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Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Verwendung
als Adjuvans bei der Therapie und umfassend eine Lösung
eines in ein Salz überführten, synthetischen Peptids,
welches eine oder mehrere Amingruppen umfaßt und fähig
dazu ist, in vivo die Antikörperantwort gegenüber Antigenen
mit einer niedrigen Immunogenität zu verstärken, in einem
pharmakologisch annehmbaren Lösungsmittel.
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Antigene sind definiert als für einen lebenden Organismus
fremde Substanzen, die, wenn sie mit dessen Immunsystem in
Kontakt kommen, einen komplexen Mechanismus zellulärer
Wechselwirkungen aktivieren, die das Antigen zu beseitigen
vermögen und das frühere Gleichgewicht wiederherstellen.
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Charakteristisches Merkmal eines Antigens ist: die
Fähigkeit, die Produktion spezifischer Antikörper
(Immunogenität) zu induzieren, die fähig sind, selektiv an dieses zu
binden (Antigenität) und es zu inaktivieren.
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Die Immunantwort, die der beste Verteidigungsmechanismus
eines Organismus gegen einen infektiösen Prozeß ist, kann
bewußt durch Verabreichen eines Antigens mittels einer
Vakzine stimuliert werden.
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Einige Antigene haben jedoch eine niedrige Immunogenität
und stimulieren in vivo eine Antikörperantwort, die nicht
ausreichend ist, dem Organismus eine wirksame Immunität zu
verleihen.
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Wie im Stand der Technik bekannt ist, kann die
Immunogenität eines Antigens verbessert werden, wenn dieses
zusammen mit einem Adjuvans verabreicht wird, wie getötete
Bakterien oder immunologisch inerte Substanzen, die fähig
sind, die Konzentration der dem Immunsystem präsentierten
Antigene zu erhöhen.
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Eine der allgemein am meisten verwendeten Substanzen
ist Freund-Adjuvans, eine Emulsion aus Mineralöl und
Wasser, gemischt mit getöteten Bakterien.
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Das Antigen wird in die Emulsion eingebracht und bildet
ein Depot, von dem es langsam freigesetzt wird, und
gleichzeitig ziehen die getöteten Bakterien Zellen mit
einer spezifischen Immunantwortsfunktion gegenüber dem Depot
an.
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Das Adjuvans hat, obwohl es von den zur Zeit kommerziell
erhältlichen eines der wirksamsten ist, Nachteile: z.B.
verursacht es stechenden Schmerz und zuweilen am
Injektionsort einen Abszeß.
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Alaun oder Aluminiumhydroxid, das als Alternative zu
Freund-Adjuvans verwendet wird, ist ebenso in einigen
Punkten unbefriedigend, besonders hinsichtlich dessen
Unwirksamkeit gegenüber synthetischen Antigenen und
Thymo-unabhängigen Antigenen. Zahlreiche Adjuvantien
bakteriellen oder chemischen Ursprungs sind daher im Stand
der Technik vorgeschlagen worden, jedoch hat sich bis
jetzt keines von ihnen als sowohl hocheffizient als auch
frei von Nebenwirkungen herausgestellt.
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Beispiele sind Mycobakterien, die nur auf die Immunantwort
Thymo-abhängiger Antigene wirken (Eisen H.N, 1973,
Antibody Formation, in Microbiology, 2. Auflage, S. 481,
Herausgeber Harper and Row Hagerstown) und humanes
1-Interleukin (IL-1), eine von Zellen der
Monozyten-Makrophagen-Linie hergestellte Substanz.
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IL-1 scheint tatsächlich bei der Verteidigung des Wirts
als Antwort auf Infektionen verschiedenen Ursprungs
eine Rolle zu spielen (Dinarello, C.A., Rev. Infect.
Dis., 6,51, 1984) und dessen Herstellung kann unter
Verwendung induzierender Agenzien bakteriellen Ursprungs
(Mizel, S.B., in Microbiology, S. 82, 1980) stimuliert
werden.
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Wenn Interleukin-1 in die Maus injiziert wird, ist es auch
fähig, die sekundäre Antwort gegenüber einem
Protein-Antigen auf Serumniveau zu steigern (Staruch, M.J.
und Wood, J., Immunol., 130, 2191 (1983).
