DD298884A5 - Impfstoffe gegen virale antigene und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft Impfstoffe gegen antigene Epitope verschiedenen Ursprungs, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Erfindungsgemaesz wird partiell oxidiertes Polysaccharid an die Oberflaeche von Bakterien gebunden, und die derart modifizierten Bakterien werden mit viralen oder bakteriellen Proteinen bzw. Polypeptiden ueberzogen (divestierte Bakterien). Diese Bakterien, eingesetzt in Impfstoffen, fuehren zu einer verstaerkten Immunantwort. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, Veterinaermedizin und die pharmazeutische Industrie.{Impfstoffe; * HIV; Epitope; Antigendrift; Bakterienverkleidung; BCG; Immunstimulation; Polysaccharide; Medizin; Veterinaermedizin; Pharmazie; divestierte Bakterien}
Description
Anwendungsgebiet der Erfindung .
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen antigene Epitope verschiedenen Ursprungs sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. Die neuen Impfstoffe führen zu einer verstärkten humoralen und zellulären Immunantwort gegenüber viralen, bakteriellen u.a. Proteinen bzw. Polypeptiden. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, Veterinärmedizin und die pharmazeutische Industrie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, vorzugsweise Viruskrankheiten, werden zahlreiche Impfstoffe hergestellt. So werden zum Beispiel von führenden Firmen Impfstoffe hergestellt, die entweder attenuierte Viren oder isolierte bzw. gentechnisch hergestellte virale Antigene enthalten (Behring-Werke-Mitteilung: Virus Hepatitiden, Hepatitis B, Mai 1988, Mitteilung: Röteln, Juli 1988). Im Grunde genommen haben sich die Impfstoffe in den letzten 10-15 Jahren nicht viel geändert. Es werden überwiegend Lebendimpfstoffe, Totvakzine oder Toxoide verwendet (Roitt, I. M.: Essential Immunology, Blackwall, Oxford 1980; Schuster, G.: Virus und Viruskrankheiten, Ziemsen Verlag 1988). Neueste Ergebnisse mit virusmodifizierten, tumorspezifischen Vakzinen bringen bei der Krebsbekämpfung Hoffnungen. (Schirrmacher, V.: DE-PS3806565 vom 14.09.1989) In dieser Patentvorschrift (PS) (Beispiel 3) wird auf die Wirkung der BCG als Vakzine hingewiesen, wenn man sie mit Newcastle-Disease-Virus inkubierten, autologen und inaktivierten Tumorzellen zusammenmischt. Die „Verkleidung" von Bakterien (vorzugsweise BCG) mit partiell oxidierten Dextranen und viralen Proteinen zur Herstellung von Vakzinen ist bisher nicht beschrieben worden.
Es ist das Ziel der Erfindung, einen neuen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, de: schwach immunoge Proteine bzw. Polypeptide in die Lage versetzt, eine verstärkte Immunantwort auszulösen.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Impfstoffe gegen antigene Epitope vet ohiedenen Ursprungs sowie Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß partiell oxidiertes Polysaccharid an die Oberfläche von Bakterien gebunden und die derart beladenen Bakterien mit definierten Epitopen (Proteinen bzw. Polypeptiden u. a.) überzogen werden. Die derart modifizierten Bakterien werden ggf. mit Zusatzstoffen versehen, z.B. 3-7%iger Dextranlöüung zur Stabilisierung. Als Polysaccharide eignen sich Dextrane, Amylose, Amylopectin oder Glycogen, aber auch andere Polysaccharide, wie z. B. Pectin, Glucomannan, Chitosan oder Lipopolysaccharide. Als Bakterien kommen vorzugsweise Mycobakterien -sowohl in vivo als auch in denaturiertem Zustand- in Frage. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß schwach immunogene virale oder bakterielle Antigene bzw. Epitope eine verstärkte Immunantwort hervorrufen, wenn sie auf Bakterien, die mit partiell oxidierten Polysacchariden beladen sind, aufgezogen werden. Derart „verkleidete" Bakterien (divestierte Bakterien) zeigen sich als wirksame Impfstoffe. Die partiell oxidierten Polysaccharide (vorzugsweise Dextran) binden sich kovalent durch die aktiven Aldehyclgruppen an die Bakterienoberflächen, indem sie mit vorhandenen Aminogruppen reagieren. Gibt man die partiell oxidierten Polysaccharide im Überschuß zu attennuierten (vorzugsweise BCG) oder zu getöteten Bakterien, bleiben noch freie Aldehydgruppen übrig, um die Bakterien mit Epitopen, Polypeptiden oder anderen freien aminogruppenhaltigen Antigenen ?«i beschichten. Nur Epitope bzw. Polypeptide, die keine eigenen freien Aminogruppen enthalten, müssen geringfügig mit einer entsprechenden Aminosäure, wie z. B. Arginin, durch Kopplung modifiziert werden. Nach der Oxidation der Polysaccharide muß das Oxidationsmittel schonend entfernt werden, Nach der Beschichtung der Bakterien mit den partiell oxidierten Polysacchariden wird nach dem Ablauf der Bindungsreaktion der Überschuß der oxidierten Polysaccharide durch einfache Waschvorgänge entfernt. Als Waschflüssigkeit ist die nichtoxidierte Polysaccharidlösung am besten geeignet. Wirkt die Polysaccharidlösung stabilisierend (wie z. B. Dextran), kann die zweite Reaktion - die Antigenbesr.hichtung - in dieser Lösung durchgeführt werden. Bei der Durchführung der Reaktion muß der optimale pH-Wert, individuell entsprechend den Baktorieneigenschaften leicht alkalisch oder leicht acid, eingestellt werden. Wichtig ist, daß die Bindungsreaktion zwischen Aldehyd- und Aminogruppen auf den attenuierten Bakterienoberflächen stattfindet. Bei toten Bakterien wird die Kopplungsreaktion bai pH4,0 oder bei pH9,0 durchgeführt. Die Antigenbindung wird immunchemisch, z.B. durch Immunfluoreszenzmikroskopie, mittels spezifischer Antikörper geprüft. Sämtliche Lösungen werden vor der Verwendung sterilisiert. Die Dextran'ösung z.B. kann autokiaviert und/oder bakterienfiltriert werden. Bei attenuierten Bakterien muß ein Vitalitätstest durchgeführt werden. Auch A:itigendriftproteine - man versteht darunter instabile virale Antigene - als Gemische einer großen Zahl von Fpitopen können auf Bakterien vorteilhaft konzentriert werden (1 mg Feuchtbakteriumoberfläche entspricht ca. 50cm2). Die divestierten Bakterien können ampulliert und als Impfstoff ohne Adjuvanszusatz verwendet werden. Antigene Epitope verschiedenen Ursprungs können mit den partiell oxidierten Polysacchariden 'vorzugsweise Dextran) extra in einer Lösung reagieren, und diese Lösung kann als Stabilisator zum Impfstoff verwendet werden.
Ausführungsbeispiele
Herstellung eines Impfstoffes gegen Hepatitis-B mittels divestierter Bakterien 50ml (20g/l) Dextran-35-Lösung wurden mit 40ml 45mM HJO4 bei pH4,5 unter Kühlung langsam oxidiert. Man erreicht einen
Oxidationsgrad von 12% (2x 12 Aldehydgruppen auf 100 Glucoseeinheiten). ,
Durch 2malige Fällung mit 60%- bzw. 96%igem Ethanol wurde die partiell oxidierte Dextranlösung gereinigt und anschließend bis zur weiteren Bearbeitung als Feststoff im Kühlschrank lichtgeschützt aufbewahrt. Vor der Anwendung bringt man das partiell
oxidierte Dextran in wäßrige Lösung. -.
Bacille de Calmette üuerin (BCG) von BCG-Institut Jena, die für unspezifische Immunisierung von Krebskranken verwendet wird, wurde mit dem partiell oxidierten Dextran bei schwach alkalischem pH beschichtet. (Bei vitalen Bakterien arbeitet man leicht acid bei pH 5,5.) Die Beschichtung wurde auf mit 70%igem Ethanol behandelten und anschließend gewaschenen Bakterienoberflächen durchgeführt. Der Überschuß des partiell oxidierten Dextrans wurde durch mehrere Waschvorgänge mit Dextran-Lösung en .lernt und die Bakterien mit Hepatitis-B-S-Antigen, das aus den Seren von asymptomatischen HBS-Trägern isoliert wurde, beschichtet. Die erfolgreiche Beschichtung wurde mittels monoklonalem Anti-HBS durch indirekten Immunfluoreszenztest bestätigt.
