CH630807A5 - Verfahren zur herstellung eines antiserums. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Antiserums und Mittel zur Durchführung des Verfahrens.

Es ist lange bekannt, dass die immunologische Antwort von Organismen, die durch die Applikation von Antigenen provoziert wird, durch Zusatz bestimmter Stoffe beeinflusst werden kann. Bei einem fördernden Einfluss derartiger unterstützender Bestandteile von immunologisch wirksamen Substanzen werden diese als Adjuvantien bezeichnet. Ad-juvantien sind sehr verschiedenen Stoffklassen zuzuordnen. Über deren Wirkungsmechanismus bestehen nur Vermutungen. Ihre Güte ist demnach nur durch vergleichende Experimente zu beurteilen, so dass eine Voraussage über die Ad-juvanswirkung einer noch nicht erprobten Substanz nur bedingt möglich ist.

Wegen der grossen wirtschaftlichen Bedeutung von immunisierenden Agentien in der Prophylaxe wie in der Therapie einer Reihe von Erkrankungen ist die Auffindung einer Adjuvanswirkung einer Substanz von grossem wirtschaftlichen Interesse.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass das Enzym Neuraminidase (Glycoprotein-N-Acetylneuraminyl-Hydro-lase, klassifiziert unter EC. 3.2.1.18) ein wertvolles immunstimulierendes Agens, ein sogenanntes Adjuvans, darstellt.

Es ist bekannt, dass die Immunogenität von Glyco-proteinen durch die Entfernung der N-Acetylneuraminsäure mit Hilfe des Enzyms Neuraminidase signifikant gesteigert werden kann. Die Steigerung der Immunogenität ist jedoch in diesen Fällen eindeutig durch die Wirksamkeit der Neuraminidase auf das Antigen zu erklären, die durch den enzymatischen Angriff auf den Glycosid-Anteil des Glyco-proteins neue antigene Determinanten freisetzt. Nach der Abspaltung der N-Acetyl-neuraminsäure-Reste kann das Desialo-Glycoprotein von der Neuraminidase getrennt zur Immunisierung eingesetzt werden.

Erfindungsgemäss wurde nun gefunden, dass die Neuraminidase als unterstützender Bestandteil von Antigenen deren Wirkung in Immunsystemen fördert. Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein Mittel, bestehend aus einem Gemisch von Antigen und Neuraminidase einem Tier verabreicht, nach der Bildung von Antikörpern im Blut dieses entnimmt und in üblicher Weise das Serum gewinnt. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.

Die Neuraminidase in diesen Mitteln wird zweckmässig in einer Menge von 0,01-150, vorzugsweise 0,5-50, in vielen Fällen auch 5-50 Einheiten pro immunisierender Dosis, eingesetzt.

Unter der Bezeichnung Neuraminidase wird eine Reihe von bekannten Enzymen zusammengefasst, die aus neuraminsäurehaltigen Glycoproteinen die Neuraminsäure abzuspalten vermögen. Ihre Gewinnung und Reinigung ist aus der Literatur bekannt. Die im Sinne der Erfindung als Adjuvans verwendbaren Neuraminidasen sind gekennzeichnet durch ihre Aktivität, die a-ketosidische Bindung zwi-s sehen der Neuraminsäure und einem Zuckerpartner zu hy-drolisieren. Vorzugsweise werden diejenigen Neuraminidasen verwendet, welche die Bindungen 2-»3,2->4,2->6 und 2 -*■ 8 hydrolisieren. Besonders wirksam ist demzufolge die aus Vibrio Cholerae erhaltene Neuraminidase, von der io bekannt ist, dass sie alle vier Bindungstypen zu hydrolisieren vermag. Eine ähnliche Aktivität zeigt die Neuraminidase von Clostridium perfringens. Es sind jedoch auch virale Neuraminidasen im Sinne der Erfindung wirksam, auch wenn sie nicht die breite Spezifität der bakteriellen Enzyme i5 besitzen. Neben den von Mirkoorganismen zu gewinnenden Neuraminidasen können auch aus dem Plasma oder Organen von Wirbeltieren erhältlichen Neuraminidasen im Sinne der Erfindung verwendet werden.

Zweckmässig werden solche Neuraminidasepräparate als 20 Adjuvans verwendet, welche mit der Sorgfalt üblicher pharmazeutischer Zubereitung hergestellt wurden.

