶＡによる前処
理はＡＰＯの毒性に全く影響を与えなかった。これらの
結果はＬ６−ＰＶＡ結合体が比較的細胞障害性のないプ
ロドラッグＡＰＯを加水分解し、アドリアマイシン単独
の使用に匹敵する程度に腫瘍細胞を殺すことができるこ
と、およびこの特定腫瘍細胞系に有意に結合しない１Ｆ
５−ＰＶＡ結合体がそのような細胞毒性を示さなかった
事実により示されるようにこの細胞毒性が抗原特異性で
あることを示す。
ドージリンパ腫細胞に対する抗体−ＰＶＡ結合体の結合 本発明のＬ６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の公
知ドージ細胞系に結合する能力もまた測定した。この細
胞系は、１Ｆ５抗体が結合するＣＤ−２０抗原を発現す
るＡＴＣＣに寄託された（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ　２１３）
パーキット（Ｂｕｒｋｉｔｔ）リンパ腫細胞系である。
結合検定は実施例１に記載したように行なったが、しか
し用いた細胞系はドージ細胞であり、結果は第２４図に
示される。
この場合に、ｌＦ５単クワクローン性抗体びＩ　Ｆ　５
−ＰＶＡ結合体はともにリンパ腫細胞に強く結合した。
従って、この研究はまた結合体の結合能力が結合操作に
より有意に影響されなかったことを示す。
さらに、図に示されるように、Ｌ６抗体およびＬ６−Ｐ
ＶＡ結合体がドージ細胞に対し評価できる結合を示さな
かった。これはドージ腫瘍細胞が、Ｌ６抗体が反応する
抗原を有しないので予期されたことであった。従って、
こ＼に記載した前の結合研究と組合せて、この研究は明
らかに本発明の結合体の結合の特異性を示し、すなわち
、Ｌ６含有結合体はＬ６陽性腫瘍細胞に特異的に結合し
、１Ｆ５含有結合体はＣＩ）−２０陽性腫瘍細胞に特異
的に結合する。
本発明の抗体−ＰＶＡ結合体／アドリアマイシンプロド
ラッグ組合せのドージ細胞に対する試験管胞毒 次いで我々はＡＰＯプロドラッグと組合せたＬ６−ＰＶ
Ａまたは１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のドージ細胞に対する試
験管内細胞障害効果を試験した。
ドージ細胞が付着しない事実のため３Ｈ−チミジン検定
を多少変形して実質的に前記実施例に記載したように行
なった。従って、ＩＭＤＭ中の約２５０．０００ドージ
細胞を９６ウエルミクロクイタープレートの各ウェルに
塗布し、抗体一酵素結合体を加えた。反応混合物を４℃
で３０分間インキュベートした。非結合抗体一酵素結合
体を５００×ｇで５分間遠心分離することにより除去し
、上澄みを除去した。細胞をＩＭＤＭ中に再び懸濁し、
洗浄操作を３回繰返してすべての非結合結合体を除去し
た。次いでＩＭＤＭ中のＡＰＯを２時間加え、前記のよ
うに１回洗浄した。検定の残余は前記実施例に記載した
ように行なった。
この検定を用いて我々はドージ細胞のＤＮＡ中への３Ｈ
−チミジン取込みの阻止、従ってＬ６ＰＶＡまたは１Ｆ
５−ＰＶＡ結合体による細胞の前処理を有しまたは有し
ない細胞に対するＡＰＯプロドラッグの細胞障害効果を
測定した。これらの組合せの細胞障害効果をアドリアマ
イシン単独による細胞の処理で認められた細胞毒性と比
較した。第２５図に示されるように、結合体による処理
のないドージ細胞に対しアドリアマイシンはＡＰＯより
有意に一層毒性であった。１Ｆ５ＰＶＡ結合体による細
胞の前処理はＡＰＯプロドラッグの細胞毒性をアドリア
マイシン単独で認められたものに匹敵する水準に有意に
増大し、Ｌ　６ＰＶＡ結合体による前処理はそのような
増大を生じなかった。
これらの結合および細胞毒性研究から得られた結果が、
Ｌ　６−　Ｐ　Ｖ　ＡプラスＡＰ○組合せが増大した細
胞障害効果を示し１Ｆ５−ＰＶＡプラスＡＰＯ組合せが
示さなかったＨ２９８１腫瘍細胞を用いたこの実施例の
前に記載した研究において得られた結果の逆であること
に注意すべきである。
これは結合体のＬ６および１Ｆ５抗体の異なる特異性か
ら予期され、明らかに本発明の結合体／プロドラッグ組
合せで得られた細胞障害効果の特異性を示す。
さらに、この研究は試験管内で腫瘍細胞に対する細胞障
害効果の生成に対するＡＰＯと組合せた１Ｆ５−ＰＶＡ
結合体の有用性を示す。従って、この実施例の試験管内
細胞毒性研究は抗体が反応する腫瘍の処置のための腫瘍
関連抗原と反応性の抗体を含む任意の結合体に対する本
発明の適用可能性を示す。
実施例５ この実施例は抗体結合シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）酵
素によるプロドラッグ５−フルオロシトシン（以下ｒ５
−ＦＣＪとして示す）の抗腫傷薬５−フルオロウラシル
（以下ｒ５−ＦＵＪとして示す）への転化に対する本発