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Jedoch besitzt IL-1 neben der Aktivität, die Immunantwort
zu verstärken, weitere nicht-immunologische Aktivitäten,
wie die Fähigkeit, Fieber, Prostaglandin E&sub2;, Proteine in
der akuten Phase und die Aktivierung von Neutrophilen, zu
induzieren, was dessen Verwendung als Adjuvans in humanen
Vakzinen limitiert.
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Im Stand der Technik hat sich daher ein Bedarf an
Adjuvantien ergeben, die fähig sind, die Antikörperantwort
gegenüber sowohl Thymo-abhängigen als auch
Thymo-unabhängigen Antigenen mit niedriger Immunogenität
zu stimulieren, ohne unerwünschte Nebeneffekte zu
induzieren.
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Es ist jetzt gefunden worden, daß diese Bedingung durch
das erfindungsgemäße Peptid erfüllt werden kann.
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Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist daher die Bereitstellung
einer Zusammensetzung zur Verwendung als Adjuvans und
umfassend eine sterile Lösung eines in ein Salz überführten,
synthetischen, erfindungsgemäßen Peptids, welches eine
oder mehrere Amingruppen umfaßt und fähig ist, in vivo die
primäre und sekundäre Antwort gegenüber Thymo-abhängigen
und Thymo-unabhängigen Antigenen mit niedriger
Immunogenität zu verstärken, in einem pharmakologisch annehmbaren
Lösungsmittel.
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Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe ist die Verwendung
der Zusammensetzung bei der Therapie.
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Weitere erfindungsgemäße Aufgaben werden aus der folgenden
Beschreibung und den Beispielen ersichtlich.
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Das erfindungsgemäße Peptid ist spezieller ein
synthetisches, in ein Salz überführtes Nonapeptid, welches eine
oder mehrere Aminogruppen umfaßt und die folgende
Aminosäuresequenz besitzt, die den Fragmenten 163-171 von
humanem Interleukin-1-β entspricht:
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Val-Gln-Gly-Glu-Glu-Ser-Asn-Asp-Lys-X (I)
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worin: Val = L-Valin; GIn = L-Glutamin; Gly = Glycin;
Glu = L-Glutaminsäure; Ser = L-Serin; Asn = L-Asparagin;
Asp = L-Asparaginsäure; Lys = L-Lysin und X = OH.
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Das Journal of Immunology, Band 137 (10), 3201-3204, 1986
beschreibt, daß dieses Peptid in vitro immunstimulierende
Eigenschaften besitzt und in vivo nicht pyrogen ist.
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Das erfindungsgemäße Peptid ist spezieller das
Hydrochlorid- oder Trifluoracetat-Derivat des Nonapeptids
mit der Sequenz (I).
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Diese Peptide, hierin Peptid 163-171.HCl und Peptid
163-171.TFA genannt, können durch eines der allgemein
bekannten Verfahren synthetisiert werden.
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Peptid 163-171.TFA wird spezieller durch das in der
gleichzeitig anhängigen italienischen Patentanmeldung
Nr. 19338 A/86 beschriebene Verfahren hergestellt.
Erfindungsgemäß wird das Hydrochlorid-Derivat des
Peptids 163-171 durch Lösen des Trifluoracetat-Peptids in
Wasser und Auftragen der resultierenden Lösung auf eine
Amberlite-Säule in Cl&supmin;-Form hergestellt. Die Säule wird
danach mit Wasser eluiert und das Eluat wird
gefriergetrocknet. Dieses Verfahren ergibt Peptid 163-171.HCl mit
einer 90 %-Ausbeute und einem Gehalt von ungefähr 2 Mol
Chlor pro Mol Peptid, gemessen mit einer gegenüber
Cl&supmin;-Ionen empfindlichen Elektrode.
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Diese Peptide in Salzform sind, wenn sie in vivo
untersucht werden, fähig, die primäre und sekundäre
Antikörperantwort gegenüber Thymo-abhängigen und Thymo-unabhängigen
Antigenen mit niedriger Immunogenität zu verstärken, ohne
die für Interleukin-1 charakteristischen Nebeneffekte zu
induzieren.
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Antigene -Substanzen von Protein- oder Polysaccharid-Natur
- werden abhängig davon, ob T-Helferzellen an der
Antikörperantwort teilnehmen oder nicht, als Thymo-abhängig
oder Thymo-unabhängig klassifiziert.
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In dieser Hinsicht verhalten sich viele Polysaccharid-
Antigene wie Thymo-unabhängige Antigene.
