DE1792298A1

DE1792298A1 - Immunochromatographische Verteilung von loeslichen Antigenen

Info

Publication number: DE1792298A1
Application number: DE19681792298
Authority: DE
Inventors: Carvalho Sergio De
Original assignee: Rand Development Corp
Current assignee: Rand Development Corp
Priority date: 1968-08-16
Filing date: 1968-08-16
Publication date: 1971-07-08

Description

Immunochromatographische Verteilung von löslichen Antigenen ese Erfindung betrifft die Herstellung von unlöslicken, immunen r-Globulinen, in denen die AntiktSrperfunktion durch das unlöslichmachen des γ-Globulins nicht veräandert wird, Verwendungen solcher unlöslichen Antikörper bei der Herstelkuig spezifischer Antigene gegen Krebs, Viren, Bakterien oder andere krankheitsereugende Organismen, sowie die Ankopplung chemotherapeutische Wirkstoffe an spezifische Antikörper.
Ein eigentümliches Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines praktischen und wirksamen Verfahrens zur Herstellung eines injizierbaren, hyperimmunen γ-Globulin-Konzetrats, das für die Behandlung von Krebs, Leukämie und anderen Krankheiten, einschliesslich denjenigen, die durch Viren oder Bakterien verursacht werden, verwendet werden kann.
Da dis Herstellung eines injizierbaren, byperimmunen Antileukämie- oder Anti-Tumor-Clobulin-Konzeintrate einen besonderz bevorzugt Ausfübrungsform der Erfindung ist, wird ln der nachfolgenden Beschreibung zum Zwecks der veranschaulichung die Herstellung eines solohen Konzentrats im einzolnan beschriebenl as versteht sich aber, dass das Unlöslichmaschen von antikörpern für die Absorption apezifischer Antigens viel universeller anwandbar lst und demzufolge die beschriebene Ausführungsform nicht als die Erfindung begrenzend, sondern ledigis1 eriäute USbfta' st'.b Man welss heute, dass die zellen eines normalen bew. gesunden Menschen eine normale Zusammansetzung ron sich ergänzenden Proteinen zeigt, die von der besonderen Zellart und den Funktionen, welche aie im Körper ausüen, etwas abhängig ist.
Im Gegensatz dazu enthalten dt. einem Karzinon entnommenen Zellen inige der in der normalen Zusammunsetzung vorkommenden Protein£, und daneben sind gewöhnilich einige abnormtie Proteine vorhanden, die entweder neu erworbene Proteine sind, welche gewöhnlich nicht in der Zelle vorkommen, oder solche Proteine sind, welche zwar gewöhnilich in des normalen Zusammensetzung von Protsinen vorhanden sind, welche aber in nicht vollständig bekannter Weise verändert worden sind. In beiden Fällen jedoch geben diese abnormalen Proteine der Zelle Krebsnatur. In der folgenden Beschreibung können die Ausdrtlcke Krebs, leukämie und Tumor dazu verwendet werden, um Zellen zu bezeichnen, die durch Dle Anwesenheit einer solchen Abnormalität gekennzeichnet sind.
Die klassische Methode zur Erzeugung von Antikörpern gegen die für Krebszellen charakteristischen, abnormalen Proteine war die, dass das Protein aus einem Karzinom extrahiert und der erhaltene Extrakt, der sowohl normale als aueh abnormale Proteine enthielt, einem oder mehreren Tieren, wie Pferden oder anderen Tieren, injiziert wurde. Wenn irgendein fremdes Protein in ein Tier eirigeftihrt wird, wird die Erzeugung von Stoffen angeregt, die sich mit dem fremden Protein zu vereinigen vennögen. In der vorliegenden Beschreibung sdll der Ausdruck Antigen solche fremden Proteine identifizieren und der Ausdruck antikörper die in das Blut abgegebenen Stoffe, welch. sich mit solchen Antigenen vereinigen, bezeichnen.
Da die injizierten Proteine dem neuen Wirtskörper fremd" waren, schritt dieser zur Erzeugung von Antikörpern gegen diese injizierten Proteine, und zwar von zwei Arten von Antikörpern, nämlich einer ersten Art gegen die normalen Proteine und einer zweiten Art gegen die abnormalen Proteine0 Nach einer geeigneten Zeitspanne, während deren das Wirtstier diese Antikörper entwickelte, wurde das Tier zur Ader gelassen, und die Antikörpermischung wurde dann als der γ-Globulinnateil des Blutes durch Zentrifugieren und andere physikalizche Methoden aus dem Blut gewonnen. Die Trennung der beiden Arten ton Antikörpern in dieser Mischung voneinander hat sich als äusserat schwierig erwiesen, und, soweit bekannt, ist noch keine praktisch durchführare methode zur herbeiführung dieser Trennung und zur Gewinnung der gewünschten Antickörper gegen die abnormalen Proteine in ausreichender Mende, um ihre Vernendung bei der Behandlung von Tumoreu und Leukämien ohne Beeinträchtigung ihrer Wirksamkeit zu gsutatten, entworden worden.
Die vorliegende Erfindung ist hauptsächlich auf ein Verfahren zur Überführung des löslichen γ-Globulins, das die antikörper gegen normales Humanprotein enthält, in ine unlösliche Verbindung ohne nachteillge Beeinflussung der antkärperfunktion und des erhaltenen Produktes wie auch auf die Verwendung des Produktes zur Abrtennung der normalen antigenen aus der bislang erhältlichen mischung von normalon antigendn und bösartigen Antigenen gerichtet.
