DE2524637A1

DE2524637A1 - Biologische reagentien, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische formulierungen

Info

Publication number: DE2524637A1
Application number: DE19752524637
Authority: DE
Inventors: Sergio Henrique Ferreira; Roderick John Flower; Samuel Wilkinson
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1974-06-04
Filing date: 1975-06-03
Publication date: 1976-01-02
Also published as: FR2273554A1; IL47412A0; FI751633A; DK248775A; CH614221A5; SE7506313L; AU8180175A; ES438163A1; FR2273554B1; NL7506560A; US4110432A; JPS519714A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 860245

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 86, P. O. Box 86 0245 Ihr Zeichen Unser Zeichen 8 MÖNCHEN 80 Your ref. ^{Our ref}- MauerklrcherstraBe 45

Anwaltsakte 26 100
Be/ßch

The Wellcome Foundation Ltd. London / England

"Biologische Reagentien, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Formulierungen"

Diese Erfindung betrifft Conjugate von Prostaglandinen und Frostaglandinanalogen, die Herstellung dieser Conjugate, pharmazeutische Formulierungen, die ein solches Conjugat enthalten, und Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe bei Säugern, wozu man bei

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It (0811)98 8272 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453100

70 43 _TELEX - 05 24 560 BERG d Hypo-Bank München 389 2623

983310 Postscheck München 653 43

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einem Sauger ein solches Conjugat oder eine derartige Formulierung anwendet.

Es wurde überraschend gefunden, daß wenn man einem Sauger ein Prostaglandinconjugat der Formel (i), wie nachfolgend definiert, verabfolgt, man eine Erleichterung, Herabsetzung oder eine Linderung einer bei dem Sauger experimentiell hervorgerufenen pathologischen Schädigung bewirkt, woraus sich der Wert der Conjugate in der Prophylaxe oder Therapie bei Säugern (beispielsweise Menschen, Pferden, Kühen, Schafen, usw.) bei pathologischen Zuständen, bei denen Prostaglandine beteiligt sind, ergibt. Im besond-eren wurde festgestellt, daß wenn man Ratten ein Conjugat von Prostaglandin B₁ (PG-E₁) verabfolgt, man eine Reduktion des Pfotenödems, provoziert durch subplantare Injektion von Carrageen, im Vergleich zu Kontrolltieren, die nicht das Conjugat erhielten, bewirkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft im besonderen Conjugate von Prostaglandinen (wie nachfolgend definiert) der allgemeinen Formel (FS)-COOH, worin (PG) den Teil des Prostaglandinmoleküls, abgesehen von der endständigen Carboxylgruppe, darstellt, mit einem immunogenen Macromolekül, das eine reaktionsfähige freie Aminogruppe enthält, der allgemeinen Formel H₂N-(M) _t worin (M) den Teil des Macromoleküls, abgesehen von der reaktionsfähigen freien Aminogruppe,darstellt. Das Prostaglandin

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und das Macromolekül können unmittelbar conjugiert sein durch eine Peptidbindung zwischen ihren entsprechenden Carboxyl- und Aminogruppen oder über ein Zwischenglied (wie nachfolgend noch erläutert).

Zu den Prostaglandinen (PG), mit denen sich diese Erfindung befaßt und von denen Conjugate gebildet werden können, gehören im besonderen die der Α-Reihe (PGA_x., PGA₂), der B-Reihe (PGB₁, PGB₂), der D-Reihe (PGD₁, PGD₂, PGD,) und der Ε-Reihe (PGE₁, PGE₂, PGE₅). Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß die Erfindung auch Conjugate beinhaltet, die von Analogen der spezifisch oben angegebenen Prostaglandine hergestellt sind, sofern sie die charakteristische Cyelopentan- oder Cyclopentengruppe aufweist oder bei denen diese Gruppe durch eine Cyclohexangruppe ersetzt ist.

Es umfaßt daher eine Klasse von Prostaglandinen und ihren Analogen, mit denen sich diese Erfindung befaßt und von denen die Conjugate gebildet werden können, Verbindungen der allgemeinen Formel

worin R^ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe

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P i

und R ein Wasserstoffatom ist oder die Reste R und

ρ ζ 4

R zusammen eine Bindung bilden, die Reste R"^ und R zusammen eine Bindung bilden, wenn der Rest R ein Wasserstoffatom ist oder sonst beide Wasserstoffatome sind und einer der Reste R-⁷ und R eine Gruppe-X .COOH und der andere eine Gruppe -ΊΓ·CH, ist, worin die Reste X und Tr gleich oder verschieden und jeder der Reste eine Kohlenstoffatomkette mit einer Länge von vorzugsweise 2 bis 8, insbesondere 4- bis 7 und optimal von 6 oder 7 Kohlenstoffatomen ist.

