DE2448530B2 - Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Diphtherietoxins und diese enthaltende Mittel - Google Patents
Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Diphtherietoxins und diese enthaltende MittelInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Diphtherietoxins durch Modi- ίο
fizierung eines Teilmoleküls des Diphtherietoxins und Mittel, insbesondere Diphtherie-Impfstoffe, welche
diese Derivate des Diphtherietoxins enthalten.
Die herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschließlich
>> durch Inaktivierung des Diphtherietoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese auch als Toxoid
bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinaten ausgestattet, wovon nur einige
wenige für die Erzeugung von schützenden Antikör- w> pern gegen Diphtherie eine Rolle spielen dürften. Die
Abtrennung von für den Schutz unwichtigen determinanten Gruppen ist wünschenswert, um zu antigenen
bzw. immunogenen Stoffen zu kommen, die wegen eines engeren Spektrums von antigenen Determinan- h>
ten eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkeit erwarten lassen.
Diphtherietoxin wird von Zellen des Oorynebacterium
diphtheriae synthetisiert und extrazellulär als eine einzige Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht
von etwa 62 000 in das Nährmedium freigesetzt. Durch milde Proteolyse in Gegenwart von Verbindungen,
die Disulfidbrücken in Proteinen zu spalten vermögen, z. B. Thiol-Verbindungen, entstehen aus
dem Diphtherietoxin zwei charakteristische Bruchstücke, das von dem NH2-terminalen Teil des Toxins
stammende sogenannte Fragmente A (Molekulargewicht ca. 24000) und das von dem Carboxy-terminalen
Teil stammende sogenannte Fragment B (Molekulargewicht ca. 38000). Das Fragment A kann mit
Methoden der Proteinchemie relativ leicht isoliert werden und ist in physiologischen Pufferlösungen in
nativer Form haltbar. Das Fragment B hingegen kann bekanntlich über längere Zeit in isoliertem Zustand
nur in Gegenwart von denaturierenden Agenzien wie Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder oberflächenaktiven
Detergenzien inn Lösung gehalten werden. Die Entfernung des Denaturierungsmirtels führt zu
einem vollständig wasserunlöslichen Fragment B, das eine Handhabung wesentlich erschwert. Dem nichtdenaturierten Fragment B wird jedoch eine entscheidende
Rolle bei der Erzeugung von Antikörpern nach parenteraler Verabreichung zugeschrieben.
Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das Fragment B des Diphtherietoxins
in einer Weise zu modifizieren, daß es ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen
Medium in Lösung gehalten werden kann. Im besonderen soll das Fragment B in der modifizierten
Form als wesentlich immunogener Bestandteil von Diphtherie-Impfstoffen verwendet werden können
und darin das herkömmliche Formaldehydtoxoid ersetzen.
Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht,
daß die spontane, irreversible Ausfällung des Fragments B, die nach Entfernung der denaturierenden
Agenzien wie Harnstoff immer beobachtet wird, dadurch vermieden wird, daß eine geringgradige chemische
Modifizierung des Fragments B entweder vor oder nach der Abtrennung des Fragments A aus dem
Molekülverband des Diphtherietoxins, das einen Komplex der Fragmente A und B darstellt, durchgeführt
wird.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Derivaten des Fragments B
des Diphtherietoxins, die in physiologisch verträglichen Lösungen beständig sind, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine wäßrige Lösung des Diphtherietoxins vor oder nach der Behandlung mit einem
proteolytischen Enzym in Gegenwart einer Disulfid-Brücken spaltenden Verbindung mit einem aliphatischen
Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, mit
einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M, vorzugsweise 0,002-0,02 M bei 1-20° C,
vorzugsweise 1-6° C, 5 Minuten bis 50 Stunden, vorzugsweise 2-20 Stunden, reagieren läßt, die Derivate
des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen
Isolierungsverfahren gewinnt und gegebenenfalls vom denaturierenden Agens abtrennt.
Nach der Isolierung des Derivates des Fragments B kann das denaturierende Agens durch Dialyse oder
andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung niedermolekularer Stoffe von hochmolekularem Pro-
tein gestatten, beispielsweise durch Gelfiltration, entfernt werden. Mit gleichen Maßnahmen ist auch der
zur Umsetzung eingesetzte und dabei nicht verbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.
Das entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Derivat zeigt danach in physiologisch
verträglichen, isotonisch wäßrigen Medien nicht mehr die von dem nativen Fragment B bekannten Denaturierungs-
und Ausfällungserscheinungen. Wie das Fragment B hat das Derivat nicht mehr die vom
Diphtherietoxin bekannte giftige Eigenschaft. Es verhält sich als Antigen und ist in der Lage, schützende
Antikörper gegen Diphtherie im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.
