CH628638A5

CH628638A5 - Verfahren zur herstellung von derivaten des diphtherietoxins.

Info

Publication number: CH628638A5
Application number: CH126881A
Authority: CH
Inventors: Torsten Bertil Dr Helting
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-10-11
Filing date: 1981-02-25
Publication date: 1982-03-15
Also published as: NL7511723A; AT342195B; CH622527A5; FR2287237B1; AU8559375A; IL48281A0; IE41909L; CA1059026A; AU502887B2; IE41909B1; DE2448530C3; DK144528B; BE834446A; DE2448530A1; IL48281A; JPS5163929A; US4033819A; LU73556A1; DE2448530B2; SE7511383L

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins und nach dem Verfahren hergestellte modifizierte Derivate.

Als Stand der Technik wird Gill, D.M., Dinius, L.L., J. Biol. Chem. 246 (1971), 1485 und Collier, R.J., Kandel, J., J. Biol. Chem. 246 (1971), 1496 genannt.

Die herkömmlichen Diphtherie-Impfstoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschliesslich durch Inakti-vierung des Diphtherietoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese auch als Toxoid bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinanten ausgestattet, wovon nur einige wenige für die Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen Diphtherie eine Rolle spielen dürften. Die Abtrennung von für den Schutz unwichtigen determinanten Gruppen ist wünschenswert, um zu antigenen bzw. immuno-genen Stoffen zu kommen, die wegen eines engeren Spektrums von antigenen Determinanten eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkeit erwarten lassen.

Diphtherietoxin wird von Zellen des Corynebacterium diphtheriae synthetisiert und extrazellulär als eine einzige Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 62000 in das Nährmedium freigesetzt. Durch milde Proteolyse in Gegenwart von Verbindungen, die Disulfidbrücken in Proteinen zu spalten vermögen, z.B. Thiol-Verbindungen, entstehen aus dem Diphtherietoxin zwei charakteristische Bruchstücke, das von dem NHi-terminalen Teil des Toxins stammende sogenannte Fragment A (Molekulargewicht ca. 24000) und das von dem Carboxy-terminalen Teil stammende sogenannte Fragment B (Molekulargewicht ca. 38 000). Das Fragment A kann mit Methoden der Proteinchemie relativ leicht isoliert werden und ist in physiologischen Pufferlösungen in nativer Form haltbar. Das Fragment B hingegen kann bekanntlich über längere Zeit in isoliertem Zustand nur in Gegenwart von denaturierenden Agenzien wie Harnstoff, Guanidinhydrochlorid oder oberflächenaktiven Detergenzien in Lösung gehalten werden. Die Entfernung des Denaturierungsmittels führt zu einem vollständig wasserunlöslichen Fragment B, das eine Handhabung wesentlich erschwert. Dem nicht-denaturierten Fragment B wird jedoch eine entscheidende Rolle bei der Erzeugung von schützenden Antikörpern nach parenteraler Verabreichung zugeschrieben.

Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, das Fragment B des Diphtherietoxins in einer Weise zu modifizieren, dass es ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen Medium in Lösung gehalten werden kann. Im besonderen soll das Fragment B in der modifizierten Form als wesentlicher immunogener Bestandteil von Diphtherie-Impfstoffen verwendet werden können und darin das herkömmliche Formaldehydtoxoid ersetzen.

Es wurde nun gefunden, dass dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht, dass die spontane, irreversible Ausfällung des Fragments B, die nach Entfernung der denaturierenden Agenzien wie Harnstoff immer beobachtet wird, dadurch vermieden wird, dass eine geringgradige chemische Modifizierung des Fragments B durch Einwirkung eines Aldehyds in niedriger Konzentration über kurze Zeit und bei niedriger Temperatur entweder vor oder nach der Abtrennung des Fragments A aus dem Molekülverband des Diphtherietoxins, das einen Komplex der Fragmente A und B darstellt, durchgeführt wird.