Das immunogene Macromolekül H^-(H) kann beispielsweise die Schlüsselverbindung Haemocyanin sein, ist aber vorzugsweise ein Protein wie Gelatine oder eine Proteinfraktion eines Säugerserums, beispielsweise ein Globulin ( o« ,ß oder &) oder ein Albumin, wobei die Säugerspezies, beispielsweise Mensch, Pferd, Kuh oder Schaf sein kann. Die "reaktionsfähige freie Aminogruppe" der Macromoleküle, die spezifisch oben angegeben wurden, ist eine ,w-Aminogruppe eines Lysinrestes in dem Macromolekül. Sofern das Macromolekül eine Vielzahl derartiger Reste enthält, ist es daher möglich, daß das Conjugat eine Vielzahl von Prostaglandinteilen beinhaltet, wobei diese gleich oder verschieden sein können, obgleich in der Praxis die freien Aminogruppen nicht alle gleich reaktionsfähig sein werden und in gleicher Weise für die Conjugation zur Verfügung stehen. Bei-

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spielsweise wird angenommen, daß das Rinderserum-Albuminmacromolekül 88 Lysinreste und damit 88 freie Aminogruppen enthält, wobei aber angenommen wird, daß nur etwa 30 bis 40 zur Conjugation zur Verfugung stehen. Es ist daher in dem folgenden Beispiel 1 die Herstellung eines Rinderserum-albumin- PGE^-Conjugats, das im Durchschnitt 9»6 Mol PGE,. pro Mol Albumin enthält, im einzelnen beschrieben. Ändert man beispielsweise die Molaranteile des Prostaglandins und des Albumins in dem Reaktionsgemisch (siehe unten), so können Conjugate erhalten werden, wain das Verhältnis (Prostaglandin zu Albumin) 1:1, 20:1, 30:1 oder sogar größer ist.

Es wird angenommen, daß das Humanserum-albumin-Macromolekül 84 Lysinreste enthält, von denen möglicherweise nur etwa 40 zur Conjugation zur Verfügung stehen. Angenommen wird, daß das Human- · -globulin (IgG)-Macromolekül 55 Lysinreste enthält.

Sofern das Conjugat ein Bindeglied (Verbindungsgruppe) enthält, ist diese vorzugsweise ihrer Ar/t nach nicht zu hydrophob und sie sollte nicht übermäßig lange ungebrochene Kohlenwasserstoffketten enthalten. Eine geeignete Klasse von Verbindungsgruppen weist die allgemeine Formel

-CO.(CHp)-CO-I-

-6-

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auf, worin χ » 2 bis 4 und Y

(i) -NH(CH₀) NH-, worin a « 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 4 ist,

(ii) -NH(CH₂)_b1.Z.(CH₂)_b2.NH-, worin b¹ und b² gleich oder verschieden, jedoch vorzugsweise gleich sind und jeder der Reste 1 biö 4, vorzugsweise 2 bis und Z m -O-, -NH- oder -CH(CH)- ist,

(iii) -W.CO.CHg.w''-, worin die Reste W und w'¹ gleich oder verschieden und jeder eine Gruppe,wie in (i) oder (ii) oben definiert,ist und/oder

-HH,CH₂-CONH.CH₂.CO.W²-, worin W² eine Gruppe, wie oben unter (i) oder (ii) definiert, ist, ist.

Unter Bezugnahme auf die vorausgehende angegebene Formel sind das Macromolekül und die Prostaglandinteile über Peptidbindungen mit den entsprechenden links- und rechts ehenden Funktionen des Verbindungsgliedes verbunden und die Wechselwirkung des Verbindungsgliedes, des Macromoleküls und der Prostaglandinteile kann in der folgenden Form

(H)-NH-CO. (CHp) -CO-Y-CO-(PTi)

^- JL

dargestellt werden.

Die Konjugate, mit denen sich diese Erfindung befaßt, können nach irgendeinem Verfahren hergestellt werden, das dem Fachmann zur Herstellung von Verbindungen ana-

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loger Struktur bekannt ist. Wegen der anerkannten Instabilität der Prostaglandine sollte jedoch ihre Handhabung im Laufe der Conjugation so weit als möglich eingeschränkt und sie sollten bei irgendeinem Mehrstufenverfahren (beispielsweise zur Herstellung eines Conjugate einer Verbindungsgruppe) wünschenswerterweise bei der Endstufe eingeführt werden.

Es sollte daher die Herstellung eines Conjugate, das eine Verbindungsgruppe (wie oben definiert) aufweist, die folgende Stufenfolge aufweisen

(a) Herstellung des Derivats (A) (H)-NH-CO.(CH₂)_X.COOH. (A)

aus dem Macromolekül (H)-NH₂, beispielsweise durch Reaktion mit einem geeigneten Säureanhydrid (C0(CH₂)_x.C0)0,

(b) Herstellung aus (A) des Derivats (B) (H)-NH-CO. (CH₂)_x.C0.Y-H (B)

durch Umsetzung mit dem geeigneten bis-Amin H-Y-H,

(c) Kupplung mit (B) des geeigneten Prostaglandins (pIj)-COOH oder mit einem Gemisch von Prostaglandinen zur Bildung des Endeonjugats.

In den vorausgehenden Formeln haben alle Bezeichnungen die oben angegebenen Bedeutungen. Wenn die Gruppe -Y-die Bedeutung -W-CO.CH₂-W'¹- hat, kann das geeignete Derivat (B), wie oben erläutert, auch dadurch herge-

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stellt werden, daß man zunächst das Derivat (M)-MH-CO-(CHp) .CO.Vf-H aus dem entsprechenden Derivat (A) und dem bis-Amin H-W-H bildet, dann dieses Derivat mit dem N-Hydroxysuccinimidoester der Bromessigsäure unter Bildung des aktivierten Derivats

(ü)-NH.CO.(CH₂)_x.CO.W.CO.CH₂.Br

umsetzt und dieses Derivat mit dem geeigneten bis-Amin H-W¹-H umsetzt.

Wenn die Gruppe -Y- die Bedeutung -NH.CH₂.CONH.CH₂-CO.W²-hat, kann das geeignete Derivat (B) auch dadurch hergestellt werden, daß man das geeignete Derivat (A) mit Glycylglycin (NH₂-CH₂-CONH-Ch₂-COOH) kuppelt unter Bildung von

(U)-NH-CO.(CH₂)_X.CO.NH.CH₂.CONH.CH₂.COOH

und dieses Derivat mit dem geeigneten bis-Amin H-W-H umsetzt.

