DK144528B - Fremgangsmaade til fremstilling af et derivat af fragment b af difteritoxin - Google Patents

Description

(ο) DANMARK \ |a * 'Vw· / Λ (

W) (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n) 14U528 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. ^572/75 (51) |nt.CI.3 C 07 G 7/00 (22) Indleveringsdag 10. okt. 1975 A 61 K 39/05 (24) Løbedag 10. okt. 1975 (41) Aim. tilgængelig 12. apr. 1976 (44) Fremlagt 22. tnar. 1982 (86) International ansøgning nr. " (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag “ (62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 11. okt. 1974, 2448530, DE

(71) Ansøger BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg/Lahn, DE.

(72) Opfinder Torsten Bertil Helting, DE.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et derivat af fragmentet B af dif= teritoxin.

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af et derivat af fragmentet B af dif-teritoxin. ved modificering af et delmolekyle af difteritoxinet.

CD De traditionelle difterivacciner til aktiv immunisering CD indeholder næsten udelukkende antigen, der er fremstillet ved in-

N

^ aktivering af difteritoxinet med formaldehyd. Dette stof, der også -3" betegnes toxoid, er udstyret med en mangfoldighed af antigene de- r- terminanter, hvoraf vel nok kun nogle få spiller en rolle for frem- bringeisen af beskyttende antistoffer mod difteri. Det er ønske-øl ligt at fraskille determinerende grupper, der er uvæsentlige for beskyttelsen, for at nå til antigene eller immunogene stoffer, der 2 144528 på grund af et snævrere spektrum af antigene determinanter stiller en forøget specificitet og en forbedret tålelighed i udsigt.

Difteritdxin syntetiseres fra celler af Corynebacterium diphtheriae og frigøres ekstracellulært i næringsmediet som en enkelt polypeptidkæde med en molekylvægt på ca. 62.000. Ved mild pro-teolyse i nærværelse af forbindelser, der er i stand til at spalte disulfidbroer i proteiner, f.eks. thiolforbindelser, dannes to karakteristiske brudstykker ud fra difteritoxinet, nemlig det såkaldte fragment A (molekylvægt ca. 24.000), der stammer fra den N^-afsluttede del af toxinet, og det såkaldte fragment B (molekylvægt ca. 38.000), der stammer fra den carboxy-afsluttede del. Fragmentet A kan isoleres relativt let ved metoder inden for proteinkemien, og det er holdbart i nativ form i fysiologiske pufferopløsninger. Fragmentet B derimod kan som bekendt kun holdes i opløsning i isoleret tilstand igennem længere tid i nærværelse af denatureringsmidler, såsom urinstof, guanidinhydrochlorid eller overfladeaktive detergenter. Fjernelsen af denatureringsmidlet fører til et fuldstændig vanduopløseligt fragment B, der er særdeles vanskeligt at håndtere. Det ikke-denaturerede fragment B tilskrives imidlertid en afgørende rolle ved. dannelsen .af beskyttende antistoffer efter parenteral indgift.

Til grund for den her beskrevne opfindelse ligger derfor den opgave at modificere fragmentet B af difteritoxinet på en sådan måde, at det kan holdes i opløsning i et fysiologisk acceptabelt medium uden tab af antigeniteten. I den modificerede form bør fragmentet B især kunne anvendes som væsentlig, immunogen bestanddel af difterivacciner og erstatte det traditionelle formalde-hyd-toxoid i disse.

Det har nu vist sig, at dette kan opnås ved en fremgangsmåde, hvis kernepunkt ligger i, at den spontane, irreversible udfældning af fragmentet B, der altid iagttages efter fjernelse af denatureringsmidlerne, såsom urinstof, undgås ved gennemførelse af en kemisk modificering af ubetydelig grad· af fragmentet B enten forud for eller efter fraskilleisen af fragmentet A fra den molekyl-samling af difteritoxinet, der er et kompleks af fragmenterne A og B.

Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed en fremgangsmåde til fremstilling af et derivat af fragmentet B af difteritoxin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 3 144528 man underkaster en vandig opløsning af difteritoxin behandling - i vilkårlig rækkefølge - med 1) et aliphatisk mono- eller dialdehyd med en kædelængde på 1-6 carbonatomer, fortrinsvis formaldehyd, i en aldehydkoncentration på fra 0,0015 M til 0,035 M, fortrinsvis fra 0,002 M til 0,02 M i fra 5 minutter til 50 timer, fortrinsvis 2-20 timer, ved 1-20°C, fortrinsvis 1-6°C, og 2) et proteolytisk enzym i nærværelse af en disulfidbro-spaltende forbindelse på i og for sig kendt måde, hvorpå man udvinder derivatet af fragmentet B fra den fremkomne opløsning i nærværelse af et denatureringsmiddel ved proteinkemiske isoleringsfremgangsmåder, fraskiller det fra denatureringsmidlet og fortsætter med en yderligere behandling af derivatet med et aldehyd.