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Die immunstimulierende Aktivität der Peptide 163-171.TFA
und 163-171.HCl wurde spezieller unter Verwendung des von
Cunningham, A. J. und Szenberg (Immunology 14, 599, 1968)
beschriebenen Hämolyse-Plaque-Verfahrens hinsichtlich der
Antikörperantwort gegenüber roten Blutkörperchen aus
Schaf, Thymo-abhängigen Antigenen und hinsichtlich der
Antwort gegenüber dem Polysaccharid von Streptococcus
pneumoniae Serotyp 3 (SIII), einem Thymo-unabhängigen
Antigen mit niedriger Immunogenität, untersucht.
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Das Verfahren besteht aus dem Bestimmen der Anzahl der
Zellen, die Antikörper sezernieren, welche für ein
gegebenes
Antigen spezifisch sind. Es besteht aus dem
Immunisieren von Mäusen mit dem zu untersuchenden Antigen,
dem Inkontaktbringen von aus der Milz der immunisierten
Mäuse erhaltenen Lymphozyten mit demselben Antigen und
letztendlich dem Nachweisen von Hämolyse-Plaques durch
Zufügen von Komplement.
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Lysezonen (Plaque-bildende Zellen; plaque forming cells;
PFC) werden an der Stelle beobachtet, wo die
Antigen-Antikörper-Reaktion stattfindet, d.h. bei jeder
Zelle, die spezifische Antikörper produziert. Dieses als
direktes Verfahren bezeichnete Verfahren weist Zellen
nach, die Antikörper der Klasse IgM sezernieren,
welche spezifisch für die Primärantwort gegenüber dem
Immunisierungs-Antigen sind.
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Die Anzahl der Zellen, die Antikörper der IgG-Klasse
sezernieren, welche charakteristisch für die Sekundärantwort
sind, wird durch Zufügen eines direkten
Kaninchen-Antiserums gegen Maus-Immunglobuline bestimmt,
bevor Komplement zugefügt wird.
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Erfindungsgemäß werden demnach Zellen, die Antikörper der
Klassen IgM und IgG sezernieren, durch Isolieren von
Lymphozyten aus der Milz von Mäusen, die mit SRBC- und
SIII-Antigenen immunisiert und durch verschiedene
Verfahren mit verschiedenen Dosen des Peptids 163-171.TFA und
des Peptids 163-171.HCl behandelt worden sind, bestimmt.
Zu diesem Zweck sind mit identischen Ergebnissen männliche
C3H/HeNCrlBR-Inzuchtmäuse und männliche und weibliche
C3H/HeJ-Mäuse, die ungefähr 25 g wogen, verwendet worden.
Erfindungsgemäß wurden zuvor in Phosphatpuffer (PBS)
gelöste SRBC- und SIII-Antigene in einer Konzentration von
1-2 x 10&sup8; SRBC/0,2 ml PBS und 0,5 ug/0,5 ml PBS
intravenös bzw. intraperitoneal in die Mäuse injiziert.
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Die Peptide in Salzform wurden danach in die Tiere in
individuellen Dosen entweder intraperitoneal oder
intravenös zusammen mit oder getrennt von den Antigenen in
Konzentrationen von 1 pg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht in
der Form steriler Lösungen in einem pharmakologisch
annehmbaren Lösungsmittel eingeführt.
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Die Lösungsmittel können z.B. Wasser, physiologische
Lösung oder Salzphosphatpuffer sein.
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Salzphosphat wurde speziell verwendet. Die resultierende
Lösung wurde, bevor sie in die Mäuse injiziert wurde, auf
einen neutralen pH mit einer anorganischen Base,
ausgewählt aus NaOH und KOH, gebracht.
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Die Anzahl der Zellen, die Antikörper der Klasse IgM
sezernieren, gemessen als PFC/Milz zu verschiedenen Zeiten
nach Immunisierung, zeigte, daß die Peptide zu allen
Zeiten eine effiziente immunstimulierende Aktivität hatten
und es keine Veränderungen hinsichtlich der Kinetiken der
Immunantwort gab.
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Es wurde ebenso beobachtet, daß die Aktivität von der
Konzentration des verabreichten Peptids abhängt und daß
im Fall des Peptids 163-171.TFA der Effekt bei einer Dosis
von 100 mg/kg maximal ist, wenn das Peptid zusammen mit
den immunisierenden Antigenen intraperitoneal geimpft
wird.