Das erfindungsgemäß hergestellte Derivat ist mit üblichen proteinchemischen Methoden weiter zu reinigen.
Bei der bekannt hohen Toxizität des nativen Diphtherietoxins und der ebenso bekannten Tatsache,
daß Eiweißfraktionierungsmethoden nur in den seltensten Fällen zu einer 100%igen Abtrennung von
Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweißkörpern, führen, ist es jedoch vorteilhaft,
das erfindungsgemäß hergestellte Produkt einer weiteren Aldehydbehandlung zu unterziehen, die zu modifizierten
Derivaten des Fragments führt und die dadurch gekennzeichnet ist, daß man das erfindungsgemäß
hergestellte Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge
von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,035 M
bis 0,35 M versetzt und 14-28 Tage bei 20-37 ° C stehen
läßt, den Aldehyd z. B. durch Dialyse entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.
Die zusätzliche Aldehydbehandlung führt zu einer weiteren Stabilität des Fragments B in wäßrigen Medien.
Es ist demnach naheliegend, daß dieses stabile Derivat des Fragments B auch dadurch erhalten werden
kann, daß Diphtherietoxin, wie für die Herstellung des Fragments B bekannt, mit einem pioteolytisehen
Enzym in Gegenwart von Disulfidbrückenspaltenden Stoffen, z. B. Thiol-Verbindungen umgesetzt
die Lösung mit einem denaturierenden Agens versetzt, das Fragment B vorteilhaft durch Chromatographie,
insbesondere Gelfiltration, gewonnen, das denaturierende Agens zweckmäßig durch Dialyse
entfernt wird und das Fragment B anschließend sofort zusammen mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd
der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, in einer Konzentration
von 0,0015 M bis 0,035 M 5 Minuten bis 50 Stunden bei 1-20° C stehen gelassen wird. Gewünschtenfalls
kann eine zweite Aldehydbehandlung zur Modifizierung des Derivates angeschlossen werden. Es kann
jedoch auch das Fragment B unmittelbar nach dessen Isolierung mit der für die Modifizierung des Derivates
verwendeten höheren Aldehydmenge umgesetzt werden.
Die Isolierung eines modifizierten Fragments B aus herkömmlichem Diphtherietoxoid ist nicht möglich,
da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zwischen
den Fragmenten A und B stattgefunden hat. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, jede das
nicht denaturierte Fragment B enthaltende Lösung erfindungsgemäß mit Aldehyden umzusetzen, um zu
Derivaten mit den vorteilhaften Eigenschaften bezüglich Stabilität und Antigenität zu kommen.
Als Ausgangsmaterial werden Diphtherietoxinhaltige wäßrige Medien eingesetzt, wie sie auch für
die Gewinnung des Fragments B verwendet werden, beispielsweise bezüglich Diphtherietoxin angereicherte
mehr oder weniger vorgereinigte Kulturfiltrate, hochgereinigte Toxinpräparationen oder Fragment-B-Lösungen.
Proteolytische Enzyme, die bei der Herstellung des Fragments B Verwendung finden, sind Pronase, Papain,
Subtilisin, vorzugsweise jedoch Trypsin in löslicher oder in einer an einen festen Träger gebundenen
Form. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die proteolytische Reaktion mit Hilfe eines Inhibitors, Trypsin
beisielsweise mit einem Trypsin-Inhibitor aus tierischen Organen oder Pflanzen abzustoppen. Bei Verwendung
von trägergebundenen proteolytischen Enzymen erübrigt sich der Einsatz von Inhibitoren.
Als Disulfid-Brücken-spaltende Verbindungen werden Thiolverbindungen bevorzugt. Hierfür kommen
beispielsweise in Frage Cystein, Mercaptoäthanol, Dithioerythrol, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol.
Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des vorgelegten
Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Lösung von Wasserstoffbindungen
in Proteinmolekülen bewerkstelligt werden kann. Bekannte Wasserstoffbindungen-lösende
Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid.
Von Harnstoff ist bekannt, daß das Fragment B mit dessen Hilfe bei Konzentration
> 0,6 M in Lösung gehalten werden kann. Vorteilhaft werden etwa 4—6 M Harnstoff oder etwa 2-4 M Guanidinhydrochlorid
verwendet.
Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, die die erfindungsgemäßen Diphtherietoxin-Derivate enthalten,
insbesondere Diphtherie-Impfstoffe zur Prophylaxe der Diphtherie-Erkrankung oder zur Herstellung
von Diphtherie-Antiseren, aber auch diagnostische Präparate. Zur Erhöhung der Lösungsstabilität
des erfindungsgemäß hergestellten Produkts kann es zweckmäßig sein, dem physiologisch verträglichen,
wäßrigen Medium, in dem dieses gelöst ist, Aminosäuren oder Kohlenhydrate zuzusetzen.