Obgleich der unläsliche Antikörper ein Antikörper gegen Viren, Bakterien oder andere Arten von Organismen sein kann, hat sich die Erfindung bei der Herstellung von unlöslichen, immunen γ-Globulinen als besonders günstig erwiesen und wird unter Bezug auf diese, thsbesondere unter Bezug auf die Gewinnung von tumorspezifischen Antikörpern beschrieben. wobei es sich versteht, das es sich hierbei um eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung handelt und dass die Erfindung viel allgemeiner anwendbar ist.
Sobald das unlösliche, immune γ-Globulin erzeugt ist, wird es als Mittel zur Abtrennung der normalen Proteine von den abnormalen Proteinen in einer Mischung derselben verwendet, wie nachfolgend beschrieben werden wird.
Dannach können die abnormalen Proteine einem zweiten Wirtstier injiziert werden, damit Antikörper, die nur gegen die abnormalen Proteine wirken, erzeugt werden, und die erhaltenen tumorspezifischen Antikörper (TSA) können dann gewonnen und für die Krebshshandlung und Krebsdiagnose verwendet werden.
In einer "Segregation of antigens from Human Leukemic and Tumoral Cells by Fluorocarbon Estraction" betitelten Veröffentlichung, die in The Journal of Laboratory and Clinical Medicine, Bd. 56, No. 3, Seiten 333-341, September 1960 erschien, ist ein Verrahren zum Estrahieren der antigenen aus Geweben beschrieben.
In einer anderen Veröffentlichung wurde die Methode zum ZUchten von Antikörpern beschrieben (Cancer Bd. 16, No. 3, März 1963, Seiten 306 et seq).
Jeder der verschiedenen schritte soll nun mit weitergehenden Einzelheiten beschrieben werden. Dabei ist jedoch zu bemerken, da in machen Fällen bei dem einzelnen Schritt eine bekannte Arbeitsweise in einer sonst unbekannten und neuartigen Kombination von Schritten herangezogen wird.
Die Zeichnungen stellen folgendes dar: fig. 1A ist ein schematisches Filiess-Schema für die Herstellung von y-Globulin; Fig. 1B ist ein schematisches Pliess-Schema fur die Herstellung einer Polyglobulin-Säule; Fig. 1C ist ein schematisches fliess-Schema rWr die Verwendung der Verfahren gemäss den Fig. 1 und 2 tür die Erzeugung von tumorspezifischen Antikörpern; und Fig. 1D zeigt dis Verwendung des Produktes gemäss Fig. 3 bei der Herstellung eines verwandten, erfindungsgemässen Produktes; Fig. 2 stellt eine Einheit dar, die aus der Umsetzung zwischen dem γ-Globlin und dem Tetrazobenziden entsteht; und fig. 3 ist eine ahematische Darstellung des Produktes, das bei der aufeinanderfolgenden Verkopplung der Einheiten gemäss Fig. 2 unter Bildung des Polymeren der Polyglobulinsäule entsteht.
1. Züchtung von Antikörpern Zur Züchtung von Antikörpern in einem Wirstier ist es zunächst notwendig, aus normalen Geweben (oder festen Tumorgeweben oder leukämischen Geweben) Antigen zu extrahieren.
Die verwendeten Gewebe wurden bislang bei der Chirurgie oder aus Autopsien, die innerhalb von 4 Stunden Moh dem Tode vorgenommen wurden, erhalten. nachfolgend wird eine Liste von noramlen und neoplastischen Geweben gebracht, aus denen Antigene nach as unten beschriebenen Methode gesammelt wurden: NORMAL Knochenmark Magen Gehirn Brust, funktionierend Niere Krummdarm Dickdarm Leber Lunge Skelettmuskel Ovarium, funktionierend Hiryanhang Milz Haut Omentum Hode subkutanes Fett Thymusdrüse schilddrüse Mutterkuchen Speiseröhre Gegärmutter ges altes Blut BÖSARTIGE I. a. Karzinome: Brust Dickdarm Bronchogen alveolar Ovarium sigmaförmiger Dickdarm Schilddrüse Krummdarm Gebärmutterhals b. Sarkome: Fibrosarkom, Bein Retikulumzellensarkon, mediastinal Liposarkom, Schenkel Melan saarkom c. ver schiedene Tumore: Astrocytoma IV, Gehirn Thymoma II. leukämische Gewebe: Lymphosarkom lymphocytisches Lymphome.
Milz mit akuter lymphatischer leukämie Milz mit akuter Stengelzellen ("stem cell")-leukämie Prostata Bauchspeicheldrüse Mastdarm Magen Niere Eileiter Leerdarm Haut Die Gewebe werden nach Entfernung von stark nekrotischen Teilen, Fett, Klumpen, bindegewebe und dem Abtupfen von impränierenden Flüssigkeiten eingefroren.
Es werden drei antigenisohe Präparate hergestellt: Eines aus normalen Geweben, eines aus festen Tumorgeweben und eines aus leukämischen Geweben. die oben aufgeführten Lymphomagewebe wurden unter den leukämischen geweben aufgenommen. Festgelegte Mengen an zerriebenen, gefrorenen Geweben werden gewogen und zur Bereitstellung von getrennten Mischungen von normalen Gewben, Tumorgeweben oder leukämischen Geweben gemischt. Jede dieser Mischungen wird dann getrennt. verarbeitet.