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Ein signifikanter Anstieg hinsichtlich der PFC/Milz wurde
ebenso beobachtet, wenn das Peptid 163-171 in einer
maximalen Dosis von 100 mg/kg zwei Tage vor und zwei Tage nach
Immunisierung intraperitoneal verabreicht wurde.
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Schließlich wurde beobachtet, daß das Trifluoracetat-
Peptid einen Anstieg hinsichtlich der PFC/Milz induziert,
der gleich zu demjenigen ist, der durch Einführen der
optimalen Dosis zusammen mit den Antigenen erhalten wurde,
wenn dieses an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor der
Immunsierung und in einer täglichen Dosis, die 10 bis 100
mal geringer als die optimale Dosis ist, intraperitoneal
eingeführt wurde.
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Erfindungsgemäß und zum Zweck des Prüfens des Effekts auf
die immunstimulierende Aktivität in Abhängigkeit des
Verabreichungsverfahrens wurden die zwei Peptide zusammen mit
den Immunisierungsantigenen intravenös in Mäuse
eingeführt.
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Es wurde auf diese Weise gefunden, daß die Peptide, wenn
sie intravenös verabreicht werden, eine Aktivität
besitzen, ausgedrückt als optimale Dosen, die notwendig
sind, einen immunstimulierenden Effekt auf die Primär- und
Sekundärantwort gegenüber Antigenen mit niedriger
Immunogenität zu erhalten, die wirksamer ist als die Aktivität,
die durch das intraperitoneale Verfahren erhalten wurde.
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Es ist ebenso gefunden worden, daß die Hydrochlorid-Form
des Peptids 163-171 überraschenderweise signifikant
aktiver ist als die Trifluoracetat-Form.
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Der maxiimale Anstieg hinsichtlich der Primärantwort
gegenüber SRBC wird bei Dosen von 10 pg - 1 ng/kg für das
Peptid 163-171.HCl und 10 - 100 ug/kg für das Peptid
163-171.TFA erhalten.
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Entsprechend wird der maximale Anstieg hinsichtlich der
Sekundärantwort gegenüber SRBC bei Dosen von 10 ng - 1
ug/kg des Peptids 163-171.HCl und 100 ug/kg von
163-171.TFA erhalten.
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Schließlich wurden signifikante Anstiege hinsichtlich
der Primärantwort gegenüber SIII bei Dosen von 1 - 100
pg/kg des Peptids 163-171.HCl beobachtet.
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Die optimale, intravenöse Dosis von humanem, rekombinanten
IL-1β ist 100 pg/kg.
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Folglich sind die Peptide als Adjuvantien bei der
Formulierung von Vakzinen geeignet.
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Peptid 163-171 in Hydrochlorid-Form ist besonders für die
erfindungsgemäßen Zwecke geeignet.
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Die erfindungsgemäßen Peptide 163-171 können als solche
oder in Form von Zusammensetzungen als Adjuvantien für
Vakzine mit niedriger Immunogenität verwendet werden.
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Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann durch Lösen des
Peptids 163-171 in Salzform in einer solchen
Konzentration, die die primäre und sekundäre Antikörperantwort
gegenüber Thymo-abhängigen und Thymo-unabhängigen
Antigenen mit niedriger Immunogenität verstärken, in einem
pharmakologisch annehmbaren, sterilen Lösungsmittel,
vorzugsweise ausgewählt aus Wasser oder Puffer-Salzlösung,
hergestellt werden.
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Vorzugsweise liegen die Mengen des verwendeten Peptids
zwischen 1 pg und 100 mg/kg, abhängig vom
Verabreichungsverfahren.
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Erfindungsgemäß kann die Zusammensetzung intravenös oder
intraperitoneal oder intramuskulär zusammen oder getrennt
von den Immunisierungsantigenen verabreicht werden. In
einer weiteren Ausführungsform kann die erfindungsgemäße
Zusammensetzung mit geeigneten Mengen an Thymo-abhängigen
oder Thymo-unabhängigen, natürlichen oder synthetischen
Antigenen mit niedriger Immunogenität gemischt werden
und die resultierendne Zusammensetzungen können als
Vakzine für die Human- oder Tier-Therapie verwendet
werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Fig. 1: Immunstimulierende Wirkung des Peptids 163-171
(P: 12-36-100 mg/kg) (Fig. 1-A) und von humanem
Interleukin-1-β (500-1000-2000-4000 U/kg) (Fig. 1-B)
auf die Primärantwort gegenüber SRBC, gemessen als
PFC/Milz.