明の免疫結合体および方法の使用に関する（第２６図参
照）。この態様の抗体−〇Ｄ結合体１５−ＦＣプロドラ
ッグ組合せは試験管内で試験管内で腫瘍細胞に対し有意
な細胞障害効果を示した。
本発明の抗体−シトシンデアミナーゼ結合体の調製 先の実施例に示したＬ６および１ＦＳ単クコクローン性
抗体びシトシンデアミナーゼ酵素を用いてＬ　６−ＣＤ
およびＩ　Ｆ　５−ＣＤ免疫結合体を調製した。ＣＤ酵
素は種々の微生物から検出され、分離されたけれども〔
例えばウェスト（Ｗｅｓ　ｔ）ほか、ビオシミ力・工・
ビオフィシ力・アクタ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、八ｃｔａ）　、７１９、ｐｐ、２５１〜５８（
１９８２）参照〕、この実施例に用いた特定のＣ，Ｄは
イバタ（Ｐ、Ｌ、Ｔｐａｔａ）ほか、「パン酵母シトシ
ンデアミナーゼ。若干の酵素特性並びにヌクレオシドお
よびヌクレオチドによるアロステリンク阻止」、バイオ
ケミストリー　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、１０
　、ｐｐ、　４２７０７６　　（１９７１）により報告
された方法に類似する方法で圧縮パン酵母から精製した
。
簡単に記載すると、酵母細胞〔サツカロミセス１セレビ
シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　）（２，０Ｋｇ）を酢酸エチルで原形質分離し
、硫酸アンモニウム沈降（５０〜７３％）を２回行ない
、粗酵素調製物を得た。硫酸アンモニウムペレットを１
０ｍＭトリス−ＣＸ緩衝液ｐＨ８，０に対して透析し、
Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）アニオン交換
カラム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製〕に適
用し、ＫＣｌ勾配（０〜０．３Ｍ）で溶出させた。
フラクションを、ニシャマ（Ｔ、　ＮｉｓＮ１５ｈｊｙ
ａほか、「５−フルオロシトシンのシトシンデアミナー
ゼカプセルと組合せたラットにおける抗腫瘍効果」、カ
ンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）　
、４５、ｐｐ、　　１７５３〜６１　（１９８５）の操
作に従って、ＰＢＳ中の基質としてシトシン（または５
−ＦＣ）を用いて２７°ＣでＣＤ活性について分析した
。従ってこの操作に従って、少量の酵素調製物を基質シ
トシン（または５−ＦＣ）に加え、反応の過程をＵＶ分
光測光により、０．　Ｉ　Ｎ　−ＨＣＡでクエンチした
分割量のウラシル（または５−ＦＵ）の発生に対してモ
ニターした。２５０／２８０　　（シトシンに対し）お
よび２５５／２９０　　（５−ＦＣに対し）の比を形成
されたウラシルまたは５−ＦＵＯ量の測定に用いた。Ｃ
Ｄ活性を測定するこの操作をＣＤ酵素の精製の各段階並
びに下記の本発明のＣＤ含有結合体の精製の間に用いた
。
従って、ＫＣ／勾配の活性フラクションをプールし、濃
縮し、Ｇ−７５セフアデツクスカラムで精製した。この
段階で、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１４％、非還元性）はＣＤ
活性を含むフラクションがＭＷ１８ｋｄ　　の主タンパ
ク質並びに２０および３０ｋｄ　　における少量のタン
パク質からなった。このフラクションのＣＤ活性は１０
Ｕ／ｍｇクンバク質であった（シトシンを基質として使
用）。他の調製物は１７Ｕ／ｍｇタンパク質程度の高い
活性を有する物質を生じた。タンパク質検定はすべてピ
アス（ＰｉｅｒｃｅＲｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）から入
手できるＢＣＡタンパク質検定試薬を用いて行なった。
次いで精製したＣＤを実施例１のＡＰ結合体に対して記
載したと実質的に同様の方法でＬ６または１ＦＳ単クコ
クローン性抗体合させた。
粗結合体（ヨードアセトアミド未処理）をＳ−２００セ
フアロース上のゲル濾過によりＰＢＳを溶離剤として用
いて精製した。フラクションは２’８０ｎｍでモニター
し、各フラクションのＣＤの活性は直前に記載したよう
に検定した。
ＣＤ−抗体比の適当な水準を有する結合体を含むフラク
ションをプールし、４〜１２％非還元性勾配ゲル上の５
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると精製し６−ＣＤおよび
１Ｆ５−ＣＤ結合体調製物が得られた。
抗体−シトシンデアミナーゼ結合体とプロドラッグ５−
フルオロシトシンとの反応 本発明のＬ６−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合体のプロド