Die verwendete Methode, die praktisch die in Journal of laboratory and Clinical Medicine (Bd. 56, No. 3, Seite 334, September 1960) beschriebene ist, ist die nachstehende: Das gefrorene, zerriebene Gewebe wird bei 1-5 zu 1-10 Gewicht? Volumen mit GBS bei pH 10,4 und -4 0C vermischt. GES ist ein isotonischer Glycinpuffer der folgenden Zusammensetzung: 7,505 gm Glycin 5,830 gm Natriumchlorid 1,840 gm Natriumhydroxid in 100C ml dreifach destillierten Wassers Zu dieser Mischung wird ein gilsiohes Volumen abgeschrecktes Genetron gefügt. Genetron ist der flüssige Fluorkohlenstoff Trifluor-trichlor-äthan. Dieser stoff. der von der firma Allied Chemical Corporation, 40 Reotor Strest, New York, N. Y. zu beziehen ist, wird vor der Verwendung in Glasbehältern bei 47 °C rektipiziert, Dieses Zweiphasen-System wird in einen VirTis-Kolben gebracht, der von einem Eis-Aceton-Bad umgeben ist, und mit dem Rand 85-Homogenisierapparat homoganisiert. Dieser Apparat besteht aus einem Luftrotor, der durch Preasluft (45,4 kg; 100 pounds) angetrieben wird, und einem Schaft, der schaffe Flügel aux rostifreiem Stahl trägt. Während der Homogenisierungszeiträume von 7 bis 10 Minuten beträgt die Temperatur im Inneren der Mischung 2 bis 4 °C bei ang ezeigten Geschwindegkeiten von 80 bis 85000 Umdrehungen je Minute. Das Homogenisat wird dann 10 Minuten lang bei 2 0C und 1400 g zentrifugiert4 Dadurch wird die Mischung in eine wässrige, trübe, überstehende Flüssigkeit und einen gellertertigen bodepsatz getrennt.
Der Satz wird gewonnen, abgeschreckt oder eingefroren, und die überstehende Schicht wird mit Fluorkohlenstoff versetzt und in gleicher Weise wie das ursprüngliche Material homogenisiert. Nach 8 bis 15 ArbeitsgMngen wird kein Bodensatz mehr gebildet. Zu diesem Zeitpunkt enthält die überstehende Flüssig keit kein nachweisbares protein und ist klar und, bestimmt iurch Ultraviolett-Absorptions0, Biuret- und Orcin-Methoden, sehr reich an Ribonucleinsäure. Alle Bodensätze werden dann in rolgender Weise vereinigt: Zunächst werden sie mit einem Glasstab gerührt und eine bestimmte Menge an Fluorkohlenstoff wird ausgedrückt und dekantiert. Dann wird eine festgesetzte Menge an abgeschrecktem GBS (pH 10,4) zu den vereinigten Bodensätzen gegeben, die von numem gründlich suspendiert werden (gewöhnlich 2-1 Volumen/Gewicht). Diese Mischung wird 10 Minuten lang bei 2°C und 1400 g zentrifugiert. die überstehende Schicht wird gewonnen, der Satz wird mit a nem Glasstab gerührt, fluorkohlenstoff wird von de, webrochenen Satz abdekantiert, und die überstehende Sabicht wird zur sinauten Suspendierung des Stzes wieder augegeben, Das Zentrifugieren und derselbe arbeitszyklus werden so lange @@@ führt, bis aus dem Bodensatz, der zum grösseren Teil in lösung ging, kein Fluorkohlenstoff erhalten wird. Auf dies. Weise werden 80 bis 95 % des ursprünglichen Proteinmaterials in Lösung gewonnen. Diese Lösung wird durch Zentrifugieren bei 20 000 g geklärt und 24 Stunden lang unter Rühren gegen isomolare PBS bei 2 0C in Cellophanbeuteln mit einer mittleren Porengrösse von 24 A° dialysiert. Die Proteinkonzentration wird als E 1 cm 280 mn gegen eine Standardverdünnung einer tyrosinreichen Albuminlösung bestimmt. Die Verarbeitung; einer Durchschnittsmenge an gefrorenem Gewebo, d. h. 500 g kann 6 bis 8 Tage benötigen. Währand Ruhozeiten werden die Lösungen eingefroren; wenn aus unerwünschten Orüaden eine Unterbrechung notwendig wird, werden Antibiotika und/oder Konservierungsmittel zugegeben, um Bakterien-, Pilz-und Hefewachstum zu hemmen. 100 Einheiten Thalliumpenicillin, 100 Mikrogramm Streptomycinsulfat und 100 Mikrogramm Mycostatin werden zu einer 1000 ml-Partie gegeben. Als Konservierungsmittel wurde Thimerosal (Merthiolat, Lilly) bis au einer Endverdünnung von 1:10 000 zugesetzt. Diese Stoffe werden bei der Dialyse schliesslich entfernt. Die Endlösung, deren pH-wert elektrometrisch bestimmt (Beckman) 7,2 betrugt, wird duroh grUndliQh gewaschene Asbestkissen (Seitz) filter-sterilistert. Bakterienkulturversuche werden während 7 Tagen in einem flüssigen Thiolyvollatmedim durchgeführt, um die Abwesenheit von Bakterien gemäss den Richtlinien von Sterilitätsprüfungen festzustellen.
Die Proteinausbeute der gefrorenen, zerriebenen Gewebe beträgt im Durchschnitt 4 bis 5 % des ursprünglichen Nassgewichtes für die normalen Oewebe, 2 bis 3 % PUr die festen Tumors und 3,5 bis 4,5 % für die leukämischen Gewebe. Dieses Antigen-Endpräparat enthält durchschnittlich 2 bis 3 g/100 ml Protein. Eine weitere Konzentration kann erreicht werden, indem durch Gqendialyse gegen Carbowax 20M-Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 20 000) oder vorzugsweise in einem Gefriertrockner, wie einem VirTis-Gefriertrookner, entwässert wird, da niedere Glykolpolymere in die Lösung eindringen und mit ihrer Absorption bei 280 mµ in Wechselwirkung treten.