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Der direkte anti-SRBC-PFC für die Primärantwort
wird vier Tage nach Verabreichung von SRBC in
einem Salzphosphatpuffer (C), SRBC und humanem
Interleukin-1-β (1) und SRBC und Peptid 163-171 (P)
bestimmt.
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Die vertikalen Linien stellen
95 %-Konfidenzintervalle dar.
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Statistische Signifikanz:
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Bereich A: Alle Gruppen gegen Kontrolle: p ≤ 0,01
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Bereich B: Peptid 163-171 gegen Kontrolle p ≤ 0,01,
humanes IL-1β 4000 U/kg gegen Kontrolle: nicht-
signifikant; alle anderen Gruppen gegen Kontrolle:
p = 0,05.
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Fig. 2: In vivo-Kinetiken der Primärantwort gegenüber
SRBC. Berechnung der Wirkungen des Peptids 163-171
(100 mg/kg; ( .. ), von IL-1β (2000 U/kg: ( .. )
und PBS ( ... ) auf die primäre Antikörperantwort
zu verschiedenen Zeiten nach dem Impfen mit dem
Antigen SRBC.
Statistische Signifikanz:
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Peptid gegen Kontrolle: p ≤ 0,05 (Tage + 2 und + 4)
und p ≤ 0,01 (andere Tage); IL-1β gegen Kontrolle:
p ≤ 0,05 (Tage + 4 und + 7) und p ≤ 0,01 (andere
Tage).
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Fig. 3: Kinetiken der Wirkung des Peptids 163-171.TFA (100
mg/kg) und von IL 1-β (2000 U/kg) auf die primäre
Antikörperantwort gegenüber SRBC. Peptide 163-171.TFA
und IL 1-β werden zwei Tage vor, zur selben
Zeit und 2 Tage nach Immunisierung mit SRBC geimpft
und der PFC/Milz wird vier Tage nach Immunisierung
bestimmt.
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Die vertikalen Linien stellen 95 %
-Konfidenzintervalle dar. Statistische Signifikanz aller Gruppen
gegen Kontrolle: p ≤ 0,05.
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Fig.4: Vergleich der Wirkung zweier verschiedener
Verabreichungszeiten des Peptids 163-171.TFA und von
humanem Interleukin-1-β auf die in
vivo-Sekundärantwort gegenüber SRBC.
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Peptid 163-171.TFA (100 mg/kg ), IL-1-β (2000 U/kg
) und PBS( )werden zusammen mit dem ersten
(Tag -10) und dem zweiten (Tag 0) Antigen-Inokulum
verabreicht.
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Die vertikalen Linien stellen 95
%-Konfidenzintervalle dar. Statistische Signifikanz:
alle Gruppen gegen Kontrolle: p ≤ 0,01.
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Fig. 5: Wirkung des Peptids 163-171.TFA (0) (12, 36, 100
mg/kg) und von humanem Interleukin-1-β ( ) (500
- 1000 - 2000 U/kg) auf die Primärantwort gegenüber
SIII verglichen mit PBS (Kontrolle ). Statistische
Signifikanz: IL-1-ß (500 U/kg) gegen Kontrolle:
nicht-signifikant; alle anderen Gruppen gegen
Kontrolle: p ≤ 0,01.
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Die folgenden Experimentbeispiele verdeutlichen die Erfindung.
Beispiel 1:
Bestimmung der immunstimulierenden Wirkung des Peptids
163-171.TFA auf das Thymo-abhängige Antigen SRBC
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24 männliche C3H/HeNCrlBr-Inzuchtmäuse (CALCO-ITALIA), die 10
bis 12 Wochen alt waren und ungefähr 25 g wogen, wurden
intravenös mit 0,2 ml Salzphosphatpuffer (PBS), der 1-2 x 10&sup8; rote
Blutkörperchen aus Schaf (SCLAVO) enthielt, behandelt. Nach 2
Stunden wurden die Mäuse wie folgt intraperitoneal behandelt:
3 Mäuse mit 0,2 ml PBS, 4 Gruppen 3 Mäuse mit 0,2 ml PBS,
enthaltend 500 - 1000 - 2000 und 4000 U/kg humanes
Interleukin-1-β (Genzyme Corporation Boston) und 3 Gruppen
3 Mäuse mit 0,2 ml PBS, enthaltend 12, 36 bzw. 100 mg/kg des
Peptids 163-171.