Wegen der bekannt hohen Toxizität des nativen Diphtherietoxins und der ebenso bekannten Tatsache, dass Eiweiss-fraktionierungsmethoden nur in den seltensten Fällen zu einer 100%igen Abtrennung von Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweisskörpern, führen, wird das bei der ersten Aldehydbehandlung entstandene Derivat des Fragments B nach Isolierung einer weiteren Aldehydbehandlung bei höherer Aldehydkonzentration über längere Zeit und bei höherer Temperatur unterzogen, wobei ein modifiziertes Derivat des Fragments B gebildet wird, das eine noch höhere Stabilität in wässrigen Medien aufweist.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von modifizierten Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine wässrige Lösung des Diphtherietoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, mit einer Aldehydkonzentration von 0,0015 M bis 0,035 M, vorzugsweise 0,002 bis 0,02 M, bei 1 bis 20°C, vorzugsweise 1 bis 6°C, 5 Minuten bis 50 Stunden, vorzugsweise 2 bis 20 Stunden, behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart einer Disulfid-Brücken-spaltenden Verbindung mit einem proteolytischen Enzym umsetzt, das Derivat des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens isoliert, das denaturierende Agens abtrennt und das Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14 bis 28 Tage bei 20 bis 37°C stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

Entsprechend dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte modifizierte Derivate zeigen in physiologisch verträglichen isotonisch wässrigen Medien nicht mehr die von dem nativen Fragment B bekannten Denaturierungs- und Ausfällungserscheinungen. Wie das Fragment B haben die modifizierten Derivate nicht mehr die vom Diphtherietoxin bekannte giftige Eigenschaft. Sie verhalten sich als Antigene und sind in der Lage, schützende Antikörper gegen Diphtherie im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.

Die Isolierung eines modifizierten Fragments B aus herkömmlichem Diphtherietoxoid ist nicht möglich, da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zwischen den Fragmenten A und B stattgefunden hat.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Ver5

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fahren werden Diphtherietoxin-haltige wässrige Medien eingesetzt, wie sie auch für die Gewinnung des Fragments B verwendet werden, beispielsweise bezüglich Diphtherietoxin angereicherte mehr oder weniger vorgereinigte Kulturfiltrate oder hochgereinigte Toxinpräparate.

Proteolytische Enzyme, die bei der Herstellung des Fragment B Verwendung finden, sind z.B. Pronase, Papain, Subti-lisin, vorzugsweise jedoch Trypsin in löslicher oder in einer an einen festen Träger gebundenen Form. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die proteolytische Reaktion mit Hilfe eines Inhibitors, Trypsin beispielsweise mit einem Trypsin-Inhi-bitor aus tierischen Organen oder Pflanzen, abzustoppen. Bei Verwendung von trägergebundenen proteolytischen Enzymen erübrigt sich der Einsatz von Inhibitoren.

Als Disulfid-Brücken-spaltende Verbindungen werden Thiolverbindungen bevorzugt. Hierfür kommen beispielsweise in Frage: Cystein, Mercaptoäthanol, Dithioerythrol, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol.

Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des vorgelegten Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Lösung von Wasserstoffbrückenbindungen in Proteinmoleküien bewerkstelligt werden kann. Bekannte Wasserstoffbrückenbindungen-lösende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid.

Von Harnstoff ist bekannt, dass das Fragment B mit dessen Hilfe bei Konzentrationen >0,6 M in Lösung gehalten werden kann. Vorteilhaft werden 4 bis 6 M Harnstoff oder 2 bis 4 M Guanidinhydrochlorid verwendet.

Nach Gewinnung des Derivates des Fragments B, im allgemeinen mit Hilfe proteinchemischer Isolierungsverfahren, wird das denaturierende Agens vorteilhaft durch Dialyse oder andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestatten, beispielsweise durch Gelfiltration, entfernt. Mit gleichen Massnahmen ist auch der zur Umsetzung eingesetzte und dabei nicht verbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.

Neben den aufgezeigten Verfahrensmöglichkeiten sind Gegenstand der Erfindung modifizierte Derivate des Fragments B des Diphtherietoxins, die durch Parameter zu kennzeichnen sind, welche sich durch ihre Herstellung nach dem vorgelegten Verfahren ergeben.

