DE2448530A1

DE2448530A1 - Derivate des diphtherietoxins, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende mittel

Info

Publication number: DE2448530A1
Application number: DE19742448530
Authority: DE
Inventors: Torsten B Dr Helting
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-10-11
Filing date: 1974-10-11
Publication date: 1976-04-15
Also published as: NL7511723A; AT342195B; CH622527A5; FR2287237B1; AU8559375A; IL48281A0; IE41909L; CA1059026A; CH628638A5; AU502887B2; IE41909B1; DE2448530C3; DK144528B; BE834446A; IL48281A; JPS5163929A; US4033819A; LU73556A1; DE2448530B2; SE7511383L

Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn) ,.

Aktenzeichen: HOE 7^/b 026= Ma 206

Datum: 9. Oktober 1974 Dr.Li/Hö

Derivate des Diphtherietoxins, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Mittel

Die Erfindung betrifft Derivate des Diphtherietoxins, Verfahren zu deren Herstellung durch Modifizierung eines Teilmoleküls des Diphtherietoxins und Mittel, insbesondere Diphtherie-Impfstoffe, welche eines der Derivate des Diphtherietcxins enthalten. *

Die herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschließlich durch Inaktivierung des Diphtherietoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese auch als Toxoid bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinanten ausgestattet, wovon nur einige wenige für die Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen Diphtherie eine Rolle spielen dürften. Die Abtrennung, von für den Schutz unwichtigen determinanten Gruppen ist wünschensv/ert, um zu antigenen bzw. immunogenen Stoffen zu kommen, dia wegen eines engeren Spektrums von antigenen Determinanten eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkoit erwarten lassen.

Diphtherietoxin wird von Zellen des Corynebacterium diphtheriae synthetisiert und extrazellulär als eine einzige Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 62.0OO in das Nahrmediuia

6 0 9 8 1 6,/ 1 0 3 1

_o" Ma 206 ^:

~²- 24*8530

freigesetzt. Durch milde Proteolysa in Gegenwart von Verbindungen, die Disulfidbrücken in Proteinen zu spalten vermögen, z.B. Thiol-Verbindungen, entstehen aus dem Diphtherietoxin zwei charakteristische Bruchstücke, das von dem NH₂-terminalen Teil des Toxins stammende sogenannte Fragment A (Molekulargewicht ca. 24,GOO) und das von dem Carboxy-terminalen Teil stammende eogenannte Fragment B. (Molekulargewicht ca. 38.000). Das Fragment A kann mit Methoden der Proteinchemie relativ leicht isoliert werden und ist in physiologischen Pufferlösungen in native r Form haltbar. Das Fragment B hingegen kann bekanntlich über längere Zeit in isoliertem Zustand nur in Gegenwart von denaturierenden Agenzien wie Harnstoff, GuaniJinhydrochlorid oder oberflächenaktiven Detergenzien in Lösung gehalten werden. Die Entfernung des Denaturierungsmittels führt zu einem vollständig wasserunlöslichen Fragment B, das eine Handhabung wesentlich erschwert. Dem nicht-denaturierten Fragment 3 wird jedoch eine entscheidende Rolle bei der Erzeugung von schützenden Antikör-

pern nach parenteraler Verabreichung zugeschrieben.

Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, -da« Fragment B des Diphtherietcxins in-einer-Weise--zu modifizieren, daß es ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen Medium in Lösung.gehalten werden kann. Im besonderen soll das Fragment B in der modifizierten Form als wesentlicher immunogener Bestandteil von Diphtherie-Impfstoffen verwendet werden können und darin das herkömmliche Formaldehydtoxoid ersetzen.

Es wurde nun gefunden, daß dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht, daß die"spontane, irreversible Ausfällung des Fragments B, die nach Entfernung der denaturierenden Agenzien wie Harnstoff immer beobachtet wird, dadurch vermieden wird, daß eine geringgradige chemische Modifizierung des Fragments B entweder vor oder nach der Abtrennung des Fragments A aus dem Molekülverband des Diphtherietoxins, das einen Komplex der Fragmente A und B darstellt, durchgeführt wird. .