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Die Peptid-enthaltenden Lösungen wurden, bevor sie injiziert
wurden, auf neutralen pH mit 0,1 N NaOH gebracht. Nach 4 Tagen
wurden die Mäuse getötet und die jeweilige Milz entfernt und
mechanisch getrennt, um die Lymphozyten abzutrennen.
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Nach dem Isolieren wurden die Lymphozyten dreimal jeweils mit
15 ml Minimalkulturmedium, enthaltend Earle-Salze (M.E.M.)
(M.A. Bioproducts Walkerswille), gewaschen und danach in 1 ml
desselben Kulturmediums zu einer Endkonzentration von 150 000
Zellen resuspendiert.
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Jeweils 0,1 ml der Zellsuspensionen wurde der Reihe nach mit
MEM-Kulturmedium verdünnt (1:10 und 1:1000) und jeweils 100
ul der Verdünnungen wurden doppelt zu Vertiefungen von
Mikroplatten, enthaltend 25 ul MEM-Kulturmedium, 25 ul
einer 10 %-igen Lösung von SRBC-Antigenen und 25 ul von
Meerschweinchen-Komplement in einer Endverdünnung von 1 : 64,
zugefügt.
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Die gesamte Suspension wurde sofort durch Kapillarwirkung von
jeder Vertiefung auf aufgelegte Deckgläser transferiert.
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Die Deckgläser, die an den Rändern mit Paraffin versiegelt
wurden, wurden danach in einem Thermostaten bei 37ºC für eine
Stunde inkubiert. Am Ende dieser Zeitdauer wurden die Plaques
der direkten Hämolyse unter Verwendung eines
Licht-Kontrast-Mikroskops gezählt, wodurch die Anzahl der
Antikörper-sezernierenden Lymphozyten (PFC) angezeigt wurde.
Die auf diese Weise ermittelten Antikörper gehörten zur Klasse
IgM, die spezifisch für die primäre Antikörperantwort sind.
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Die Ergebnisse in den Figuren 1A und 1B zeigen einen Anstieg
hinsichtlich der Anzahl der Plaques/Milz im Vorhandensein
des Peptids 163-171.TFA und humanem IL-1-β, abhängig von der
Dosis und maximal bei einer Dosis von 100 mg/kg des Peptids.
Beispiel 2:
Bestimmung der immunstimulierenden Wirkung des Peptids
163-171.TFA zu verschiedenen Zeiten nach Impfen mit SRBC
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Die Mäuse wurden wie im vorstehenden Beispiel 1 behandelt,
indem sie 2 Stunden nach Verabreichung der SRBC mit 100 mg/kg
des Peptids 163-171 und 2000 U/kg von humanem IL-1β
intraperitoneal beimpft wurden.
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Die immunstimulierende Aktivität des Peptids 163-171 und von
IL-1β wurde danach an den Tagen 2, 4, 7, 9 und 15 nach
Beimpfung durch Isolieren der Lymphozyten aus der Milz der
behandelten Ratten und Zählen der Anzahl der PFC/Milz bestimmt.
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Die Ergebnisse, dargestellt in Fig. 2, zeigen eine
signifikante, immunstimulierende Aktivität durch das Peptid
163-171.TFA an allen Zeitpunkten (Maximum nach 4 Tagen) und
die Abwesenheit einer Variation hinsichtlich der Kinetiken
der primären Antikörperantwort.
Beispiel 3:
Kinetiken der immunstimulierenden Wirkung des Peptids
63-171.TFA auf die Primärantwort gegenüber SRBC
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3 Gruppen jeweils 9 Mäuse wurden wie folgt behandelt:
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A) Der ersten Gruppe, unterteilt in drei Untergruppen
jeweils 3 Mäuse, wurde 100 mg/kg des Peptids 163-171.TFA,
2000 U/kg von humanem IL-1β und 0,2 ml PBS zwei Tage vor
Immunisierung mit SRBC verabreicht;
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B) Die zweite Gruppe, unterteilt in drei Untergruppen
jeweils 3 Mäuse, wurde mit 100 mg/kg des Peptids
163-171.TFA, 2000 U/kg IL-1-β und 0,2 ml PBS zwei
Stunden nach Immunisierung mit SRBC behandelt und
schließlich
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C) die dritte Gruppe, unterteilt in drei Untergruppen
jeweils 3 Mäuse, wurde mit 100 mg/kg des Peptids 163-171.