Efter isoleringen af derivatet af fragmentet B kan denatureringsmidlet fjernes ved dialyse eller andre sammenlignelige metoder, der muliggør fraskillelse af lavmolekylære stoffer fra højmolekylært protein, f.eks. ved gelfiltrering. Ved samme foranstaltninger skal man også fra blandingerne fjerne det aldehyd, der er anvendt til omsætningen og ikke opbrugt ved denne.·

Det ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede derivat viser herefter ikke mere de ved det native fragment B kendte denaturerings- og udfældningssymptomer i fysiologisk acceptable, isotonisk vandige medier. Ligesom fragmentet B har derivatet ikke mere den ved difteritoxinet kendte, giftige egenskab. Det opfører sig som antigen og er i stand til at fremkalde beskyttende antistoffer mod difteri i menneske- eller dyreorganismen.

Let ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede derivat skal renses yderligere ved gængse proteinkemiske metoder. Scm følge af den som bekendt høje toksicitet af det native difteritoxin og det ligeledes kendte faktum, at proteinfraktioneringsmetoderne kun i de sjældneste tilfælde fører til en 100%'s fraskillelse af ledsagestoffer, især lignende strukturerede proteinstoffer, underkastes det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen én gang aldehydbehandlede derivat af fragmentet B en yderligere aldehydbehandling, der fortrinsvis gennemføres ved, at man til derivatet af fragmentet B sætter et aliphatisk mono- eller dialdehyd med en kædelængde på 1-6 carbonatomer, fortrinsvis formaldehyd, indtil en aldehydkoncentration på fra 0,035 M til 0,35 M og lader blandingen henstå ved 20-37°C i 14-28 dage, fjerner aldehydet, f.eks. ved dialyse, og udvinder produktet.

144528 4

Den supplerende aldehydbehandling fører til en yderligere stabilitet af fragmentet B i vandige medier. Som følge heraf er det nærliggende, at dette stabile derivat af fragmentet B også kan fremstilles ved, at man, som det er kendt ved fremstillingen af fragmentet B, omsætter difteritoxinet med et proteolytisk enzym i nærværelse af disulfidbro-spaltende stoffer, f.eks. thiolforbin-delser, sætter et denatureringsmiddel til opløsningen, med fordel udvinder fragmentet B ved chromatografi, især gelfiltrering, fjerner denatureringsmidlet hensigtsmæssigt ved dialyse, og dernæst straks lader fragmentet B henstå ved 1 - 20°C i fra 5 minutter til bO timer sammen med et aliphatisk mono- eller dialdehyd med en kædelængde på 1 - 6 carbonatomer, fortrinsvis formaldehyd, i en koncentration på fra 0,0015 M til 0,035 M, hvorefter der kan tilsluttes en anden aldehydbehandling til modificering af derivatet.

Det er ikke muligt at isolere et modificeret fragment B ud fra et traditionelt difteritoxoid, fordi der her har fundet en kovalent tværbinding sted mellem fragmenterne A og B ved anvendelse af væsentlig højere formaldehydmængder. Der er imidlertid intet til hinder for at omsætte en hvilken som helst opløsning indeholdende det ikke-denaturerede fragment B med aldehyder på den her omhandlede måde for at nå til derivater med de fordelagtige egenskaber med hensyn til stabilitet og antigenitet.

Som udgangsmateriale anvendes sådanne difteritoxin-hol-dige, vandige medier, som også anvendes til udvindingen af fragmentet B, f.eks. mere eller mindre forrensede kulturfiltrater, der er koncentrerede med hensyn til difteritoxinet, højrensede toxinpræ-parationer eller fragment B-opløsninger.

Proteolytiske enzymer, der anvendes ved fremstillingen af fragmentet B, er pronase, papain, subtilisin, men fortrinsvis trypsin, i opløselig eller i en til en fast bærer bundet form. Det har vist sig fordelagtigt at standse den proteolytiske reaktion ved hjælp af en inhibitor, trypsin f.eks. med en trypsin-inhibitor, fra dyreorganer eller planter. Ved anvendelse af bærerbundne proteolytiske enzymer er anvendelsen af inhibitorer overflødig.