ラッグ５−ＦＣを５−ＦＵに、または基質シトシンをウ
ラシルに転化する能力を次のように測定した：遊離ＣＤ
（最終濃度＝５μｇ／ｍＡ）、Ｌ６−ＣＤ結合体（最終
ＣＤ濃度：５／Ｊｇ／ｍｉりまたは１Ｆ５−ＣＤ結合体
（最終ＣＤ濃度：５Ｊ１ｇ／ｍＡ＞を、ａ）シトシンま
たはｂ）５−ＰＣのＰＢＳ中の３ｍＭ溶液に２７℃で加
え、時間にわたって形成された生成物の量を前記実施例
節に記載したように分光測光で測定した。結果は第２７
図に示される。
図に示されるように、５−ＦＵは遊離ＣＤ酵素および本
発明の抗体−ＣＤ結合体の両方によりプロドラッグ５−
ＦＣから生じた。同図はまた、結合体がＣＤ単独の活性
に等しい活性を示す事実により明らかなように、いずれ
の結合体の抗体に対する酵素の結合に基＜ＣＤ酵素活性
の有意な低下のないことを示す。遊離酵素および結合体
の特異的活性は約４０／ｍｇ酵素であった。
比較のため結合体の反応性を基質として５ＦＣの代りに
シトシンを用いて試験した。図に示されるように、シト
シンを基質として、結合体はまた遊離ＣＤ酵素単独の活
性に実質的に等ＣＤ活性を示した。結合体の特異的活性
□１０Ｕ、／ｍｇの結合酵素−はさらにＣＤの原酵素活
性が結合体中に保存されたことを示した。
活性のこの水準は結合体をＰＢＳ中に４　’Ｃで貯蔵し
たときに数週間維持された。
抗体−ＣＤ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に対する　　Ａ 本発明のＬ　６−ＣＤおよび１Ｆ５−ＣＤ結合体のＨ２
９８１腫瘍細胞に結合する能力を実施例１および２に記
載したように測定した。結合検定の結果は第２８図に示
される。
ＦＡＣ３分析はＬ６およびＬ　６−ＣＤが腫瘍細胞に強
く結合し、Ｉ　Ｆ　５−ＣＤ結合体が細胞に対する結合
を示さなかったことを示した。前記前の結合研究のよう
に、この検定は抗体の酵素に対する結合にもか＼わらず
これらの結合体の結合活性の保存、並びに結合体の結合
の特異性を示す。
本発明の抗体−〇Ｄ結合体１５−ＦＣプロドラッグ組合
せのＨ２９８１腫瘍細胞に対する試験細胞毒性 本発明の抗体−〇Ｄ１５−ＦＣプロドラッグ組合せのＨ
２９８１腫瘍細胞に対する試験管内細胞毒性を実施例１
および２に記載した３Ｈチミジン取込み検定にＨｌｕす
る３Ｈ−ロイシン取込み検定を用いて測定した。
この検定によれば、１０％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎仔血清を有
するＩ　Ｍ　Ｄ　Ｍ　０．１　ｍ　ｊｌ中の１０４Ｈ２
９８１細胞の懸濁液を９６ウエルミクロタイタープレー
ト中に置き、３７℃で一夜付着させた。次いでプレート
を洗浄し、０．１ｍ＃ＩＭＤＭ中のＬ６−ＣＤまたは１
Ｆ５−ＣＤ結合体（シトシンを基質として用いて結合酵
素ＣＤ活性１０Ｕ／ｍｇを含む１０μｇ全タンパク質／
　ｍ　ｊ２　）を加えた。４℃で３０分後に、プレート
を４回洗浄し、薬物５−ＦＣまたは５−ＦＵの種々の濃
度を含むロイシン不含ＲＰＭＩ培地０．１５ｍｆｆをウ
ェルに加えた。細胞を３７℃で１８時間インキュベート
し、次いでロイシン不含ＲＰＭＩＯ，０５ｍｌ１中の３
）（ｏイシン（１μＣ１／ウエル）で６時間標識した。
次いで実施例１および２に３Ｈ−チミジン取込み検定に
対して記載したように処理した。
この検定を用いて腫瘍細胞のタンパク質中への３Ｈ−ロ
イシンの阻止、従ってプロドラッグ５−ＦＣの、Ｌ６−
ＣＤまたは１Ｆ５−ＣＤ結合体による細胞の前処理を有
しまたは有しない細胞に対する細胞障害効果を測定した
。これらの組合せの細胞障害効果を親薬物５−ＦＵ単独
による細胞の処理で認められた細胞毒性と比較した。第
２９図に示されるように、結合体による処理のない腫瘍
細胞に対して５−ＦＣは非常に小さい細胞障害活性を示
し、５−ＦＵは２０μＭのＩＣ５゜で細胞増殖を阻止し
た。しかし、Ｌ６−ＣＤ結合体による細胞の前処理は５
ＦＣの細胞毒性を５−ＦＵ単独で認められたと等しい水
準に増大した。この結果は抗原結合Ｌ６−ＣＤが非毒性
プロドラッグ５−ＦＣを５ＦＵに転化することができる
事実と矛盾しない。非結合性結合体Ｉ　Ｆ　５−ＣＤは
そのような増大を示さず、この増大細胞毒性の抗原特異
的性質を示した。
我々は本発明の多くの態様を提供したけれども、我々の
基本構成を変更し、本発明の方法、免疫結合体およびプ
ロドラッグを用いる他の態様を与えることができること
は明らかである。
従って、本発明の範囲が実施例として前に提供した特定
態様よりはむしろ特許請求の範囲により規定されるべき
であることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
