TW201932487A - 單域抗體－胞嘧啶脫氨酶融合蛋白及其製備方法、藥物組合物、及其用途 - Google Patents

單域抗體－胞嘧啶脫氨酶融合蛋白及其製備方法、藥物組合物、及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及融合蛋白、製備融合蛋白的方法以及使用融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含：單域抗體(sdAb)或其功能性變異體、和胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體，二者可選地經連接胜肽連接。本發明的融合蛋白還具有CD活性。本發明還涉及包含所述融合蛋白和藥學可接受的賦形劑的藥物組合物或製劑、以及這些融合蛋白的醫藥用途。

Description

單域抗體-胞嘧啶脫氨酶融合蛋白
本發明涉及融合蛋白、製備融合蛋白的方法和使用融合蛋白的方法。更具體地，本發明涉及融合蛋白，包含針對細胞蛋白的功能性單域抗體(sdAb)(例如：VHH或納米抗體)或其功能性變異體和胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體，二者可選地經連接胜肽連接。所述sdAb或其功能性變異體可連接(可選地經連接胜肽)至CD蛋白或其功能性變異體的N端或C端。本發明的融合蛋白還具有CD活性。本發明還涉及包含這類融合蛋白和藥學可接受的賦形劑的藥物組合物或製劑，以及這些融合蛋白的醫藥用途。
化療藥5-氟尿嘧啶(5-FU)廣泛用於癌症治療中，但採用5-FU的全身性治療與嚴重毒性副作用相關。該試劑通過干擾轉錄而抑制細胞生長，且可以用在癌症和其它增殖性疾病的治療中。胞嘧啶脫氨酶(CD)將非毒性前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)轉化為細胞毒性劑5-氟尿嘧啶。5-FC因人類細胞中缺乏CD而對人體細胞無毒性。與5-氟胞嘧啶前藥共同施用的胞嘧啶脫氨酶基因是癌症基因療法中最廣泛測 試的自殺體系中的一種。在對受試者以5-FC治療後，CD基因在腫瘤內的表達能夠誘導5-氟尿嘧啶的局部生成，從而產生腫瘤內化療。將5-FC和CD組合施用往往與全身性毒性相關。因此，在增殖性疾病的治療中，具有針對CD/5-FC組合策略採用替代性手段的需求。
目前已開發了抗體導向的酵素-前藥療法(ADEPT)來克服該限制。與腫瘤特異性抗體綴合的活化性酵素被遞送至腫瘤細胞內，隨後施用前藥，該前藥在被所述酶活化前是惰性的。因此，可以避免全身性毒性。
Park等公開了含有TSG-6(Link)的透明質酸結合和酵母菌胞嘧啶脫氨酶(CD)的重組融合蛋白。在他們的研究中，在BL21-Codon Plus®(DE3)RIPL大腸桿菌細胞中表達了各種Link-CD構建體，例如GST-標籤、(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：188)接頭。雖然致力於增加可溶性蛋白的積累，但大多數表達的蛋白仍在包涵體(inclusion body)內聚集。平均而言，從每升培養基的可溶性級分中回收了約500μg/L的純化蛋白(Mol Pharm.2009；6(3)：801-812)。
Deckert等公開了A33scFv-胞嘧啶脫氨酶重組蛋白並證明了其抗原結合特異性及酶活性。將BL21大腸桿菌λDE3溶源體(lysogen)透過T7-RNA聚合酶控制的細菌系統表達A33scFv-CD。融合蛋白以包涵體型式表達，最終培養物產量約100μg/L(British Journal of Cancer(2003)88,937-939)。
在單一表達體系中表達由人抗體序列和細菌酶組成的異種蛋白是困難的。Coelho等試圖在嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)中產生A33scFv-胞嘧啶脫氨酶重組蛋白，以選擇高產量细胞株進行生產。在其研究中，選擇一經pPICZαA-轉殖之高產量嗜甲醇酵母菌株，且該目標蛋白可以分泌至培養上清液中。純化後的總產量為約1.0mg/L(International Journal of Oncology 31：951-957,2007)。
這些結果均指明，腫瘤特異性抗體或抗原結合片段與CD的融合不適合工業生產。因此，具有在工業用途上可達可觀的生產產量並具有抗原結合特異性和酶活性的CD融合蛋白的需求。
本發明提供了融合蛋白、製備融合蛋白的方法以及使用融合蛋白的方法。以下是本發明的非限制性實施例。
在本發明的某些實施例中，融合蛋白包含式I或式II：N-(L)n-C (式I)；C-(L)n-N (式II)；其中，N為一單域抗體(sdAb)或其功能性變異體，L為一連接胜肽且n=0-50，並且C為一胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體。
在這些實施例的某些態樣，融合蛋白包含式I 並且連接胜肽的C端或單域抗體或其功能性變異體的C端與CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在連接胜肽，且單域抗體或其功能性變異體的C端與CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在至少一個連接胜肽，且單域抗體或其功能性變異體的C端與連接胜肽的N端融合，而連接胜肽的C端與另一個連接胜肽的N端或者CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。
在這些實施例的其它態樣，融合蛋白包含式II並且連接胜肽的C端或CD蛋白或其功能性變異體的C端與單域抗體或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在連接胜肽，且CD蛋白或其功能性變異體的C端與單域抗體或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在至少一個連接胜肽，且CD蛋白或其功能性變異體的C端與連接胜肽的N端融合，而連接胜肽的C端與另一個連接胜肽的N端或者單域抗體或其功能性變異體的N端融合。
在一些實施例中，融合蛋白基本上由式I所組成。在一些實施例中，融合蛋白係式I。
在一些實施例中，融合蛋白基本上由式II所組成。在一些實施例中，融合蛋白係式II。
在一些實施例中，單域抗體或其功能性變異體與一標靶結合，其中所述標靶係選自由細胞膜分子、分泌性分子和胞內分子所組成的群組。在一些實施例中，所述標靶是一腫瘤相關抗原或一腫瘤特異性抗原。
在某些實施例中，所述標靶選自由以下組成的 群組：EGFR、5T4、A33、AFP、β-連環蛋白、BRCA1、BRCA2、C242、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23、CD30、CD3、CD37、CD40、CD44、CD5、CD51、CD52、CD56、CD64、CD74、CD80、CDCP1、c-KIT、COX-2、cMET、CSF1R、CTLA-4、EGF2、ErbB2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HER3、HIF-Ia、HLA-DR、IGF-IR、mTOR、NPC-1C、P53、PDGFRα、PDGFRβ、PLGF、PSA、RGMa、R0N、TNF、TP53、TPD52、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、FAP、醣蛋白75、TAG-72、MUC16、NR-LU-13、SLAMF7、EGP40、BAFF、PRL-3、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、MART-1、gp100、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、hTERT、間皮素、MCC、Mum-1、ERBB2IP、EpCAM、TfR、整合素α6β4、HGFR、PTP-LAR、CD147、CDCP1、CEACAM6、JAM1、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-1、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
在一些實施例中，所述標靶選自由以下組成的群組：EGFR、c-KIT、cMET、HER2、HER3、FGFR1、 FGFR2、FGFR3、IGF-IR、P53、PDGFRα、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、MUC16、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、間皮素、EpCAM、整合素α6β4、CEACAM6、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-l、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
在一些實施例中，所述標靶為VEGFR2、EGFR、CEA、HER2或HER3。
在一些實施例中，所述標靶為VEGFR2。在某些實施例中，所述標靶為EGFR。
在一些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36組成的群組。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34 組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36組成的群組。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：35組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36組成的群組。
在一些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：23(3VGR19)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：23(3VGR19)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：23(3VGR19)的胺基酸序列組成。
在一些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：2(4VGR17)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：24(4VGR17)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：24(4VGR17)的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：25(4VGR38)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：25(4VGR38)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：25(4VGR38)的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：41組成的群組；以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：42組成的群組。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40組成的群組，一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：41組成的群組；以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：42組成的群組。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：41組成的群組，以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：42組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：26(VHH122)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：26(VHH122)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述 單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：26(VHH122)的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：27(7D12)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：27(7D12)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：27(7D12)的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：205組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：206組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：207組成的群組。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體基本由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：205組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：206組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：207組成的群組。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體由以下組成：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：205組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：206組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：207組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：69(2D3)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：69(2D3)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：69(2D3)的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：70(5F7)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：70(5F7)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：70(5F7)的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：71(47D5)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：71(47D5)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：71(47D5)的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含：一序列為SEQ ID NO：208的互補決定區1(CDR1)，一序列為SEQ ID NO：209的互補決定區2(CDR2)，和一序列為SEQ ID NO：210的互補決定區3(CDR3)。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體基本由：一序列為SEQ ID NO：208之互補決定區1 (CDR1)，一序列SEQ ID NO：209的互補決定區2(CDR2)，和一序列為SEQ ID NO：210的互補決定區3(CDR3)所組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體由：一序列為SEQ ID NO：208的互補決定區1(CDR1)，一序列為SEQ ID NO：209的互補決定區2(CDR2)，和一序列為SEQ ID NO：210的互補決定區3(CDR3)所組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：75(BCD090-M2)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：75(BCD090-M2)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：75(BCD090-M2)的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：214組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：215組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：216組成的群組。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體基本由：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：214組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：215組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：216組 成的群組。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體由：一互補決定區1(CDR1)，由SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：214組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：215組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：216組成的群組所組成。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：77(ABS29544.1)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：77(ABS29544.1)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：77(ABS29544.1)的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：79(NbCEA5)的胺基酸序列。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體基本由SEQ ID NO：79(NbCEA5)的胺基酸序列組成。在某些態樣，所述單域抗體或其功能性變異體由SEQ ID NO：79(NbCEA5)的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，存在至少一連接胜肽，且其包含胺基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO：1)，其中n為1、2、3、4、5或6。在某些實施例中，存在至少一連接胜肽，且其包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的胺基酸序列。在某些實施例中，存在至少一連接胜肽，且其包含胺基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO：188)。
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異 體是細菌CD蛋白或其功能性變異體，或者酵母菌CD蛋白或其功能性變異體。
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含一胺基酸序列，所述選自由SEQ ID NO：21、22、186和187組成的群組。在某些態樣，所述CD蛋白或其功能性變異體基本由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO：21、22、186和187組成的群組。在某些態樣，所述CD蛋白或其功能性變異體由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO：21、22、186和187組成的群組。在某些態樣，CD蛋白包含SEQ ID NO：22的胺基酸序列、基本由其組成或者由其組成。在某些態樣，CD包含SEQ ID NO：187的胺基酸序列、基本由其組成或者由其組成。
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含一胺基酸序列，所述胺基酸序列與SEQ ID NO：21、22、186和187中的任一個具有至少90%相似度、至少91%相似度、至少92%相似度、至少93%相似度、至少94%相似度、至少95%相似度、至少96%相似度、至少97%相似度、至少98%相似度、至少99%相似度或100%相似度。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一CD蛋白的功能性變異體，其具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的起始胺基酸序列，其中所述功能性變異體與所述起始胺基酸序列相比，包含至少一個突變，所述突變選自由Y84A、Y84H、T85D、T86E、M92N、M92A、M92K、M92Q、 V128A、V128T、V129A、V129L、V129I、V129T、V130A和V130T組成的群組。在某些實施例中，所述融合蛋白包含一CD蛋白的功能性變異體，其具有SEQ ID NO：186或SEQ ID NO：187的起始胺基酸序列，其中所述功能性變異體與所述起始胺基酸序列相比，包含至少一個突變，所述突變選自由Y85A、Y85H、T86D、T87E、M93N、M93A、M93K、M93Q、V129A、V129T、V130A、V130L、V130I、V130T、V131A和V131T組成的群組。