Die Herstellung von Conjugaten,bei denen die Prostaglandin- und Macromolekülteile unmittelbar verbunden sind, sowie die geeigneten Stufen, wie oben beschrieben, zur Herstellung von Conjugaten mit Bindeglied (Verbindungsgruppe) wird vorzugsweise unter Verwendung eines der dem Fachmann bekannten Verfahren zur Förderung der Bildung der Peptidbindung bewirkt, beispielsweise unter Verwendung eines Carbodiimide, unter Ver-

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wendung des Woodward's Reagens K oder unter Verwendung des gemischten Anhydridverfahrens. Sofern man ein Carbodiimid verwendet, ist es vorzugsweise ein solches, wie beispielsweise N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-äthylcarbodiimid und N-(3-Diäthylaminopropyl)-N-äthylcarbodiimid, wonach der entsprechende Harnstoff, ein Nebenprodukt der Reaktion, wasserlöslich ist und daher aus dem Reaktionsgemisch heraus dialysiert werden kann. Zu geeigneten Reagentien für das gemischte Anhydridverfahren gehören Äthylchlorformiat, Isobutylchlorformiat und Isobutylchlorcarbonat und die Reaktion wird wünschenswerterweise in Gegenwart einer tertiären organischen Base, wie einem Trialkylamin, beispielsweise Triethylamin oder Tri-n-butylamin, oder N-Methylmorpholin durchgeführt. Das Woodward's-Reagens K ist N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat·

Bei der Herstellung von Conjugaten mit einer Verbindungsgruppe ist die Kondensation des Prostaglandins (1?£)-COOH sowohl mit der neu geschaffenen Aminofunktion (die sich aus dem Einbau des bis-Amins H-T-H ergibt) als auch mit irgendeiner der ursprünglichen Aminofunktionen des Ausgangsmaterials (H).NHp» die noch immer reaktionsfähig und frei sind, möglich. In der Anfangsstufe (q.v.) ist daher ausreichend Säureanhydrid vorhanden, um die Umsetzung aller reaktionsfähigen freien Aminogruppen mit diesem sicherzustellen. Ein 12-facher

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Molarüberschuß Anhydrid über die Gesamtzahl der Aminogruppen ist geeignet und sofern das Macromolekül (M)-NHp Tyrosinreste beinhaltet (wie dies zum Beispiel bei RintLerserum-albumin&er Pail ist) wird diese Stufe wünschenswerterweise bei einem leicht alkalischen p„-Wert, wie p„ 8,0, zur Vermeidung der Acylierung der Tyrosinhydroxylgruppen durchgeführt.

Die Kondensation des bis-Amins H-Y-H kann nicht nur mit der neu geschaffenen Carboxylfunktion (die man von dem Säureanhydrid erhält) erfolgen, sondern ebenso mit irgendwelchen freien und reaktionsfähigen Carboxylfunktionen(aus Asparaginsäure- und Glutaminsäureresten) in dem Ausgangsmaterial (E)-NHp* Rinderserum-albumin, Humaaserum-albumin und Human- ^ -globulin (IgG) sind bekannt dafür, daß sie freie Carboxylfunktionen dieser Art enthalten und es kann angenommen werden, daß wenigstens ein !Teil dieser Funktionen reaktionsfähig sind und zur Kondensation zur Verfügung stehen. Das bis-Amin H-Y-H sollte wünschenswerterweise in sehr großem Überschuß vorhanden sein, um eine Vernetzung des Produkts zu vermeiden.

Die Conjugate, mit denen sich diese Erfindung befaßt, können daher dargestellt werden durch die allgemeine Forael

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-TI-

.σο.γ^7_ρ co. ORJ) )_m

(GO.Y.CO.

worin (E), (PU), Y und χ die oben definierte Bedeutung haben,

m wenigstens 1 und nicht größer als die Zahl der freien Aminogruppen in dem Stamm-Maeromolekül der Gruppe (K), die für die Acylierung zur Verfügung steht, ist, p=o oder 1 ist,

η = O oder eine ganze Zahl ist, die nicht größer ist als die Anzahl der Carboxylgruppen in dem Stamm-Macromolekül der Gruppe (W), die zur Reaktion mit dem bis-Amin H-Y-H zur Verfügung steht, und O ist, wenn ρ = O ist und

sofern die Summe von m und η größer als Λ ist, die Gruppen (!FS) gleich oder verschieden sein können.

Diese Conjugate können dadurch hergestellt werden, daß man das geeignete Amin

H)_m

(M)

(CO.Y.H)

mit dem geeigneten Prostaglandin (PEF).COOH oder mit einem Gemisch unterschiedlicher Prostaglandine umsetzt.

5 O 9 B 8 1 / 1 O 8 O

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Es wird angenommen, daß alle Conjugate der Formel (I), wie oben definiert, neu sind mit Ausnahme der Conjugate, worin ρ und η beide 0 sind und solchen, die nur eine Spezies der Gruppe (PG") enthalten, die von einem Prostaglandin Α., Ag, B_x., E^ und Eg abstammen. Von keinem der Conjugate der Formel (I), die bekannt sind, ist eine Brauchbarkeit in der Human- oder Tiermedizin beschrieben.

Bis zur Verwendung werden die Conjugate der Formel (I) wünschenswerterweise in gefriergetrocknetem Zustand gelagert, um den möglichen Abbau des Prostaglandinteils zu verringern.