Die aus einer Mischung von normalen Gewben erhaltene Proteinlösung wird zum Immunisieren von Pferden Verwendet. Die Immunisierungsdosis, die einem Pferd von jedem der drei Antigene, und zwar dem normalen, dem Tumor- oder dem leukämischen verabreicht wird, beträgt 35 mg Protein je ml Lösung je 4,54 kg (10 pounds) Körpergewicht je 2 Wochen; sie wird intramuskulär an Stellen, iLe mehr als 15,24 cm von den Stellen, an denen Blut abgezapft wird, ntternt liegen, zugeführt. Die zweite Dosis wird einem vollständigen Freunds'schon Hilfsmittel (Difco Laboratories) (Volumverhältnis 5:1) einverleibt. Wenn der Test anzeigt, dass geeignete Niveaus an ausfällenden Antikörpertitern zum Ernten von Plasma erreicht worden sind, wird alle 2 Wochen nicht weniger als 5 Tage nach der letzten Injektion Blut gesammelt. Das Blut wird mittels geringen negativen Druckes durch eine 13 gauge-Nadel abgezogen, die, in die Jugularvene eingeführt und mit einem Vinylschlauch Verbunden ist; es wird in einem Polyäthylenballon, der 3,8 % natriumcitrat enthält, mit 9 Teilen Blut je 1 Teil anticoagulans gesammelt. Periodisches schwasches Rühren gewährleistet, dass das Anticoagulans gründlich gemisoht wird. Bei jeder Blutentnahme wurden 6 bis 8 1 Blut abgezapft. Das Blut wird bei 2 0C Uber Nacht stehen gelassen, damit es infolge der Schwerkraft absedimentiert. Das Plasma wird angesaugt, bei 1600 g 10 Minuten lang zentrifugiert, damit das y-Globulin sich abscheidet, das dann gemesben und in PolyäthylenbehK1tern ein. gefroren wird, und bis zur Verwendung gelagert. herstellung von Polyglobulin Die vorliegende Erfindung besteht darin, das die inminen γ-Globuline, die aus dem Blut abgetrennt wurden, das aus mit normalen Humanantigenen geimpften Pferden gesammelt wurde, ohne Beeinträchtigung der antikörperfunktion unlöslich gemacht werden.
Kurz gesagt, umfasst dieser Teil des Verfahrens die Umsetzung bifunktioneller Tetrazobenzidingruppen mit dem γ-Globulin, wodurch das letztere, möglicherweise als Ergebnis einer Vernetzung, in eine unlösliche Form übergeführt wird. Das erhaltene Polyglobulin wirkt als ein unlösliches Adsorbens für spezifische Antigene.
Die Arbeitsweise zur herstellung der Polylobulinsäule ist die folgendes A. Diazotierung von Benzidin Die Diazotierung von Benzidin erfolgt auf bekannte Weise und gehört nicht zum Gegenstand der Erfindung. Eine bevorzugte Diazotierungemethods ist die nachstehende: 720 mg Benzidin wurden in 6 1/2 mg 6N HC1 gelöst. Diese Lösung wurde mit 31,5 ml destilliertem Wasser versetzt, wid dann wurde. die erhaltene Lösung aur eine Temperatur zwischen 7 und 8 0c abgekühlt. Unterhalb 6 0c erstarrt diese Zusammensetzung.
37 ml der frisch hergestellten, abgeschreckten Lösung wurden in einen 100 ml fassenden Becher gebracht und mittels einer Mischung von Eiswasser und gewöhnlichem Salz abgeschreckt.
Whhrend das Benzidln bei etwa 7 bis 8 °c gehalten wurde, wurden 14 ml einer vorgekühlten Natriumnitritlösung, die durch Auflösen von 1,3 g NaNO2 in 33 ml destilliertem Wasser und Abschrechken der erdaltenen Lösung auf etwa 8°C hergestellt worden war, in Anteilen von etwa 0,2 nil im Verlaufe von 2 Minuten zu der abgeschreckten Benzidinlösung gefügt, Als Ergebnis des Zusatzes entwickelte sich eine hell strohgelbe Farbe, die während der ganzen Zugabe bestehen blieb.
Unmittelbar nach jeder Zugabe von 0,1 bis 0,2 ml wurde ein in die Lönung eingetauchves Stärke-Jodid-Papier dunkelblau.
Dies zeigte einen Überschuss an dem gerade zugesetzten Nitrit an. Nach 10 Sekunden langem Rühren wurde das nitrit zum Teil gebunden, zum Teil beseitigt, und das Jodidpapier wurde nicht mehr blau. Der Endpunkt wurde duroh Bestehenbleiben der Bläung des Papiers selbst nach 10 bis 20 Sekunden lang währendem Rühren angezeigt. LSeres Ruhren (10 Minuten) beseitigt jedoch wieder die Bläuung des Papiers als Ergebnis der verflüchtigung Uberschüssiger salpetriger Säure. Das Benziden wurde infolge der vorstehend beschriebenen Nassnahmen gemäss der nachfolgenden Reaktionsgleichung vollstängig diazotiert: Die Farbe des Tetrazo-benzidins konnte durch Zugabe von Natriumaoetat hervorgebracht werden. Das Natriumacetat wurde als Lösung hergestellt, indem 4,50 g Natriumacetat in 20,0 ml Wasfler gelöst und die erhaltene Lösung auf etwa 8 °C abgeschreckt wurde. In einen 250 ml fassenden Becher wurden 20,0 ml frisch hergestellter Natriumacetatlösung gebracht. Ünter beständigem Rühren wurde das Tetrazo-benziden im Verlauffe von einer Minute zu der Natriumacetatlösung gegeban, Die Farbe wurde zunächst hellgelblichgrün und änderte sich innerhalb von 3 bis 5 Minuten in gelblichbraun (die Farbe Bchwachen Tees).