在某些實施例中，所述CD的功能性變異體包含一胺基酸序列，選自SEQ ID NO：22、187、189、190、191、192、193和194組成的群組。在某些實施例中，所述CD的功能性變異體基本由一胺基酸序列組成，選自SEQ ID NO：22、187、189、190、191、192、193和194組成的群組。在某些實施例中，所述CD的功能性變異體由一胺基酸序列所組成，選自SEQ ID NO：22、187、189、190、191、192、193和194組成的群組。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一抗VEGFR2單域抗體或其功能性變異體，和一CD蛋白或其功能性變異體。在這些實施例的某些態樣，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，所述胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：SEQ ID NO：7、無HIS-標籤的SEQ ID NO：7(即，SEQ ID NO：7的第1-297位胺基酸)、SEQ ID NO：9、無HIS-標籤的SEQ ID NO：9(即，SEQ ID NO：9的第1-297位胺基酸)、SEQ ID NO：11和無HIS-標籤的SEQ ID NO： 11(即，SEQ ID NO：11的第1-297位胺基酸)。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一抗EGFR單域抗體或其功能性變異體，和一CD蛋白或其功能性變異體。在這些實施例的某些態樣，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，所述胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：SEQ ID NO：13、無HIS-標籤的SEQ ID NO：13(即，SEQ ID NO：13的第1-297位胺基酸)、SEQ ID NO：15、無HIS-標籤的SEQ ID NO：15(即，SEQ ID NO：15的第1-297位胺基酸)、SEQ ID NO：17和無HIS-標籤的SEQ ID NO：17(即，SEQ ID NO：17的第1-297位胺基酸，即SEQ ID NO：19)。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一抗HER2單域抗體或其功能性變異體，和一CD蛋白或其功能性變異體。在這些實施例的某些態樣，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，所述胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：SEQ ID NO：72、無HIS-標籤的SEQ ID NO：72(即，SEQ ID NO：72的第1-297位胺基酸)、SEQ ID NO：73、無HIS-標籤的SEQ ID NO：73(即，SEQ ID NO：73的第1-291位胺基酸)、SEQ ID NO：74和無HIS-標籤的SEQ ID NO：74(即，SEQ ID NO：74的第1-292位胺基酸)。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一抗HER3單域抗體或其功能性變異體，和一CD蛋白或其功能性變異體。在這些實施例的某些態樣，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：76和無HIS-標籤的SEQ ID NO：76(即，SEQ ID NO：76的第1-300位胺基酸)胺基酸序列。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一抗CEA單域抗體或其功能性變異體，和一CD蛋白或其功能性變異體。在這些實施例的某些態樣，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，選自由以下序列組成的群組：SEQ ID NO：78、無HIS-標籤的SEQ ID NO：78(即，SEQ ID NO：78的第1-293位胺基酸)、SEQ ID NO：80和無HIS-標籤的SEQ ID NO：80(即，SEQ ID NO：80的第1-296位胺基酸)。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一減敏(de-immunized)的單域抗體(例如：具有一個或多個減敏突變的單域抗體的功能性變異體)和/或一減敏的CD蛋白(例如：具有一個或多個減敏突變的CD蛋白的功能性變異體)。例如：在某些實施例中，所述融合蛋白包含在至少一個T細胞表位中的至少一個減敏突變，所述至少一個T細胞表位選自由表位1(SEQ ID NO：63)、表位2(SEQ ID NO：64)、表位3(SEQ ID NO：65)、表位4(SEQ ID NO：66)、表位5(SEQ ID NO：67)和表位6(SEQ ID NO：68)組成的群組。在某些實施例中，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，選自SEQ ID NO：93-185。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由一胺基酸序列所組成，選自SEQ ID NO：93-185。在某些實施例中，所述融合蛋白由一胺基酸序列所組成，選自SEQ ID NO：93-185。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含選自SEQ ID NO：93-181的胺基酸序列的第1-297位胺基酸。在某些 實施例中，所述融合蛋白基本由選自SEQ ID NO：93-181的胺基酸序列的第1-297位胺基酸所組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由選自SEQ ID NO：93-181的胺基酸序列的第1-297位胺基酸所組成。
在某些實施例中，所述融合蛋白基本由一胺基酸序列所組成，選自SEQ ID NO：182-185。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由SEQ ID NO：19的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由SEQ ID NO：19的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述融和蛋白基本由一胺基酸序列所組成，選自SEQ ID NO：19、182、183、184和185。
在某些態樣，本發明涉及一藥物組合物或藥物製劑，包含本發明的至少一種融合蛋白。在某些態樣，所述藥物組合物或藥物製劑包含本發明的至少一種融合蛋白和至少一種藥學可接受載劑或賦形劑。
在某些態樣，本發明涉及一種在一有需要的受試者中治療癌症的方法，所述方法包括對所述受試者施用有效量的本發明的至少一種融合蛋白或藥物組合物。在某些實施例中，所述至少一種融合蛋白或藥物組合物係注射施用。
在某些實施例中，所述在有需要的受試者中治療癌症的方法還包括對所述受試者施用一有效量的胞嘧啶脫氨酶受質。在某些實施例中，所述受質包括一5-氟尿嘧啶 的前藥。在某些實施例中，所述5-氟尿嘧啶前藥選自由5-氟胞嘧啶(5-FC)、Toca FC、5-FC類似物以及它們的光活化性(photoactivatable)化合物、鹽或酯所組成的群組。在某些實施例中，對受試者施用的前藥是5-FC。
在某些實施例中，所述癌症係選自由結腸癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、基底細胞癌、鮑溫病、子宮頸癌、眼表鱗狀瘤、黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、前列腺癌、結直腸癌、頭頸癌、膽管癌、食道癌、骨癌、子宮內膜癌、卵巢癌、軟組織肉瘤和Merkel細胞癌組成的群組。在某些實施例中，所述癌症係一實體腫瘤。在某些實施例中，所述實體腫瘤係結腸癌、結直腸癌、胰腺癌或頭頸癌。
在某些態樣，本發明涉及一核酸分子，所述核酸分子包含一編碼前述實施例中任一個的融合蛋白的的核酸序列。
在某些態樣，本發明涉及一包含一經密碼子優化的核酸序列的核酸分子，該經密碼子優化的核酸序列編碼前述實施例中任一個的任何融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體。在某些態樣，本發明涉及一包含一經密碼子優化的核酸序列的核酸分子，該經密碼子優化的核酸序列編碼前述實施例中任一個的任何融合蛋白的CD或其功能性變異體。
在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：8的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含 SEQ ID NO：10的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：12的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：14的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：16的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：18的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：20的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：195的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：196的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：197的核酸序列。在某些實施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：198的核酸序列。
在某些態樣，本發明涉及一載體，所述載體包含編碼前述實施例中任一個的融合蛋白的核酸。
在某些態樣，本發明涉及一宿主細胞，所述宿主細胞包含編碼前述實施例中任一個的融合蛋白的載體或核酸。
在某些態樣，本發明涉及一製備前述實施例中任一個所述的融合蛋白的方法，所述方法包括在一宿主細胞中表達一編碼所述融合蛋白的核酸。在某些實施例中，所述宿主細胞係經細胞工程改良，以改善具有雙硫鍵的蛋白的活性、細胞質生產和/或穩定性。
在某些實施例中，所公開的製備融合蛋白的方法產生了一具有雙硫鍵的融合蛋白，該融合蛋白的活性、細胞質生產和/或穩定性與非經細胞工程改良的相同宿主細胞 所產生的融合蛋白相比增加了選自2倍、5倍、10倍、20倍、50倍和100倍的量。
在某些實施例中，所述宿主細胞是一非哺乳動物細胞。在某些實施例中，所述宿主細胞是一酵母菌細胞或一細菌細胞。在某些實施例中，所述宿主細胞是一大腸桿菌細胞、一古細菌細胞或一放線菌細胞。在某些實施例中，所述宿主細胞是一大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株提供一形成雙硫鍵的細胞質環境。在某些態樣，所述細胞質環境係通過優化硫氧還蛋白和/或穀胱甘肽途徑以及/或者表達細胞質雙硫鍵異構酶來實現。在某些實施例中，所述宿主細胞係經一染色體基因套持續地表達細胞質雙硫鍵異構酶的大腸桿菌菌株。在這些實施例的某些態樣，所述細胞質雙硫鍵異構酶是DsbC。在某些態樣，所述大腸桿菌菌株是SHuffle® T7、SHuffle® T7 Express、SHuffle® Express、OrigamiTM或Rosetta-gamiTM。
第1A圖顯示了全抗體-CD-CD融合蛋白的蛋白設計。第1B圖顯示了在哺乳動物細胞中表達的全抗體-CD融合蛋白的蛋白設計和表達情形。
第2A圖顯示了抗原靶向區-CD融合蛋白的載體設計。第2B圖總結了所測試的融合蛋白的表達情形和功能性分析結果；v=經驗證；N/D=未經檢測；N/A=無相 關數據。第2C圖和2D顯示了本發明的幾種VHH-CD融合蛋白的表達情形。I0：誘導前的大腸桿菌培養物。I5：誘導後5小時的大腸桿菌培養物。細胞質(C)：破菌液的可溶性部分。包涵體(I)：破菌液的不溶性部分。M：標誌物。
第3圖顯示了經小規模純化的幾種單域抗體-CD融合蛋白的SDS-PAGE分析。M=標誌物。
第4A圖和第4B圖顯示了幾種單域抗體-CD融合蛋白的粒徑排阻層析分析。
第5A圖和第5B圖顯示了幾種單域抗體-CD融合蛋白的胞嘧啶脫氨酶(CDase)活性。
第6A圖和第6B圖顯示了以ELISA測定單域抗體-CD融合蛋白與人類VEGFR2和人類EGFR(第6A圖)以及人類HER2、HER3和CEA(第6B圖)的結合能力。OD=吸光值。
第7A圖和第7B圖顯示了經大規模純化的單域抗體CD融合蛋白3VGR19-CD-H(第7A圖)和7D12-CDome3(第7B圖)的純化情形。LS=低速上清液；F1=鎳瓊脂醣凝膠管柱的流通液(flow through)1；F2=鎳瓊脂醣凝膠管柱的流通液2；M=標誌物；Q1=第1離子交換管柱；Q2=第2離子交換管柱；QF1=第1離子交換管柱的流通液；QF2=第2離子交換管柱的流通液；X1=分離液1；X2=分離液2。
第8圖顯示了單域抗體-CD(3VGR19-CD)融合蛋白 在SHuffle® T7 Express和T7 Express細胞中的表達情形。S=上清液(細胞質)；P=沉澱(包涵體)；M=標誌物；I0=誘導前的大腸桿菌培養物；I5=誘導後5小時的大腸桿菌培養物。與融合蛋白對應的亮帶以箭頭標示。
第9A圖(MDA-MB-231)和第9B圖(A431)顯示了本發明的幾種融合蛋白在表達抗原的細胞中的細胞毒性測定結果。
第10A圖顯示了以融合蛋白CDoem3-H和7D12-CDoem3-H在表現EGFR的細胞中的細胞毒性測定的結果。第10B圖顯示了融合蛋白CDoem3和7D12-CDoem3在表現EGFR的細胞中的細胞毒性測定的結果。NP=陰性蛋白對照組(CDoem3-H)。
第11A圖顯示了以7D12-CDoem3-H和7D12-CDoem3與5-氟胞嘧啶(5-FC)組合治療後的A431異種移植模型的腫瘤生長曲線；第11B圖顯示了以7D12-CDoem3-H和7D12-CDoem3與5-FC組合治療後的A431異種移植模型的腫瘤重量。
第12圖顯示了7D12-CDoem3-H的單一突變變異體的表達情形和功能性分析結果。
第13A圖和第13B圖顯示了7D12-CDoem3-H的多突變變異體的表達情形和功能性分析結果。
第14圖顯示了7D12-CDoem3和7D12-CDoem3變異體的T細胞增殖和IL-2 ELISpot反應的統整結果。
第15圖顯示了7D12-CDoem3和7D12-CDoem3 變異體的胞嘧啶脫氨酶活性和對人類EGFR的結合能力。
本發明提供了包含一單域抗體(sdAb)或其功能性變異體與一胞嘧啶脫氨酶(CD)或其功能性變異體的雙功能融合蛋白。本發明描述製備具有良好的生物學活性和優異產量(例如：約1g/L)、適於商業用途的融合蛋白的方法。本發明的融合蛋白可以作為細胞質蛋白，在大腸桿菌中以高產量表達，且在經細胞工程改良，優化細胞質中的雙硫鍵形成的大腸桿菌菌株中，能夠進一步改善蛋白穩定性。本文還提供了在癌症和其它增殖性疾病的治療中使用本發明的融合蛋白的組合物和方法。
本發明顯示本發明的各種單域抗體-CD融合蛋白是穩定的，且具有對癌細胞的細胞毒性效果。可溶性蛋白可通過SDS-PAGE檢測到，且於SEC-HPLC中顯示出相對高純度。在產出的所有融合蛋白中，CD和單域抗體部分均維持了其原有功能。5-FC向5-FU的轉化測定證明了CD活性，而ELISA呈現融合蛋白與人類VEGFR2、EGFR、HER3、HER2或CEA的結合。通過在癌細胞株中的細胞毒性測試，單域抗體-CD融合蛋白證明了其能夠標靶並結合VEGFR2和EGFR，並且將無毒性的5-FC轉化為毒性的5-FU，從而殺死表達抗原的癌細胞。在A431小鼠異種移植模型中，單域抗體-CD融合蛋白證實可藉由抑制和壓制腫瘤生長而具功能性。
本發明所述的方法，表達數種具有良好的生物 學活性、優異產量(例如：約1g/L)和適於商業用途的融合蛋白。
本發明還提供了可穩定生產且展示出CD活性和抗原結合活性的減敏單域抗體-CD融合蛋白。
除非具體說明或從上下文顯而易見，如本發明所用，術語“或”應理解為包含性。除非具體說明或從上下文顯而易見，如本文所用，術語“一/一個/一種”(“a”,“an”)和“所述/該”(“the”)理解為單數或複數。
此外，“和/或”在本發明使用時應同時或不與另一個同時被當作兩個指定的特徵或成分。因此，在本文諸如“A和/或B”等短語中所用的術語“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”(僅)和“B”(僅)。
除非具體說明或從上下文顯而易見，在本發明使用時，術語“約”應理解為處於本領域正常容許範圍內，例如在平均值(例如：聲明值)的兩個標準差內。“約”可以理解為聲明值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%以內。除非由上下文顯而易見，本發明提供的所有數值由術語“約”修飾。
本文提供的任何組合物或方法可以與本文提供的任何一種或多種其它組合物或方法結合應用。
酶的“活性”是對其催化反應的能力(即，“發揮功能”)的量度，且可以表達為反應的產物產生的速率。例如：酶活性可表示為每單位時間或每單位的酶產生的產物的量(例如：濃度或重量)，或者以親和力或解離常數來表示。 “胞嘧啶脫氨酶活性”、“胞嘧啶脫氨酶的生物活性”或“胞嘧啶脫氨酶的功能性活性”在本文中可互換使用，其是根據標準技術在體內或體外測定，CD或其功能性變異體或者本發明的融合蛋白對於CD受質的活性。CD活性的測定是本領域已知的，例如：CD活性可以通過5-FC向5-FU、或者胞嘧啶向尿嘧啶轉化的速率來測量。5-FC、5-FU、胞嘧啶和尿嘧啶的檢測可以通過“實施例”章節中描述的方法、通過層析色譜和/或通過本領域已知的其它方法來進行。
在本發明中，“基本由...組成”或“基本以...組成”允許存在多於所敘述的內容，條件是所敘述的內容的基本特性或新特性不被多於所敘述的內容所改變，但是先前技術實施例排除在外。例如：“基本由”所敘述的序列“組成”的多肽/蛋白或核酸序列可以分別包括不破壞所敘述序列的生物學活性的一個或多個額外的胺基酸或核酸。
如本文所用，“融合多肽”或“融合蛋白”是指包含並非天然存在於同一蛋白中的兩個或多個不同多肽或其活性片段的蛋白。融合蛋白具有單個連續多肽骨架，其可選地具有在兩個或多個不同多肽中的任兩者之間的連接胜肽。該融合蛋白的製備，可以利用分子生物學的常規技術，將兩個或多個基因在框架內連接在單個核酸序列內，然後在可產生融合蛋白的條件下，將該核酸表達於適當的宿主細胞中。
如本文所用，“功能性變異體”是指與多肽或蛋白具有實質性或顯著的序列相似度並且保留該多肽或蛋白 的至少一種生物學活性的多肽或蛋白的變異體。多肽或蛋白的功能性變異體可以通過本領域已知手段基於本發明來製備。功能性變異體可以包括對多肽或蛋白的胺基酸序列的一個或多個修飾。在某些實施例中，所述修飾改變多肽或蛋白的一種或多種物化性質，例如：通過改善多肽或蛋白的熱穩定性、改變受質特異性、改變最適pH和減少免疫原性等。在某些實施例中，所述修飾改變多肽或蛋白的一種或多種生物學性質，條件是其不會破壞或損毀多肽或蛋白的所有生物學性質即可。
根據本發明的某些實施例，多肽或蛋白的功能性變異體包含對多肽或蛋白的一個或多個胺基酸進行置換，該置換不會顯著影響多肽或蛋白的生物學活性，優選為保守性胺基酸置換。保守性胺基酸置換包括但不限於：鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)內的胺基酸置換、極性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)內的胺基酸置換、疏水性胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)組內的胺基酸置換、芳香性胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)組內的胺基酸置換以及小胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)組內的胺基酸置換。非標準或非天然胺基酸(例如：4-羥基脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸和α-甲基絲氨酸)也可以或者作為另選使用來置換多肽或蛋白中的標準胺基酸序列。
根據本發明的某些實施例，多肽或蛋白的功能性變異體包含對該多肽或蛋白的一個或多個胺基酸的缺失 和/或插入。例如：CD的功能性變異體可以包括對CD的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸的缺失和/或插入。例如：單域抗體的功能性變異體可以包括對單域抗體的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸的缺失和/或插入。在某些實施例中，單域抗體的功能性變異體可以包括對單域抗體的框架(FR)區的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸的缺失和/或插入。在某些實施例中，多肽或蛋白的功能性變異體包括第一個甲硫氨酸的缺失。
根據本發明的某些實施例，多肽或蛋白的功能性變異體包含對母蛋白的取代和缺失和/或插入。在某些態樣，置換是保守性置換，且/或缺失和/或插入是小的缺失和/或小的插入。
如本發明所用，“單域抗體”、“sdAb”、“sdAb蛋白”、“VHH”(重鏈抗體的變異區)和“納米抗體(nanobody)”可互換使用。如本發明所用，“CD”、“CDase”和“CD蛋白”可互換使用。
術語“同一”或“相似度”百分比在兩個或多個核酸或多肽的情況下，是指兩個或多個序列或亞序列在以最 大對應性進行比較和比對(必要時引入空位)時，為相同或有特定百分比的核苷酸或胺基酸序列為相同(不將任何保守性胺基酸置換認為是序列相同的一部分)。術語“基本同一”是指兩個或多個序列或亞序列具有與採用下文所述的預設參數使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法或者通過手動比對並目視檢查所測定相同的所指明百分比的胺基酸殘基或核苷酸(即，在比較窗或者指定的區域中針對最大對應性進行比較並比對(必要時引入空位)時，在所指明區域的至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的相似度)。該定義包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所述，演算法能將空位等計算在內。當未指明時，相似度或基本相似度在參比序列的整個長度上確定。當指明時，相似度可以在長度為至少約10個胺基酸或核苷酸的區域、長度為至少約25個胺基酸或核苷酸的區域或者在長度為50-100個胺基酸或核苷酸的區域中進行確定。