Wie oben erwähnt, sind die Conjugate der Formel (I) wertvoll zur Prophylaxe oder Therapie bei Säugern von pathologischen medizinischen oder veterinärmedizinischen Zuständen, bei denen endogene Prostaglandine beteiligt sind, wobei das genaue Gebiet der Brauchbarkeit eines Conjugate von seinem Prostaglandinteil abhängen wird. Es haben daher Conjugate, bei denen der Prostaglandinteil aus den Ε-Reihen (PGE^, PGEg, PGE;,) stammt, besondere Brauchbarkeit bei der Prophylaxe oder Therapie, aber insbesondere der Therapie, der nachfolgend angegebenen Zustände.

(a) Erkrankungen, bei denen akute oder chronische Entzündungsveränderungen ohne unmittelbare Infektionsur-

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sache ablaufen, zum Beispiel ulcerative Kolitis, Kollagenosen, Bindegewebestörungen, nicht-infektiöse Arthritis, periarterielle Störungen bzw. Leiden einschließlich im besonderen rheumatische Arthritis, Gicht und degenerative Arthritis.

(b) Zustände mit akuten oder chronischen Entzündungsveränderungen, in erster Linie als Folge allergischer oder immunologischer Ursachen, wie allergischer Rhinitis, Urticaria, Ekzeme und anderer allergischer Hauterkrankungen, und Entzündungen der Augen.

(c) Störungen als Folge von Blutplattchenaggregation.

Diese Conjugate haben besondere Brauchbarkeit bei der Prophylaxe oder Therapie, aber im besonderen bei der Prophylaxe von

(d) Migräne und verwandten Zuständen.

Als Folge der strukturellen Ähnlichkeit der Prostaglandine der A-, B-, D- und Ε-Reihen, worin in jedem Falle eine Oxogruppe die 9- oder 11-Stellung (unter Verwendung des üblichen Bezeichnungssystems für Prostaglandine) einnimmt, haben Conjugate, worin der Prostaglandinteil bzw. die Prostaglandinteile der A-, B- oder D-Reihen entsprechen, zusammen mit den strukturellen Analogen der Prostaglandine der A-, B-, D- oder E-

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Reihen, die den charakteristischen Cyclopentan- oder Cyclopentenring aufweisen, ebenso Brauchbarkeit, wie oben angegeben, bei den oben beschriebenen Zuständen.

Der Macromolekülteil eines Conjugate ist wünschenswerterweise nicht-antigen gegenüber der Spezies, bei der das Conjugat verabfolgt werden soll und Conjugate, die Menschen verabfolgt werden sollen, stammen am zweckmäßigsten von einer Humanserumproteinfraktion, wie Humanserum-albumin oder Humanserum-globulin ab.

Die Conjugate können in jeder Weise, die zur Bildung einer aktiven Immunität geeignet ist, verabfolgt werden, jedoch am zweckmäßigsten mittels subcutaner, intradermaler oder intramuskulärer Injektion. Im allgemeinen wird die Menge Conjugat der Formel (i), die bei einem Säuger zur Bildung einer aktiven Immunität erforderlich ist, im Bereich von 1 bis 1000 /Ug (errechnet als Prostaglandinteil) pro kg Körpergewicht liegen, wobei diese Dosis, soweit notwendig, nach irgendeinem geeigneten Immunisierungsschema wiederholt werden kann.

Die Conjugate werden vorzugsweise als pharmazeutische Vakzinformulierung verabfolgt, die vorzugsweise steril ist und die sowohl bei der Veterinär- wie bei der Humanmedizinischen Verwendung ein Conjugat der Formel (I)

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(nachfolgend als Wirkstoff bezeichnet) zusammen mit einem oder mehreren hierfür geeigneten Träger enthalten. Der Träger bzw. die Träger müssen "geeignet" in dem Sinne sein, daß sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich sein müssen und für dea Empfänger nicht schädlich sein dürfen. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in Dosierungseinheiten, beispielsweise als verschlossene Ampullen, dargeboten werden, wobei jede Ampulle eine bekannte Menge Wirkstoff enthält, und sie können dadurch hergestellt werden, daß man den Wirkstoff mit dem bzw. den hierzu geeigneten Trägern zusammenbringt. Sofern die Formulierung steril ist, kann dies durch Einzelsterilisierung der Komponenten der Formulierung vor ihrem Mischen unter sterilen Bedingungen oder es kann durch Sterilisierung der Formulierung als solchen unter Verwendung irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren bewirkt werden.

Zu geeigneten Formulierungen gehören wäßrige Suspensionen des Wirkstoffe und (wenn der Wirkstoff wasserlöslich ist, wie wenn er beispielsweise von einem Serum-albumin abstammt) wäßrige Lösungen, wobei das wäßrige Medium beispielsweise Pyrogen-freies Wasser oder physiologische Kochsalzlösung ist und derartige Suspensionen und Lösungen können nach Bedarf durch Zugabe des wäßrigen Mediums zu dem pulverisierten, ge-