609816/1031

- 3 - " ^Ma 206

244853C

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des Diphtherietoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, mit einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M, vorzugsweise 0.002 - 0.02 M, bei 1 - 20⁰C, vorzugsweise 1 - 6⁰C, 5 Minuten bis 50 Stunden, vorzugsweise 2-20 Stunden, behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart einer Disulfid-Brücken spaltenden Verbindung mit einem proteolytischen Enzym umsetzt, das / Derivat des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit protein-chemischen Isolierungsverfahren gewinnt und zweckmässig vom denaturierenden Agens abtrennt.

Nach der Isolierung des Derivates des Fragments B kann das de-· naturierende Agens durch Dialyse oder andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestattet, beispielsweise durch Gelfiltration entfernt werden. Mit gleichen Maßnahmen ist auch der zur Umsetzung eingesetzte und dabei nicht verbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.

Das entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Derivat zeigt danach in physiologisch verträglichen, isotonisch wäßrigen Medien nicht mehr die von dem nativen Fragment B bekannten Denaturierungs- und Ausfällungserscheinungen- Wie das Fragment B hat das Derivat nicht mehr die vom Diphtherietcxin ■bekannte giftige Eigenschaft. Es verhält sich als Antigen und ist in der Lage, schützende Antikörper gegen Diphtherie im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.

Das erfindungsgemäß hergestellte Derivat ist mit üblichen proteinchemischen Methoden weiter zu reinigen. Eei der bekannt hohen Toxizität des nativen Diphtherietoxins und der ebenso bekannten

6098 16/103 1

'Ma 206

-4- . 244853C

Tatsache, dass Eiweissfraktionierungsmethoden nur in den selten- · sten Fällen zu einer 100#igen Abtrennung von Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweisskörpern, führen, ist es jedoch vorteilhaft, das erfindungsgemäss hergestellte Produkt einer weiteren Aldehydbehandlung zu unterziehen, dadurch gekennzeichnet, dass man das erfindungsgemäss hergestellte Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14-28 Tage bei 20 - 37⁰C stehen lässt, den Aldehyd z.B. durch Dialyse entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

Die zusätzliche Aldehydbehandlung führt zu einer v/eiteren Stabilität des Fragments B in wässrigen Medien. Es ist demnach naheliegend, dass dieses stabile Derivat des Fragments B auch dadurch erhalten werden kann, dass Diphtherietoxin wie für die Herstellung des Fragments B bekannt, mit einem proteolytischen Enzym in Gegenwart von Disulfidbrücken-spaltenden Stoffen, z.B. Thiol-Verbindungen umgesetzt, die Lösung mit einem denaturierenden Agens versetzt, das Fragment B vorteilhaft durch Chromatographie, insbesondere Gelfiltration, gewonnen, das denaturierende Agens zweckmäßig durch Dialyse entfernt wird und das Fragment B anschließend sofort zusammen mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, in einer Konzentration von-0,0315 M bis 0,035 M 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1-20⁰C stehen gelassen wird. Gewünschtenfalls kann eine zweite Aldehydbehandlung zur Modifizierung des Derivates angeschlossen werden. Es kann jedoch auch das Fragment B unmittelbar nach dessen Isolierung mit der für die Modifizierung des Derivates verwendeten höheren Alöehydmenge umgesetzt werden.