相似度百分比可以採用序列比較軟體或演算法或者通過目視檢查來測定。本領域中已知可以用來獲得胺基酸或核苷酸序列的比對的各種演算法和軟體(例如參見，Karlin等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：2264-2268，如Karlin等，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：5873-5877中所改良)，以及NBLAST和XBLAST程式(Altschul等，1991,Nucleic Acids Res., 25：3389-3402)。在某些實施例中，可以使用如Altschul等，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述的Gapped BLAST、BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschul等，1996,Methods in Enzymology,266：460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或MegAlign(DNASTAR)。
術語“分離的”在用來描述蛋白或核酸時，是指基本不含存在于其天然環境中的其它成分的分子。例如：分離的蛋白基本不含來自其所源自的細胞或組織來源的細胞物質或其他蛋白。術語“分離的”也指其中的分離的蛋白具一定純度而足以作為藥物組合物施用的製劑，或至少70%-80%(w/w)純度、更優選至少80%-90%(w/w)純度、甚至更優選至少90%-95%(w/w)純度、且最優選至少95%、96%、97%、98%、99%或100%(w/w)純度。
如本文所用，在比較資料的上下文中的“參比”是指比較的標準物。
如本文所用，“特異性結合”是指一試劑(例如：單域抗體或其功能性變異體)可識別並結合一分子(例如：VEGFR2、EGFR)，但基本不會識別和結合樣品中的其它分子(例如：生物樣品中的其它分子)。例如：特異性結合的兩個分子形成在生理學條件下相對穩定的複合體。特異性結合的特徵在於高親和力和低至中等的結合位數量，而非特異性結合有所區別，後者通常具有低的親和力以及中等至高的結合位數量。如本文所用，“特異性結合至”或“對...具有特 異性”是指標靶和抗體(例如：單域抗體或其功能性變異體)之間的可測定且可再現的相互作用，例如結合；該結合取決於在一混雜分子群體(包含生物分子)中，存在著一標靶。例如：可特異性結合標靶(也可以是表位)的單域抗體或其功能性變異體，以比所述單域抗體或其功能性變異體結合其它標靶更高的親和力、親留力、更容易和/或持續時間更長地與該標靶結合。在一個實施例中，單域抗體或其功能性變異體與不相關標靶的結合程度低於該單域抗體或其功能性變異體與其標靶所測定的結合的約10%(例如：通過放射免疫測定(RIA))。在某些實施例中，特異性結合標靶的單域抗體或其功能性變異體的解離常數(KD)<1x10-6M、<1x10-7M、<1x10-8M、<1x10-9M或者<1x10-10M、<1x10-11M、<1x10-12M。在某些實施例中，單域抗體或其功能性變異體特異性結合在蛋白上來自不同物種的蛋白間保守的表位。在另一個實施例中，特異性結合可以包括專一性結合(即，其僅結合一個蛋白)，但這並非必須。
如本文所用，“受試者”是指哺乳動物，包括但不限於人或非人哺乳動物，例如牛、馬、犬、羊或貓科動物。
本文所提供的範圍應理解為簡略表達，且因此涵蓋該範圍內的所有值。例如：1至50的範圍應理解為包括選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(包 括其非整數)的任何位數、位數的組合或者次範圍。
術語“腫瘤”或“贅生物(neoplasm)”是指含有贅生性細胞的異常組織團塊。贅生物和腫瘤可以是良性的、惡化前的和惡性的。
術語“癌症”或“惡性贅生物”是指表現出不受控的生長、侵入臨近組織且常常轉移至身體的其它部位的細胞。這包括血液學和淋巴的癌症。
術語“結合親和力”一般指分子(例如：單域抗體)的單個結合位點與其結合對象(例如：抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指出，如本文所用，“結合親和力”、“結合至”、“結合”或“與...結合”是指結合對的成員(例如：抗體Fab片段和抗原)之間的1：1相互作用的內在結合親和力。分子X對其結合對象Y的親和力一般可以通過解離常數(KD)表示。親和力可以通過本領域已知的普通方法(包括本文所述的那些方法)來測定。低親和力抗體通常緩慢地與抗原結合，且傾向於容易解離，而高親和力抗體通常與抗原結合更快，且傾向於更長久地維持結合。測定結合親和力的各種方法是本領域已知的，且出於本發明的目的可以使用其中任何一種。測定結合親和力(例如：結合強度)的具體說明性和示例性實施例在下文描述。
在“先前技術”和整個說明書中引用或描述了各種出版物、文獻和專利；這些參考文獻的每一個在本文通過援引以其整體併入。對包括在本說明書中的檔、法案、材料、裝置或文獻等的討論是出於提供本發明背景的目的。這些討 論並非承認這些材料的任一種或所有構成了關於所公開或要求保護的任何發明的現有技術的一部分。
本發明提供了包含式I或式II的融合蛋白，其中：N-(L)n-C (式I)；C-(L)n-N (式II)；其中，N為一單域抗體(sdAb)或其功能性變異體，L為一連接胜肽，n=0-50，且C為一胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由式I組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由式I組成。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由式II組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由式II組成。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含式I，如此所述連接胜肽的C端或所述單域抗體或其功能性變異體的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在所述連接胜肽，所述單域抗體或其功能性變異體的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在所述連接胜肽，且所述單域抗體或其功能性變異體的C端與所述連接胜肽的N端融合，而所述連接胜肽的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。
在其他實施例中，所述融合蛋白包含式II，如此所述連接胜肽的C端或所述CD蛋白或其功能性變異體的C端與所述單域或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在所述連接胜肽，所述CD蛋白單域抗體或其 功能性變異體的C端與所述單域抗體或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在所述連接胜肽，且所述CD蛋白或其功能性變異體的C端與所述連接胜肽的N端融合，而所述連接胜肽的C端與所述單域抗體或其功能性變異體的N端融合。
本發明的融合蛋白的示例性單域抗體
單域抗體包含一具有3個互補決定區(C DR)的單一變異區。單域抗體傳統上包含駱駝類(camelid)僅有重鏈的抗體(HcAb)的可變片段，即，重鏈抗體的重鏈的變異區，VHH。某些VHH多肽也以商標名Nanobody®(Nb；Ablynx)表示。然而，在本發明中，使用術語奈米抗體(nanobody)不是將單域抗體限制為由Ablynx所提供的Nanobody®。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自駱駝、羊駝(alpacas)或駱馬(llamas)的僅有重鏈IgG類抗體。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體是通過CDR嫁接產生的細胞工程改良多肽。例如：所述單域抗體或其功能性變異體是通過將源自駱駝類的單域抗體的CDR區域的全部或某一些替代為具有所需標靶的其它已知抗體的CDR區域而產生。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體是見於鯊魚中的僅有重鏈的抗體的重組衍生物。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體利用本領域通常技術通過合成生成。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體是人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；參見例如：美國專利 第6,248,516 B1號)。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體是來自駱駝類的人源化VHH。如本文所用，術語“人源化”單域抗體，是指單域抗體在天然存在的VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸序列，被來自人的常規四鏈抗體的VH結構域對應位置處的一個或多個胺基酸序列所替換。這種替換可以通過本領域通常方法來進行，例如：單域抗體的框架區(FR)可以由人類變異區的框架區替換。
CDR對於單域抗體或其功能性變異體的表位識別極為重要。在不干擾單域抗體或其功能性變異體識別並結合其同源表位的情況下，可以對構成CDR的胺基酸序列進行改變。例如：可以進行不會影響標靶表位識別然而增加單域抗體或其功能性變異體對該表位的結合親和力的改變。在某些實施例中，這些改變是保守胺基酸取代和/或小的缺失或小的插入。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含任一種僅有重鏈IgG類抗體的變異區。單一變異區包含3個互補決定區(CDR)。所述單域抗體或其功能性變異體可以為具有(通式)結構FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的免疫球蛋白和/或多肽，其中FR1、FR2、FR3和FR4分別指框架區1、2、3和4，且其中CDR1、CDR2和CDR3分別指互補決定區1、2和3。所述單域抗體或其功能性變異體的胺基酸序列的編號根據Kabat等("Sequence of proteins of immunological interest," US Public Health Services,NIH Bethesda,Md.,Publication No.91)對VH結構域的通用編號。根據該編號，單域抗體的FR1包含在1-30位的胺基酸序列，單域抗體或其功能性變異體的互補決定區1(CDR1)包含在31-35位的胺基酸序列，單域抗體或其功能性變異體的FR2包含在36-49位的胺基酸序列，單域抗體或其功能性變異體的互補決定區2(CDR2)包含在50-65位的胺基酸序列，單域抗體或其功能性變異體的FR3包含在66-94位的胺基酸序列，單域抗體或其功能性變異體的互補決定區3(CDR3)包含在95-102位的胺基酸序列，且單域抗體或其功能性變異體的FR4包含在103-113位的胺基酸序列。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體是半衰期延長的單域抗體。增加多肽的半衰期的方法是本領域通常知識。
本發明的融合蛋白作為治療劑的有效性取決於適當的單域抗體標靶的選擇。所述標靶可以是目前已知或者正在被認知的任何種類，並且包括肽和非肽(例如：細胞表面脂質、醣類或其他轉譯後修飾)。
在一個實施例中，本發明的單域抗體或其功能性變異體與癌細胞表面上的胞外標靶結合。在一個實施例中，單域抗體或其功能性變異體與標靶結合，其中所述標靶選自細胞膜分子、分泌性分子和胞內分子。
在某些實施例中，標靶選自由以下組成的群 組：EGFR、5T4、A33、AFP、β-連環蛋白、BRCA1、BRCA2、C242、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23、CD30、CD3、CD37、CD40、CD44、CD5、CD51、CD52、CD56、CD64、CD74、CD80、CDCP1、c-KIT、COX-2、cMET、CSF1R、CTLA-4、EGF2、ErbB2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HER3、HIF-Ia、HLA-DR、IGF-IR、mTOR、NPC-1C、P53、PDGFRα、PDGFRβ、PLGF、PSA、RGMa、RoN、TNF、TP53、TPD52、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、FAP、醣蛋白75、TAG-72、MUC16、NR-LU-13、SLAMF7、EGP40、BAFF、PRL-3、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、MART-1、gp100、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、hTERT、MCC、Mum-1、ERBB2IP、EpCAM、TfR、整合素α6β4、HGFR、PTP-LAR、CD147、CDCP1、CEACAM6、JAM1、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、間皮素、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-1、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
在某些實施例中，標靶選自由以下組成的組：EGFR、c-KIT、cMET、HER2、HER3、FGFR1、FGFR2、 FGFR3、IGF-IR、P53、PDGFRα、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、MUC16、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、間皮素、EpCAM、整合素α6β4、CEACAM6、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-1、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
在某些實施例中，所述標靶為VEGFR2、EGFR、CEA、HER2或HER3。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體靶向EGFR。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自J.Biomol.Screen.2009 Jan；14(1)：77-85中所描述的VHH122。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自Structure 21,1214-1224,July 2,2013.PDB：4KRM_I和美國專利公開第US2009/0252681號所描述的7D12。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體靶向VEGFR2。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自Mol.Immunol.2012 Feb；50(1-2)：35-41中所描述的3VGR19。在某些實施例 中，所述單域抗體或其功能性變異體源自Mol.Immunol.2012 Feb；50(1-2)：35-41所描述的4VGR17。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自Mol.Immunol.2012 Feb；50(1-2)：35-41所描述的4VGR38。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體靶向HER2。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自美國專利公開US 2011/0059090中所描述的2D3、5F7或47D5。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體靶向HER3。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自Version 2.F1000Res.2018；7：57中所描述的BCD090-M2(PDB ID：6EZW)。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體結合CEA。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自於US20160280795A1、FEBS J.2009 Jul；276(14)：3881-93和J Nucl Med.2010 Jul；51(7)：1099-106中描述的ABS29544.1或NbCEA5。
本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體的生物學活性能通過確定其與標靶或其表位的結合親和力來評估。在某些實施例中，所述融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體對標靶或其表位的親和力可以為例如約1皮莫耳濃度(pM)至約100微莫耳濃度(μM)(例如：約1皮莫耳濃度(pM)至約1納莫耳濃度(nM)、約1nM至約1微莫耳濃度(μM)、或約1μM至約100μM)。在某些實施例中，所述融 合蛋白的單域抗體或其功能性變異體能以小於或等於1納莫耳濃度(例如：0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM、0.025nM、0.01nM、0.001nM，或者前述值的任意兩個所限定的範圍)的KD與標靶(例如：VEGFR2、EGFR、HER2、HER3或CEA)結合。在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體能以小於或等於200pM(例如：190pM、175pM、150pM、125pM、110pM、100pM、90pM、80pM、75pM、60pM、50pM、40pM、30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、1pM，或者前述值的任意兩個所限定的範圍)的KD與標靶結合。本發明公開的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體對所關注的抗原或表位的親和力，可以使用任何現有技術認可的測定來檢測。這些方法包括例如螢光活化細胞分選(FACS)、可分離珠(例如：磁珠)、表面等離子共振(SPR)、溶液相競爭(KINEXA.TM.)、抗原篩選(antigen panning)和/或ELISA(參見例如：Janeway等(編)，Immunobiology，第5版，Garland Publishing,New York,N.Y.,2001)。
用於製備本發明的融合蛋白的單域抗體(或其功能性變異體)和核酸可以如下文實施例所描述的或者通過該領域具通常知識者已知的任何方法來製備。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含、基本由下述組成或者由下述組成：一CDR1選自由SEQ ID NO：28、31和34組成的群組；一CDR2，選自 由SEQ ID NO：29、32和35組成的群組；以及一CDR3，選自由SEQ ID NO：30、33和36組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含、基本由下述組成或者由下述組成：一CDR1；選自由SEQ ID NO：37和40組成的群組；一CDR2，選自由SEQ ID NO：38和41組成的群組；以及一CDR3，選自由SEQ ID NO：39和42組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含、基本由下述組成或者由下述組成：一CDR1，選自由SEQ ID NO：199、202和205組成的群組；一CDR2，選自由SEQ ID NO：200、203和206組成的群組；以及一CDR3，選自由SEQ ID NO：201、204和207組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含、基本由下述組成或者由下述組成：一序列為SEQ ID NO：208的CDR1，一序列為SEQ ID NO：209的CDR2，以及一序列為SEQ ID NO：210的CDR3。
在某些實施例中，一單域抗體或其功能性變異體包含、基本由下述組成或者由下述組成：一CDR1，選自由SEQ ID NO：211和214組成的群組；一CDR2，選自由SEQ ID NO：212和215組成的群組；以及一CDR3，選自由SEQ ID NO：213和216組成的群組。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自實施例中所公開的抗VEGFR2單域抗體群組，即3VGR19(SEQ ID NO：23)、4VGR17(SEQ ID NO：24) 和4VGR38(SEQ ID NO：25)。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自實施例中所公開的抗EGFR單域抗體群組，即VHH122(SEQ ID NO：26)和7D12(SEQ ID NO：27)。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自實施例中所公開的抗HER2單域抗體群組，即2D3(SEQ ID NO：69)、5F7(SEQ ID NO：70)和47D5(SEQ ID NO：71)。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自實施例中所公開的抗HER3單域抗體群組，即BCD090-M2(SEQ ID NO：75)。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體選自實施例中所公開的抗CEA單域抗體，即抗CEA單域抗體(ABS29544.1)(SEQ ID NO：77)和NbCEA5(SEQ ID NO：79)。
在某些實施例中，本發明公開的任何單域抗體或其功能性變異體與酵母菌CD蛋白或其功能性變異體融合，所述酵母菌CD蛋白或其功能性變異體包含SEQ ID NO：21(野生型CD，無N端甲硫氨酸)、SEQ ID NO：22(具有點突變A22L/V107I/I139的SEQ ID NO：21變異體)、SEQ ID NO：186(野生型CD，包括N端甲硫氨酸)、SEQ ID NO：187(具有點突變A23L/V108I/I140L的SEQ ID NO：186變異體)或者任何前述胺基酸序列的功能性變異體。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一處於C端的組氨酸標籤(HIS-標籤)，例如6-HIS標籤(SEQ ID NO：6)。在某些實施例中，所述融合蛋白經連接胜肽(例如：GSS) 與HIS-標籤連接。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體可以經部分或完全人源化以用於預防和/或治療與該單域抗體的標靶的存在有正相關性的病況。一般而言，人源化涉及將單域抗體或其功能性變異體的源自駱駝類的框架區和變異區的所有或一部分用人類對應序列替換，其目的是減少單域抗體在治療應用中的致敏性。在某些情形中，駱駝類免疫球蛋白的FR殘基被相應人類殘基所替換。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含在以下T細胞表位上的一個或多個突變：