Die erfindungsgemäss hergestellten modifizierten Derivate können in Diphtherieimpfstoffen zur Prophylaxe der Diphtherieerkrankung oder zur Herstellung von Diphtherieantiseren, aber auch diagnostischen Präparaten eingesetzt werden. Zur Erhöhung der Lösungsstabilität des erfindungsgemäss hergestellten Produktes kann es zweckmässig sein, dem physiologisch verträglichen, wässrigen Medium, in dem dies gelöst ist, Aminosäuren oder Kohlenhydrate zuzusetzen.

Die Eignung der modifizierten Derivate als Impfstoffe wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute Verträglichkeit und Wirksamkeit der modifizierten Derivate bescheinigen.

Verträglichkeitstest

Da bei dem herkömmlichen Formaldehyd-Toxoid insbesondere auf allergische Reaktionen vom verzögerten Typ geachtet werden muss, wurde das Produkt gemäss der Erfindung mit dem herkömmlichen Toxoid im folgenden Versuch verglichen:

Gruppen à 10 Meerschweinchen erhielten:

A. 0,5 ml des Produkts nach Beispiel 1 mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% AI (OH)3-Gel adsorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)3.

B. 0,5 ml eines herkömmlichen Formaldehyd-Toxoids mit 0,1 mg Protein/ml, an 0,02% Al(OH)3-Gel adsorbiert, und 3 Wochen später 0,5 ml desselben Antigens mit 0,04 mg/ml ohne Al(OH)3.

12 Tage später erhielten sämtliche Tiere 0,1 ml der beiden Antigene intrakutan in drei Verdünnungen (10 ug/ml, 1 [ig/ml und 0,1 |j.g/ml). Die Hautdicke an der Injektionsstelle wurde nach 24 und 48 Stunden gemessen. Die durchschnittliche Zunahme der Hautdicke als Mass für die allergische Reaktion war mit dem herkömmlichen Toxoid grösser als bei dem erfindungsgemässen Produkt.

Durchschnittliche Zunahme der Hautdicke in Vio mm nach Injektion, gemessen mit Kutimeter (Hautdickenmessgerät der Fa. Hauptner):

A. Mit dem Produkt gemäss der Erfindung immunisierte Tiere

24 Std.

Reaktion 48 Std.

Challenge mit erfindungsgemässem Produkt Challenge mit herkömmlichem Toxoid

5,3 0,16 7,0 1,8

B. Mit dem herkömmlichen Toxoid immunisierte Tiere

Challenge mit erfindungsgemässem Produkt Challenge mit herkömmlichem Produkt

5,7 3,0 9,1 4,9

Wirksamkeitstest

Gruppen à 5 Meerschweinchen erhielten subkutan 0,5 ml (20 ug) einer Suspension des Produkts nach Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Al(OH)3-Gel. 4 Wochen später wurden die Tiere mit 0,3 mg Diphtherietoxin, entsprechend 10 minimaltödlicher Dosen (= dlm = dosis letalis minima), vergiftet. Sämtliche Tiere überlebten die Vergiftung. Dasselbe Produkt verabreicht als adsorbatfreier Impfstoff mit 100 ug/Tier, führte zu einer Überlebensrate von 20%.

Um einen Vergleich mit der Situation der Menschen, die schon einen Diphtherieantitoxintiter haben, ziehen zu können, wurden Gruppen à 5 Meerschweinchen mit herkömmlichem Toxoid vorimmunisiert. Die Dosis des herkömmlichen Impfstoffes wurde so gewählt, dass der Antito-xintiter nach 28 Tagen stets unter 0,125 IE/ml Serum betrug. Am Tag 28 wurden Antigene, die laut den Beispielen hergestellt worden waren, in unterschiedlichen Dosen als adsor-batfreie Impfstoffe verabreicht und der Antitoxintiter 10 Tage später ermittelt. Tiere, die 0,2 bis 0,4 |j.g/Tier des Produktes laut Beispiel 2 bekommen hatten, zeigten eine Erhöhung des Antitoxintiters um das 30- bis 60-fache. Die Erfindung soll an den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