TFA, 2000 U/kg IL-1β und 0,2 ml PBS zwei Tage nach
Immunisierung mit SRBC behandelt.
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Die Ergebnisse, dargestellt in Fig. 3, zeigen einen
signifikanten Anstieg hinsichtlich der PFC/Milz im
Vorhandensein des Peptids 163-171.TFA, gemessen 4 Tage nach
Immunisierung im Fall sowohl der Mäuse, die wie in A)
behandelt wurden als auch der Mäuse, die wie in B) und C)
behandelt wurden.
Beispiel 4
Bestimmung der immunstimulierenden Aktivität des
Pevtids 163-171 auf die sekundäre Antikörperantwort
gegenüber SRBC
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Mäuse, die mit SRBC wie im vorstehenden Beispiel 1 immunisiert
worden waren, wurden nochmals vier Tage nach der ersten
Impfung mit einer ähnlichen Dosis an SRBC-Antigenen und
gleichzeitig mit 12,36,100 mg/kg des Peptids 163-171.TFA und
500 - 1000 - 2000 U/kg von humanem IL-1-β intraperitoneal
beimpft.
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Die immunstimulierende Aktivität des Peptids auf die
Sekundärantwort gegenüber SRBC wurde ebenso durch Verabreichen
derselben Dosis des Peptids und von humanem IL-1-β, aber nur
mit der ersten Impfung bestimmt.
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Vier Tage nach der zweiten Dosis wurden die Mäuse getötet und
die Anzahl an PFC/Milz wurde wie in Beispiel 1 nach Vereinigen
des Komplements mit einem Kaninchenserum gegen
Maus-Immunglobulin in einer Endverdünnung von 1:200 bestimmt.
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Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 1 und Fig. 4, zeigen
einen Anstieg hinsichtlich der Gesamt-PFC/Milz in der
Anwesenheit des Peptids 163-171.TFA, das zu verschiedenen
Zeiten verabreicht wurde, abhängig von der verwendeten
Konzentration und das Maximum für eine Dosis von 100 mg/kg.
Tabelle I
Wirkung verschiedener Dosen des Peptids 163-171.TFA und von
humanen rIL-1-β auf die Sekundärantwort gegenüber SRBC
Behandlung a
Durchschnitt an Gesamt-Anti-SRBC-PFC/Milz (95 % Konfidenzintervall)
Peptid
a) Mäusen, die intravenös mit 1-2x10&sup8; SRBC am Tag -10
beimpft worden waren, wurden eine ähnliche Dosis am Tag 0
verarbreicht und sie wurde gleichzeitig intraperitoneal mit PBS
(Kontrolle) oder mit verschiedenen Dosen des Peptids
163-171.TFA oder von hu rIL-1β behandelt. Die Gesamtanzahl
der Anti-SRBC-PFC wurde vier Tage nach der zweiten
Antigenimpfung gemessen.
b) Statistische Significant gegen Kontrolle.
Beispiel 5
Adjuvanswirkung des Peptids 163-171.TFA auf das
Thymo-unabhängige Antigen SIII
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Das Verfahren war das gleiche wie in Beispiel 1:
intraperitoneale Impfung mit 0,5 ml PBS, enthaltend 0,5 ug
Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae Serotyp 3 SIII
(erhalten von Phillips J. Baker NIAID, NIH, Bethesda) und nach
zwei Stunden mit Peptid 163-171.TFA und humanem Interleukin
1-β.
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Nach fünf Tagen wurden die Mäuse getötet und Splenozyten
wurden aus der Milz isoliert, wiederholt gewaschen und in
MEM-Kulturmedium resuspendiert.
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Die Adjuvansaktivität des Peptids 163-171.TFA und von humanem
IL-1-β wurde danach wie in Beispiel 1 unter Verwendung von 25
ul einer 10 %-igen Suspension des SIII-Antigens, konjugiert
mit SRBC durch Chromchlorid in PBS (Baker P.J. et al. Appl.