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位1(SEQ ID NO：63)修飾的序列X1X2QX3X4GX5LRL，其中，X1可以被V置換，X2可以被A置換，X3可以被V置換，X4可以被D置換，和/或X5可以被D或E置換。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位2(SEQ ID NO：64)修飾的序列LX1X2EDX3X4X5Y，其中，X1可以被R、A、D、S或T置換；X2可以被A、D或E置換；X3可以被D、E、G、H或Q置換；X4可以被D或E置換；和/或X5可以被V、A、T、R、 Q或N置換。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位3(SEQ ID NO：65)修飾的序列X1YYCAAAAGS，其中X1可以被V、A、T、R、Q或N置換。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位1(SEQ ID NO：63)修飾的序列X1X2QX3X4GSLRL，其中，X1可以被V置換，X2可以被A置換，X3可以被V置換，和/或X4可以被D置換。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位2(SEQ ID NO：64)修飾的序列LX1X2EDTAX5Y，其中，X1可以被R或T置換、X2可以被A置換、和/或X5可以被V或R置換。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含從表位3(SEQ ID NO：65)修飾的序列X1YYCAAAAGS，其中X1可以被V、A或R置換。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含具有序列ESGGGX1X2QX3GGSL的FR1序列，其中，X1為S或V，X2為V或A，且X3為A、T或V。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體包含具有修飾序列MNSLX1X2EDTAX3YYCAA的FR3序列，其中X1為K、R或T；X2為P或A；和X3為R或V。
單域抗體胺基酸序列與人類家族III VH胺基酸序列緊密相關。因此，在某些實施例中，產生了“人源化”單域抗體形式。在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體源自HCAb，該HCAb是通過用一標靶多肽對一已消除 了內源性鼠科抗體表達並導入了人轉基因的轉基因小鼠進行免疫而產生。HCAb小鼠公開於美國專利8,883,150號、美國專利8,921,524號、美國專利8,921,522號、美國專利8,507,748號、美國專利8,502,014、US 2014/0356908、US2014/0033335、US2014/0037616、US2014/0356908、US2013/0344057、US2013/0323235、US2011/0118444和US2009/0307787中，所有均通過援引併入本文，因為它們都公開了關於僅有重鏈的抗體及其在轉基因小鼠中的生產。HCAb小鼠經免疫且所得的免疫活化(primed)的脾細胞與鼠科骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤。然後所得HCAb可以通過以對應的人序列替換鼠科CH2和CH3區，從而完全人源化。
製備本發明的融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體的另外的方法是本領域通常知識。例如：一種獲得單域抗體或其功能性變異體的方法包括：(a)將駱駝類用一種或多種抗原免疫；(b)從經免疫的駱駝類分離周邊淋巴細胞，獲得總RNA並合成對應的cDNA；(c)構建編碼單域結構域的cDNA片段的基因庫；(d)使用PCR將步驟(c)中獲得的編碼單域抗體結構域的cDNA轉錄為mRNA，將mRNA轉化為核糖體或噬菌體表現形式，並通過核糖體表現或噬菌體表現篩選來選擇單域抗體結構域；和(e)在合適的載體中表達該單域抗體結構域，以及可選地將表達的單域抗體結構域純化。其他示例性方法在Revets等，2015 Expert Opin. Biol.Ther.(2005)5(1)：111-124,“Generation and production of recombinant nanobodies.”中提供的任一篇參考文獻中有描述。另外，Harbour Biomed提供了人類重鏈齧齒類技術和人類重鏈構建體的平臺，描述於美國專利9,353,179、9,346,877和8,921,522以及歐洲專利1776383和1864998中，所有均通過援引併入本文。Ablynx還提供了可以用來製備本發明的化合物的奈米抗體的來源。
關於奈米抗體的進一步描述，可以參考以下參考文獻(其各自通過援引併入本文)：Muyldermans的綜述文章(Reviews in Molecular Biotechnology 74：277-302,2001)，以及作為一般背景技術提及的以下專利申請：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/341031；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；National Research Council of Canada的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(對應於EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，和Ablynx N.V.的其它公佈的專利申請。亦可參考前述申請中提及的其它技術，特別是國際申請WO 06/040153的第41-43頁提到的參考文獻列表，所述列表和參考文獻通過援引併入本文。如這些參考文獻中所述，奈米抗體(特別是VHH序列和部分人源化奈米抗體)的特徵特別在於一個或多個框架序列中的"Hallmark序列"。在例如WO 08/101985和WO 08/142164中，可以看到對奈米抗體(包括奈米抗體的人源化和/或駱駝化)以及其他修飾、部分或片段、衍生物或者“奈米抗體融合物”、多價構結構(包括連接胜肽序列的某些非限制性實例)和增加奈米抗體的半衰期的不同修飾以及它們的製備。對於奈米抗體的其它一般性描述，參考WO 08/020079(第16頁，第61頁第24行至第98頁第3行)。
本發明的融合蛋白的示例性連接胜肽
本文所用的術語“連接胜肽”、“多肽連接胜肽”、“連接胜肽結構”和“連接胜肽區”(簡寫為“L”)可互換使用並且指長度為約1至100個胺基酸的寡肽或多肽區，其將本發明的融合蛋白的多肽連接起來(例如：單域抗體或其功能性變異體和CD蛋白或其功能性變異體)。本發明的融合蛋白可以包含一個或多於一個連接胜肽。所述連接胜肽可以由柔性殘基如甘氨酸和蘇氨酸組成，從而相鄰蛋白結構區相對于彼此自由移動。在某些實施例中，所述連接胜肽包含1至20、1至15、1至10或者1至9個胺基酸。在某些實施例中， 所述連接胜肽包含1至9個胺基酸，例如：1、2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸。在某些實施例中，所述連接胜肽是長度為約6至約30個胺基酸的肽。在這些實施例的各態樣中，所述連接胜肽的長度可以為例如至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或30個胺基酸。在這些實施例的其它態樣中，所述連接胜肽的長度可以為例如至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29或至多30個胺基酸。在這些實施例的其它態樣中，所述連接胜肽的長度可以為約6至約8、約6至約10、約6至約12、約6至約14、約6至約16、約6至約18、約6至約20、約6至約22、約6至約24、約6至約26、約6至約28、約6至約30、約8至約10、約8至約12、約8至約14、約8至約16、約8至約18、約8至約20、約8至約22、約8至約24、約8至約26、約8至約28、約8至約30、約10至約12、約10至約14、約10至約16、約10至約18、約10至約20、約10至約22、約10至約24、約10至約26、約10至約28、約10至約30、約12至約14、約12至約16、約12至約18、約12至約20、約12至約22、約12至約24、約12至約26、約12至約28、約12至約30、約14至約16、約14至約18、 約14至約20、約14至約22、約14至約24、約14至約26、約14至約28、約14至約30、約16至約18、約16至約20、約16至約22、約16至約24、約16至約26、約16至約28、約16至約30、約18至約20、約18至約22、約18至約24、約18至約26、約18至約28、約18至約30、約20至約22、約20至約24、約20至約26、約20至約28、約20至約30、約22至約24、約22至約26、約22至約28、約22至約30、約24至約26、約24至約28、約24至約30、約26至約28、約26至約30或者約26至約30個胺基酸。在某些實施例中，所述連接胜肽區包含1至50個胺基酸。
所述連接胜肽可以包含天然或非天然胺基酸。在某些實施例中，所述連接胜肽包含任何胺基酸、不同胺基酸的組合或者相同胺基酸。所述連接胜肽可以是不同種類互相連接的多肽序列，其一次或多次地連續或者與其他序列交替。所述連接胜肽可以是重複的多肽序列。在某些實施例中，整個多肽序列重複了1至50次。在希望確保兩個相鄰結構區不會在空間上彼此干擾時，也可以使用更長的連接胜肽。
在某些實施例中，所述連接胜肽是(GGGGS)n，其中n=1、2、3、4、5或6(SEQ ID NO：1)。在某些實施例中，所述連接胜肽是一個或多個GSGG(SEQ ID NO：2),GGGGSGGGS(SEQ ID NO：3)和/或一個或多個GSG。在某些實施例中，所述連接胜肽是KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：4)或 EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：5)。在某些實施例中，所述連接胜肽是(GGGGS)3(SEQ ID NO：188)。用在連接胜肽中的示例性胺基酸包括甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、絲氨酸、丙氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、天冬氨酸、脯氨酸、穀氨酸和/或賴氨酸。可用于融合蛋白的其他連接胜肽的實例是本領域通常知識，且某些可見於Chen,X等，Adv Drug Deliv.Rev.2013 Oct 15；65(10)：1357-1369中，本文通過援引以其整體併入。適於本發明的融合蛋白的另外的連接胜肽也可見於Klein等，Protein Eng.Des.Sel.2014 Oct；27(10)：325-330，本文通過援引以其整體併入。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白在單域抗體或其功能性變異體和CD蛋白或其功能性變異體之間包含一個連接胜肽。在某些實施例中，所述融合蛋白在單域抗體或其功能性變異體和CD蛋白或其功能性變異體之間包含至少一個連接胜肽。例如：在某些方面，所述融合蛋白在單域抗體或其功能性變異體和CD蛋白或其功能性變異體之間包含兩個連接胜肽。
在某些實施例中，所述單域抗體或其功能性變異體和CD蛋白或其功能性變異體直接融合(例如：沒有連結用連接胜肽)。
本發明的融合蛋白的示例性胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白
胞嘧啶脫氨酶(CD)是能夠將相對無害的5-氟胞嘧啶(5-FC)前藥轉化為細胞毒性化合物5-尿嘧啶(5-FU) 的酶(特別是在其被轉化為具有細胞毒性的5-氟尿苷5’-單磷酸(5-FdUMP)時)。因此，本發明的融合蛋白將與表達本發明的單域抗體或其功能性變異體的標靶細胞結合，且所述融合蛋白的CD蛋白或其功能性變異體會將5-FC轉化為5-FU，由此殺死標靶細胞。在某些實施例中，所述標靶細胞是癌細胞。在某些實施例中，所述標靶細胞通過旁觀者效應被殺死。Anticancer Res.1998 Sep-Oct；18(5A)：3399-406；Am J Cancer Res.2015；5(9)：2686-2696。
在某些實施例中，所述CD或其功能性變異體可以是酵母菌CD或其功能性變異體。在某些實施例中，所述CD或其功能性變異體可以是細菌CD或其功能性變異體。在某些實施例中，所述CD或其功能性變異體是大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶或其功能性變異體。例如：在某些實施例中，所述CD或其功能性變異體是由NCBI參照序列：NP_414871.1表示的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶。在某些實施例中，所述CD或其功能性變異體是由GenBank登錄號AAB67713.1表示的酵母菌胞嘧啶脫氨酶。釀酒酵母(S.cerevisiae)的FCY1基因和大腸桿菌的coda基因分別編碼這兩種生物體的CD，它們是已知的且其序列已公開(EP 402108；Erbs等，1997,Curr.Genet.31,1-6；WO 93/01281)。
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含SEQ ID NO：21的序列。在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含SEQ ID NO：186的序列。在某 些實施例中，對應於胞嘧啶脫氨酶的序列含有一個或多個變化。某些實施例中，所述變化產生了野生型CD的功能性變異體。優選地，CD結構域中的變化是穩定性突變。例如：在某些實施例中，所述CD的功能性變異體包含SEQ ID NO：22的序列，其與SEQ ID NO：21相比具有A22L/V107I/I139L。在某些實施例中，所述CD的功能性變異體包含SEQ ID NO：187的序列，其與SEQ ID NO：186相比具有A23L/V108I/I140L。
本發明還提供了包含CD多肽的融合蛋白，所述CD多肽包含與SEQ ID NO：21、22、186或187具有至少80%、90%、95%、98%或99%的相似度的序列，其中所述多肽具有胞嘧啶脫氨酶活性且因此被稱為“功能性變異體”。
在某些實施例中，所述CD蛋白的功能性變異體可以是減敏形式以減少免疫原性。在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含以下T細胞表位上的一個或多個突變：
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含從表位4(SEQ ID NO：66)修飾的序列X1X2X3LSPCD X4，其中X1可以被A或H置換，X2可以被 D置換，X3可以被E置換，且X4可以被N、A、K或Q置換。在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含從表位5(SEQ ID NO：67)修飾的序列X1CTGAIIMY，其中X1可以被N、A、K或Q置換。在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含從表位6(SEQ ID NO：68)修飾的序列X1X2X3VDDERCKK，其中X1可以被A或T置換，X2可以被A、L、I或T置換，且X3可以被A或T置換。
在某些實施例中，所述CD蛋白或其功能性變異體包含從表位6(SEQ ID NO：68)修飾的序列X1X2VVDDERCKK，其中X1可以被A置換，X2可以被T置換。
在某些實施例中，所述CD功能性變異體是SEQ ID NO：21或22的變異體，其中所述變異體包含選自Y84A、Y84H、T85D、T86E、M92N、M92A、M92K、M92Q、V128A、V128T、V129A、V129L、V129I、V129T、V130A和V130T的至少一個突變。在某些實施例中，所述CD功能性變異體是SEQ ID NO：186或187的變異體，其中所述變異體包含選自Y85A、Y85H、T86D、T87E、M93N、M93A、M93K、M93Q、V129A、V129T、V130A、V130L、V130I、V130T、V131A和V131T的至少一個突變。
在某些實施例中，所述CD蛋白的功能性變異體選自由SEQ ID NO：22、187、189、190、191、192、193和194組成的群組。在某些實施例中，所述CD蛋白的功 能性變異體選自由SEQ ID NO：22、189、191和193組成的群組。
用於檢測胞嘧啶脫氨酶活性的測定方法是本領域通常知識。例如：胞嘧啶脫氨酶活性可以通過確定5-FC向5-FU或者胞嘧啶向尿嘧啶轉化的速率來檢測。5-FC、5-FU、胞嘧啶和尿嘧啶的檢測可以通過實施例章節中所述的方法、通過色譜分析和/或通過本領域通常知識中其它方法來進行。
本發明的示例性融合蛋白
本發明提供了數種融合蛋白的實例，如下所述： 本發明提供了包含式I或式II的融合蛋白，其中：N-(L)n-C (式I)；C-(L)n-N (式II)；其中，N為一單域抗體(sdAb)或其功能性變異體，L為一連接胜肽，n=0-50，且C為一胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由式I組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由式I組成。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由式II組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由式II組成。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含式I，如此所述連接胜肽的C端或所述單域抗體或其功能性變異體的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在連接胜肽，所述單域抗體或其功能性變異 體的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在連接胜肽，且所述單域抗體或其功能性變異體的C端與所述連接胜肽的N端融合，而所述連接胜肽的C端與所述CD蛋白或其功能性變異體的N端融合。
在其他實施例中，所述融合蛋白包含式II，因此所述連接胜肽的C端或所述CD蛋白或其功能性變異體的C端與所述單域抗體或其功能性變異體的N端融合。例如：在某些態樣，不存在連接胜肽，所述CD蛋白或其功能性變異體的C端與所述單域抗體或其功能性變異體的N端融合。在某些態樣，存在連接胜肽，且所述CD蛋白或其功能性變異體的C端與所述連接胜肽的N端融合，而所述連接胜肽的C端與單域抗體或其功能性變異體的N端融合。
本發明還提供了包含單域抗體(其針對胞外標靶抗原，包括但不限於本發明所述的任何標靶抗原)與本發明所述的任何胞嘧啶脫氨酶融合的融合蛋白。
例如：在某些實施例中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17或者任何前述序列的第1-297位胺基酸的胺基酸序列。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17或者任何前述序列的第1-297位胺基酸的胺基酸序列組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由SEQ ID NO：7、9、11、13、15、17或者任何前述序列的第1-297位胺基酸的胺基酸序列組成。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，選自由SEQ ID NO：17、19和93-185組成的群組。 在某些實施例中，所述融合蛋白基本由一胺基酸序列組成，選自由SEQ ID NO：17、19和93-185組成的群組。在某些實施例中，融合蛋白由一胺基酸序列組成，選自由SEQ ID NO：17、19和93-185組成的群組。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：93-181組成的群組的胺基酸序列的第1-297位胺基酸。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由選自由SEQ ID NO：93-181組成的群組的胺基酸序列的第1-297位胺基酸組成。在某些實施例中，所述融合蛋白由選自由SEQ ID NO：93-181組成的群組的胺基酸序列的第1-297位胺基酸組成。
在某些實施例中，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，選自由SEQ ID NO：19、182、183、184和185組成的群組。在某些實施例中，所述融合蛋白基本由一胺基酸序列組成，選自由SEQ ID NO：19、182、183、184和185組成的群組。在某些實施例中，所述融合蛋白由一胺基酸序列組成，選自由SEQ ID NO：19、182、183、184和185組成的群組。
本發明還提供了包含多於一個單域抗體或其功能性變異體或者CD蛋白或其功能性變異體的融合蛋白。例如：所述融合蛋白可以具有以下式III或IV：N1-[(L1)n-N2]n1-(L2)n-(C)-[(L3)n-C]n2 (式III)
(C)-[(L1)n-C]n2-(L2)n N1-[(L3)n-N2]n1 (式 IV)
其中，N1和N2各自為一單域抗體或其功能性變異體，其中N1和N2可以是相同或不同的單域抗體或其功能性變異體，且其中n1=0-10；L1、L2和L3各自為一連接胜肽，其中n=0-50；C為一胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體，其中n2=0-10。
例如：所述融合蛋白可以具有以下式：N1-L1-N2-L2-C；N1-L1-N2-L2-C-L3-C；N1-N2-L-C；N1-N2-L-C；N1-L1-C-N2-L2-C；其中，N1和N2可以相同和不同，且其中L1、L2和L3的任一個可以相同或不同。
在某些實施例中，融合蛋白是一雙價融合蛋白，包含兩種不同的單域抗體或其功能性變異體(即，其結合兩個不同標靶或者同一標靶中的兩個不同表位)。在某些實施例中，所述融合蛋白是一單價融合蛋白。