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gebenenfalls gefriergetrockneten Wirkstoff zugegeben werden. Vorteilhafterweise enthalten die Formulierungen jedoch ein Adjuvans zur Steigerung des Immunansprechens des Wirkstoffs. Zu geeigneten Adjuvantien gehören (a) Aluminium- oder Calciumsalze, wie Kaliumalaun und Calciumphosphat, (b) ein Pflanzenöl (beispielsweise Erdnussöl) oder ein Mineralöl, wenn die Formulierung weiterhin ein geeignetes Emulgierungsmittel enthält und als öl-in-Wasser- oder Wasser-in-ölemulsion dargeboten werden soll, (c) eine Suspension abgetöteter Bakterien, worin beispielsweise die Bakterien Corynebacterium parvum sind, und (d) (ausgenommen, wenn die erhaltene Formulierung Menschen verabfolgt werden soll) Freund's Adjuvans, entweder

Als weitere Beispiele geeigneter Adjuvantien können erwähnt werden:

BOG (Bacille-Calmette-Guerin)
Aluminiumhydroxid (Alhydrogel)

Arquad 2HO? (Diocatadecyldimethylammoniumchlorid) Adjuvant 65 (Merck)

Außer den oben erwähnten Bestandteilen können die Formulierungen einen oder mehrere weitere Bestandteile enthalten, wie Puffer, Konservierungsmittel (einschließlich Antioxidationsmittel) und Materialien, die man den

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Formulierungen zugibt, um sie mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers isotonisch zu machen.

Es ist darauf hinzuweisen, daß während eine sofortige Anwendbarkeit der Conjugate der Formel (I) zur aktiven Immunisierung von Säugern, wie vorausgehend beschrieben, gegeben ist, sich die Conjugate ebenso dazu eignen, Immunoglobuline zu bilden bzw. zu vermehren, die zur passiven Immunisierung von Tieren der gleichen oder einer unterschiedlichen Säugerspezies, von der, in der die Immunoglobuline gewonnen wurden, verwendet werden können. Beispielsweise können in einem Pferd oder in Menschen durch aktive Immunisierung mit einem Conjugat der Formel (I) gebildete Immunoglobuline zur passiven Immunisierung anderer Menschen verwendet werden. Solche Materialien können als sterile wäßrige Präparate verabfolgt werden, die nach Bedarf durch Zugabg&es wäßrigen Mediums zu dem pulverisierten Feststoff hergestellt werden können. Sie können nach irgendeinem Verfahren verabfolgt werden, das dem Fachmann als geeignet und zweckmäßig bekannt ist, beispielsweise durch intramuskuläre Injektion.

Immunoglobuline, die durch aktive Immunisierung mit einem Conjugat gebildet sind, in dem der Prostaglandinteil der Ε-Reihe (PGE₁, PGE₂, PGE,) angehört, haben besondere Brauchbarkeit zur passiven Immunisierung in den folgenden Fällen:

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(a) zur Beherrschung akuter oder chronischer Entzündungszustände infektiösen Ursprungs, wo die Kontrolle der InfektionsWirkungen von besonderer Bedeutung ist,

(b) in bestimmten Fällen zur Kontrolle postoperativer Eatzündungsreaktionen,

(c) Kontrolle von Fieber.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne den Erfindungsbereich einzuschränken.

Beispiel 1

(a) Herstellung von Rinderserum-albumin-PGE.-conjugat

PGE,. (20 mg) löst man in 0,02 #iger (Gew.AoI.) Natriumcarbonatlösung in 10# wäßrigem Äthanol (20 ml). Zu dieser Lösung gibt man Rinderserum-albumin (4-6 mg) und N-(3-Bimethylaminopropyl)-N-äthylcarbodiimid-hydrochlorid (20 lag) xmxk röhrt das erhaltene Gemisch 24 Stunden bei fiaumteaperatur· Man dialysiert dann das Gemisch (4°C_? 24 Std·) unter Verwendung einer ^tlVisking"-Eohrleitung 24/52 gegen den Puffer (0,005M Dinatriumhydrogenphosphat/Nateiumdihydrogenphosphat, ^ 7,0; 0,15M Hatriumcnlorid) bei pg 7»2. (Viermal ausgetauscht, geweils mil; 500 ml). Der durch Lycphilisieren erhaltene Feststoff (515 ag) enthält, nachgewiesen durch U.V.-Spektros-

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kopie, 2,06 mg PGE₁ (d.h. ca. 9,6 Mol PGE₁ pro Mol Hinderserum-albumin), wozu man den Molarextinktionskoeffizienten des Prostaglandinteils des Conjugate mißt (Em = 27 200).

(b) Immunisierung von Ratten

Männliche "Wistar"-Ratten (21), drei Wochen alt, teilt man in zwei Gruppen. Einer Gruppe verabfolgt man subdermale Injektionen in monatlichen Intervallen (3 Injektionen insgesamt) mit dem Rinderserum-albumin-PGE₁-conjugat (500/Ug), emulgiert in Freund's vollständigem Adjuvans (0,1 ml), wobei die Kontrolle nach demselben Zeitplan Injektionen mit nur Freund's vollständigem Adjunvans (0,1 ml) erhält.