Die Eignung der Produkte als Impfstoffe wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute
Verträglichkeit und Wirksamkeit des Produkts bescheinigen.
Verträglichkeitstest
Da bei dem herkömmlichen Formaldehyd-Toxoid insbesondere auf allergische Reaktionen vom verzögerten
Typ geachtet werden muß, wurde das Produkt gemäß der Erfindung mit dem herkömmlichen Toxoid
im folgenden Versuch verglichen:
Gruppen ä 10 Meerschweinchen erhielten:
A. 0,5 ml des Produkts nach Beispiel 1 mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)3-GeI absorbiert,
und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)3.
B. 0,5 ml eines herkömmlichen Formaldehyd-ToxoidsmitO.l
mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)3 adsorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben
Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)3.
12 Tage später erhielten sämtliche Tiere 0,1 ml der
beiden Antigene intrakutan in drei Verdünnungen (10 μg/ml, 1 μg/ml und 0,1 μg/ml). Die Hautdicke an
der Injektionsstelle wurde nach 0,24 und 48 Stunden
gemessen. Die durchschnittliche Zunahme der Hautdicke als Maß für die allergische Reaktion war mit
dem herkömmlichen Toxoid größer als bei dem erfindungsgemäßen Produkt.
Durchschnittliche Zunahme der Hautdicke in V10 mm nach Injektion, gemessen mit Kutimeter
(Hautdickenmeßgerät der Fa. Hauptner):
A. Mit dem Produkt gemäß
Erfindung immunisierte Tiere Reaktion
24 Std. 48 Std.
Challenge mit erfindungsgemäßem Produkt 5,3 0,16
Challenge mit herkömml.
Toxoid 7,0 1,8
Challenge mit herkömml.
Toxoid 7,0 1,8
B. Mit dem herkömmlichen
Toxoid immunisierte Tiere
Challenge mit erfindungsgemäßem Produkt 5,7 3,0
Challenge mit herkömml.
Toxoid immunisierte Tiere
Challenge mit erfindungsgemäßem Produkt 5,7 3,0
Challenge mit herkömml.
Toxoid 9,1 4,9
Wirksam keitstest
Gruppen ä 5 Meerschweinchen erhielten subkutan 0,5 ml (20 μg) einer Suspension des Produkts nach
Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Al(OH)3-GeI. 4 Wochen
später wurden die Tiere mit 0,3 mg Diphtherietoxin, entspr. 10 minimal-tödlicher Dosen
(= dim = dosis letalis minima), vergiftet. Sämtliche Tiere überlebten die Vergiftung. Dasselbe Produkt
verabreicht als adsorbatfreier Immpfstoff mit 100 μg/Tier, führte zu einer Überlebensrate von 20%.
Um einen Vergleich mit der Situation der Menschen ziehen zu können, die schon einen Diphtherieantitoxintiter
haben, wurden Gruppen ä 5 Meerschweinchen mit herkömmlichem Toxoid vorimmunisiert.
Die Dosis des herkömmlichen Impfstoffes wurde so gewählt, daß der Antitoxintiter nach 28 Tagen stets
unter 0,125 ΙΕ/ml Serum betrug. Am Tag 28 wurden Antigene, die laut den Beispielen hergestellt worden
waren, in unterschiedlichen Dosen als adsorbatfreie Impfstoffe verabreicht und der Antitoxintiter 10 Tage
später ermittelt. Tiere, die 0,2-0,4 μg/Tier des Produkts laut Beispiel 2 bekommen hatten, zeigten eine
Erhöhung des Antitoxintiters um das 30-60fache.
Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.
Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als
0,1 % Proteinlösung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von
0,015 M Aldehyd versetzt und 16 Stunden bei 4° C stehen gelassen. Die Lösung wird in einen Dialysierschlauch
gefüllt und anschließend gegen die lOfache Menge von 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer
(TRIS) von pH 8,0 dialysiert, danach mit Trypsin (2 μg/ml) in Gegenwart von Dithiothreito!
(DTT) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37° C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor aus
Rinderlunge (3 μg/ml) versetzt. Nach Ankonzentrierung der Lösung auf eine Endkonzentration von
10 mg Protein pro ml auf einem Ultrafilter wird Harnstoff
bis zu einer Konzentration von 6 M/l hinzugefügt und die Lösung auf eine Säule (4,5 X 100 cm) von Sephadex®
G-150 (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala), äquilibriert mit 6 M Harnstoff in 0,1 MTrispuffer,
pH 8,0 und DTT 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei
der Chromatographie werden durch Messung der UV-Absorption bei 280 mn drei Proteinpeaks erkennbar.