Diphtherietoxin (100000 Flockungseinheiten = Lf-Ein-heiten, entsprechend ca. 270 mg Protein) wird als 0,1 %ige Proteinlösung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,015 M Aldehyd ersetzt und 16 Stunden bei 4°C stehengelassen. Die Lösung wird in einem Dialysierschlauch gefüllt und anschliessend gegen die 10-fache Menge von 0,1 M Trishydroxymethylami-nomethan-HCl-Puffer (TRIS) vom pH 8,0, dialisiert, danach' mit Trypsin (2 jag/ml) in Gegenwart von Dithiothreitol (DTT) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37°C inkubiert

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und anschliessend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge (3 iig/ml) versetzt. Nach Ankonzentrierung der Lösung auf eine Endkonzentration von 10 mg Protein pro ml auf einem Ultrafilter wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M hinzugefügt und die Lösung auf eine Säule (4,5 x 100 cm) von Sephadex{R| G-150 (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala), äquilibriert mit 6 M Harnstoff in 0,1 M Tris-

puffer, pH 8,0, und DTT 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei der Chromatographie werden durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm drei Proteinpeaks erkennbar. Der erste, kleinste Peak stellt hochmolekulares Material dar und wird verworfen. Der zweite Peak enthält das Derivat des Fragments B. Es kann zur Weiterreinigung einer Rechromatographie unterzogen werden. Peak 3 enthält das Fragment A.

Die Lösung des isolierten Derivates des Fragments B wird mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, auf 500 ml verdünnt und anschliessend gegen denselben Puffer so lange dialysiert, bis eine qualitative Harnstoff-Analyse negativ wird. Die Formaldehydkonzentration der Harnstoff-freien Lösung des Derivates des Fragments B wird anschliessend auf 0,07 M gebracht und die Lösung wird 21 Tage bei 37°C inkubiert. Nach einer abschliessenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfernung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat des Fragments B gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und zu einer Vaccine in bekannter Weise verarbeitet werden. Dabei kann als Stabilisator Glycin (0,1 M) oder Lysin (0,05 M) verwendet werden.

Statt Formaldehyd kann, in gleicher molarer Konzentra-s tion auch Glutardialdehyd, Propionaldehyd oder Butyral-dehyd entweder in beiden Stufen oder.auch nur in einer Stufe verwendet werden, um zu einem Produkt mit den gleichen Eigenschaften der guten Löslichkeit und der Antigenität kommen zu können.

Beispiel 2

Diphtherietoxin (100 000 Flockungseinheiten = Lf-Ein-heiten, entsprechend ca. 270 mg Protein) wird als 0,1 %ige 15 Proteinlösung in 0,1 MTrishydroxymethylaminomethan-HC1 -Puffer vom pH-Wert 8,0 dialysiert, danach mit Trypsin (2 ng/ml) in Gegenwart von Dithioerythrit (DTE) (1,5 mg/ml) während 60 Minuten bei 37°C inkubiert und anschliessend mit Trypsininhibitor aus Rinderlunge 20 (3 (ig/ml) versetzt. Danach wird Formaldehyd bis zu einer Konzentration von 0,015 M Aldehyd zu der Lösung zugesetzt und 16 Stunden bei 4°C stehengelassen. Zu dieser Lösung wird Harnstoff bis zu einer Konzentration von 6 M hinzugefügt und die Gewinnung des Derivates des Fragments B wie im Beispiel 1 vorgenommen. Die anschliessende Umsetzung mit 0,07 M Formaldehyd erfolgt ebenfalls wie im Beispiel 1.

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Claims

628 638 2 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von modifizierten Derivaten des Fragments B des Diphtherietoxins, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Lösung des Diphtherietoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehyd-Konzentration von 0,0015 M bis 0,035 M bei 1 bis 20°C 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt, vor oder nach der Aldehydbehandlung das Toxin in Gegenwart einer Disulfid-Brücken-spaltenden Verbindung mit einem proteolytischen Enzym umsetzt, das Derivat des Fragments B aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens isoliert, das denaturierende Agens abtrennt und das Derivat des Fragments B mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,035 M bis 0,35 M versetzt und 14 bis 28 Tage bei 20 bis 37°C stehen lässt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat des Fragments B gewinnt.

2. Nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1 hergestellte modifizierte Derivate des Fragments B des Diphtherietoxins.