(c) Messung der Antikörpertiter

Einen Monat nach der letzten Injektion anästhesiert man (Nembutal) zwei Tiere in jeder Gruppe (immunisiert und Kontrolle) und entnimmt Blut (2ml) mittels Kanüle aus der absteigenden Aorta in ein Reagenzglas, das Heparin (0,1 ml, 5000 Einheiten/ml) enthält. Nach mäßigem Mischen zentrifugiert man das Blut (5000 g, 20 Min.), entfernt das Plasma und verdünnt es mit TRIS (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-salzsäurepuffer (Pjj 7,5, 100 mMol) unter Bildung von 1:2 und 1:5 Verdünnungen. Gleiche Portionen von 0,5 ml an nicht verdünntem und verdünntem Plasma mischt man in den Reagenz-

B ü 9 8 ij 1 / 1 0 8 0

gläsern mit ^H-PGE_x, (etwa 10 c.p.m.; Radiochemicals, Amersham) und bebrütet dann die Röhrchen (18 Std. bei

Nach beendetem Bebrüten gibt man Polyäthylenglycol 4000 (0,5 ml, 25#ige (Gew.AoI.) wäßrige Lösung) zu, mischt den Inhalt der Röhrchen und überführt sie in gekühlte Zentrifugenröhrchen· Nach Zentrifugieren (10 000 g, 30 Hin.) entfernt man 0,1 ml Überstehendes und bestimmt die Radioaktivität der Probe durch Flussigkeits-Szintilla- tionszählung. Durch Vergleich dieser Zahlen mit der an fangs zugeführten Radioaktivität ist es möglich, die Bindung mit dem Plasma zu errechnen, d.h. das mit dem Protein ausgefällte (radioaktiv) markierte Prostaglandin.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

(d) Messung der Entzündungsreaktion Dieser Versuch erfolgte einen Monat nach der letzten Injektion des Conjugate. Die Tiere, sowohl immunisiert als auch Kontrolltiere, ließ man über Nacht hungern und provozierte am nächsten Tag eine Entzündung durch subplantare Injektion in eine Pfote von Carrageen (0,1 ml einer 0,5#igen Lösung in physiologischer Kochsalzlösung). Zum gleichen Zeitpunkt wurde die gegenüber liegende (Kontroll)-Pfote in der gleichen Weise mit

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0,1 ml physiologischer Kochsalzlösung indiziert. Das Pfotenvolumen wurde nach dem Verfahrender Quecksilberverdrängung (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 150, 328 (1965)) gemessen und die Vergrößerung als Folge der induzierten Entzündung wurde durch Subtrahieren des Volumens der Kontrollpfote von dem Volumen der Pfote, in die Carrageen injiziert wurde , errechnet.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle II angegeben. Man erkennt eine Erhöhung des Pfotenvolumens während vier Stunden nach der Injektion. Die Reaktion (als Vergrößerung des Volumens), die die immunisierten Tiere zeigten, war bedeutend geringer als die der Kontroll— tiere.

Beispiel 2

Herstellung eines Rinderserum-albumin-PGE,.-Conjugate mit einem Bindeglied

(a) Succinyl-Rinderserum-albumin (Suc-BSA) Kristallines Rinderserum-albumin (5»0 g) löst man in Wasser (100 ml) und kühlt die Lösung auf O⁰C. Man gibt stufenweise fortschreitend unter Rühren Bernsteinsäureanhydrid (5»0 g) während 1 Stunde zu, während man den Pjj-Wert auf 8,0 durch Zugabe von N.Natriumhydroxid beibehält (Verwendung eines p_H-Meßgeräts). Nach der Zugabe des Anhydrids läßt man die Reaktion

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30 Minuten ablaufen. Verbraucht wird eine Gesamtmenge von 98,6 ml N.Natriumhydroxid. Die Lösung dialysiert man (Visking-Röhre 36/32) 48 Stunden bei 4°C gegen häufig gewechseltes destilliertes Wasser. Nach Lyophilisieren des Inhalts der Röhre erhält man 5 »71 g amorphes Pulver.

Die Ninhydrinuntersuchung wurde nach dem Verfahren von E.W. Temm und E.C. Cocking (Analyst, 1955» 80, 209) durchgeführt, woraus sich ergibt, daß die gesamten Aminogruppen in dem Albumin succinyliert sind.

(t>) Reaktion von Suc-BSA mit 3«3 -Diaminodipropylamin Succinyl-Rinderserum-albumin (70 mg) löst man in Wasser (25 ml).und gibt 3·3 -Diaminodipropylamin-dihydrochlorid (1,59 g) (ein ca. 50-facher Überschuß gegenüber den Gesamt-Carboxylgruppen) und Äthyldiäthylamino— propylcarbodiimid-hydrochlorid (0,89 g) (ca. 30-facher Überschuß gegenüber den Gesamt-Carboxylgruppen) zu. Den pg-Wert der Lösung «teilt man auf 5,0 mit 0,5N Salzsäure ein und rührt das Reaktionsgemisch im Dunkeln 24- Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung dialysiert man (Visking-Röhre 18/32) bei 4⁰C gegen häufig gewechseltes destilliertes Wasser. Den Inhalt der Röhre lyophiliaiert man unter Bildung von 80 mg eines weißen amorphen Pulvers (DAP-Suc-BSA).

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Mittels Ninhydrinuntersuchung wurden die Gesamt-Aminogruppen auf 80 bestimmt.

(c) Conjugation von Prostaglandin PGE^ mit dem DAT-Suc-BSA Man löst Prostaglandin PGE_x. (30 mg) in Äthanol, das 1O# einer 0,02#igen wäßrigen Natriumcarbonatlösung (30 ml) enthält. DAP-Suc-BSA (60 mg) und Äthyldiäthylaminopropylcarbodiimid-hydrochlorid (30 mg) gibt man zu. Den P_H~Wert stellt man auf 6,8 mit 0,5N Natriumcarbonatlösung ein und rührt das Gemisch bei Raumtemperatur 24-Stunden. Die Lösung dialysiert man (Visking-Röhre 18/32) bei 4-⁰C gegen viermal gewechselten Puffer (0,005 M Dinatriumhydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat : 0,15M Natriumchlorid, eingestellt auf p™ 7,0 mit N Natriumhydroxid) während 24 Stunden. Den Inhalt der Röhre lyophilisiert man unter Bildung von 310 mg eines weißen amorphen Pulvers.