B. Mischpolymerlsation von immunem γ-Globulin In einen 1000 ml fassenden Becher wurden 600 ml einer Lösung von 1,6 % γ-Grobulin in 1/15 M nach Sorensen phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2; PBS 7,2) gebracht, Diese Lösung wurde während der Arbeitsvorgänge bei 8 °C gehalten. In einem Zeitraum von 30 Minuten wurden 720,0 mg des wie oben beschrieben frisch hergestellten Tetrazobenzidins unter langsamem Rühren, un Schaumbildung zu vermeiden, zugegeben.
Es wurde 7 Minuten lang gewartet und dann wurden 10 ml 8N-Kaliumcarbonat zugasetzt. Das Rühren wurde waitere 10 Minuten lang fortgesetzt, Das Rühren während der Kopplung verhinderte eine massive Gelatinierung des Globulins. Das Endprodukt besass die Konnsistenz eines Gels. Die Mischung wurde dann in einem Büchnertrichter filtriert und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS 7,2) gewaschen.
C. Herstellung der Polyglobulinsäule Die als Rrgebnis des Wiedersuspendierens des oben beschriebenen Polymerisats erhaltene Aufschlämmung wurde in 60 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS 7,2) wiedersuspendiert. Die Säule vude durch die Schwerkraft. dazugebract, sich zu verdichten; die Fliessgeschwindigkeit des Absorbats in dieser Säule betrug etwa 120 Tropfen je Minute. Die Absorptionen wurden in einen; kalten Raum oder derart durchgeführt, das die Säule und Absorbate mit Kühlvorrichtungen umgeben wurden.
Unter Verwendung einer Aufachlänunung, die aus 80 ml phosphat gepufferter Salzlösung (PBS 7,2) und 9,6 g eines Polyglobulins bestand, das aus Prerd-antinormal-human-γ-Globulin und frisch hergestelltem Tetrazobenziben hergestellt worden war, wurde eine 30 x 1,25 cm-Glassäule mit Hilfe der Schwerkraft verdichtet, und dann wurde eine Proteinlösung aus einer Ansammlung von leukämischen Milzen in die Spule geleitet und mit dem immunen y-Olobulin umgesetzt. Nach 3 Durchängen durch die Globulinsäule reagierte das Eluat weder mit demselben Globulin noch mit Kaninche-Antipferd-γ-Globulin, sondern reagierte zu 2-6 mit einem pferdeimmunen γ-Globulin, das aus Tieren erhalten worden war, die mit den chromatographierten Antigenen immunisiert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen an: 1. In der Säule kam kein lösliches y Globulin vor.
2. Die Absorption normaler Antigene in leukämischen Milzen verlief vollständig.
3. Spezifische, leukimische Antigene wurden in reiner Form isoliert diese Technik stellt eine hochempfindliche und spezifische Methode bereit, um sowohl Analysen. durchzufUhren als auch grosse Mengen an unterschiedlichen Antigenen aus einer Mischung herzustellen wenn einige dieser Antigene zur Herstellung spezifischer γ-Globuline als immunologische Absorbenten zur Verfügung stehen.
In einem anderen Versuch wurden unter Verwendung einer in ähnlicher Weise hergestellten Säule 50 ml, die 4,3 g leu= kämischen Mischproteins ("cocktail protein") in 0,1 M glycingepufferter Salzlösung (pH 10,4) enthieLten, zugegeben Mit dem Absorbat 1, das als Muster verwendet wurde, wurden noch 2 weitere Versuche durchgeführt, welche die Absorbate 2 und 3 ergaben. Darach wurden 50 ml aliquote Teile PES 7,2 zugegeben, und es wurden die Waschlösungen 1 bis 16 erhalten.
Die verschiedenen Fraktionen wurden nach den in Nature 194, Seite 1275 (1962) und in Exp Mol Path, Bd. 3, Ergänzungsband 2, 220 (1964) beschriebenen Präcipitin-Methoden mit den in der untenstehanden Tabelle I angezeigten Ergehnissen geprüft.
Tabelle I Präcipitintiier in einem 2-dimensionalen Titrationssystem Reaktion gegen Pferde-anti- Pferde- Kaninchenhuman-Normal- Antileukämie- Antipferd-Fraktion γ-Globulin γ-Gloublin γ-Globulin normale Mischung 2-7 2-2 0 leukämische Hischung 2-3 2-5 0 Absorbat 1 2-1 2-4 0 Absorbat 1 0 2-5 0 Absorbat 3 0 2-6 0 I, Wäscke 0 2-6 0 6. Wäsche 2-2 0 L.
16. Wäsche () 0 0 Unter Verwendund einer ähnilichen Säule und einer Tumorproteinmischung sanstelle der Leukänieprotoinmischung wurden die in Tabelle II gezeigten Ergebnisse erhalten : T a b e 1 1 e I, Präcipitintiter in einem 2-dimensionalen Titrationssystem Reaktion gegen Pferde-anti- Pferde-anti-Tumornormal-human- γ-Globulin Fraktion γ-Globulin normale Proteinmischung 2-7 2-2 Tumor-Proteinmischung 2-3 2-4 Absorbat ; 2-1 2-3 Absorbat. 2 0 2@@ Absorbat 3 0 2-6 1. Wäsche 0 2-5 6. Wäsche 2-3 0 16. @äsche O 0 Diese Technik ist auch mit anderen als Tumor- odor leukämischen Proteinen wirksam, wie aus dem folgenden Beispiel hervorgeht: Eine Säule mit einer Abmessung von 1 x 0,5 cm wurde mit 13 Tg Polytetanus-antitoxin hergestellt, das durch Umsetzung von Tetrazobenzidin mit Pferde-Tetanus-Antitoxin (Lilly, Partie Hr. 080-823880) als Glabulinkonzentrat, das 3000 neutralisierende Einheiten und 0,22 mg Protein Je ml enthielt, was einem Präcipitintiter von 2-9 gegen ein Tetanus-Toxoid (Lilly), das 15 Lf-Einheiten Tetanus-Tosid je ml enthält, entspricht, hergestellt worden war. Alls der Umrechnung der Volumteile in Präcipitintiter wurde geschätzt, dass die Menge des Toxoide die Gesamtiausfällungskapazität das gesamten Tetanus-Antitoxins in der Säule nicht überstieg. Demgemäss wurden 0,3 ml toxoid in 0,6 ml eines naninchenserums verdünnt, das 4,6 g Protion je 100 ml enthielt, und die Mischung Nurde mittels einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS 7,2) auf ein Vol':nen von 10 ml gebracht. Die gemischte Antigenverdünnung wurde dann zweimal durch die Säule geschicht, und Proben der Absorbate wurden in Präcipitinsystemen peprüft.