本發明的融合蛋白可以進一步與例如肽標籤等部分融合以便純化，參見例如：WO 93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol Lett 39：91(1994)；U.S.Pat.No.5,474,981；Gillies等，Proc Natl Acad Sci USA 89：1428(1992)；和Fell等，J Immunol 146：2446(1991)。在某些實施例中，所述肽標籤是組氨酸(HIS)標 籤。在某些實施例中，所述肽標籤是組氨酸六胜肽(SEQ ID NO：6)。所述組氨酸六胜肽標籤可以是在pQE載體(QIAGEN,Inc.,Chatsworth，加利福尼亞州)或者另一種載體(許多可商業購得，Gentz等，Proc Natl Acad Sci USA 86：821(1989))中提供的標籤。可用於純化的其它肽標籤包括但不限於“HA”標籤[其對應於一源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等，Cell 37：767(1984))]和“FLAGTM”標籤。所述肽標籤可以位於所述融合蛋白的N端、所述融合蛋白的C端或者處於所述融合蛋白的功能性結構區之間(例如：單域抗體和CD或其功能性變異體之間)。所述肽標籤可以通過一連接胜肽連接至融合蛋白。例如：連接所述融合蛋白和所述標籤(例如：HIS-標籤)的連接胜肽可以是GSS。
本發明還涵蓋與化學小分子綴合的融合蛋白，包括例如細胞毒性/化療小分子和/或放射標籤在內的小分子。本文所述用於與本發明的融合蛋白的組合治療的任何細胞毒性劑和化療劑均可經化學綴合至本發明的融合蛋白。在某些實施例中，所述細胞毒性劑和所述化療劑與所述融合蛋白為共價綴合。在某些實施例中，所述細胞毒性劑和所述化療劑與所述融合蛋白為非共價綴合。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白與所述細胞毒性劑或所述化療劑的綴合通過一連接頭，該連接頭選自由雙硫基、硫醚基、酸性不穩定基團、光不穩定基團、蛋白酶不穩定基團和酯酶不穩定基團組成的群組。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白與細胞毒 性和/或細胞生長抑制劑綴合。在這些實施例的某些態樣，所述細胞毒性和/或細胞生長抑制劑與所述融合蛋白的單域抗體或其功能性變異體綴合。在這些實施例的某些態樣，所述細胞毒性和/或細胞生長抑制劑與所述融合蛋白的CD蛋白或其功能性變異體綴合。
在其它實施例中，所述融合蛋白與細胞激素、超抗原和/或毒素綴合(以化學方式或基因改造方式)或者偶聯。
在某些實施例中，所述融合蛋白的藥代動力學(包括所述融合蛋白的半衰期)可以通過化學修飾而改善，例如添加諸如聚乙二醇等聚亞烷基二醇(“聚乙二醇化(PEGylation)”)、POLY PEG、PAS化(PASylation)或者通過包覆於一脂質體而改善。在某些實施例中，所述融合蛋白(例如：單域抗體或其功能性變異體)包含允許聚乙二醇化和/或促進聚乙二醇化的一個或多個額外的胺基酸序列(例如：額外的半胱氨酸序列以便容易附接PEG基團)。在某些實施例中，所述融合蛋白的半衰期通過如下增加：將聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合性配體或糖遮罩體與所述融合蛋白接合；與結合血清蛋白(諸如白蛋白、IgG、FcRn和/或轉鐵蛋白)的蛋白經由基因融合；與白蛋白或白蛋白的結構區間或者與白蛋白結合性蛋白經由基因融合；將所述融合蛋白加入奈米載劑、緩釋製劑或者醫療器械中。
在某些實施例中，所述融合蛋白可以通過糖基 化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、已知保護基/阻斷基的衍生化和/或蛋白裂解切割來修飾。這些修飾可以通過已知技術進行，包括但不限於特異性化學切割、乙醯化、甲醯化和本領域已知的其它技術。另外，融合蛋白可以包含一個或多個非經典胺基酸。
在某些實施例中，例如出於診斷或檢測目的(例如：為達到例如監測治療或跟蹤融合蛋白的分佈而進行成像)，所述融合蛋白可以包含可一檢測標籤。合適的可檢測標記和標記蛋白的方法是本領域通常知識。合適的可檢測標記包括例如放射性同位素(例如：銦-111、鍀-99m或碘-131)、正電子發射性標記(例如：氟-19)、順磁性離子(例如：釓(III)、錳(II))、表位元標記(標籤)、親和性標記(例如：生物素、親和素)、自旋標記、酶、螢光基團或者化學發光基團。當不採用標記時，複合物的形成(例如：所述融合蛋白與一標靶間)可以通過表面等離子共振、ELISA、FACS或本領域通常知識中的其它合適方法來確定。
編碼本發明的蛋白的核酸
本發明所公開的核酸，包括編碼如本文所述的單域抗體、連接胜肽、CD蛋白、單域抗體和/或CD蛋白的功能性變異體、融合蛋白或者任何前述物質的功能性等價物的核苷酸序列在內的核酸，是以重組DNA分子型式，在適當的宿主細胞(例如細菌細胞)表達本發明的融合蛋白。如本文所用，術語“核酸分子”或“多核苷酸”意指包括DNA分子(例如：cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如：mRNA) 以及使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單股或雙股的。
在某些態樣，本發明涉及編碼一胞嘧啶脫氨酶或一突變型嘧啶脫氨酶多肽或其生物學活性部分的多核苷酸；編碼一單域抗體或其生物學活性變異體的多核苷酸；編碼本發明的一個或多個連接胜肽的多核苷酸；以及編碼本發明的融合蛋白的多核苷酸。
在某些實施例中，編碼CD或其功能性變異體的多核苷酸是一經密碼子優化的多核苷酸。在某些實施例中，所述CD多核苷酸或經密碼子優化的多核苷酸，包含由生物體(例如：細菌或酵母菌菌株)分離的天然存在的核酸的重組、細胞工程改良或分離的形式。示例性CD多核苷酸包括編碼SEQ ID NO：21、22、186或187所述的多肽。本發明的實施例中所用的核酸落在所述實施例的範圍內。
在某些實施例中，所述CD或單域抗體多核苷酸(包括經密碼子優化的多核苷酸)通過將一個或多個天然存在的、經分離的或者重組的CD或單域抗體多核苷酸序列進行多樣化(例如：重組和/或突變)而產生。如本文其他部分更詳細所述，產生多樣化的CD或單域抗體多核苷酸，其所編碼的CD或單域抗體多肽(例如：CD或單域抗體的功能性變異體)具有優異的功能屬性，是有可能的，例如：與多樣化過程中未經修飾作為受質或是母股的CD或單域抗體多核苷酸相比，增加催化功能、增加穩定性或者更高的表達水準。由於遺傳密碼的不確定性，編碼基本相同或功能性等同 胺基酸序列的不同核酸序列可以用於克隆和/或表達本發明的融合蛋白。
本發明的多核苷酸具有各種用途，例如在本發明的融合蛋白的重組生產(即，表達)中，和作為產生進一步多樣性的受質，例如產生新的和/或改進的變異體的重組反應或突變反應等等。
本發明的CD和單域抗體多核苷酸的某些具體的、實質性和可靠的功用，不要求該多核苷酸編碼出具有顯著CD活性、或者變異體CD活性或單域抗體活性(例如：標靶結合)的多肽。例如：未編碼出活性酶的CD多核苷酸，其獨到的功能性特徵，可做為多樣化過程，取得CD多核苷酸變異體或非-CD多核苷酸的寶貴資源(例如：高kcat或kcat/Km、低Km、對熱或其它環境因素的高穩定性、高轉錄率或轉譯率、對蛋白裂解的抗性、增加抗原結合性、增加抗原特異性、降低免疫原性)。
在某些實施例中，所述編碼單域抗體或其功能性變異體的多核苷酸是一經密碼子優化的多核苷酸。在某些實施例中，所述單域抗體多核苷酸或經密碼子優化的單域抗體多核苷酸包含以重組、細胞工程改良或分離的形式，分離自生物體(例如：單峰駝、駱駝、駱馬、羊駝或鯊魚)的天然存在的胺基酸。
編碼本發明的融合蛋白的示例性多核苷酸包括SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18、20和195-198中所述的序列。
本文所用的術語“宿主細胞”，包括可接受用核酸構建體的轉殖的任何細胞。術語“轉殖”是指將外來(即，外源性或胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞，從而該宿主細胞將表達所引入的基因或序列，以產生所需物質，通常是所引入的基因或序列編碼的蛋白或酶。所述引入的基因或序列可以包括調節序列或控制序列，例如細胞的遺傳機制所利用的起始、終止、啟動子、信號、分泌或其他序列。宿主細胞，接受並表達引入的DNA或RNA時為“轉殖”，稱為“轉殖株”或“克隆株”。引入宿主細胞的DNA或RNA可以來自任何來源，包括與該宿主細胞同一屬或同一種的細胞，或者不同屬或種的細胞，或者來自基因合成。
術語“經密碼子優化的序列”通常是指針對特定宿主物種，替換使用頻率低於約20%的任何密碼子以進行優化的核苷酸序列。對於在給定宿主物種中的表達已進行優化的核苷酸序列，在本文稱為“表達增強的序列”，除了透過密碼子優化外，還可藉由，例如：刪除錯誤的多聚腺苷酸序列、除去外顯子/內含子剪接信號、除去跳躍子類的重複序列、和/或優化GC含量。
本發明還提供了一載體，包含一個或多個核酸序列，其編碼所公開的CD蛋白或其功能性變異體、單域抗體或其功能性變異體、連接胜肽和/或融合蛋白。所述載體可以例如為質體、游離基因組(episome)、黏接質體、病毒載體(例如：逆轉錄病毒或腺病毒)或者噬菌體。合適的載體和載體製備方法是本領域通常知識(參見例如：Sambrook 等，Molecular Cloning,a Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,New York,N.Y.(1994，以及線上可獲取的更新章節)。
在某些實施例中，一包含編碼本發明公開的一個或多個胺基酸序列的一個或多個核酸的載體可以被引入能夠表達由其所編碼的多肽/蛋白的宿主細胞內，包括任何合適的原核或真核細胞。因此，本發明提供了一細胞(包括分離的細胞)，其包含所公開的載體。優選的宿主細胞能夠容易且可靠地生長、具有足夠快的生長速率、具有優異特性的表達系統，並且能夠容易且高效地被轉殖或轉染。
合適的原核宿主細胞的實例包括但不限於來自芽孢桿菌屬(例如：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和短芽孢桿菌(Bacillus brevis))、埃希氏菌屬(如大腸桿菌)、假單胞菌屬、鏈黴菌屬、沙門氏菌屬和歐文氏菌屬的細胞。另外的合適的原核宿主細胞包括大腸桿菌的各種菌株(例如：K12、HB101(ATCC No.33694)、DH5、DH10、MC1061(ATCC No.53338)和CC102))。在某些實施例中，宿主細胞是TunerTM(Novagen)、AD494(Novagen)、HMS174(Novagen)、NovaBlue(Novagen)、BLR(Novagen)、C41(Lucigen)、C43(Lucigen)、Lemo21(NEB)、NiCo21(NEB)、BL21、BL21(DE3)或T7 Express (NEB)。
在某些實施例中，宿主細胞是一大腸桿菌菌株，提供一形成雙硫鍵的細胞質環境。例如：所述細胞質環境是通過優化硫氧還蛋白和/或谷胱甘肽途徑和/或通過表達細胞質雙硫鍵異構酶來達成。在某些實施例中，所述宿主細胞是一大腸桿菌菌株，該菌株細經一染色體基因套持續地表達細胞質雙硫鍵異構酶(例如：DsbC)。在某些實施例中，所述原核宿主細胞是SHuffle® Express(NEB# C3028)細胞(New England Biolabs)。在某些實施例中，所述原核宿主細胞是SHuffle® T7(NEB #C3026)或SHuffle® Express T7 LysY(NEB# C3030)細胞。SHuffle®具有穀氧還蛋白還原酶和硫氧還蛋白還原酶的基因缺失(△gor△trxB)，這允許在細胞質中形成雙硫鍵。該突變組合通常是致命的，但可通過編碼過氧化物還原酶(ahpC*)的基因突變抑制。另外，SHuffle®表達了一類缺乏信號序列的細胞質雙硫鍵異構酶DsbC，將DsbC保持在細胞質中。該酶據顯示會作用於具有多個雙硫鍵的蛋白，以糾正被錯誤氧化的鍵並促進正確折疊。具有這些性質(例如：提供雙硫鍵形成的細胞質環境)的任何其它細胞株可以用於製備本發明的化合物。在某些實施例中，原核宿主細胞是OrigamiTM或Rosetta-gamiTM。
酵母菌真核表達體系的實例包括但不限於酵母屬、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬和耶氏酵母屬。
合適的昆蟲宿主細胞描述於例如Kitts等， Biotechniques,14：810-817(1993)；Lucklow,Curr.Opin.Biotechnol.,4：564-572(1993)；和Lucklow等，J.Virol.,67：4566-4579(1993)中。示例性昆蟲宿主細胞包括Sf-9和HI5(Invitrogen,Carlsbad，加州)。
胞外蛋白表達的實例包括但不限於大腸桿菌破菌液、兔網織紅細胞破細胞液(RRL)、小麥胚芽提取物以及昆蟲細胞破細胞液(例如：SF9或SF21裂解物)。無細胞表達體系，表示重組蛋白生產中的蛋白合成，是在細胞裂解物中發生，而不是在培養細胞內發生。無細胞表達體系可以對傳統胞內方法補充數種優點和特性，例如更快的生產速度，因為其無需基因轉染、細胞培養或者複雜的蛋白純化。
與其他藥物的組合治療
本發明的融合蛋白可以單獨施用或與其他藥物(例如：作為佐劑)組合施用。例如：多種化療藥，尤其是抗贅生藥可與本發明的融合蛋白組合施用。大多數化療藥物可以分為烷基化劑、抗代謝藥、蒽環類、植物生物鹼、拓撲異構酶抑制劑、抗體和其他抗腫瘤製劑。
如本文所用，輔助或組合施用(合併給藥)包括以相同或不同劑型同時施用融合蛋白和另一種藥物，或者分開施用融合蛋白和另一種藥物(例如：依次施用)。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白與損傷DNA或干擾DNA修復的抗贅生藥物共施用。在某些實施例中，本發明的融合蛋白和抗贅生藥物協同性地起效。在某些實施例中，本發明的融合蛋白增加了細胞對抗贅生藥物的敏 感性，例如增加了至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。損傷DNA或干擾DNA修復的抗贅生藥物的非限制實例，包括卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸、順鉑、環磷醯胺、達卡巴嗪、道諾黴素、艾黴素、泛艾黴素、艾達黴素、異環磷醯胺、洛莫司汀、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、雙羥蒽醌、奧沙利鉑、丙卡巴肼、替莫唑胺和戊柔比星。在某些實施例中，所述抗贅生藥物是替莫唑胺，其為通常針對膠質母細胞瘤使用的損傷DNA的烷基化劑。在某些實施例中，所述抗贅生藥物是PARP抑制劑(例如：KU0058948、ABT-888(維利帕尼(veliparib))、奧拉帕尼(olaparib)、KU-59436、AZD-2281、AG-014699、BSI-201、BGP-15、INO-1001、ONO-2231)，其抑制DNA損傷的鹼基切除修復中的步驟。在某些實施例中，所述抗贅生藥物是組蛋白去乙醯酶抑制劑(例如：伏林司他、羅米地新、西達本胺、帕比司他、丙戊酸、貝林司他(Belinostat)、莫西司他(Mocetinostat)、阿貝司他(Abexinostat)、恩替司他(Entinostat)、SB939(普雷司他)、Resminostat(Resminostat)、吉維司他(Givinostat)、奎诺司他(Quisinostat)、硫脲丁腈(KevetrinTM)、CUDC-10、CHR-2845(特諾司他)、CHR-3996、4SC-202、CG200745、ACY-1215(瑞考司他)、ME-344、萊菔硫烷(sulforaphane))，其在轉錄層級抑制DNA修復並破壞染色質結構。在某些實施例中，所述抗贅生藥物是蛋白酶體抑制劑(例如：硼替佐米、卡非佐米、 環氧酶素、伊沙佐米、SalinosporamideA)，其通過破壞細胞中的泛素代謝來抑制DNA修復。泛素是調節DNA修復的信號傳導分子。在某些實施例中，所述抗贅生藥物是激酶抑制劑(例如：ATM抑制劑(CP466722或KU-55933)、CHK 1抑制劑(XL-844、UCN-01、AZD7762或PF00477736)、或CHK 2抑制劑(XL-844、AZD7762或PF00477736))，其通過改變DNA損傷回應信號傳導途徑來抑制DNA修復。
可以與本發明的融合蛋白組合的抗贅生藥物的另外實例包括但不限於：烷化劑(例如：替莫唑胺、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺、苯丁酸氮芥、達卡巴嗪、洛莫司汀、卡莫司汀、丙卡巴肼、苯丁酸和異環磷醯胺)、抗代謝藥(例如：吉西他濱、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、氟達拉濱和氟尿嘧啶)、抗有絲分裂劑、長春花生物鹼如長春新鹼、長春鹼、長春瑞濱和長春地辛)、蒽環類(包括多艾黴素、道諾黴素、戊柔比星、艾達黴素及泛艾黴素，以及放線菌素如放線菌素D)、細胞毒性抗生素(包括絲裂黴素、普卡黴素和博來黴素)和拓撲異構酶抑制劑(包括喜樹鹼類，諸如託泊替康和表鬼臼毒素衍生物，如安吖啶、依託泊苷、磷酸依託泊苷和替尼泊苷)。
可以與本發明的融合蛋白組合施用的其它化療劑的實例包括：烷化劑，例如：塞替派和環磷醯胺；烷基磺酸鹽，例如：白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，例如：苯左替派(benzodopa)、卡 波醌、美妥替派(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括：六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫代磷醯胺和三羥甲基蜜胺；乙酸原化合物(acetogenin)(例如：布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol))；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙堿；樺木酸；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康(CPT-11(伊立替康)、乙醯喜樹堿、東莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素；培美曲塞；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻環肽(cryptophycin)(如克瑞托欣(cryptophycin)1和克瑞托欣8)；海兔毒素；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1)，艾榴塞洛素(eleutherobin)；潘可瑞斯汀(pancratistatin)；TLK-286；CDP323，口服α-4整合素抑制劑；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，例如：苯丁酸氮芥、氯吡嗪、氯吡膦、雌莫司汀、異環磷醯胺、甲基二(氯乙基)胺、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾醇、松龍苯芥、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類，例如：卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼莫司汀；抗生素，例如：烯二炔類抗生素(例如：卡奇黴素，特別是卡奇黴素γ和卡奇黴素ω(參 見例如：Nicolaou等，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994)；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；新制癌菌素生色團和相關的色素蛋白烯二炔抗生素生色團；阿克拉黴素(aclacinomysins)；放線菌素；安麯黴素；重氮絲氨酸；博來黴素；放線菌素C(cactinomycin)；卡柔比星；洋紅黴素；嗜癌素；色黴素；放線菌素D；道諾黴素.；地托比星(detorubicin)；6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸；艾黴素(包括嗎啉多柔比星素，氰基嗎啉多柔比星，2-吡咯啉多柔比星，多柔比星HCl脂質體注射液和去氧多柔比星)；泛艾黴素；依索比星(esorubicin)；艾達黴素；麻西羅黴素(marcellomycin)；絲裂黴素，例如：絲裂黴素C，黴酚酸，諾加拉黴素，橄欖黴素，培洛黴素(peplomycin)，泊非黴素(potfiromycin)，嘌呤黴素，古拉黴素(guelamycin)，羅多比星(rodorubicin)，鏈黑黴素(streptonigrin)，鏈脲黴素，殺結核菌素，烏苯美司，淨司他丁和佐柔比星；抗代謝藥，例如：甲氨蝶呤、吉西他濱，替加氟，卡培他濱，埃坡黴素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如：二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤，蝶羅呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如：氟達拉濱，6-巰基嘌呤，硫胺素和硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如：安西他濱，阿紮胞苷，6-氮尿苷，卡莫氟，阿糖胞苷，雙去氧尿苷，多西氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷和伊馬替尼(2-苯基氨基嘧啶衍生物)，以及其他c-Kit抑制劑；抗腎上腺素，例如：氨 魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補充劑，例如：亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生群；依達曲沙地磷醯胺(defofamine)；美可辛；地吖醌；表鳥氨酸(elfomithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；美登素類，如美登素和安沙黴素；米托胍腙；雙羥蒽醌；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索；2-乙基醯肼；甲基苄肼；PSK.RTM.多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根黴素；西佐；螺環鍺；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)，三亞胺醌(triaziquone)；2,2,2-三氯乙胺(trichlorothethylamine)；單端孢黴烯(例如T-2毒素，疣孢菌素A，桿孢菌素A和anguidine)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；衛矛醇；呱泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；塞替派；紫杉烷類，例如：紫杉醇、紫杉醇的白蛋白細胞工程改良奈米顆粒製劑和多西紫杉醇；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，例如：順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；雙羥蒽醌；長春新鹼；奧沙利鉑；甲醯四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞濱；諾消靈；依達曲沙；道諾黴素；氨喋呤；伊班膦酸鹽；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸 (DMFO)；類視色素，例如：視黃酸；上述中的任一者的藥學可接受鹽、酸或衍生物，以及上述中的兩種或多種的組合，例如：CHOP(對環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和潑尼松龍的組合療法的縮寫)和FOLFOX(對採用奧沙利鉑與5-FU和甲醯四氫葉酸(leucovovin)組合的治療方案的縮寫)。可以與本發明的融合蛋白組合使用的其它治療劑，包括：二膦酸鹽，例如：氯膦酸鹽(clodronate)、NE-58095、唑來膦酸/唑來膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、帕米膦酸鹽、替魯膦酸鹽或利塞膦酸鹽、以及曲沙他濱(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制參與異常細胞增殖的信號傳導途徑中的表達或基因，例如：PKC-α、Raf,H-Ras和表皮生長因子受體(EGFR)；疫苗，例如：Stimuvax疫苗、Theratope疫苗以及基因療法疫苗(例如：Allovectin疫苗、Leavectin疫苗和Vaxid疫苗)；拓撲異構酶1抑制劑；抗雌激素，例如：氟維司群；Kit抑制劑，例如：伊馬替尼或EXEL-0862(酪氨酸激酶抑制劑)；EGFR抑制劑，例如：厄洛替尼或西妥昔單抗；抗VEGF抑制劑，例如：貝伐單抗；arinotecan；rmRH；拉帕替尼和拉帕替尼二甲苯磺酸鹽(ErbB-2和EGFR雙酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016)；17AAG(格爾德黴素衍生物，其為熱休克蛋白(Hsp)90毒素)以及上述中任一者的藥學可接受鹽、酸或衍生物。