Den PGE^-Gehalt des Conjugate bestimmt man spektrophotometrisch (siehe Beispiel 1) und er entspricht der Gegenwart von 10 Mol Heptan pro Mol modifiziertes Protein, d.h. daß 10 der verfügbaren Aminogruppen durch Prostaglandin substituiert sind.

Dies entspricht einer Formel

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>.NH. (CH₂)₅.NH. (CH₂)₅.NH BSA
^\, ^H.CO. (CH₂)₂.CO.NH(CH₂)₅.NH(CH₂)₅NH.

worin η + m ■ 10 sind.

Tabelle I

Anfangs-^H-PGE,. (JIi)-Bindung an Plasma in Ratten, die mit dem Rinderserum-albumin-PGE₁-Conjugat immunisiert sind.

	Plasma	Verdünnt
Unverdünnt		Hl 0,5 1
O 31	1:2 O 8

⁺ Kontrolle
⁺ Immunisiert

⁺ Jede Zahl stellt den Mittelwert von zwei Ratten dar.

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Tabelle II

Carrageen - induzierte Pfotenödeme bei Ratten, die mit dem Rinderserum-albumin-PGE.-Conjugat immunisiert sind.

Erhöhung des Pfotenvolumens (/Ul) (m+S.E.M.) (Zeit nach ' Injection)

	η	Gewicht (g)	O Std.	1 Std.	2 Std. 4 Std.	395,6 607,7 (±31,1) (±35,0)
Kon trolle	10	359 (±12)	-4,1 (+ 14)	348,2 568,8 785,9 (+59,0) (+54,2) (+40,5)	p<0,01 ρ «^0,005
Immuni siert	11	330 (± 8,2)	12,4 (±8,6)	206,7 (±19,0)
P⁺	-	-	unbe deu tend	p<0,05

⁺ Die Bedeutung zwischen Gruppen wurde analysiert mit dem ungepaarten T-Test ("unpaired t-test") .

Beispiel 3

In.jizierbares Präparat des Con.juRats von Beispiel 1 Man verwendet das dialysierte Gemisch von Beispiel Diese Lösung wurde dann durch Filtrieren durch eine Filtermembrane mit einer Porengröße von 0,22 ,um sterilisiert. Volumen des sterilen Filtrats, die das Äquivalent von 5 mg Rinderserum-albumin enthalten, verteilt man unter aseptischen Bedingungen in vorausgehend

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sterilisierte Fläschchen und führt dann eine Gefriertrocknung durch. Danach verschließt man die Fläschchen mit sterilen Kautschukverschlüssen. Das Vakzin verbleibt in gefriergetrocknetem Zustand, bis es benötigt wird.

Zur Injektion löst man das gefriergetrocknete Material in 1 ml steriler Lösung von Natriumchlorid 0,9# (Gew./ Vol.).

Es kann aber auch die Injektion dadurch hergerichtet werden, daß man zu einem Fläschchen gefriergetrocknetem Vakzin 0,2 ml eine sterile Suspension von ultrafeinem hydratisiertem Aluminiumoxid, das etwa 7,0 mg Aluminium/ml enthält (Alhydrogel, hergestellt von Superfos Export Co., Kopenhagen ist geeignet),zugibt. Dieses Gemisch läßt man eine kurze Zeit stehen und verdünnt auf 1 ml Volumen durch Zugabe einer 0,9#igen (Gew.AoI.) sterilen Natriumchloridlösung, bevor man es durch intramuskuläre oder subcutane Injektion verabfolgt.

Beispiel 4

Injizierbares Präparat des Conjugats von Beispiel 2 Man verwendet das dialysierte Gemisch von Beispiel Diese Lösung sterilisiert man dann durch Filtrieren durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 ,um. Volumen des sterilen Filtrate, die das Äquivalent von

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1 mg Conjugat enthalten, verteilt man in voraus sterilisierte Fläschchen und führt eine Gefriertrocknung durch und verschließt sie wie im Beispiel 3· Dieses Vakzin kann in der gleichen Weise,wie im Beispiel 3 angegeben, zur Injektion hergerichtet werden.

-Patentansprüche-

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Claims

Patentansprüche :

1. Pharmazeutische Formulierung, geeignet zur parenteralen Verabfolgung zur Prophylaxe oder !Therapie bei Säugern eines pathologischen Zustandes, bei dem endogene Prostaglandine beteiligt sind, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine wirksame prophylactische oder therapeutische Menge eines Conjugate der Formel (I)

(NH.^ÜO(CH₂)_x.CO.Y_Jl7 CO. (PS))_m (H) (D

(CO. Y. CO(Pl?) )_n

enthält, worin

(M) der Rest eines immunogenen Macromoleküls der Formel (H)-NH₂,

(pTr) der Rest eines Prostaglandins oder seines Analogen der Formel (PS)-COOH der Prostaglandine der A-, B-, D- und Ε-Reihe und deren Analogen ist, die den charakteristischen Cyclopentan- oder Cyclopentenring aufweisen oder worin diese Gruppe durch eine Cyclohexangruppe ersetzt ist,
Y (i) -HH(CH₂)_aNH- ist, worin a * 2 bis 6 ist,

(ii) -HH(CH₂)_b1.Z.(CH₂)_b2.NH- ist, worin b¹ und b² gleich oder verschieden und jedes 1 bis 4· und Z -O-, -NH- oder -CH(OH)- ist, (iii) -W-CO-CH₂-W¹- ist, worin W und W¹ gleich oder