609816/1031

Ma 206

Die Isolierung eines modifizierten Fragments B aus herkömmlichem Diphtherletoxoid ist nicht möglich, da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zwischen den Fragmenten A und B stattgefunden hat. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, jede das nicht denaturierte Fragment B enthaltende Lösung erfindungsgemäss mit Aldehyden umzusetzen, um zu Derivaten mit den vorteilhaften Eigenschaften ■bezüglich Stabilität und Antigenität zu kommen«

Als Ausgangsmaterial werden Biphtherietoxin-haltige wäßrige Medien eingesetzt, wie sie auch für die Gewinnung des Fragments B verwendet werden« beispielsweise bezüglich Diphtherie-■fcoxln angereicherte mehr oder weniger vorgereinigte Kultur filtrate, hochgereinigte Tcxinpräparationen oder Fragment B-Lösungen.

Proteolytische Enzyme, die bei der Herstellung des Fragments B Verwendung finden, sind Pronase_? Papain_ff Subtilising vorzugsweise jedoch Trypsin in löslicher odar in einer an einen festen Träger gebundenen Form» Es hat sich als vorteilhaft erwiesen. die proteolytische Reaktion mit EiIfe eines Inhibitors, Trypsin beispielsweise mit einem Trypsin-Xnhibitor aus tierischen Organen oder Pflanzen abzustoppen. Bei Verwendung von trägergebundenen proteolytischen Enzymen erübrigt sich der Einsatz von Inhibitoren.

Als Disulfid-Brücken-spaltende Verbindungen werden "Thiolverbindungen bevorzugt. Hierfür kommen beispielsweise in Frage Cystein, Mercaptoäthanol, Dithioerythrol, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol.

Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des vorgelegten Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Lösung von Wasserstoffbindungen in Prbteinmolekülen bewerkstelligt werden kann. Bekannte Vasserstoffbindungenlösende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid.

6098 16/1031

Ma 206

?on Harnstoff ist bekannt_s daß das Fragment B mit dessen Hilfe bei Konzentrationen >O,6 M in Lösung gehalten werden kann. Vor« teilliaft werden etwa h - 6 M Harnstoff oder etwa 2 - 4 M Guanidinhydrochlorid verwendet_o

Meben den aufgezeigten Verfahrensmöglichkeifcen sind Gegenstand der Erfindung ferner Derivate des Diphtherietoxins, die durch Parameter zu kennzeichnen sind* welche sich durch ihre Herstellung nach, dem vorgelegten Verfahren ergeben«

Schließlich sind Gegenstand der Erfindung Mittel, die die erfindiHigsgemäßen. Diphtherietoxin-Derivate enthalten, insbesondere Diphtherie-Impfstoffe zur Prophylaxe der Diphtherie-Erkrankung ©der zur Herstellung von Diphtherie-Antiseren, aber auch diagnostische Präparate«. Zur Erhöhung der Losungsstabilität des erfindungsgemäß hergestellten Produkts kann es zweckmäßig sein, dem physiologisch verträglichen„ wäßrigen Medium, in dem dies gelöst ist, Aminosäuren oder Kohlenhydrate zuzusetzen.

Die Eignung der Produkte als Impfstoffs wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute Verträglichkeit und Wirksamkeit ■des Produkts bescheinigen«

609816/1031

— Ί. - ' fa.· ?06

Vertr äql ichke it ste st

244B53C

Da bei dem herkömmlichen Formaldehyd-Toxoid insbesondere auf allergische Reaktionen vom verzögerten Typ geachtet werden muß, wurde das Produkt gemäß der Erfindung mit dem herkömmlichen Toxoid im folgenden Versuch verglichen:

Gruppen ä 10 Meerschweinchen erhielten:

A. 0,5 ml des Produkts nach Beispiel 1 mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)₃-GeI adsorbiert» und 3 Wochen später 0,5 nl desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)₃.

B. 0,5 ml eines herkömmlichen Formaldehyd-Toxoids mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)₃ adsorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)₃.

12 Tage später erhielten sämtliche Tiere 0,1 ml der beiden Antigene intrakutan in drei Verdünnungen (10/ug/ml, 1 /ug/ml und O,l ,ug/ml) . Die Hautdicke an der Injektionsstelle wurde nach O,24 und 48 Stunden gemessen. Die durchschnittliche Zunahme der -flautdicke als-Maß für-die-allergische Reaktion war mit dem herkömmlichen Toxoid größer als bei dem erfindungsgemäßen Produkt.