第１図は抗体一酵素結合体を結合する腫瘍細胞における
プロドラッグの活性化に用いる方策を示す図、 第２図は、（八）９６．５−ＡＰ免疫結合体、（Ｂ）Ｌ
６−ＡＰ免疫結合体、（Ｃ）　Ａ　Ｐ、（Ｄ）単クロー
ン性抗体９６．５、（Ｅ）単クローン性抗体１．．６の
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析結果を示す写真、 第３図はエトポシドホスフェートおよびエトボシドチオ
ホスフェヒトプロドラソグの調製および加水分解を示す
図、 第４図は、（Ａ）エトポシド−４′−ホスフェート単独
、（Ｂ）エトポシド単独、（Ｃ）エトポシド−４′−ホ
スフェートプロドラッグとＡＰとの反応５分後の生成物
、（Ｄ）エトポシド−４′ホスフエートプロドラツグと
Ｌ６−ＡＰ結合体との反応５分後の生成物のＨＰＬＣを
示す図、第５図はエトポシド−４′−ホスフェートまた
はエトポシド−４′−チオホスフェートのアルカリ性ホ
スファターゼ暴露による時間に関するエトポシド遊離を
示すグラフ、 第６図はＨ３３４７腫瘍細胞に対する抗体および結合体
の結合を示すグラフ、 第７図はアルカリ性ホスファターゼ結合体に対する結合
検定の結果を示すグラフ、 第８図はエトポシドまたはエトポシドホスフェートプロ
ドラソグのモル濃度に対する殺される腫瘍細胞の割合を
示すグラフ、 第９図は薬物濃度とＨ３３４７腫瘍細胞のＤＮＡ中への
３Ｈ−チミジン取込み阻止との関係を示すグラフ、 第１０図は非処置または結合体処置腫瘍中のホスファタ
ーゼ活性を示し、第１０Ａ図は全ホスファターゼ活性と
時間との関係を示すグラフ、第１０Ｂ図はＨ−Ｅ染色断
面およびＡＰ基質キット測定結果を示すワ真、 第１１図は非処置または処置マウスの腫瘍容積の時間に
関するグラフ、 第１２図は本発明に用いるマイトマイシン誘導体の化学
構造を示す図、 第１３図はＭＯＰとアルカリ性ホスファターゼ酵素との
反応の時間に関するグラフ、第１４図はＬ６および１Ｆ
Ｓ単クコクローン性抗体にＬ６−ＡＰおよび１Ｆ５−Ａ
Ｐ結合体のＨ２９８１腫瘍細胞に対する結合を示すグラ
フ、 第１５図はＨ２９８１腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チ
ミジン取込みの阻止を示すグラフ、第１６図はＨ２９８
１腫瘍細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チミジン取込みの阻止
を示すグラフ、第１７図ＣＥＭ細胞のＤＮＡ中への３Ｈ
−チミジン取込みの阻止を示すグラフ、 第１８図、第１９図はそれぞれマウス中の時間に関する
腫瘍容積を示すグラフ、 第２０図はアドリアマイシンプロドラッグの化学構造お
よび調製を示す図、 第２１図はＬ６−ＰＶＡ結合体およびＰＶＡ単独による
ＡＰＯの代謝を示すグラフ、第２２図はＬ６単クローン
性抗体並びにＬ６ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体の
０２９８１腫瘍細胞に対する結合を示すグラフ、 第２３図はＡＤＭ、ＡＰＯおよびＡＰＯ＋ＰＶＡ結合体
によるＨ　２９８１細胞の阻止を示すグラフ、 第２４図はＬ６および１Ｆ５単クコクローン性抗体にＬ
６−ＰＶＡおよび１Ｆ５−ＰＶＡ結合体のドージリンパ
腫細胞に対する結合を示すグラフ、 第２５図はドージリンパ腫細胞のＤＮＡ中への３Ｈ−チ
ミジン取込みの阻止を示すグラフ、第２６図は５フルオ
ロシトシン（５−ＦＣ）および５−フルオロウラシル（
５−ＦＵ）の化学構造を示す図、 第２７図はシトシンまたは５ＦＣとＣＤ、Ｌ　６−ＣＤ
または１Ｆ５−ＣＤとの反応の時間に関する生成物量を
示すグラフ、 第２８図はＬ６並びにＬ６−ＣＤおよび１Ｆ５ＣＤのＨ
２９８１腫瘍細胞に対する結合を示すグラフ、 第２９図ばＨ２９８１腫瘍細胞のタンパク質中への３Ｈ
−ロイシン取込みの阻止を示すグラフ、 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 標的指向させた活性化生成酵素 ＣＤＥ ０−１６−ＡＰ ）　９６．５ ０−９６．５−ＡＰ アドリアマイシン ＡＰＯ

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給する方法であっ
    て、相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対する細胞障害
    性が弱い少くとも１種のプロドラッグを一層細胞障害性
    の親薬物に転化できる酵素に結合した、前記腫瘍細胞の
    表面上の抗原と反応性の抗体を含む少くとも１種の抗体
    −酵素結合体の有効量の投与、および前記プロドラッグ
    の有効量の投与を含む方法。