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse Angeführt.
Tabelle III Präcipitintiter in einem 2-dimensionalen FällungsSystem Reaktion gegen Schaf-anti- Kaninchen-antikaninchen- Pferd-γ-Globu-+) Fraktion γ-Globulin TAT lin Mischung aus Tetanus-Toxoid und Kaninchenserum 2-3 2-9 0 Absorbat 1 2-3 2-7 0 Absorbat 2 2) 0 0 1. Wäsche 2) 0 .0 3. Wäsche mit PBS pH 7,2 2 2-3 0 16. Wäsche 0 0 0 +) Colorado Serum Co. CS1466, ein schafimmunes Globulin mit einem Präoipitintiter von 2-3 gegen vereinigtes Kaninchen-γ-Globulin Die in den Tabellen 1, II und III zusammengestellten Versuchsergebnisse zeigen folgendes: 1. Dass polymerisierte Pferde-γ-Globulin ist vollständig unlöslich, da durch Umsetzung mit einem kaninchen-anti-Pferd-Globulin hohen Titer keine Spuren in den Absorbaten oder Waschlösungen nachgewiesen wurden.
2. Das Polyglobulin besitzt volle und spezifische Antikörper Wirksamkeit. da es awle normalen Antigene aus der Tumor-Protein-lischung nach 2 Absorptionen zurücknält, ohne die gesamte Anti-Tumor-Wirksamkeit zurückzuhalten, wie durch Reaktich der Absorbate gegen ein pferdeimmunes γ-Globulin, das sowohl anti-normale als auch Antl-Tumor-Wirksamkeit besass, gepräft wurde.
3. Es erfoI.gt keine nicht-spezifische Absorption von nicht spezifischen antigenen, wie sich aus der Tatsache ergibt, dass Leukämie- oder Tumor-Antigene bis zu höheren Titern nach der Absorption durch dio Säule als vor der Absorption, do h. in Mischung mit normalen Antigenen, reagieren. Die Absorption, welche iii der Säule einzutreten scheint, hat die Merkmale einen Immunreaktion.
4. Ein Antigenüberschuss verhinderte Absorption in der Säule.
So wurde keine Absorption von Antigenen nachgewiesen, wenn das Lreifache der in der Xquivalenzzone vorhergesagten Antigenmenge der Säule zugesetzt wurde. Statt dessen wurden die Antigene mg um mg quantitativ alle wieder in den Absorbauten und Waschlösungen gewonnen. unter einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung neuartiger Produkte, die auf der Kopplung des nach dem schema tisch ia Fig. 1C gezeigten Verfahren hergeßtellten Antileukämie-oder antitumor-r-Globulins an verschiedenc chemotherapeutische Verbindungen beruht.
Dieser teil der Errindung lässt sich derart beschreiben, da er die drel in Fig. 4 veranschaulichten Stufen umfasst, nämlich: Diazotierung des Benzidins; Kopplung eines ohemotherapeutischen Mittels an das Benzidin; aud Kopplung der zuletzt genannten Verbindung an antileukämie-γ-Globulin.
Die folgenden Produkte sind für diesen Aspekt der Erfindung repräsentativ: I. I. An Methotrexat gekoppeltes Antileukämie-r-globulin.
XI. An Methotrexat gekoppeltes Antitumor-y-Globulin.
III. An Uracilsenf ("mustard") gekoppeltes Antitumor-γ-Globulin.
Produkt I hat die folgende Zusammensetzung: Pferdehyperimmunes Antileukämie-γ-Globulin 65-90 gm/100 ml-Methotrexat 140-180 mg/100 ml-isctconische Salzlösung-Marthiolat 1:10 000.
Produkt II hat die folgende Zusammensetzung: Pferdehyperimmenes Antitumor-γ-Globulin 65-90 gm/100 ml-Methotrexat 140-180 mg/100 mlisotonische Salzlösung-Merthiolat 1:10 000.
Produkt III hat die folgende Zusammentstzung: Pferdehyperimmunes Antitumor-γ-Globulin 68-162 gm/100 ml-Uracilsenf 180-273 mg/100 mlisotonische Salzlösung-Merthiolat 1:10 000.
Bei dieser Arbeitsweise wird abgeschrecktes Benzidin, wie oben beschrieben, mittels vorgekühlton Natriumnitrits diazotiert.