Der erste, kleinste Peak stellte hochmolekulares Material dar und wird verworfen. Der zweite
Peak enthält das Derivat des Fragments B. Es kann zur Weiterreinigung einer Rechromatographie unterzogen
werden. Peak 3 enthält das Fragment A.
Die Lösung des isolierten Derivates des Fragments B wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 auf 500 ml verdünnt und anschließend gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis eine qualitative Harnstoff-Analyse negativ wird. Die Formaldehydkonzentration der Harnstoff-freien Lösung des Derivates des Fragments B wird anschließend auf 0,07 M gebracht und die Lösung wird sodann 21 Tage bei 37° C inkubiert. Nach einer abschließenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und zu einem Impfstoff in bekannter Weise verarbeitet werden. Dabei kann als Stabilisator Glycin (0,1 M) oder Lysin (0,05 M) verwendet werden.
Die Lösung des isolierten Derivates des Fragments B wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 auf 500 ml verdünnt und anschließend gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis eine qualitative Harnstoff-Analyse negativ wird. Die Formaldehydkonzentration der Harnstoff-freien Lösung des Derivates des Fragments B wird anschließend auf 0,07 M gebracht und die Lösung wird sodann 21 Tage bei 37° C inkubiert. Nach einer abschließenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und zu einem Impfstoff in bekannter Weise verarbeitet werden. Dabei kann als Stabilisator Glycin (0,1 M) oder Lysin (0,05 M) verwendet werden.
Statt Formaldehyd kann auf die molare Aldehydmenge, bezogen auf Glutardialdehyxd, Propionaldehyd
oder Butyraldehyd, entweder in beiden Stufen oder auch nur in einer Stufe verwendet werden, um
zu einem Produkt mit den gleichen Eigenschaften der guten Löslichkeit und der Antigenität kommen zu
können.
Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als
0,l%ige Proteinlösung in 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer
von pH-Wert 8,0 dialysiert, danach mit Trypsin (2 μg/ml) in Gegenwart von
Dithioerythrit (DTE) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37° C inkubiert und anschließend mit Trypsininhibitor
aus Rinderlunge (3 μ^ΐτιΐ) versetzt. Danach
wird Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 0,015 M Aldehyd zu der Lösung zugesetzt und 16
Stunden bei 4° C stehen gelassen. Zu dieser Lösung wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M/l
hinzugefügt und die Gewinnung des Derivates des Fragments B wie im Beispiel 1 vorgenommen. Gewünschtenfalls
kann die anschließende Umsetzung mit 0,07 M Formaldehyd ebenfalls wie im Beispiel 1
erfolgen.
Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Einheiten, entspr. ca. 270 mg Protein) wird als
0,1 %ige Proteinlösung, unier Weglassung der Vorbehandlung mit 0,015 M Aldehyd, mit Trypsin in Gegenwart
von Dithiothreitol wie im Beispiel 1 behandelt und wie dort für die Umsetzung des Derivates
des Fragments B beschrieben mit 0,07 M Aldehyd weiter verarbeitet und schließlich das modifizierte
Derivat des Fragments B gewonnen.
Claims (5)
1. Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins die in physiologisch
verträglichen Lösungen beständig sind, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige
Lösung des Diphtherietoxins vor oder nach der Behandlung mit einem proteolytischen Enzym in
Gegenwart einer Disulfidbrücken spaltenden ι»
Verbindung mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen
in einer Aldehydkonzentration von 0,0015 M bis 0,035 M bei 1-20° C, 5 Minuten
bis 50 Stunden reagieren läßt, die Derivate des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart
eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und gegebenenfalls
vom denaturierenden Agens abtrennt. -'«
2. Verfahren zum Herstellen von Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aldehydbehandlung an von denaturierendem Agens freiem Fragment B durchführt. -?'>
3. Verfahren zur Modifizierung der nach Anspruch 1 erhaltenen Derivate des Fragments B des
Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man diese mit einem aliphatischen Mono- oder
Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlen- j<> Stoffatomen bis zu einer Aldehyd-Konzentration
von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14-28 Tage bei 20-37° C stehen läßt, den Aldehyd entfernt
und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt. Γι
4. Verfahren zum Herstellen der nach Anspruch 3 erhältlichen modifizierten Derivate des
Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aldehydbehandlung
nach Anspruch 3 an von denaturierendem Agens w freiem Fragment B durchführt.
5. Diphtherie-Impfstoff, enthaltend eines der nach den Ansprüchen 1-4 erhaltenen Derivate.
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