  2. （２）抗体が多クローン性、単クローン性またはキメラ
    の抗体からなる群から選ばれる、請求項（１）記載の方
    法。
  3. （３）抗体が単クローン性抗体、Ｌ６、９６．５および
    １Ｆ５からなる群から選ばれる、請求項（１）記載の方
    法。
  4. （４）酵素がアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリンア
    ミダーゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミナ
    ーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルポキシペプチダ
    ーゼ、炭水化物開裂酵素およびβ−ラクタマーゼからな
    る群から選ばれる、請求項（１）記載の方法。
  5. （５）酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求項
    （１）記載の方法。
  6. （６）酵素がペニシリンＶアミダーゼである、請求項（
    １）記載の方法。
  7. （７）酵素がシトシンデアミナーゼである、請求項（１
    ）記載の方法。
  8. （８）親薬物がエトポシド、テニポシド、アドリアマイ
    シン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテ
    リン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス−プ
    ラチナムおよびシスプラチナム類似体、ブレオマイシン
    類、エスペラマイシン類、５−フルオロウラシル、メル
    ファラン並びに他のナイトロジエンマスタードからなる
    群から選ばれる、請求項（１）記載の方法。
  9. （９）親薬物がエトポシドである、請求項（１）記載の
    方法。
  10. （１０）親薬物がマイトマイシンである、請求項（１）
    記載の方法。
  11. （１１）親化合物がアドリアマイシンである、請求項（
    １）記載の方法。
  12. （１２）親化合物が５−フルオロウラシルである、請求
    項（１）記載の方法。
  13. （１３）プロドラッグがホスフェート含有プロドラッグ
    、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロド
    ラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有
    プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、場合に
    より置換されていることができるフェノキシアセトアミ
    ド含有プロドラッグ、および場合により置換されている
    ことができるフェニルアセトアミド含有プロドラッグか
    らなる群から選ばれる、請求項（１）記載の方法。
  14. （１４）プロドラッグがエトポシドホスフェート類、エ
    トポシドチオホスフェート類、エトポシドサルフェート
    類、テニポシドホスフェート類、テニポシドチオホスフ
    ェート類、テニポシドサルフェート類、アドリアマイシ
    ンホスフェート類、アドリアマイシンサルフェート類、
    Ｎ＾７−Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフ
    ェート類およびＮ＾７−Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイト
    マイシンサルフェート類からなる群から選ばれる、請求
    項（１）記載の方法。
  15. （１５）プロドラッグがエトポシド−４′−ホスフェー
    トまたはその薬学的に許容される塩である、請求項（１
    ）記載の方法。
  16. （１６）プロドラッグが７−（２′−アミノエチルホス
    フェート）マイトマイシンまたはその薬学的に許容され
    る塩である、請求項（１）記載の方法。
  17. （１７）プロドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキシフェノキ
    シアセチル）アドリアマイシン、Ｎ−（フェノキシアセ
    チル）アドリアマイシン、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェニ
    ルアセチル）アドリアマイシンおよびＮ−（フェニルア
    セチル）アドリアマイシンからなる群から選ばれる、請
    求項（１）記載の方法。
  18. （１８）プロドラッグが５−フルオロウリジンモノホス