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verschieden sind und jeder Rest eine Gruppe

wie unter (i) oder (ii) oben definiert ist und (iv) -NH.CH₂.CONH.CH₂ ο CO.W²- ist, worin W² eine Gruppe wie unter (i) oder (ii) oben definiert ist,

χ = 2 bis 4,

m wenigstens 1 und nicht größer als die Anzahl der freien Aminogruppen in dem Stamm-Macromolekül der Gruppe (M), die zur Acylierung zur Verfügung steht, ist, p=0 oder 1 ist und

η = 0 oder eine ganze Zahl nicht größer als die Anzahl der Carboxylgruppen in dem Stamm-Macromolekül der Gruppe (Sf) ist, die zur Reaktion mit dem bis-Amin H-Y-H zur Verfügung steht, und 0 ist, wenn ρ = 0 ist und worin, wenn die Summe m und η größer als 1 ist, die Gruppen (PG) gleich oder verschieden sein können, zusammen mit einem für Menschen geeigneten Adjuvans.

2. Formulierung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß in dem Conjugat der Formel

(I) Y -NH(CH₂)_b1.Z.(CH₂)_b2.liH- ist, worin Z -NH- ist

1 2
und b und b gleich oder verschieden sind und jedes 2 bis 4 ist oder Y -NH(CH₀) NH- ist, worin a = 2 bis 4

C- Cl

3. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in

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dem Conjugat der Formel (I) (PG") von einer Verbindimg der Formel

i 2

abstammt, worin R Wasserstoff oder Hydroxy und R

Wasserstoff ist oder die Reste R und R zusammen eine Bindung bilden, Ή? und R zusammen eine Bindung bilden, wenn R . Wasserstoff ist und sonst beide Wasserstoff
sind und einer der Reste R^ und R eine Gruppe -X .COOH und der andere eine Gruppe -X^.CH, ist, worin die Reste X und Xr gleich oder verschieden sind und jeder der
Reste eine Kohlenstoffatomkette ist.

4. Formulierung gemäß Anspruch 3» dadurch
gekennzeichnet , daß in dem Conjugat
der Formel (I) (I⁵CT) von einer Verbindung abstammt, wie sie im Anspruch 3 definiert ist, worin jeder der Reste X und λ eine Kohlenetoffkette mit einer Länge von
2 bis 8 Kohlenstoffatomen ist.

5· Formulierung gemäß Anspruch 3» dadurch
gekennzeichn et, daß in dem Conjugat
der Formel (I) (PGr) von einer Verbindung abstammt, wie sie in Anspruch 3 definiert ist, worin jeder der Reste

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X*¹ und X² eine Kohlenstoffkette mit einer Länge von 6 oder 7 Kohlenstoffatomen ist.

6. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) (M) von einer Proteinfraktion eines Säugerserums abstammt.

7. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) (M) von einer Proteinfraktion eines Humanserums abstammt.

8. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) (H5) von einem Humanserumalbumin abstammt.

9. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) ρ β 1 ist.

10. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) χ = 2 ist.

11. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10,

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dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) (PG) von einem Prostaglandin der Ε-Reihe abstammt.

12. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) die Summe von η und m gros ser ist als 1 und die ^G)-Gruppen verschieden sind.

13. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Conjugat der Formel (I) Y -NH(CH₂)₃-NH.(CH₂)JSH.-ist.

14. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß <k&s Adjuvans Aluminiumhydroxid ist.

15- Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lösung oder Suspension in einem wäßrigen flüssigen Medium ist.

16· Verschlossene Ampulle mit dem Gehalt einer als Bosieruageeinheit bekannten Menge einer yeraulierung gemäß einem der Ansprüche i bis 15*

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17. Ampulle gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß der Inhalt sich in gefriergetrocknetem Zustand befindet.

18. Verfahren zur Herstellung einer Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß man das Conjugat der Formel (I) mit dem anderen Bestandteil oder Bestandteilen der Formulierung mischt.

19· Conjugat der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß wenn ρ und η beide 0 sind und die Gruppe (PG) von einem Prostaglandin Α., A^, Β,., Ε. und/oder Ep abstammt, m größer als 1 ist und das Conjugat wenigstens eine zweite Spezies der Gruppe (PG) beinhaltet.

20. Conjugat gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß (H) von einer Proteinfraktion eines Humanserums abstammt.

21. Conjugat gemäß einem der Ansprüche 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß ρ » ist.

22. Conjugat gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß χ » ist. -34-

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23· Conjugat gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß Y -NH(CH₂),.NH.(CH₂)₅.NH- ist.

. Conjugat gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß von einem Prostaglandin der Ε-Reihe abstammt.

(25) Verfahren zur Herstellung eines Conjugate der For mel (I), wie in einem der Ansprüche 19 bis 24 definiert, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Amin der Formel

(00.1.H)_n

mit einem oder mehreren Prostaglandinen, nach Eignung, der Formel

(PS)-COOH

kondensiert, wobei in den Formeln (W), (P7x), Y» x» m, ρ und η die in einem der Ansprüche 19 bis 24 angegebenen Bedeutungen haben.

26. Conjugat der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 19 bis 24 definiert, sofern es nach dem Verfahren gemäß Anspruch 25 hergestellt ist.

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. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15

im wesentlichen wie in einem der Beispiele 3 und 4-beschrieben.

. Conjugat gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24 im

wesentlichen wie unter Bezugnahme auf Beispiel 2 beschrieben.

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