在某些實施例中，本文公開的融合蛋白或藥物組合物與5-氟尿嘧啶(5-FU)共施用。在某些實施例中，所 述融合蛋白或其藥物組合物與含有5-FU的以下方案共施用，例如：FOLFUHD(5-FU和甲醯四氫葉酸(leucovorin)、sLV5FU2(5-FU和甲醯四氫葉酸)、IFL(伊立替康、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FLOX(5-FU、甲醯四氫葉酸和奧沙利鉑)、mFOLFOX6(奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FOLFOX4(奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FOLFOX7(奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FOLFIRI(伊立替康、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FOLFOXIRI(伊立替康、奧沙利鉑、甲醯四氫葉酸和5-FU)、FOLFIRINOX(甲醯四氫葉酸鈣、氟尿嘧啶、鹽酸伊立替康和奧沙利鉑)或CMF(環磷醯胺、甲氨蝶呤和5-FU)。在某些實施例中，所述融合蛋白或其藥物組合物與含有5-FC的方案共施用，例如：在某些實施例中，任何前述含有5-FU的方案可被5-FC所替代(例如：5-FC和甲醯四氫葉酸；5-FC、甲醯四氫葉酸和伊立替康；5-FC、甲醯四氫葉酸和奧沙利鉑；5-FU、甲醯四氫葉酸、伊立替康和奧沙利鉑；5-FU、甲醯四氫葉酸鈣、鹽酸伊立替康和奧沙利鉑；5-FC、環磷醯胺和甲氨蝶呤)。
在某些實施例中，本發明公開的融合蛋白或藥物組合物可以與一種或多種增強5-FU的細胞毒性效應的物質組合施用或共施用。增強5-FU的細胞毒性效應的物質包括但不限於：抑制嘧啶的起始生物合成的酶的藥物，和諸如：甲醛四氫葉酸(Waxman等，1982,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18,685-692)等藥物，甲醛四氫葉酸在5-FU的代 謝產物(5-FdUMP)存在時增加對胸苷酸合成酶的抑制，從而導致複製所需的dTMP總量的減少；以及例如：甲氨蝶呤(Cadman等，1979,Science 250,1135-1137)等藥物，其通過抑制二氫葉酸還原酶並增加PRPP(磷酸核糖焦磷酸)總量，使得細胞RNA內的5-FU的引入增加。在某些實施例中，增強5-FU的細胞毒性效應的物質抑制5-FU的降解，例如：在某些實施例中，所述物質是吉美嘧啶；在某些實施例中，增強5-FU的細胞毒性效應的物質降低5-FU的副作用，例如：在某些實施例中，所述物質是奧替拉西鉀；在某些實施例中，增強5-FU的細胞毒性效應的物質通過抑制二氫嘧啶脫氫酶來抑制5-FU的代謝，例如：在某些實施例中，所述物質是尿嘧啶。
施用方法
本發明的融合蛋白或藥物組合物的遞送可以以不同方式進行，包括口服、皮下、靜脈內、腹腔或腫瘤內施用。其它施用和遞送途徑包括關節內、動脈內、肌內、注射、皮下、胸膜內、局部、皮膚、皮內、透皮、注射，例如：透黏膜、顱內、椎管內、黏膜、呼吸道、鼻內、經插管、肺內、肺內灌注、頰部、舌下、靜脈內、鞘內、腔內、離子電滲、眼內、眼部、腺內、器官內和淋巴管內。
每種遞送/施用途徑對於本發明的融合蛋白製劑具有不同要求，且所述製劑可以由本領域普通技術人員常規製備。例如：對於口服應用或腹腔內注射，單域抗體-CD融合蛋白需要對極端條件(即，蛋白酶和/或酸性pH)的抗 性。如果需要，如本領域通常知識，可以通過改造序列或通過引入額外的雙硫鍵來改善對肽酶和糜蛋白酶的抗性，從而使融合蛋白具有蛋白酶抗性。對於靜脈內施用，在血清中的穩定性可能很重要，大多數與作用區域或奈米顆粒組合的單域抗體據描述在血清中都非常穩定。
根據某些實施例，所述治療應用或治療方法包括對受試者或細胞施用藥學可接受量的前藥(例如：胞嘧啶類似物，特別是5-FC)的額外步驟。以非限制性說明而言，可以使用50mg/kg/日至1000mg/kg/日的劑量，或者500mg/kg/day的劑量，或者200mg/kg/day的劑量，一天一次或者一天多於一次。在某些實施例中，所述方法包括：5-FC首次載入劑量，足以在施用的1至2天內，於血清中測得約1-200(例如：10-100)μg/ml的濃度。在某些實施例中，所述前藥根據標準療法施用(例如：口服、全身性)，且所述前藥的施用，可在施用本發明揭露的融合蛋白之後進行。在某些實施例中，所述前藥是口服施用。在某些實施例中，所述前藥以單次劑量施用。在某些實施例中，所述前藥以如下劑量施用：該劑量經反覆施用，持續足夠的時間以使宿主生物體或細胞內產生毒性代謝物。
在某些實施例中，所述前藥可以是一化合物，在體內被轉化以提供一生物學、藥學或治療上具活性的5-FC形式。這類光活化性化合物可以包含光敏接頭，其可被放射線照射切除，放射線例如：紫外光(包括能夠遠端或臨時活化的植入腫瘤位點的光)。
在某些實施例中，一胞嘧啶類似物是代替5-FC施用。胞嘧啶類似物可以作為胞嘧啶脫氨酶的受質，包括鹵代胞嘧啶和前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)(其被CD活化為5-氟尿嘧啶(5-FU))。另外，可以使用5-FC的延長釋放製劑(例如：Toca FC)。
藥物組合物
本發明提供了包含本文公開的一種或多種融合蛋白的藥物組合物。在某些實施例中，所述藥物組合物包含本文公開的一種或多種融合蛋白的藥物組合物和一種或多種藥學可接受的賦形劑。藥物組合物包含本發明的融合蛋白及其任何轉譯後修飾物以及藥學可接受的賦形劑，也落在本發明範圍內，並且可以使用本領域已知的方法製備。合適的賦形劑是本領域通常知識。賦形劑的選擇部分地取決於組合物可施用的特定位置以及施用組合物的特定方法。組合物可選地為無菌的。所述組合物可以冷凍或凍乾以便儲存，並在使用前在合適的無菌載劑中回溶。所述組合物可以根據例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,Pa.(2013)和任何其它版本中所描述的常規技術來生成。
術語“賦形劑”廣泛地指除活性治療成分以外的任何成分。賦形劑可以是一惰性物質、一非活性物質和/或一非醫藥活性的物質。賦形劑可以起到各種目的，例如：作為載劑、溶劑、稀釋劑、片劑助劑，和/或用以改善活性物質的施用和/或吸收。
在某些實施例中，本發明的藥物組合物經製備以具有某種穩定性(物理和/或化學穩定性)。術語“物理穩定性”是指多肽或蛋白由於暴露於熱-機械壓力和/或與不穩定介面或表面(例如：疏水性表面)相互作用而形成生物學上無活性和/或不溶性聚集沉澱的傾向。水性蛋白製劑的物理穩定性，可以在不同溫度以各種時長暴露於機械/物理壓力(例如：振搖)後借助目視檢查和/或通過渾濁度測定來評估。作為另選，物理穩定性可以使用蛋白的構象狀態的光譜學試劑或探針(例如：硫代黃素T或“疏水斑”探針)評估。
術語“化學穩定性”是指多肽或蛋白結構中的化學(特別是共價)變化，與原完整蛋白相比，該變化導致降低的生物學價效和/或增加的免疫原性效果的化學降解產物。所述化學穩定性可以通過在暴露於不同的環境條件後在不同的時間點測定化學降解產物的量來評估，例如：通過SEC-HPLC和/或RP-HPLC。
本發明的融合蛋白可以作為藥物製劑治療性使用。術語“藥物製劑”是指其形式可允許活性成分的生物學活性作用的製劑，其中所述製劑不含對於將要施用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的額外成分。在某些實施例中，所述藥物製劑是無菌的。
在某些實施例中，一藥物組合物或藥物製劑可以是溶液、乳化液或懸浮液(例如：加入微粒、脂質體或細胞內)。典型地，在組合物或製劑中施用一適當量的藥學可接受鹽以使其為等滲條件。藥學可接受載劑的實例包括但不 限於食鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH優選為約5至約8，且更優選為約7至約7.5。藥物組合物或製劑可以包含載劑、增稠劑、稀釋劑、緩衝劑、防腐劑和/或表面活性劑。合適的載劑包括持續釋放製劑，例如：包含本發明的融合蛋白的固體疏水性聚合物的半透性基質，該基質為成形的顆粒的形式，例如：膜、脂質體或微粒。某些載劑將更為優選，取決於例如施用途徑和待施用的組合物的濃度，此為本領域技術人員顯而易見的。藥物組合物或製劑還可以包含一種或多種額外的活性成分，例如：細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、化療劑、抗微生物劑、抗炎劑和麻醉劑。
為了輔助本發明的融合蛋白溶解在水性環境中，可以添加表面活性劑作為潤濕劑。所述表面活性劑可以包括陰離子介面活性劑例如月桂基硫酸鈉、磺基琥珀酸二辛基酯鈉和二辛基磺酸鈉。可以使用陽離子介面活性劑，其可包括苯紮氯銨或苄索氯銨(benzethomium chloride)。可以在製劑中作為表面活性劑使用的非離子介面活性劑，包括但不限於：聚桂醇400；聚乙二醇40硬脂酸酯；聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50或60；甘油單硬脂酸酯；聚山梨酯20、40、60、65或80；蔗糖脂肪酸酯；甲基纖維素；和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨地或者作為混合物以不同比例存在于融合蛋白的藥物組合物或製劑中。本發明的藥物組合物或製劑可以包含可增強肽吸收的添加劑。例如：在某些實施例中，組合物或製劑包含脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸中的一種或多種。
使用方法
本發明的融合蛋白可以用於治療增殖性疾病(癌症/腫瘤、再狹窄、青光眼、瘢痕)。在某些態樣，本發明涉及在患有癌症或本文公開的任何疾病的受試者中，施用融合蛋白或其藥物組合物或製劑，由此治療該患者中的所述疾病的方法。除了治療用途外，本文所述的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑可以用在診斷或研究應用中。
在某些實施例中，本發明的融合蛋白或其藥物組合物或製劑可以用於治療本領域已知的任何癌症，例如結腸癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、基底細胞癌、鮑溫病和子宮頸癌。在某些實施例中，本發明的化合可以用於治療眼表鱗狀瘤。在某些實施例中，所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑可以用於治療黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰臟癌、膽管癌、食道癌、骨癌、子宮內膜癌、卵巢癌、軟組織肉瘤或Merkel細胞癌。在某些實施例中，所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑可以用於治療實體腫瘤。在某些實施例中，所述實體腫瘤是結腸癌、結直腸癌、胰腺癌或頭頸癌。
在某些實施例中，所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑可以用於治療光化性角化病。在某些實施例中，所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑可以用作眼部和/或眶周手術的輔助治療。在某些實施例中， 所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑用於治療肥厚性(HTS)瘢痕和/或蟹足腫。
術語“治療”是指意圖在於治癒、緩解或穩定疾病的對患者的醫學管理。該術語包括積極治療，即具體針對改善疾病、病理狀況或者病症的治療，也包括病因治療，即針對去除相關疾病、病理狀況或者病症的成因的治療。另外，該術語包括：姑息性治療，即設計來緩解症狀而非將疾病、病理狀況或者病症治癒的治療；預防性治療，即針對最小化或者部分或完全地抑制相關疾病、病理狀況或者病症的發展的治療；和/或支持性治療，即用來補充針對改善疾病、病理狀況或者病症的另一種特定療法的治療。
術語“治療有效性”是指所用的蛋白、組合或製劑的量是足以緩解疾病或病症的一個或多個成因或症狀的量。所述緩解僅要求減少或改變，並非必須消除。用於治療癌症的蛋白、組合物或製劑的治療有效量，優選為足以導致腫瘤消退或者使腫瘤對放療或化療敏感化的量。用於治療所需的所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑的量，不僅隨所選的特定單域抗體(或其功能性變異體)和融合蛋白而有所變化，而且隨施用途徑、待治療的病況的性質、以及患者的年齡和狀況等等因素而變化，且最終由主治醫師或臨床醫師斟酌決定。此外，所公開的融合蛋白、藥物組合物和/或藥物製劑的劑量可能根據標靶細胞、腫瘤、組織、移植物或器官而有所變化。
臨床醫師通常將能根據本文提到的因素來確定 合適劑量。此外，顯而易見地，在特定情況下，臨床醫師可以選擇偏離這些量，例如基於上文引用的因素以及該醫師的專業判斷。一般地，施用的量的指引，可以由在基本相同的途徑，針對相同標靶而通常施用的相當的常規抗體、或抗體片段的量獲得，但要考慮親和力/親留力、價效、生物分佈、半衰期和本領域技術人員通常知識中的類似因素的差異。例如：本發明的融合蛋白通常可以1克/kg體重/天至0.01微克/kg體重/天，連續地(例如：通過輸注)作為單次每日劑量、或者作為在當天中多次分開的劑量施用，優選0.1克/kg體重/天至0.1微克/kg體重/天，例如：約1、10、100、或1000微克/kg體重/天。在某些實施例中，本發明的融合蛋白以約10mg/kg至約60mg/kg的劑量施用。在某些實施例中，本發明的融合蛋白以約10mg/kg/天至約60mg/kg/天的劑量施用。
本發明的融合蛋白的其它合適劑量，在動物或人體重的範圍內，可以例如為1pg/kg至60mg/kg；然而，低於或高於該示例性範圍的劑量在本發明的範圍之內。每日胃腸外劑量可以為：約0.00001μg/kg至約20或約40mg/kg總體重(例如：約0.001μg/kg、約0.1μg/kg、約1μg/kg、約5μg/kg、約10μg/kg、約100μg/kg、約500μg/kg、約1mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg，或前述值中任兩者所限定的範圍)，優選為約0.1μg/kg至約10mg/kg總體重(例如：約0.5μg/kg、約1μg/kg、約50μg/kg、約150μg/kg、約300μg/kg、約750μg/kg、約1.5mg/kg、約5mg/kg，或 前述值中任兩者所限定的範圍)，更優選為約1μg/kg至5mg/kg總體重(例如：約3μg/kg、約15μg/kg、約75μg/kg、約300μg/kg、約900μg/kg、約2mg/kg、約4mg/kg，或前述值中任兩者所限定的範圍)，甚至更優選為0.5至15mg/kg體重/天(例如：約1mg/kg、約2.5mg/kg、約3mg/kg、約6mg/kg、約9mg/kg、約11mg/kg、約13mg/kg，或前述值中任兩者所限定的範圍)。治療性或預防性效力可以通過對受治療患者的定期評估來監測。對於在數日或更長時間中的重複施用，根據病況，治療可以重複進行，直到抑制目標疾病症狀。然而，其他的劑量方案也可以使用，且落在本發明的範圍內。例如：所需劑量可以通過組合物的單次快速施用、組合物的多次快速施用或者通過連續輸注施用來遞送。本發明公開的融合蛋白的其它施用方法已在本文其它部分示例說明。
實施例1 哺乳動物表達質體的構建
通過本領域的重組DNA技術方法來構建CD融合蛋白的表達質體。某些代表性的表達質體的構建方法/設計如本文所述。
(1)Rituxan-CD-CD表達質體
Rituxan-CD-CD融合蛋白的設計如第1A圖所示。Rituxan重鏈、Rituxan輕鏈和酵母菌胞嘧啶脫氨酶的核酸序列可通過基因合成來合成。包含SP-RituxanHC-CD-接頭-CD(SEQ ID NO：89)和SP-RituxanLC(SEQ ID NO：90)的編碼片段通過重疊 PCR生成。然後將片段SP-RituxanHC-CD-接頭-CD和SP-RituxanLC分別經AvrII/BstZ171位點和EcoRV/PacI位點克隆至pCHO1.0載體內(*SP：信號肽)。
(2)Herceptin-CD表達質體
Herceptin-CD融合蛋白的設計如第1B圖所示。Herceptin可變區和酵母菌胞嘧啶脫氨酶的核酸序列可以通過基因合成來合成。含有SP-HerceptinHC-CD(SEQ ID NO：91)和SP-HerceptinLC(SEQ ID NO：92)的編碼片段通過重疊PCR生成。然後將片段SP-HerceptinHC-CD和SP-HerceptinLC分別經AvrII/BstZ171位點和EcoRV/PacI位點克隆至pCHO1.0載體內。
實施例2 Rituxan-CD-CD和Herceptin-CD在哺乳動物細胞中的生產
為產生哺乳動物表達蛋白，將Rituxan-CD-CD和Herceptin-CD通過CHO-STM細胞(Thermo)利用FreeStyle MaxTM試劑根據FreeStyle MaxTM轉染步驟進行暫時性表達，轉染後72小時收集上清液，然後將上清液：(1)通過ELISA定量以確定蛋白濃度，(2)通過蛋白A純化並通過非還原性膠體電泳檢查表達情況，和(3)濃縮以用於CD活性分析。
Rituxan-CD-CD和Herceptin CD的表達濃度分別為0.002μg/mL和0.5μg/mL，兩種融合蛋白均具有CD活性，Rituxan-CD-CD即使在蛋白A純化後通過PAGE也幾乎檢測不到(資料未示出)。據觀察，在通過非還原性 PAGE分析時，Herceptin-CD作為抗原(第1B圖)。
實施例3 大腸桿菌表達質體的構建
每種融合蛋白的編碼序列包含兩個主要元件，一個編碼抗原辨識片段(標靶結合區域)，如單域抗體、抗原結合片段或內皮抑制素等；以及一個編碼酵母菌胞嘧啶脫氨酶片段。編碼連接胜肽的序列連接所述主要組成，在表達時所述連接胜肽不會干擾標靶結合區域蛋白元件或CD元件的任一個的功能。表達質體簡化示意性在第2A圖中呈現。
(1)單域抗體-CD表達質體
單域抗體和酵母菌胞嘧啶脫氨酶的核酸序列可以通過基因合成來合成。使用特定引子通過重疊PCR獲得單域抗體-CD融合蛋白的編碼片段。單域抗體和CD之間的連接胜肽序列為(GGGGS)3(SEQ ID NO：188)。將上述片段經XbaI和XhoI位點克隆至pET28a載體(Novagen)內(第2A圖)。具有CD突變或VHH突變的融合蛋白變異體是通過重疊PCR生成。
(2)抗原結合片段-CD表達質體
通過基因合成來合成酵母菌胞嘧啶脫氨酶的核酸序列。使用特定引子通過延伸PCR獲得抗原結合片段-CD的編碼片段(SEQ ID NO：81-84)。抗原結合片段和CD之間的接頭肽序列是(GGGGS)3(SEQ ID NO：188)。將上述片段經XbaI和XhoI位點克隆至pET28a載體(Novagen)內(第2A圖)。
(3)內皮抑制素-CD表達質體
通過基因合成來合成內皮抑制素和酵母菌胞嘧啶脫氨酶的核酸序列。使用特定引子通過重疊PCR獲得內皮抑制素-CD融合蛋白的編碼片段(SEQ ID NO：85)。置於抗原結合片段和CD之間的連接胜肽序列是(GGGGS)3(SEQ ID NO：188)。然後將上述片段經XbaI和XhoI位點克隆至pET28a載體(Novagen)內(第2A圖)。
實施例4 大腸桿菌中的CD融合蛋白生產
為進行生產，通過標準轉殖步驟將表達質體轉殖至SHuffle® T7 express或T7 express大腸桿菌勝任細胞(New England Biolabs)內。
為了測試估測蛋白質特性，將重組蛋白以約300mL生產規模表達並純化。對於蛋白表達，將新鮮的轉殖株以1：100稀釋接種至30℃(SHuffle® T7 Express細胞)或37℃(T7 Express細胞)的選擇培養基中直到OD600達到0.4-0.8(I0)。添加IPTG(Uni-region)0.4mM以誘導蛋白表達。對於T7 Express細胞，經誘導的培養物在37℃溫育5小時。對於SHuffle® T7 Express細胞，在生產誘導溫度為25℃或30℃時，生產溫度為25℃，誘導溫度為30℃。誘導後5小時(I5)，收集培養物並在PBS中打散懸浮，以利用超聲破碎法進行細胞裂解，分別從細胞破菌液收集可溶和不溶的部分。首先將細胞破菌液的可溶性部分與鎳瓊脂醣凝膠珠(GE Healthcare)在室溫共置1小時，共置後，以20mM、40mM和80mM咪唑(分別為W1、W2和W3)梯度清洗鎳珠(GE)。用含150mM和250mM咪唑的緩衝液(E1和 E2)將每種融合蛋白沖提。通過SDS-PAGE分析來自每個步驟的樣品以評估表達和純化情形。收集經純化的重組蛋白並與具有5%甘油的PBS進行緩衝液交換，以便進行SDS-PAGE、SEC-HPLC、CD活性和抗原結合活性分析。所有重組蛋白的表達濃度、物化特性、CD活性和抗原結合活性經評估並總結在第2B圖中。表達情形在第2C圖和第2D圖中示例說明。純化的單域抗體-CD的SDS-PAGE、SEC-HPLC、CD活性和抗原結合活性分析在第3圖、第4A圖、第4B圖、第5A圖、第5B圖、第6A圖和第6B圖中示例說明。
結果顯示，單域抗體-CD融合蛋白大多以可溶性形式表達並且在SDS-PAGE和SEC-HPLC分析時表現出可接受的純度狀態。小規模生產時期的單域抗體-CD融合蛋白的濃度為約10μg/mL或大於10μg/mL，此濃度可以在大規模生產中進一步增加至160-400mg/L，且可在過程優化後增加至>1g/L，這適合於工業生產。所有單域抗體-CD融合蛋白的抗原結合活性和CD活性都能維持。