Durchschnittliche Zunahme der Hautdicke in 1/10 ium nach Injektion, gemessen mit Kutimeter (Hautdickenmeßgerät der F?.. Hauptner):

A. Mit dem Produkt gemäß Erfindung

immunisierte Tiere · ■ . Reaktion

24 Std. 48 Std.

Challenge mit erfindungsgemäßem Produkt 5,3 0,16 Challenge mit herkömml. Toxoid 7,0 1,8

B. Mit dem herkömmlichen Toxoid
immunisierte Tiere

Challenge mit erfindungsgemäßem Produkt 5,7 3,0 Challenge mit herkömml. Toxoid 9,1 4,S

6 0 9 8 16/1031

Wirksamkeitstest - 3Γ ~ - Ma 206

S "" ^ " 244853C

Gruppen ä 5 Meerschweinchen erhielten subkutan 0,5 ml (20 / einer Suspension des Produkts nach Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Ai(0H)3-Gel. 4 Wochen später· wurden die Tiere mit 0,3 mg Diphtherietoxin, entspr. 10 minimal-tödlicher Dosen (= dim = dosis letalis minima), vergiftet. Sämtliche Tiere überlebten die Vergiftung. Dasselbe Produkt verabreicht als adsorbatfreier Impfstoff mit 100/ug/Tier, führte zu einer Überlebensrate von 20%.

m einen Vergleich mit der Situation der Menschen, die schon einen Diphtherieantitoxintiter haben, ziehen zu können, wurden Gruppen ei 5 Meerschweinchen mit herkömmlichem Toxoid vorimmunieiert. Die Dosis des herkömmlichen Impfstoffes wurde so gewählt, daß der Antitoxintiter nach 28 Tagen stets unter 0,125 IE/ml Serum betrug. Am Tag 28 wurden Antigene, die laut den Beispielen hergestellt worden waren, in unterschiedlichen Dosen als adsorbatfreie Impfstoffe verabreicht und der Antitoxintiter 10 Tage epäter ermittelt. Tiere, die 0,2-0,4 ^ig/Tier des Produkts laut Beispiel 2 bekommen hatten, zeigten eine Erhöhung des Antitoxintiter s um das 30-6Ofache.

Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.

609816/1031

ORlGfNAL INSPECTED

Beispiel 1 _ 5, _ ^Ma" ^2o6

Diphtherietoxin (100.000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als 0,1% Proteinlcsung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 mit "Formaldehyd bis zu einer End-Tconzentration von 0,015 M Aldehyd versetzt und 16 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Lösung wird in einen Dialysierschlauch gefüllt und anschließend gegen die 1Ofache Menge von 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer (TRIS) von pH 8,0 dialysiert, danach mit Trypsin (2/ug/ml) in Gegenwart von Dithiothreitol (DTT) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge (3/ag/ml) versetzt. Nach Ankonzentrierung der Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mg Protein pro ml auf einem Ultrafilter wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M/l hinzugefügt und die Lösung auf eine Säule (4,5 χ 100 cm) von Sephade'x'^R) G-150 (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala), äquilibriert mit 6 M Harnstoff in 0,1 M Trispuffer, pH 8,0, und DTT 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei der Chromatographie werden durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm drei Proteinpeaks erkennbar. Der erste, kleinste Peak stellt hochmolekulares Material dar und wird verworfen. Der zweite Peak enthält das Derivat des Fragments B. Es kann zur Weiterreinigung einer Rechromatographie unterzogen werden. Peak 3 enthält das Fragment A.