Die mit den HBS-divestierten-Bakterien geimpften Mäuse produzieren Anti-HBS-Antikörper schon im low-tolfii anten Bereich, verglichen mit der Immunantwort von Mäusen, die nur mit HBS geimpft wurden. Ein vollkommenes Fehlen des Antikörpers gegenüber dem schwach immunogenen H3S konnte nur bei der letzten Gruppe festgestellt werden.
Herstellung eines Impfstoffes gegen HIV-gp-120
Als Antigen wurde ein Nonapeptid der V3 Region gp-120 des HIV, gekoppelt mit Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH-9) verwendet.
BCG wurde wie im Beispiel 1 mit partiell oxidiertem Dextran beschichtet (BCG-D).
60mg BCG-D wurden in 3 ml 4%iger Dextran-35-Lösung aufgenommen und der pH-Wert auf 9,0 eingestellt.
Unter Kühlung wurde 30μΙ (2mg/ml) KHL-9 langsam zugegeben und lichtgaschützt bei +40C vorsichtig geschüttelt.
Die Suspensionen mit divestierten Bakterien können portioniert in Ampullen bis zur Verwendung aufbewahrt werden.
Herstellung eines modifizierten Impfstoffes gegen HIV-gp-120 nach Beispiel 2 70μΙ 4%ige partiell oxidierte Dextranlösung wurde bei pH9,0 mit 30μΙ 2mg/ml KHL-9 unter Kühlung und lichtgeschützt über 12 Stunden geschüttelt und diese Lösung zu dem in Beispiel 2 hergestellten Impfstoff gemischt.
Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen virale oder bakterielle Antigene bzw. Epitope, dadurch gekennzeichnet, daß partiell oxidiertes Polysaccharid an die Oberfläche von Bakterien gebunden, die derart modifizierten Bakterien mit viralen oder bakteriellen Proteinen bzw. Polypeptiden überzogen und die entstehenden Suspensionen gegebenenfalls mit Zusatzstoffen versehen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharide vorzugsweise Dextran, aber auch andere Polysaccharide, wie z. B. Stärke, Glucomannan, Pectin, Cellulose, Chitosan oder auch Lipopolysaccharide, Verwendung finden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Bakterien Mycobakterien, wie BCG oder auch z. B. Bordetella pertussis, eingesetzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine auch Antigen-Drift-Proteine eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß vitale, abgeschwächte Bakterien eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß denaturierte Bakterien eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die mit partiell oxidierten Polysacchariden und danach mit Proteinen überzogenen Bakterien in nachträglich denaturierter Form zur Anwendung kommen.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die divestierten (verkleideten) Bakterien in einer partiell oxidierten Polysaccharidlösung, die vorher mit dem gewünschten Antigen (Proteine, Polypeptide, Epitopgemische) reagiert hat, stabilisiert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die divestisitcn Bakterien mit Glucose, Mannose, Lactose oder einer anderen Mono- bzw. Polysaccharidlösung stabilisiert werden.
10. Impfstoffe gegen virale oder bakterielle Antigene bzw. Epitope, dadurch gekennzeichnet, daß als wirksame Komponente verkleidete Bakterien eingesetzt werden, die durch Bindung partiell oxidierter Polysaccharide an Bakterien und durch Überziehen der derart modifizierten Bakterien mit viralen oder bakteriellen Proteinen bzw. Polypeptiden gewonnen werden.
11. Impfstoff nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die mit partiell oxidierten Polysacchariden und danach mit Proteinen überzogenen Bakterien in vivo Anwendung finden.
12. Divestierte Bakterien.
13. Divestierte Bakterien nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Polysaccharidhülle enthalten, die mit Epitopen verschiedenen Ursprungs überzogen sind.
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