Lösungen von Urecilsenf (Upjohn) und von Methotrexat (4-Amino-N10-methyl-Pteroy-glutaminslure) werden hergestellt, indem 500 mg; von jeder Verbindung in 12,0 ml IN NaOH gelöst und dann mit 16,0 ml Wasser versetzt werden. Die erhaltene Lösung wurde auf etwa 8 0C abgeschreckt. Das frisch hergestellte Tetrazo-benzidin wurde im Verlaufe von 2 Minutn mit 28,o ml der einen oder der anderen frisch herestellten Lösung versetzt. Die erhaltene Mischung nahm langsam eine dunkelbrüunlch-rote Farbe an, was die Kopplung des Chromogens anzeigt. Man liess die Mischung 7 Minuten lang bei 8 0C stehen. Zur Vervollständigung der Kopplung wurden 10,0 ml 8N Kaliumcarbonat unter heftigem Rühren mit Methotrexat zugetropft. die Farbe der erhalbenen Verbindung (Diazo-diphenyldiazo-mthotrexat oder einfach azolrexat) war tief kaffeebraun und klar. Mit dem Uracilsenf war die Farbe der erhaltonen Verbindung (Tetrazo-benzidin-uracil-Senf) rotorange oder ziegelrarben, und die Mischung war infolge von Gasbildung trübe. Der Endpunkt bei der Zugabe von Methotrexat ist der Punkt maximaler Farbentwicklung ohne Niedersohlagsbildung. Der Endpunkt bei der Zugabe von uracilsenf ist ein klarer Schnittpunkt. Mit Jeder Zugabe wird die Lösung dunkler; am Endpunkt klärt sie sich Plötzlich (von dunkelcola zu ziegelrot). Man lässt die Lösungen ungestört bei 30 0C 45 Minuten bis eine Stunde lang im Dunkon stehen.
Das nach der Arbeitsweise der Fig. 1C hergestellte γ-Globulinreagens wird in einen 250 ml-Becher gebracht, und das azotierte Arzneimittel wird in 10,0 Ulaliquoten Teilen in Abständen von 1 Minute augesetzt. Dieser Endpunkt ist Sehr scharf. Überdies verursaohr ein Überschuss an der Tetrazoverbindung sofort eine irreversible Gelatinierung. Aus diesem Grunde sollte vor jeder neuen Sabe mit 2 Probenröhrchen ("side test tubes"), von denen das eine 1 ml der Mischung und 0,1 ml der Tetrazoverbindung und das andere 1 ml dieser Verbindung und 0,1 ml der Mischung enthält, was die Überschussbedingungen ftlr jedes Reagens schafft, Rücktitration durchgeführt werden. In dieser Stufe darf nur sehr sanft gerührt werden, damit eine Schaumbildung vermiedn wird, welche das protein denaturiert. Nach Erreichen des endpunktes werden unter schwachem Rühren 10,0 ml 8N Kaliumcarbonat zugetropft.
Die gekoppelten γ-Globuline haben praktisch dieselben Farben wie die Tetrazoverbindungen. Spektrophotometrische Messungen der Tetrazoverbindungen und des gekoppelten γ-Globulins sind infolge der spezifischen monochromatischen Absorptionen möglich. Eine quantitative Bestimming von Jedem Element in der Endverbindung ist möglich, wenn Standardlösungen von jedem einzelnen Element und von ihren physikalischen Mischungen angesetzt werden.
Nachfolgend werden die Wellenlängen angegeben, bei denen für die unterschiedlichen Elemente (Fig. 2-a, b und o) äAbsorptionsmaxima auftreten.
Tetrazo-biphenyl-methotrexat (Azotrexat): # max. = 365, 305, 252 mµ #min. = 240, 267, 237 mµ Tetrazo-biphenyl-uracilsenf (azoum); # max. = 400 mµ #min. = 310 mµ γ-Olobulin #max.=280 mµ #min.=250 mµ Das Endprodukt wird als nächstes gegen isotonisches Natrium chlorid dialysiert. Der Stoff wird in Cellophanbeutel gefüllt und diese in 1/100 v/v einer Salzlösung gebrachtes und. es wird 18 Stunden lang gerührt, Das Ausmass der Dialyse, das zur Beseitigung nicht gekoppelter Stoffe erforderlich ist, wird durch Untersuchung der Absorption vor Proben der Kochsalzlösung mit dem Spektrophotometer bestimmt. Die Dialyse wird unterbrochen, wenn in den erwarteten Wellenlöngenbereichen nur die Absorption nieht-chromatischer Kochsalzlösung auftritt. Nach der Dialyse wird das Volumen durch Gefrierverdampfung so eingestellt, daas fast die ursprüngliche Konzentration des y.Globulins erreicht ist.

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zem Abtrerman formate Ausigene und sbnormaler Antigene aus einer Fisehung dersilben, dadures gekennzeichnet, dass man in Stufe (a) ein lösliches anti-normales γ-Globulin hergestellt, indem marn ein nicht denaturiertes normales Protein einem Tier injiziert und das anti-normale γ-Globulin aus dem Blut des genannten Tieres abtrennt, wobei man das nichtdenaturlerto normale Protein erhält, indem man normales Gewebe in einem Fluorkohlenstoffverdünnungsmittel zur Trennung des Gewebenucleoproteins in Nucleinsäure und nicht-denaturiertes normales Protein wiederholt homogenisiert; in der Stufe (b) das lösliche, anti-normale γ-Globulin mit Tetrazobenzidin amsetzt, um ein unlösliches Poly-γ-globulin bereit zu stellen; und in der Stufe (c) die Mischung der normalen und abnormalen Antigene durch eine Säule des genannten Poly-γ-globulins leitet, um die normalen Antigene durch Uttnaetzung mit dem Poly-γ-globulin zu cntfernen und dadurch die abnormalen Antigene von den vormelen Antigenen der genannten Mischung abzutrennen.