    フェートおよび５−フルオロシトシンからなる群から選
    ばれる、請求項（１）記載の方法。
  19. （１９）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰである、請求項
    （１）記載の方法。
  20. （２０）抗体−酵素結合体が９６．５−ＡＰである、請
    求項（１）記載の方法。
  21. （２１）抗体−酵素結合体が１Ｆ５−ＡＰである、請求
    項（１）記載の方法。
  22. （２２）抗体一酵素結合体がＬ６−ＰＶＡである、請求
    項（１）記載の方法。
  23. （２３）抗体−酵素結合体が１Ｆ５−ＰＶＡである、請
    求項（１）記載の方法。
  24. （２４）抗体−酵素結合体がＬ６−ＣＤである、請求項
    （１）記載の方法。
  25. （２５）抗体−酵素結合体が１Ｆ５−ＣＤであ、請求項
    （１）記載の方法。
  26. （２６）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰであり、プロド
    ラッグがエトポシド−４′−ホスフェート、Ｎ＾７−Ｃ
    ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフェート、ま
    たはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項（１
    ）記載の方法。
  27. （２７）抗体−酵素結合体がＬ６−ＰＶＡであり、プロ
    ドラッグがＮ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）
    アドリアマイシンおよびＮ−（フェノキシアセチル）ア
    ドリアマイシンからなる群から選ばれる、請求項（１）
    記載の方法。
  28. （２８）抗体−酵素結合体がＬ６−ＣＤであり、プロド
    ラッグが５−フルオロシトシンである、請求項（１）記
    載の方法。
  29. （２９）腫瘍細胞が癌腫、黒色腫、リンパ腫、骨および
    軟組織肉腫並びに他の腫瘍からなる群から選ばれる起源
    である、請求項（１）記載の方法。
  30. （３０）腫瘍細胞に細胞障害性物質の組合せを供給する
    方法であって、それぞれ相当する親薬物に比べて腫瘍細
    胞に対する細胞障害性が弱い少くとも１種のプロドラッ
    グを一層細胞障害性の親薬物に転化できる酵素に結合し
    た、前記腫瘍細胞の表面上の抗原と反応性の抗体を含む
    抗体−酵素結合体の有効量の投与、および１種以上の前
    記プロドラッグの有効量の投与を含む方法。
  31. （３１）酵素がアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリン
    アミダーゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミ
    ナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチ
    ダーゼ、炭水化物開裂酵素およびβ−ラクタマーゼから
    なる群から選ばれる、請求項（３０）記載の方法。
  32. （３２）酵素がアルカリ性ホスファターゼである、請求
    項（３１）記載の方法。
  33. （３３）親薬物がエトポシド、テニポシド、アドリアマ
    イシン、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプ
    テリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン類、シス−
    プラチナムおよびシス−プラチナム類似体、ブレオマイ
    シン類、エスペラマイシン類、５−フルオロウラシル、
    メルファラン並びに他のナイトロジエンマスタードから
    なる群から選ばれる、請求項（３０）記載の方法。
  34. （３４）プロドラッグがホスフェート含有プロドラッグ
    、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロド
    ラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有
    プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、場合に
    より置換されていることができるフェノキシアセトアミ
    ド含有プロドラッグ、および場合により置換されている
    ことができるフェニルアセトアミド含有プロドラッグか