Microbiol. 17, 422 (1969) bestimmt. Bei diesem Verfahren
wurden 0,5 ml sedimentierte SRBC in 1 ml Salzlösung, enthaltend 1
mg SIII, resuspendiert und 0,1 ml einer 0,1 Lösung von
Chromchlorid (Sigma Chemical Co., St. Louis) wurde danach zur
ersten Lösung zugefügt. Die sich ergebende Mischung wurde
unter sanfter Bewegung bei Raumtemperatur (20-25ºC) für 5
Minuten gehalten.
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Die Ergebnisse, dargestellt in Fig. 4, zeigen einen Anstieg
hinsichtlich der Anzahl der PFC/Milz in der Anwesenheit des
Peptids 163-171.TFA in Abhängigkeit von der Dosis und ein
Maximum bei einer Dosis von 100 mg/kg.
Beispiel 6
Analyse der immunstimulierenden Aktivität des Peptids
163-171.TFA, intravenös geimpft, im Vergleich zur Aktivität
des Peptids 163-171.HCl
A. Primärantwort gegenüber SRBC
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Das Verfahren war das gleiche wie in Beispiel 1, d.h.
intravenöse Impfung einiger Mäuse mit 0,2 ml PBS,
enthaltend das Peptid 163-171.TFA (von 1 pg/kg bis 100 ug/kg)
und anderer Mäuse mit 0,2 ml PBS, enthaltend das Peptid
163-171.HCl (von 1 pg/kg bis 100 u/kg).
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Die Ergebnisse, dargestellt in der nachstehenden Tabelle
2, zeigen, daß die Peptid 163-171.TFA-Zusammensetzung
aktiver ist, wenn sie intravenös geimpft wird, und daß
die Peptid 163-171.HCl- Zusammensetzung signifikant
aktiver als die 163-171.TFA- Zusammensetzung ist
hinsichtlich der Dosis, die notwendig zum Erhalten der
optimalen, immunstimulierenden Wirkung ist.
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Der maximale Anstieg hinsichtlich der Primärantwort
gegenüber SRBC wird bei Dosen von 10 pg - 1 ug/kg des
Peptids 163-171.HCl und Dosen von 10 - 100 ug/kg des
Peptids 163-171.TFA erhalten.
Tabelle 2
Vergleich der Wirkungen des Peptids 163-171.TFA und
163-171.HCl auf die Primärantwort gegenüber SRBC
Dosis des Peptids
PFC/Milz (% Kontrolle) nach
Kontrolle
B. Sekundärantwort gegenüber SRBC
-
Das Verfahren war das gleiche wie in Beispiel 4,
wobei das Antigen intravenös zusammen mit den
Zusammensetzungen des Peptids 163-171.TFA und
163-171.HCl (von 100 pg/kg bis 100 ug/kg in PBS)
geimpft wurde.
-
Die Ergebnisse in der nachstehenden Tabelle 3
zeigen, daß der maximale Anstieg hinsichtlich der
Sekundärantwort gegenüber SRBC bei einer Dosis von 1
ug/kg des Peptids 163-171.HCl, d.h. ungefähr
10000-fach niedriger als die Antwort, die im Fall
des Peptids 163-171.TFA (100 ug/kg) beobachtet
wurde, erhalten wird.
-
Zusätzlich ist die optimale Dosis für das
intravenös geimpfte Trifluoracetat-Peptid niedriger als
die Dosis (100 mg/kg), die benötigt wird, wenn es
intraperitoneal eingeführt wird.
Tabelle 3
Vergleich der Wirkungen des Peptids 163-171.TFA und 163-171.HCl
auf die Sekundärantwort gegenüber SRBC
Dosis des Peptids
Gesamt-PFC/Milz (% Kontrolle) nach
Kontrolle
Primärantwort gegenüber SIII
-
Das Verfahren war das gleiche wie in Beispiel 5,
d.h. intravenöse Impfung der Zusammensetzung der zwei
Peptide in Konzentrationen von 1 pg bis 100 pg/kg.
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Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen signifikante Anstiege
hinsichtlich der Antwort gegenüber dem Antigen SIII bei
Dosen von 1 - 100 pg/kg des Peptids 163-171.HCl.
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Bei denselben Dosen ist das Trifluoracetat-Peptid
inaktiv.
Tabelle 4
Vergleich zwischen den Wirkungen des Peptids 163-171.TFA
und 163-171.HCl auf die Primärantwort gegenüber SIII
Dosis des Peptids
PFC/Milz (% Kontrolle) nach
Kontrolle