2. Verwahren zum Abtrennen normaler Antigene und abnormaler Antigene aus einer Mischung derselben, die man dadurch er halten hat, dass man einen Proteinbestandteil einem Tier injiziert und die Mischung der Antigene aus dem Blut des genannten Tieres gewonnen hat, wobei der Proteinbestandteil dadurch erhalten worden ist, dass leukämische und Tumorzellen in einam Fluorkohlenstoffverdünungsmittel zur Frennung der Zellennucleoproteine in einen Nucleinsäurebestandteil und den genanten, nicht-denaturierten Proteinbestandteil homogenisiert worden sind, dadurch gekennzeiohnet, dass man in Stufe (a) ein unlösliches Poly-γ-globulin hergestellt, das ein Umsetzungsprodukt aus (1) sinem löslichen anti-normalen γ-Globulin, Das Antikörper gegen normale Humanproteine enthält, und (2) Tetrazobenzidin ist; und in Stufe (b) die Mischung der normalen und abnormalen Antigene durch eine Gäule des genannten Poly-γ-globulins leitet, um die normalen Antigene durch Umsetzung mit dem Poly-γ-globulin zu entfernen und dadurch die abnormalen Antigene von der genannten Mischung abzutrennen.
3. Verfaaren zum Abtrennen hormaler Antigene und Abnormeler Antigene aus einer Mischung derselben, die man auß dem Blut eines Tiereß erhalten hat, dem man ein nicht-denaturlertes Protein injiziert hat, wobei das nicht-denaturierte Protcin dadurch erhalten worden ist, dass ein Tumorgewbe in einen, Fluorkohlenstoffverdünnungsmittel bei einer Temperatur von 2 bis 4 0C und bei einer Geschwindigkeit von etwa 80 000 bis 85 000 U/min. homogenisiert worden ist, um einen Nucleinsäurebestandteil und einen Proteinbestandteil der Gewebenucleoproteine bereit zu stellen, und dass die Homogenisierung etw 8 bis 15 nal wiederholt worden ist, um das nicht-denaturierte Protein bereit zu stellen, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stuf (a) ein lösliches anti-normales γ-Globulin herstellt, indem ian eill nicht-denaturiertes normales Protein einem Tier injiziert und das anti-pormale γ-Globulin aus dem Blut des genannten Tieres abtrennt, wobei das nicht-denaturierte normale Protein dadurch erhalten worden ist, dass normales Gewebe in einem fluorkohlenstoffverdünnungs mittel bei einer Temperatur von etwa 2 bis 4 0C und bei einer Goschwindigkeit von etwa 80 000 bis 85 000 U/min. homogenisiert worden ist, um einen Nucleinsäurebestandteil und einen Proteinbestandteil bereit au stellen, und dass danach die Homogenisierung 8 bis 15 mal wiederholt worden ist, um das micht-denaturierte normale Protein bereit zu stellen; in Strufe (b) das lösliche anti-normale γ-Globulin mit Tetrazobenzidin umsetzt, um ein unlösliches Poly-γ-Globulin bereit zu seellen; und in Stufe (c) die Mischung der normalen und abnormalen Antigene durch eine Säule des genannten unlöslichen Poly-γ-globulins leitet, um die normalen Antigene damit umzusetzen und dadurch die abnormalen Antigene aus der genannten Mischung abzutremen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mischung der normalen und abnormalen Antigene aus dem Blut eines Pferdes erhält, dem man einen Proteinbestandteil von leukämischen Gewebenucleoproteinen injiziert hat, die zur Bereitztellung des nicht-denaturierten Proteinbestandteils wiederholt in einem Fluorkohlenstoffverdünnung smittel homogenisiert worden sind.
5. verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mischung der normalen und abnormalen Antigene aus dem Blut eines Pferdes erhält, dem man einen Proteinbestandteil von tumorgewebenucleoproteinen injiziert hat, die zur Bereitstellung des nicht -denaturierten Proteine standteils wiederholt in einem Fluorkohlenstoffverdünnungsmittel homogenisiert worden sind.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, das. die leukämischen Gewebe gesammelte ("oooled") Gewebe sind.
7. Verfahren nach Anspruh 5, dadurch gekennzeicbnet, dass din Tumorgewebe gesammelte aewebe sind.
8. Verfahren zum Abtrennen normaler Antigene und abnormaler Antigene aus einer Mischung derselben, die man aus dem Blut eines Tieres erhalten hat, dem man ein nicht-denaturiertes Protein injiziert hat, wobei das nicht-denaturierte Protein dadurch erhalten worden ist, dass leukämisches Gewebe in einem Fluorkohlenstoffverdünnungsmittel bei einer Temperatur von 2 bis 4 °C und bei einer Geschwindigkeit von etwa 80 000 bis 85 000 U/min. homogenisiert worden ist, um einen Nucleinsäurebestandteil undeinen proteinbestandteil des Gewebenucleoproteins bareit zu Stellen, und dass die Homogenisierung etwa 8 bis 15 mal wiederholt worden ist, um das nicht-denaturierte, Protein bereit zu stellen, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (a) ein lösliches anti-normales γ-Globulin herstellt, indem man eln nicht-denaturiertes normales Protein einem Tier injiziert und das anti-normale y-Globulin aus dem Blut den genannten Tieres abtrennt, wobei das nicht-denaturierte normale Protein dadurch erhalten worden ist, dass normales gewabe in einem fluorkohlenotoffverdünnungsmittel bei einer Temperatur von etwa 2 bis 4 °C und be. einer Geschwindigkeit von etwa 80 000 bis 85 000 U/min. homogenisiert worden ist, um einen Nucleinrebestandteil und einen Proteinsäurebestandteil bereit zu stellen, und danach die Homogenisierung etwa 8 bis 15 ma-1 wiederholt worden ist, um das nicht-denaturierte normale Protein bereit zu stellen; in Stufe (b) das lösliche anti-normale y-Olobulin mit Tetrazobenzidin umsetzt, um ein unlösliches Poly-yglobulin herzustellen; und in Stufe (c) die Mischung der normalen und abnormalen Antigene durch eine Säule des genannten unlöslichen Poly-γ-globulins leitet, um die normalen Antigene damit umzusetzen und dadurch die abnormalen Antigene aus der genannten Mischung abzutrennen.

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