相比之下，內皮抑制素-CD無法以可溶性形式表達，因此不適合工業生產。雖然抗原結合片段-CD融合蛋白具有更小的分子量，其似乎以可溶性形式表達。大多數抗原結合片段-CD融合蛋白以二聚體或多聚體形式聚集沉澱，且抗原結合片段在與CD融合時喪失了其抗原結合活性。
測試了大於10種單域抗體-CD融合蛋白和5種標靶抗原，資料顯示單域抗體是合適的與CD融合的抗原結 合片段，且單域抗體和CD均維持其生物學活性。
實施例5 由不同大腸桿菌菌株生產的單域抗體-CD的穩定性研究
3VGR19-CD-H的表達質體被分別轉殖至SHuffle® T7 Express和T7 Express大腸桿菌勝任細胞中。數據顯示3VGR19-CD-H在SHuffle® T7 Express和T7 Express中的表達情形相似(第8圖)。
從SHuffle® T7 Express和T7 Express大腸桿菌勝任細胞表達的3VGR19-CD-H融合蛋白經純化並以3mg/mL在以下4種緩衝液中透析：(1)PBS，(2)含1%甘油的PBS中的，(3)含5%甘油的PBS，(4)含3%甘露醇的PBS。在37℃溫育3小時、37℃溫育8小時和4℃溫育1周後，觀察在各個緩衝液中的純化蛋白的外觀，並總結於表1中。“+”的數目代表渾濁程度。“+/-”意味著觀察到極少的聚集。結果顯示出，在從T7 Express細胞表達的3VGR19-CD-H中觀察到大量沉澱，但在SHuffle® T7 Express細胞中沒有。
實施例6：單域抗體-CD融合蛋白的5L饋料批次發酵
為了評估本發明的單域抗體-CD融合蛋白在生物反應器條件下的產生，進行了5L饋料批次發酵。將冷凍細胞接種至2mL選擇培養基中，在30℃培養4-6小時，然後以1：1000稀釋接種至200mL選擇培養基作為種培養物。次日，將所述種培養物接種至5-L發酵槽中。將溫度設定在30℃，pH為7.2±0.1，DO為25%，氣流為1-1.5vvm。在葡萄糖低於0.3g/L開始饋料，且調節饋料速率以將葡萄糖維持在0.5-1g/L。當OD600高於60時，添加0.4mM IPTG以誘導蛋白表達。在細胞達到穩定期後收成本次饋料批次。最終，在發酵過程達到穩定期後停止。純化後的單域抗體-CD的生產農度為約160-400mg/L。在製程優化後TC4的生產濃度可以增加至1-1.3g/L。
實施例7 單域抗體-CD融合蛋白的大規模純化
具有HIS-標籤的融合蛋白
將細胞沉澱以由20mM TrisHCl,0.5M NaCl,20mM咪唑和5%甘油，pH 8.0組成的緩衝液重懸回溶，並通過均質器(APV2000)以850-950bar在10分鐘內均質化兩次。所得均質物經在4℃於22000 xg離心60分鐘澄清並過濾。然後將細胞破菌液載入具有鎳瓊脂醣凝膠管柱和接續的離子交換Q瓊脂醣凝膠管柱的FPLC。將細胞破菌液用20mM TrisHCl,0.5M NaCl,20mM咪唑和5%甘油，pH 8.0 溶液載入至鎳瓊脂醣凝膠管柱上，然後在20mM TrisHCl,0.5M NaCl和5%甘油，pH 8.0溶液中，以0-500mM咪唑梯度進行沖提。將沖提液用20mM TrisHCl,170mM NaCl,5%甘油，pH 8.0載入至離子交換Q瓊脂醣凝膠管柱上，並收集流通液作為純化產物，然後用20mM TrisHCl,1000mM NaCl,5%甘油，pH 8.0溶液沖洗，以除去雜質和聚集沉澱物。通過SDS-PAGE分析純化的融合蛋白。結果顯示出所有單域抗體-CD融合蛋白在純化後都顯示出高純度(第7A圖)。
無HIS-標籤的融合蛋白
將細胞沉澱重新懸浮回溶在由5%甘油中的20mM Tris-HCl和150mM NaCl組成的pH8.0緩衝液中，並通過均質器(APV2000)以850-950bar在10分鐘內均質化兩次。所得均質物經在4℃於22000xg離心60分鐘澄清並過濾。然後將過濾物通過rProteinA親和柱(Repligen)並隨後用離子交換柱陰離子交換Q瓊脂醣凝膠管柱(GE)純化。用於rProteinA親和管柱的緩衝系統，包括5%甘油、20mM Tris-HCL和150mM NaCl的pH 8.0溶液(用於結合和洗滌)，然後以50mM甘氨酸，5%甘油，pH 3.0緩衝液沖提，沖提後將產物用1M Tris-HCl,pH9.0以1：25的比例中和。用於離子交換管柱的緩衝液包含5%甘油、20mM Tris-HCl和150mM NaCl的pH 8.0溶液。純化的產物隨後通過5kDa(孔尺寸)TFF系統過濾以濃縮產物(切面流過濾)(Merck Millipore)，然後通過10kDa Amicon濾膜(Merck Millipore)交換緩衝液(第7B圖)。
實施例8 sdAb-CD融合蛋白的粒徑排阻層析分析
為了檢驗每種融合蛋白的純度，使用BioSep SEC-s2000(Phenomenex)或Superdex 200 Increase(GE Healthcare)10/300管柱樹脂進行粒徑排阻液相層析(SEC-HPLC)。將如上所述生產的蛋白的樣品首先在含5%甘油的PBS溶液中稀釋至1或2mg/mL。使用注射筒型濾膜(PureTech)將樣品過濾，並置於PP樣品槽(Thermo)中進行SEC-HPLC分析。BioSep SEC-s2000的流動相為具有0.3M氯化鈉的0.1M磷酸鈉的pH7.0溶液。Superdex 200 Increase的流動相為含有5%甘油的PBS溶液。每個管柱的流速均為0.5mL/min。管柱溫度設定在25±2℃，且自動採樣器溫度設定在10±2℃。蛋白以UV280的吸光值檢測。結果顯示，抗VEGFR2單株抗體-CD融合蛋白3VGR19-CD-H、4VGR17-CD-H和4VGR38-CD-H的純度分別為約71%、約74%和約71%(第4A圖)。抗EGFR單域抗體-CD融合蛋白VHH122-CD-H和7D12-CD-H的純度分別為約83%和約87%(第4A圖)。對於7D12-CDoem3-H和7D12-CDoem3，純度分別為約88%和約93%(第4A圖)。在優化純化過程後，純度可達到約95%或高於95%(第4B圖)。
實施例9 單域抗體-CD融合蛋白的胞嘧啶脫氨酶活性
為了檢驗CD融合蛋白的胞嘧啶脫氨酶活性，如上所述製備單域抗體-CD融合蛋白，將融合蛋白樣品的連續稀釋液在包含0.25% BSA和0.05% Tween 20的緩衝液中與20mM 5-FC混合，並將混合物在37℃靜置90分鐘。然後用10%三氯乙酸終止反應，並將混合物在4℃離心以收集上清液。分別以290nm和255nm處的吸光值來檢測5-FC和5-FU的存在。
結果證明，所測試的靶向VEGFR2的單域抗體-CD融合蛋白可將5-FC轉化為5-FU(第5A圖)。在對靶向EGFR、HER2、HER3或CEA的單域抗體-CD融合蛋白中獲得了類似結果(第5A圖和第5B圖)。
實施例10 單域抗體-CD融合蛋白的抗原結合親和力
通過ELISA測試了本文公開的人VEGFR2和單域抗體-CD融合蛋白之間的結合。對於VEGFR2結合測定，將塗覆抗體(coating antibody)人類VEGFR2-Fc(Sino Biological)在塗覆緩衝液(100mM NaHCO3+32mM Na2HCO3)中稀釋至1μg/ml。利用阻斷緩衝液(blocking buffer)(0.25% BSA,0.05% Tween-20,0.05% NaN3,1mM EDTA)靜置2小時進行阻斷。將所測試的融合蛋白樣品在阻斷緩衝液中製備並添加至反應孔盤以進行結合。以在含0.25% BSA和0.05% Tween 20的緩衝液中稀釋5000倍的兔源抗-His-HRP抗體(abcam)進行檢測。
對於EGFR結合檢測，將ELISA反應孔盤塗覆含有濃度為1μg/mL的hEGFR-Fc(Sino Biological)的塗覆緩衝液。利用阻斷緩衝液(0.25% BSA,0.05% Tween-20,0.05% NaN3,1mM EDTA)靜置2小時進行阻斷。阻斷後，將樣品在阻斷緩衝液中連續稀釋並添加至反應孔盤結合1小時。最後，以含0.25% BSA和0.05% Tween 20的緩衝液中稀釋的二抗(兔源抗-HIS-HRP)進行檢測。
對於HER2、HER3和CEA結合測定，用於各測定的塗覆抗體分別為人類ErbB2/Her2-Fc(Acro biosystem)、人類ErbB3/Her3-Fc(Acro biosystem)和人類CEACAM5-Fc(novoprotein)。
結果顯示，3VGR19-CD-H、4-VGR17-CD-H和4VGR38-CD-H結合VEGFR2；VHH122CD-H和7D12-CD-H結合EGFR；5F7-CDoem3-H、47D5-CDoem3-H和2D3-CDoem3-H結合HER2，NbCEA5-CDoem3-H和AntiCEA-CDoem3-H結合CEACAM5；且BCD090-M2-CDoem3-H結合HER3(第6A圖和第6B圖)
實施例11單域抗體-CD融合蛋白於細胞系統下的細胞毒性測定
實驗方法A：
在MDA-MB-231(人乳腺上皮細胞癌)和A431(人表皮樣癌)EGFR表達性癌細胞株上測試與5-FC組合的數種抗-EGFR單域抗體-CD融合蛋白的細胞毒性。 首先將細胞以30,000細胞/孔接種至96-孔板中，並於37℃在生長培養基(DMEM(Gibco)添加10% FBS)中過夜培養。在培養16至18小時後，將板孔用PBS清洗一次。向各孔添加100微升的100μg/ml融合蛋白並在37℃靜置1小時。在用PBS清洗以除去過量融合蛋白後，將100μl的5-FC或5-FU以指定濃度添加至對應孔静置72小時。最後，添加10μl/孔的細胞增殖試劑WST-1(Roche)並將細胞在37℃靜置4小時。使用ELISA測讀儀在吸光值OD450(WST-1)和OD690(參照波長)測定細胞存活。結果證明，每種所測試的單域抗體-CD融合蛋白和5-FC的組合都降低了MDA-MB-231和A431兩種細胞株中的癌細胞存活(第9A圖和第9B圖)。
實驗方法B：
在作為另選的測定方法中，本發明的抗EGFR單域抗體-CD融合蛋白與5-FC組合的細胞毒性在A431、Bx-PC3、Cal-27和FaDu癌細胞株上進行了測試。使用具有C端His-標籤的CD蛋白(CDoem3-H)作為陰性蛋白對照組(NP)。首先，將細胞用4mL含有2μM NP或單域抗體-CD的培養基重懸回溶並在37℃靜置1小時。各細胞株使用ATCC建議的生長培養基：A431：CRL-1555TM；FaDu：HTB-43TM；Cal 27：CRL-2095TM；BxPC-3：CRL-1687TM。細胞隨後使用PBS清洗3次並以30,000細胞/孔重新接種到96孔板中。向板孔中添加指定濃度的5-FC並在37℃靜置72小時。培養後，添加10μl細胞增 殖試劑WST-1並將混合物在37℃靜置3小時。使用ELISA測讀儀在OD450和OD690測定細胞存活。結果表明，抗EGFR單域抗體-CD融合蛋白降低了所有受測癌細胞株的存活率(第10A圖和第10B圖)。
實施例12 在A431異種移植模型上的單域抗體-CD蛋白測試
以NOD-SCID雄性小鼠中的A431異種移植模型(LASCo)評估了7D12-CDoem3或7D12-CDoem3-H融合蛋白的治療效果。將2.5×106 A431腫瘤細胞皮下注射至體重為20-27g的小鼠的右側。在腫瘤尺寸達到200-300mm3後(腫瘤移植後大約10天)，將小鼠隨機分配至不同治療組(n=6)。在4週中每週2次施用所示量的空載劑(PBS)、5-FU(腹膜內)、5-FC(腹膜內)和單域抗體-CD融合蛋白(靜脈內)。測定腫瘤的固體重並通過T-檢驗，評估腫瘤體積的差異的顯著性。
靜脈給予20mg/kg或40mg/kg的7D12-CDoem3-H或7D12-CDoem3，併用腹膜給予劑量為500mg/kg的5-FC，可導致A431腫瘤生長的顯著減少，此顯示於在腫瘤細胞移植後，腫瘤體積和腫瘤質量與空載劑處理的組別相比均有減少(p<0.01)(第11A圖和第11B圖)。這證實7D12-CDoem3-H或7D12-CDoem3與5-FC的合併給藥對於體內A431癌細胞生長具有抑制性效果。
實施例13 T細胞表位定位
針對91個肽的進行EpiScreenTM T細胞表位定 位(epitope mapping)，結果顯示有包含6個表位的六個肽對T細胞具有陽性反應。利用iTopeTM，在可誘導T細胞陽性增殖反應的肽中，鑒定出9個潛在的HLA-DR限制性結合序列。
總體而言，在7D12-CDoem3序列內鑒定出6個T細胞表位，表位1-3位於7D12單域抗體的框架區，而表位4-6位於CD區域。
實施例14 單域抗體-CD融合蛋白的單一表位變異體
設計了7D12-CDoem3-H的各個單一表位變異體來評估這些變異體是否在消除免疫源性的同時能保持其結構、溶解度、CDase活性和抗原結合活性。
藉由重疊PCR生成了43個單一表位變異體的表達質體。這些融合蛋白變異體被生產並評估其CD活性、EGFR結合活性和表達情形。結果總結在第12圖中。
資料顯示，所有EGFR結合結構區域取代(TC3-001~TC3-027)對EGFR結合能力都沒有顯著影響。所有具有修飾的表位4和表位5的8個變異體(TC3-028 ~TC3-035)喪失其CDase活性。具有修飾的表位6的變異體(TC3-036~TC3-043)受到的影響較小。
基於表達濃度、生物學活性和與人種系的序列相似性(EGFR結合結構域)，選擇以下變異體用於多突變設計(相對於SEQ ID NO：17編號)：
a.表位1：S12V、V13A、T15V、G16D和S18D
b.表位2：K88R、P89A、I94V、K88D、K88T
c.表位3：I94R、I94Q
d.表位4：Y224H
e.表位6：V268A、V268T、V269T
實施例15 單域抗體-CD融合蛋白的單表位變異體
藉由重疊PCR生成了43個TC3多突變變異體的表達質體。這些融合蛋白變異體被生產並評估其CD活性、EGFR結合活性和表達情形。結果總結在第13A圖和第13B圖中。
基於表達濃度、生物學活性、生理學特性和消除T細胞表位的覆蓋程度，進一步選擇5個候選多變異體來評估其免疫原性潛能。
實施例16 免疫原性分析
使用EpiScreenTM時間周期T細胞測定評估了7D12-CDoem3的5個變異體的免疫原性潛能。使用移除CD8表現的PBMC以建立基底培養細胞，添加樣品後不同時間點的CD4+ T細胞增殖是通過放射性[3H]-胸苷嵌入量測 定。在8天後也通過ELISpot測定了IL-2的分泌。對TC4(樣品1)和其它4種融合蛋白候選物進行了測試。
EpiScreenTM時間周期T細胞增殖測定
一組52個的供體被選擇來最佳地呈現歐洲人/北美人和世界人群表達的HLA-DR和HLA-DQ同種異型(allotype)的數量和頻率。來自每個供體的PBMC被重新懸浮在AIM-V®中達4×106-6×106PBMC/mL。測定的重組蛋白的最終樣品濃度為0.3μM。將細胞培養總共8天。在第5、6、7和8天，將各孔中的細胞於100μL AIM-V®培養基中加入0.75μCi[3H]-胸苷(Perkin Elmer®,Beaconsfield，英國)做為脈衝標記，並再培養18小時，其後使用TomTec Mach III細胞收集器收集至過濾墊上(Perkin Elmer®,Beaconsfield，英國)。以視差低背景計數在1450 Microbeta Wallac Trilux液相閃爍計數儀(Perkin Elmer®,Beaconsfield，英國)上通過閃爍計數來測定各孔的每分鐘計數(cpm)。
EpiScreenTM IL-2 ELISpot測定
以來自同組供體的PBMC進行IL-2 ELISpot 測定。將ELISpot反應盤(Millipore,Watford，英國)用IL-2捕獲抗體(R&D Systems,Abingdon，英國)預先潤濕並塗覆過夜。將各供體的細胞密度調節至在AIM-V®培養基中為4×106-6×106PBMC/mL，並向各樣品孔添加100μL細胞。向適當的樣品孔內添加50微升樣品和對照。在8天培養期之後，根據製造商之操作說明(R&D Systems)將ELISpot板顯影，簡言之，清洗反應盤然後添加生物素標記的檢測抗體(R&D Systems,Abingdon，英國)，在37℃靜置1.5小時後，將反應盤再用PBS清洗三次，並添加過濾後的鹼性磷酸黴標記的鏈黴親和素(streptavidin-AP)(R&D Systems,Abingdon，英國)於室溫靜置1小時。除去streptavidin-AP，並將反應盤用PBS清洗三次。向各樣品孔添加100微升BCIP/NBT受質(R&D Systems,Abingdon，英國)並在室溫靜置30分鐘。通過用dH2O清洗樣品孔和孔的背部3次而終止斑點顯色。在Immunoscan®分析儀上掃描經乾燥的反應盤並使用Immunoscan®第5版軟體確定每孔斑點數(spw)。
對於細胞增殖測定和IL-2 ELISpot測定，測前已確立了刺激指數(SI，stimulation index)的經驗閾值是大於或等於1.9(SI1.90)，因此能引起高於該閾值反應的樣品視為陽性的。對於細胞增殖(每時間點n=3)和ELISpot(n=6)，陽性反應是如下通過統計和經驗閾值定義：
1.以獨立樣本T檢驗比較測試組培養基對照孔的測試孔的cpm或spw的值，p<0.05反應認定為反應顯著。
2.SI1.90，其中刺激指數(SI)=測試組平均值(cpm或spw)/基線(cpm或spw)。
第14圖顯示了健康供體T細胞增殖和IL-2 ELISpot反應的總結。在第5-8天期間內皆具有陽性的T細胞反應(SI1.90，顯著p<0.05)者以”P”呈現，IL-2 ELISpot陽性反應(SI1.90，顯著p<0.05)者以”E”呈現。細胞增殖測定與IL-2 ELISpot測定的陽性反應的比例以百分比表示在表格底部欄位。相關性是代表細胞增殖測定與在ELISpot測定中皆為陽性反應的百分比。
由於IL-2 ELISpot測定中的陽性反應的比例較低，僅基於細胞增殖測定反應對樣品做排序。樣品4引起了較高的陽性反應(SI1.90,p<0.05)，在本供體組有25%。樣品1、3和5引起了本供體組12%至15%的的陽性反應，而樣品2對8%的供體組對有陽性反應。樣品2產生了最低的臨床免疫原性風險。
實施例17 減敏單域抗體-CD的功能分析
針對減敏TC4變異體的CD活性和EGFR結合活性進行分析並顯示在第15圖中。
CD活性通過實施例8所述的方法進行測定。
以表面電漿共振(SPR)測定了TC4相關蛋白和EGFR-Fc之間的結合親和力。SPR測定通過Biacore T100(GE Healthcare)進行。將抗人IgG(Fc)抗體以25μg/mL稀釋在固定緩衝液(10mM NaOAc,pH 5.0)中。根據製造商操作步驟指南，將抗體經標準胺基偶合(amine coupling)化學反應固定在感測晶片CM5(Series S Sensor Chip CM5,GE；目錄號：29104988)上。此過程應產生約9000RU結合量的水準。流動相為PBST且流動池中的溫度維持在25℃。固定後，將配體溶液(人類EGFR-Fc蛋白，在流動相中為2μg/mL)注射至系統，接觸時間120s，流速10μL/min。其後，將TC4-wt或TC4-突變異體在PBST中稀釋為0.74nM、2.22nM、6.67nM、20nM和60nM，並以低濃度至高濃度注射至系統。分析物注射的條件為：對各濃度的接觸時間為120秒，在最終步驟解離樣品600秒。用Biacore T100評估軟體進行分析。各樣品的單循環動力學分析物的分析結果以二階段反應套入以確定KD值。所述結果的指標為最大結合量(Rmax)應在50~250RU範圍內。
結果顯示，與原始型TC4相比，TC4變異體TC4-44、50、51和87的EGFR結合能力和CD活性類似(第15圖)。
<110> 順天醫藥生技股份有限公司
<120> 單域抗體-胞嘧啶脫氨酶融合蛋白
<140> 108100438
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<223> 未知的描述TC3-087 S12V,T15V,K88R,P89A,I94V,V268A sequence
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 未知的描述 TC3-089 V13A,K88T,I94R,V268A,V269T sequence
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述TC3-090 V13A,K88T,I94R,Y224H,V268A sequence
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述TC4_44(S12V,T15V,K88R,P89A,I94V,V268A)sequence
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述 TC4_50(V13A,K88T,I94R,V268A)sequence
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述TC4_51(G16D,K88T,I94R,V268A)sequence
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述TC4_87(S12V,T15V,K88R,P89A,I94V,V268A,V269T)sequence
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of yeast cytosine deaminase WITH methionine
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<210> 187
<211> 158
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of mutant yeast cytosine deaminase WITH methionine
<400> 187
<210> 188
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V268A(V128A)WITHOUT methionine
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<211> 158
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V268A(V129A)WITH methionine
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V269T(V129T)WITHOUT methionine
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<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V269T(V130T)WITH methionine
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<211> 157
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V268A,V269T(V128A,V129T)WITHOUT methionine