    らなる群から選ばれる、請求項（３０）記載の方法。
  35. （３５）プロドラッグがエトポシドホスフェート類、エ
    トポシドチオホスフェート類、エトポシドサルフェート
    類、テニポシドホスフェート類、テニポシドチオホスフ
    ェート類、テニポシドサルフェート類、アドリアマイシ
    ンホスフェート、アドリアマイシンサルフェート類、ア
    ドリアマイシンのＮ−フェノキシアセチル誘導体、アド
    リアマイシンのＮ−フェニルアセチル誘導体、Ｎ＾７−
    Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフェート類
    およびＮ＾７−Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシン
    サルフェート類からなる群から選ばれる、請求項（３０
    ）記載の方法。
  36. （３６）プロドラッグの１つが５−フルオロシトシンま
    たは５−フルオロウリジンモノホスフェートである、請
    求項（３０）記載の方法。
  37. （３７）プロドラッグがエトポシド−４′−ホスフェー
    ト、Ｎ＾７−Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホ
    スフェートまたはそれらの薬学的に許容される塩である
    、請求項（３０）記載の方法。
  38. （３８）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰ、９６．５−Ａ
    Ｐおよび１Ｆ５−ＡＰからなる群から選ばれる、請求項
    （３０）記載の方法。
  39. （３９）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰであり、プロド
    ラッグがエトポシド−４′−ホスフェートおよびＮ＾７
    −Ｃ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフェート
    またはそれらの薬学的に許容される塩である、請求項（
    ３０）記載の方法。
  40. （４０）腫瘍細胞に細胞障害性物質の組合せを供給する
    方法であって、各結合体の抗体が前記腫瘍細胞の表面上
    に位置する同一または異なる抗原と反応性であり、各結
    合体の酵素が同一または異なり、相当する親薬物に比べ
    て腫瘍細胞に対する細胞障害性が弱い少くとも１種のプ
    ロドラッグを一層細胞障害性の親薬物に転化できる１種
    以上の抗体−酵素結合体の有効量の投与、および前記プ
    ロドラッグまたはプロドラッグ類の有効量の投与を含む
    方法。
  41. （４１）抗体−酵素結合体、Ｌ６−ＡＰ。
  42. （４２）抗体−酵素結合体、９６．５−ＡＰ。
  43. （４３）抗体−酵素結合体、１Ｆ５−ＡＰ。
  44. （４４）抗体−酵素結合体、Ｌ６−ＰＶＡ。
  45. （４５）抗体−酵素結合体、１Ｆ５−ＰＶＡ。
  46. （４６）抗体−酵素結合体、Ｌ６−ＣＤ。
  47. （４７）抗体−酵素結合体、１Ｆ５−ＣＤ。
  48. （４８）式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｒ＾１がＨであり、Ｒ＾３がＯＨまたはＯＣＨ＿３であ
    るか、または Ｒ＾１がＯＨであり、Ｒ＾３がＯＣＨ＿３であり、Ｒ＾
    ２はＨまたはＯＨである） を有する化合物。
  49. （４９）式、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、 Ｒ＾１がＨであり、Ｒ＾３がＯＨまたはＯＣＨ＿３であ
    るか、または Ｒ＾１がＯＨであり、Ｒ＾３がＯＣＨ＿３であり、Ｒ＾
    ２はＨまたはＯＨである） を有する化合物。
  50. （５０）Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）ア
    ドリアマイシン。
  51. （５１）Ｎ−（フェノキシアセチル）アドリアマイシン
    。
  52. （５２）請求項（１）記載の少くとも１種の抗体−酵素
    結合体の薬学的に有効な量を含む、腫瘍の治療に有用な
    薬学的に許容される組成物。
  53. （５３）請求項（１）記載の少くとも１種の抗体−酵素
    結合体および相当する親薬物に比べて腫瘍細胞に対する
    細胞障害性の弱い少くとも１種のプロドラッグの組合せ
    。
  54. （５４）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰ、Ｌ６−ＰＶＡ