Som disulfidbro-spaltende forbindelser foretrækkes thiol-forbindelser. På tale hertil kommer f.eks. cystein, mercaptoethanol, 5 U4528 dithioerythritol, men fortrinsvis dithiothreitol.

Ved denatureringsmidler i den her omhandlede fremgangsmådes forstand skal forstås kemiske forbindelser, ved hjælp af hvilke der kan gennemføres en opløsning af hydrogenbindinger i proteinmolekyler. Kendte hydrogenbinding-opløsende midler er f.eks. urinstof eller guanidinhydrochlorid.

Om urinstof er det kendt, at fragmentet B ved dettes hjælp kan holdes i opløsning ved koncentrationer på >0,6 M. Der anvendes fortrinsvis ca. 4 - 6 M urinstof eller ca. 2 - 4 M guanidinhydrochlorid .

Det ifølge opfindelsen fremstillede produkt anvendes især til difterivacciner til profylakse af difterisygdommen eller til fremstilling af difteri-antisera, men også til diagnostiske præparater. Til rorøgelse af det ifølge opfindelsen fremstillede produkts opløsningsstabilitet kan det være hensigtsmæssigt at sætte aminosyrer eller carbon-hydrater til det fysiologisk acceptable medium, hvori produktet er opløst.

Produkternes egnethed som vacciner påvises nedenfor ved forsøg, der beviser produktets gode tålelighed og virkning.

Tålelighedsforsøg

Da man ved det traditionelle formaldehyd-toxoid især skal være opmærksom på allergiske reaktioner af den protraherede type, sammenlignes det her omhandlede produkt med det traditionelle toxoid ved nedenstående forsøg:

Til grupper på 10 marsvin gives A. 0,5 ml af produktet fra eksempel 1 med 0,1 mg protein/ml, adsor-beret på 0,02% AliOHj^-gel, og 3 uger senere 0,5 ml af samme antigen med 0,04 mg/ml uden Al(OH)^· B. 0,5 ml af et traditionelt formaldehyd-toxoid med 0,1 mg protein/ml, adsorberet på 0,02% Al (OH),, og 3 uger senere 0,5 ml af sairme antigen med 0,04 mg/ml uden Al (OH) ^.

12 dage senere får samtlige dyr 0,1 ml af begge antigener A og B intracutant i tre fortyndinger (10 γ/ml, 1 Ύ/mi og 0,1 γ/ml), da man ikke på forhånd kan vide^ hvilken fortynding der giver et resultat, son kan bedønmes. Hud 6 144528 tykkelsen på injektionsstedet måles efter 0,24 og 48 timer. Den gennemsnitlige forøgelse af hudtykkelsen som mål for den allergiske reaktion er større ved det traditionelle toxoid end ved det her omhandlede produkt.

Gennemsnitlig forøgelse af hudtykkelsen i 1/10 mm efter injektion, målt med et cutimeter (hudtykkelsesmåleapparat fra firmaet Hauptner) for dosen 10 γ/ml.

A, Dyr immuniseret med produktet Reaktion ifølge opfindelsen 24 timer 48 timer

Indgift af produktet ifølge opfindelsen 5,3 0,16

Indgift af traditionelt toxoid 7,0 1,8 B. Dyr immuniseret med det traditionelle toxoid

Indgift af produktet ifølge opfindelsen 5,7 3,0

Indgift af det traditionelle toxoid 9,1 4,9

Virkningsforsøg

Til grupper på 5 marsvin gives subcutant 0,5 ml (20 γ) af en suspension af produktet ifølge eksempel 1, adsorberet på 0,2% Al(OH)3-gel. 4 uger efter forgiftes dyrene med 0,3 mg difteri-toxin, svarende til 10 minimal-dødelige doser (= dim = dosis letalis minima). Samtlige dyr overlever forgiftningen. Indgivet som adsorbat-. fri vaccine med 100 γ/dyr fører samme produkt til en overlevelsesrate på 20%.

For at kunne drage en sammenligning med situationen hos mennesker, der allerede har en difteriantitoxintiter, for-immuniseres grupper på 5 marsvin med et traditionelt toxoid. Dosen af den traditionelle vaccine vælges således, at antitoxintiteren efter 28 dage stadig andrager under 0,125 iE/ml serum. Den 28. dag indgives antigener, der er fremstillet ifølge eksemplerne, i forskellige doser som adsorbatfrie vacciner, og antitoxintiteren konstateres 10 dage senere. Dyr, der har fået 0,2-0,4 γ/dyr af produktet ifølge eksempel 2, viser en forhøjelse af antitoxintiteren på det 30-60-dobbelte.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af nedenstående eksempler.