Die Losung des isolierten Derivates des Fragments B wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 auf 500 ml verdünnt und anschüä3sxl· gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis eine qualitative Harnstoff-Analyse negativ wird. Die Formaldehydkonzentratj.on der Harnstoff-freien Lösung des Derivates des Fragments B wird anschließend auf 0,07 M gebracht und 21 Tage bei 37°C inkubiert. Nach einer abschließenden Dialyse gegen O,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und zu einer Vaccine in bekannter Weise verarbeitetv/erüai. Dabei kann als Stabilisator Glycin (0,1 M) oder Lysin (0,05 M) verwendet werden.

60981 6/1031

/ο

Statt Formaldehyd kann auf die molare Aldehydmenge ⁴TDezogen' auch Glutardialdehyd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd entweder in beiden Stufen oder auch nur in einer Stufe verwendet werden, um zu einem Produkt mit den gleichen Eigenschaften der guten Löslichkeit und der Antigenität kommen zu können.

Beispiel 2

Diphtherietoxin (100.000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als O,l%ige Proteinlösung in 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer von pH-Wert 8,0 dj.alysiert, danach mit Trypsin (2/ug/ml) in Gegenwart von Dithioerythrit (DTE) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge (3/Ug/ml) versetzt. Danach wird Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 0,015 M Aldehyd zu der Lösung zugesetzt und 16 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Zu dieser Lösung v/ird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M/1 hinzugefügt und die Gewinnung des Derivates des Fragments B wie im Eeispiel 1 vorgenommen. Gewünschtenfalls kann die anschließende Umsetzung mit 0,07 M Formaldehyd ebenfalls wie im Beispiel 1 erfolgen.

Beispiel 3

Diphtherietoxin (100.000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als 0,l%ige Proteinlösung unter Weglassung der Vorbehandlung mit 0,015 M Aldehyd mit Trypsin in Gegenwart von Dithiothreitol wie im Beispiel 1 behandelt und wie dort für die Umsetzung des Derivates des Fragments B beschrieben mit 0,07 M Aldehyd weiter verarbeitet und schließlich das modifizierte Derivat des Fragments 3 gewonnen.

6098 16/103 1

Claims

Patentansprüche

».Ma 206

1· Verfahren zur Herstellung eines Derivates des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des Diphtherietoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M bei 1 - 20° C, 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart einer Disulfid-Brücken spaltenden Verbindung mit einem proteolytischen Enzym umsetzt _t das Derivat des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und zweckmässig vom denaturierenden Agens abtrennt.

2. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Derivates des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man das gemäss Anspruch 1 hergestellte Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehyd-Konzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14 - 28 Tage bei 20-37 c stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

3· Verfahren zur Herstellung eines Derivates des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man von denaturierendem Agens freies Fragment B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 -. 6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M versetzt und 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1 - 20° C stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins gewinnt.

6098 16/103 1

: Ma 206

k. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Derivates des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man von denaturierendem Agens freies Fragment B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehvd-Konzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1 - 20 C stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins gewinnt.

5· Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins, gekennzeichnet durch Parameter eines Produkts, das erhalten wird durch ein Verfahren gemäss Anspruch 1.

6. Modifiziertes Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins, gekennzeichnet durch Parameter eines Produkts, das erhalten wird durch ein Verfahren gemäss Anspruch 2.

7»Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins, gekennzeichnet durch Parameter eines Produkts, das erhalten wird durch ein Verfahren gemäss Anspruch 3·

8. Modifiziertes Derivat des Fragments E des Diphtherietoxins, gekennzeichnet durch Parameter eines Produkts, das erhalten wird durch ein Verfahren gemäss Anspruch 4.

9. Mittel enthaltend ein Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins oder ein modifiziertes Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins nach einem der Ansprüche 5 bis 8.

10. Diphtherie-Impfstoff enthaltend ein"Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins nach Ansprüchen 5 und 7·

11. Diphtherie-Impfstoff enthaltend ein modifiziertes Derivat des Fragments B des Diphtherietoxins nach Ansprüchen 6 und 8.

60981 6/103 1