    およびＬ６−ＣＤからなる群から選ばれる、請求項（５
    ３）記載の組合せ。
  55. （５５）プロドラッグがホスフェート含有プロドラッグ
    、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロド
    ラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有
    プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、場合に
    より置換されていることができるフェノキシアセトアミ
    ド含有プロドラッグ、および場合により置換されている
    ことができるフェニルアセトアミド含有プロドラッグか
    らなる群から選ばれる、請求項（５３）記載の組合せ。
  56. （５６）プロドラッグがエトポシドホスフェート類、エ
    トポシドチオホスフェート類、エトポシドサルフェート
    類、テニポシドホスフェート類、テニポシドチオホスフ
    ェート類、テニポシドサルフェート類、アドリアマイシ
    ンホスフェート類、アドリアマイシンサルフェート類、
    アドリアマイシンのＮ−フェノキシアセチル誘導体、ア
    ドリアマイシンのＮ−フェニルアセチル誘導体、マイト
    マイシンホスフェート類、マイトマイシンサルフェート
    類、５−フルオロウリジンモノホスフェートおよび５−
    フルオロシトシンからなる群から選ばれる、請求項（５
    ３）記載の組合せ。
  57. （５７）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰであり、プロド
    ラッグがエトポシド−４′−ホスフェート、Ｎ＾７−Ｃ
    ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフェートまた
    はそれらの薬学的に許容される塩である、請求項（５３
    ）記載の組合せ。
  58. （５８）請求項（１）記載の少くとも１種の抗体−酵素
    結合体の薬学的に有効な量および請求項（１）記載の少
    くとも１種のプロドラッグの薬学的に有効な量を哺乳動
    物に投与する段階を含む、哺乳動物腫瘍を治療する方法
    。
  59. （５９）プロドラッグがホスフェート含有プロドラッグ
    、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロド
    ラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有
    プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、場合に
    より置換されていることができるフェノキシアセトアミ
    ド含有プロドラッグ、および場合により置換されている
    ことができるフェニルアセトアミド含有プロドラッグか
    らなる群から選ばれる、請求項（５８）記載の方法。
  60. （６０）プロドラッグが５−フルオロウリジンモノホス
    フェートおよび５−フルオロシトシンからなる群から選
    ばれる、請求項（５８）記載の方法。
  61. （６１）抗体−酵素結合体がＬ６−ＡＰであり、プロド
    ラッグがエトポシド−４′−ホスフェート、Ｎ＾７−Ｃ
    ＿１＿−＿８アルキルマイトマイシンホスフェートまた
    はそれらの薬学的に許容される塩である、請求項（５８
    ）記載の方法。
  62. （６２）腫瘍細胞に細胞障害性物質を供給する方法であ
    って、少くとも、少くとも１種の弱い細胞障害性プロド
    ラッグをその一層細胞障害性の薬物に転化できる酵素の
    機能的に活性な部分に結合した、腫瘍関連抗原と反応性
    の抗体の抗原結合領域を少くとも含む少くとも１種の融
    合タンパク質の有効量の投与、および前記プロドラッグ
    の有効量の投与を含む方法。
  63. （６３）抗体が単クローン性抗体、Ｌ６、９６．５およ
    び１Ｆ５からなる群から選ばれる、請求項（６２）記載
    の方法。
  64. （６４）酵素がアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリン
    アミダーゼ、アリールスルファターゼ、シトシンデアミ
    ナーゼ、プロテアーゼ、Ｄ−アラニルカルボキシペプチ
    ダーゼ、炭水化物開裂酵素、およびβ−ラクタマーゼか
    らなる群から選ばれる、請求項（６２）記載の方法。
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