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<211> 158
<212> PRT
<213> 未知
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<223> 未知的描述Protein sequence of Cdoem V268A,V269T(V129A,V130T)WITH methionine
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<213> 未知
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<223> 未知的描述Polynucleotide sequence encodes TC4_50(V13A,K88T,I94R,V268A)
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<212> DNA
<213> 未知
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<223> 未知的描述Polynucleotide sequence encodes TC4_51(G16D,K88T,I94R,V268A)
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<212> DNA
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<223> 未知的描述Polynucleotide sequence encodes TC4_87(S12V,T15V,K88R,P89A,I94V,V268A,V269T)
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<212> PRT
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<223> 未知的描述2D3 CDR1 sequence
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Claims (73)

  1. 一種融合蛋白，包含式I或式II，其中：式I係N-(L)n-C；且式II係C-(L)n-N；其中，N係一單域抗體(sdAb)或其功能性變異體，L係一連接胜肽，n=0-50，且C係一胞嘧啶脫氨酶(CD)蛋白或其功能性變異體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之融合蛋白，其中，n=0。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之融合蛋白，其中，n=1。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之融合蛋白，其中，n=2。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之融合蛋白，其中，該融合蛋白基本上係由式I或式II所組成。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之融合蛋白，其中，該融合蛋白係由式I或式II組成。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體可與一標靶結合，其中該標靶係可選地選自由細胞膜分子、分泌性分子和胞內分子所組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之融合蛋白，其中該標靶係一腫瘤相關抗原或一腫瘤特異性抗原。
  9. 如申請專利範圍第7或8項所述之融合蛋 白，其中，該標靶係選自由以下組成的群組：EGFR、5T4、A33、AFP、β-連環蛋白、BRCA1、BRCA2、C242、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23、CD30、CD3、CD37、CD40、CD44、CD5、CD51、CD52、CD56、CD64、CD74、CD80、CDCP1、c-KIT、COX-2、cMET、CSF1R、CTLA-4、EGF2、ErbB2、ErbB3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HER3、HIF-Ia、HLA-DR、IGF-IR、mTOR、NPC-1C、P53、PDGFRα、PDGFRβ、PLGF、PSA、RGMa、RoN、TNF、TP53、TPD52、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、FAP、醣蛋白75、TAG-72、MUC16、NR-LU-13、SLAMF7、EGP40、BAFF、PRL-3、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、MART-1、gp100、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、hTERT、間皮素、MCC、Mum-1、ERBB2IP、EpCAM、TfR、整合素α6β4、HGFR、PTP-LAR、CD147、CDCP1、CEACAM6、JAM1、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-1、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
  10. 如申請專利範圍第7或8項所述之融合 蛋白，其中，該標靶係選自由以下組成的群組：EGFR、c-KIT、cMET、HER2、HER3、FGFR1、FGFR2、FGFR3、IGF-IR、P53、PDGFRα、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、CA-IX、αvβ3、α5β1、MUC16、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原、癌症睾丸(CT)抗原(例如：NY-ESO-1、MAGE-A3、MAGE-A1)、間皮素、EpCAM、整合素α6β4、CEACAM6、整合素α3β1、整合素αvβ3、PD-L1、AXL、CDH6、DLL3、EDNRB、EFNA4、NEPP3、EPHA2、FOLR1、LewisY、GPNMB、GUCY2C、HAVCR1、整合素α、LYPD3、MUC1、NECTIN4、NOTCH3、PTK7、SLC34A2、SLC39A6、SLC44A4、SLITRK6、STEAP1、TACSTD2、TPBG、TIM-1、GD2和煙鹼型乙醯膽鹼受體(nAChR)。
  11. 如申請專利範圍第7至10項中任一項所述之融合蛋白，其中，該標靶係VEGFR2、EGFR、CEA、HER2或HER3。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中，該標靶係VEGFR2。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中，該標靶係EGFR。
  14. 如申請專利範圍第11或12項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：34組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：32和 SEQ ID NO：35組成的群組；和一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：36組成的群組。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：23(3VGR19)的胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：24(4VGR17)的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：25(4VGR38)的胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第11或13項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：40組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：41組成的群組；以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：42組成的群組。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：26(VHH122)的胺基酸序列。
  20. 如申請專利範圍第18項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：27(7D12)的胺基酸序列。
  21. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：202和SEQ ID NO：205組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：203和SEQ ID NO：206組成的群組；以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：204和SEQ ID NO：207組成的群組。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：69(2D3)的胺基酸序列。
  23. 如申請專利範圍第21項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：70(5F7)的胺基酸序列。
  24. 如申請專利範圍第21項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：71(47D5)的胺基酸序列。
  25. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含：一序列為SEQ ID NO：208之互補決定區1(CDR1)，一序列為SEQ ID NO：209之互補決定區2(CDR2)，和一序列為SEQ ID NO：210之互補決定區3(CDR3)。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：75(BCD090-M2)的胺基酸序列。
  27. 如申請專利範圍第11項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含：一互補決定區1(CDR1)，選自由SEQ ID NO：211和SEQ ID NO：214組成的群組；一互補決定區2(CDR2)，選自由SEQ ID NO：212和SEQ ID NO：215組成的群組；以及一互補決定區3(CDR3)，選自由SEQ ID NO：213和SEQ ID NO：216組成的群組。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：77(ABS29544.1)的胺基酸序列。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之融合蛋白，其中，該單域抗體或其功能性變異體包含SEQ ID NO：79(NbCEA5)的胺基酸序列。
  30. 如申請專利範圍第1或3-29項中任一項所述之融合蛋白，其中，至少一個連接胜肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：188的胺基酸序列。
  31. 如申請專利範圍第1-30項中任一項所述之融合蛋白，其中，該CD蛋白或其功能性變異體是：(i)一細菌CD蛋白或其功能性變異體、或者(ii)一酵母菌CD蛋白或其功能性變異體。
  32. 如申請專利範圍第31項所述之融合蛋白，其中，該CD蛋白或其功能性變異體包含一胺基酸序列，該胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187組成的群組 的胺基酸序列，具有至少90%相似度、至少91%相似度、至少92%相似度、至少93%相似度、至少94%相似度、至少95%相似度、至少96%相似度、至少97%相似度、至少98%相似度、至少99%相似度或100%相似度。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之融合蛋白，其中，該CD蛋白或其功能性變異體包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187組成的群組。
  34. 如申請專利範圍第32項所述之融合蛋白，其中，該CD蛋白或其功能性變異體由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187組成的群組。
  35. 如申請專利範圍第31或32項所述之融合蛋白，其中，該CD蛋白或其功能性變異體係一具有一起始胺基酸序列的功能性變異體，該起始胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：186和SEQ ID NO：187組成的群組；其中，當該起始胺基酸序列係SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22時，該功能性變異體包含至少一個突變，該突變選自由Y84A、Y84H、T85D、T86E、M92N、M92A、M92K、M92Q、V128A、V128T、V129A、V129L、V129I、V129T、V130A和V130T組成的群組；且其中，該起始胺基酸序列係SEQ ID NO：186或SEQ ID NO：187時，該功能性變異體包含至少一個突變，該突變選自由V85A、 Y85H、T86D、T87E、M93N、M93A、M93K、M93Q、V129A、V129T、V130A、V130L、V130I、V130T、V131A和V131T組成的群組。
  36. 如申請專利範圍第1-12項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含：一抗VEGFR2單域抗體或其功能性變異體、及一CD蛋白或其功能性變異體。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：(i)SEQ ID NO：7,(ii)SEQ ID NO：7的第1-297位胺基酸，(iii)SEQ ID NO：9,(iv)SEQ ID NO：9的第1-297位胺基酸，(v)SEQ ID NO：11，和(vi)SEQ ID NO：11的第1-297位胺基酸。
  38. 如申請專利範圍第1-11項中任一項或申請專利範圍第13項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包含：一抗EGFR單域抗體或其功能性變異體、及一CD蛋白或其功能性變異體。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：(i)SEQ ID NO：13,(ii)SEQ ID NO：13的第1-297位胺基酸，(iii)SEQ ID NO：15, (iv)SEQ ID NO：15的第1-297位胺基酸，(v)SEQ ID NO：17，和(vi)SEQ ID NO：19。
  40. 如申請專利範圍第1-11項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含：一抗HER2單域抗體或其功能性變異體、及一CD蛋白或其功能性變異體。
  41. 如申請專利範圍第40項所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：(i)SEQ ID NO：72,(ii)SEQ ID NO：72的第1-297位胺基酸，(iii)SEQ ID NO：73,(iv)SEQ ID NO：73的第1-291位胺基酸，(v)SEQ ID NO：74，和(vi)SEQ ID NO：74的第1-292位胺基酸。
  42. 如申請專利範圍第1-11項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含：一抗HER3單域抗體或其功能性變異體、及一CD蛋白或其功能性變異體。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：(i)SEQ ID NO：76，和(ii)SEQ ID NO：76的第1-300位胺基酸。
  44. 如申請專利範圍第1-11項中任一項所述之融合蛋白，其中該融合蛋白包含：一抗CEA單域抗體 或其功能性變異體、及一CD蛋白或其功能性變異體。
  45. 如申請專利範圍第44項所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含一胺基酸序列，該胺基酸序列選自由以下序列組成的群組：(i)SEQ ID NO：78,(ii)SEQ ID NO：78的第1-293位胺基酸，(iii)SEQ ID NO：80，和(iv)SEQ ID NO：80的第1-296位胺基酸。
  46. 如前述申請專利範圍中任一項所述之融合蛋白，其中，該融合蛋白包含至少一個T細胞表位中的至少一個減敏突變，其中該至少一個T細胞表位係選自由表位1(SEQ ID NO：63)、表位2(SEQ ID NO：64)、表位3(SEQ ID NO：65)、表位4(SEQ ID NO：66)、表位5(SEQ ID NO：67)和表位6(SEQ ID NO：68)組成的群組。
  47. 如申請專利範圍第1項所述之融合蛋白，其中，所述融合蛋白基本上由SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：93-185中的任一個的胺基酸序列所組成，或者基本上由SEQ ID NO：93-181中的任一個的第1-297位胺基酸所組成。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之融合蛋白，其中，該融合蛋白基本上由一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列選自由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184和SEQ ID NO：185組成的群組。
  49. 一種藥物組合物，該藥物組合物包含：一有效量的前述申請專利範圍中任一項所述的至少一種融合蛋白、以及至少一種藥學可接受的載劑或賦形劑。
  50. 一種在一有需要的受試者中治療癌症之方法，該方法包括對該受試者施用申請專利範圍第1-48項中任一項所述之至少一種融合蛋白或者申請專利範圍第49項所述之藥物組合物。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之方法，其中，該至少一種融合蛋白或該藥物組合物係注射施用。
  52. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，該方法更包括對該受試者施用一有效量的胞嘧啶脫氨酶的受質。
  53. 如申請專利範圍第52項所述之方法，其中，所述受質包含一5-氟尿嘧啶的前藥。
  54. 如申請專利範圍第53項所述之方法，其中，該5-氟尿嘧啶的前藥係選自由5-氟胞嘧啶(5-FC)、Toca FC、5-FC類似物、以及它們的光活化性化合物、鹽或酯所組成的群組。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之方法，其中，該前藥係5-FC。
  56. 如申請專利範圍第50-55項中任一項所述之方法，其中，所述癌症係選自由結腸癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、基底細胞癌、鮑溫病、子宮頸癌、眼表鱗狀瘤、黑色素瘤、腎細胞癌、肺癌、膀胱癌、膽囊癌、喉癌、肝癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、前列腺癌、結直腸癌、頭頸癌、 膽管癌、食道癌、骨癌、子宮內膜癌、卵巢癌、軟組織肉瘤和Merkel細胞癌組成的群組。
  57. 如申請專利範圍第50-56項中任一項所述之方法，其中，該癌症係一實體腫瘤。
  58. 如申請專利範圍第57項所述的方法，其中，該實體腫瘤是結腸癌、結直腸癌、胰臟癌或頭頸癌。
  59. 一種診斷一患有癌症或有風險患癌症的受試者之方法，所述方法包括：(i)將申請專利範圍第1-48項中任一項所述的至少一種融合蛋白或申請專利範圍第49項所述的藥物組合物與該受試者的細胞或組織接觸以形成一複合體，以及(ii)檢測該複合體的存在。
  60. 一種核酸分子，該核酸分子包含一編碼申請專利範圍第1-48項中任一項所述之融合蛋白的核酸序列，其中，該核酸分子係可選地包含一經密碼子優化的核酸序列。
  61. 如申請專利範圍第60項所述之核酸分子，其中，該核酸分子基本上係由一核酸序列所組成，該核酸序列選自由SEQ ID NO：8、10、12、14、16、18、20、195、196、197和198組成的群組。
  62. 一種載體，該載體包含申請專利範圍第60或61項所述的核酸分子。
  63. 一種宿主細胞，該宿主細胞包含申請專利範圍第62項所述的載體。
  64. 如申請專利範圍第63項所述之宿主細胞，其中，該宿主細胞係一非哺乳動物細胞。
  65. 如申請專利範圍第64項所述之宿主細胞，其中，該宿主細胞係一酵母菌細胞或一細菌細胞。
  66. 如申請專利範圍第65項所述之宿主細胞，其中，該宿主細胞係一大腸桿菌細胞、一古細菌細胞或一放線菌細胞。
  67. 如申請專利範圍第66項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞係一大腸桿菌菌株，所述大腸桿菌菌株提供一形成雙硫鍵的細胞質環境。
  68. 如申請專利範圍第67項所述之宿主細胞，其中，該大腸桿菌菌株係經一染色體基因套持續地表達一細胞質雙硫鍵異構酶。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之宿主細胞，其中，該細胞質雙硫鍵異構酶係DsbC。
  70. 如申請專利範圍第67項所述之宿主細胞，其中，該大腸桿菌菌株係SHuffle® T7、SHuffle® T7 Express、SHuffle® Express、OrigamiTM或Rosetta-gamiTM。
  71. 一種製備融合蛋白之方法，該方法包括在一宿主細胞中表達申請專利範圍第60或61項所述的核酸。
  72. 如申請專利範圍第71項所述之方法，其中，該宿主細胞係經細胞工程改良，以改善該融合蛋白的活性、細胞質生產和/或穩定性。
  73. 如申請專利範圍第72項所述之方法，其中，該方法產生了一具有雙硫鍵的融合蛋白，該融合蛋白 的活性、細胞質生產和/或穩定性與非經細胞工程改良的相同宿主細胞所產生的融合蛋白相比增加了2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
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