7 144528

Eksempel 1

Til difteritoxin (100.000 flokkulationsenheder = Lf-en-heder, svarende til ca. 270 mg protein) i form af en 0,1%'s proteinopløsning i 0,1 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,8 sættes formaldehyd indtil en slutkoncentration på 0,015 M aldehyd, og blandingen får lov at henstå ved 4°C i 16 timer. Opløsningen fyldes i en dialyseslange og dialyseres dernæst mod den tidobbelte mængde 0,1 M trishydroxymethylaminomethan-HCl-puffer (TRIS) med en pH--værdi på 8,0, inkuberes derefter ved 37°C i 60 minutter med trypsin (2 γ/ml) i nærværelse af dithiothreitol (DTT) (1,5 mg/ml), og derpå tilsættes trypsininhibitor ud fra okselunger (3 γ/ml). Efter koncentrering af opløsningen til en slutkoncentration på 10 mg protein pr. ml på et ultrafilter tilsættes urinstof indtil en koncentration på 6 M/liter, og opløsningen påføres en søjle (4,5 x 100 cm) af "Sephadex" ®G-150 (indregistreret varemærke for Pharmacia, Uppsala) ækvilibreret med 6 M urinstof i 0,1 M tris-puffer med en pH--værdi på 8,0 og DTT (0,001 M). Elueringen sker med ækvilibrerings-blandingen. Ved chromatografien kan der konstateres tre proteinspidser ved 280 nm ved måling af UV-absorptionen. Den første, mindste spids repræsenterer højmolekylært materiale og kasseres. Den anden spids indeholder derivatet af fragmentet B. Den kan underkastes en genchromatografi til yderligere rensning. Spids 3 indeholder fragmentet A.

Opløsningen af det isolerede derivat af fragmentet B fortyndes til 500 ml med 0,1 M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,8 og dialyseres dernæst mod samme puffer, indtil en kvalitativ urinstofanalyse bliver negativ. Formaldehydkoncentrationen i den urinstoffrie opløsning af derivatet af fragmentet B bringes derpå op på 0,07 M og inkuberes ved 37°C i 21 dage. Efter en afsluttende dialyse mod 0,15 M NaCl til fjernelse af frit formaldehyd udvindes det modificerede derivat af fragmentet B. Det kan koncentreres ved ultrafiltrering og forarbejdes til en vaccine på kendt måde. Til dette formål kan man anvende glycin (0,1 M) eller lysin (0,05 M) som stabilisator.

I stedet for formaldehyd kan man, beregnet på den molære aldehydmængde, også anvende glutardialdehyd, propionaldehyd eller butyraldehyd enten på begge trin eller kun på det ene trin for at kunne nå til et produkt med samme egenskaber med hensyn til den gode opløselighed og antigeniteten.

8 144528

Eksempel 2

Difteritoxin (100.000 flokkuleringsenheder = Lf-enheder, svarende til ca. 270 mg protein) dialyseres som en 0,1%'s proteinopløsning i 0,1 M trishydroxymethylaminomethan-HCl-puffer med en pH-værdi på 8,0, inkuberes derefter med trypsin (2 γ/ml) ved 37°C i 60 minutter i nærværelse af dithioerythritol (DTE) (1,5 mg/ml), og dernæst tilsættes trypsininhibitor ud fra okselunger (3 γ/ml). Derefter sættes formaldehyd til opløsningen indtil en koncentration på 0,015 M aldehyd, og opløsningen får lov at henstå ved 4°C i 16 timer. Til denne opløsning sættes urinstof indtil en koncentration på 6 M/liter, og udvindingen af derivatet af fragmentet B sker som angivet i eksempel 1. Herefter kan den påfølgende omsætning ske med 0,07 M formaldehyd, ligeledes som angivet i eksempel 1.

Eksempel 3

Difteritoxin (100.000 flokkuleringsenheder = Lf-enheder, svarende til ca. 270 mg protein) behandles som 0,1%'s proteinopløs-. ning med trypsin i nærværelse af dithiothreitol som i eksempel 1, idet behandlingen med 0,015 M aldehyd først foretages efter tryp-sinbehandlingen, hvorefter der forarbejdes yderligere med 0,07 M aldehyd, som beskrevet i eksempel l,til omsætningen af derivatet af fragmentet B, og til sidst udvindes det modificerede derivat af fragmentet B.