Die pro-Dosis eines Antigens zuzusetzende Menge des Adjuvans Neuraminidase wird zweckmässig in Einheiten der Aktivität des Enzyms ausgedrückt. Eine Neuraminidase-25 Einheit ist die Menge des Enzyms, die benötigt wird, um 1 Mikrogramm N-Acetylneuraminsäure aus humanem ct!-Glycoprotein (Orosomucoid) in 0,05molarem Natrium-acetatpuffer vom pH-Wert 5,5 mit dem Zusatz von 9 mg/ml Kochsalz und 1 mg/ml Calciumchlorid in 15 Minuten bei 30 73 °C freizusetzen [E. Mohr und G. Schramm, Z. Naturf. 15b, (1960), Seite 568, und Schultze et al. (1959)]. Ein Vergleich der Enzymaktivität nach Schramm und Mohr, und andere Definitionen der enzymatischen Aktivität von Neuraminidase ist von Schick und Zilg (1977) gegeben wor-35 den. Wegen der Möglichkeit, dass Neuraminidase auf neur-aminsäurehaltige Antigene eine antigenändernde Wirksamkeit ausüben kann, sind bei den im Rahmen der Erfindung durchgeführten Versuche zumeist neuraminsäurefreie Antigene verwendet worden. Dies kann jedoch den Erfindungs-40 gegenständ nicht auf derartige Verbindungen einengen, um so mehr, als Neuraminidase bislang nicht gemeinsam mit neuraminsäuretragenden Antigenen zur Immunisierung verwendet wurde. In der Regel wurden die mit Neuraminidase inkubierten Glycoprotein-Antigene nach der Inkubation 45 mehrfach gewaschen und auf diese Weise die Neuraminidase entfernt.

Die Entfernung (Waschen) einer zunächst zu dem Antigen zugegebenen Menge Neuraminidase führt zu keiner nennenswerten Stimulierung der Immunantwort gegen das so Antigen. Eine Keimsuspension von neuraminsäurefreien Escherichia Coli-Keimen verursacht bei Mäusen in Anwesenheit von Neuraminidase einerseits eine frühere Antikörper-Reaktion, anderseits höhere Antikörper-Spiegel im Serum als eine neuraminidasefreie Keimsuspension. 55 Das zeigt der folgende Versuch:

Mäuse wurden mit 2 x 108 Keimen von abgetöteten E. Coli/Maus zusammen mit verschiedenen Mengen Vibrio Cholerae Neuraminidase intraperitonial immunisiert. Bei einem Teil der Mäuse wurde die Neuraminidase zunächst zu 6o den abgetöteten E. Coli-Keimen zugesetzt, danach jedoch wurde die Neuraminidase durch Zentrifugation der Keime von den Keimen entfernt, diese in geeignetem Puffermedium resuspendiert und diese Massnahme 3mal wiederholt. Ein anderer Teil der Mäuse erhielt die E. Coli-Keime zusammen 65 mit Vibrio Cholerae Neuraminidase.

Die Tabelle 1 zeigt die Antikörper-Titer im Blut der verschiedenen Mäusegruppen am 5. und 20. Tag nach erfolgter Immunisierung.

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Tabelle 1

Immunisierung von Mäusen mit neuraminsäurefreien E. Coli-Keimen

Antigen E. Coli + Adjuvans Mittlerer Antikörpertiter

2 x 108/Maus Vibrio Cholerae ± Standardabweichung am

Tag

5

20

ja kein

10 +

10

160+120

ja

0,5 E

60+

40

640 + 240

ja

0,5 E gewaschen

10+

10

130+ 60

ja

0,05 E

10+

10

320+140

ja

5 E

160+

120

640 + 320

ja

5 E gewaschen

10+

10

160+100

ja

50 E

80+

40

320+160

ja

50 E gewaschen

10+

10

160+ 80

Die Stimulierung der immunologischen Antwort wird unabhängig von der Art der Verabreichung des Antigens gemeinsam mit der Neuraminidase wirksam, z.B. bei intraperitonealer, subcutaner, intradermaler oder intramuskulärer Gabe. Die angegebennen Antikörper sind im Bakterizidie-test gemessen.

Vergleichbare Ergebnisse werden in einem Immunisierungsversuch mit Vibrio Cholerae erhalten. In der indirekten Hämagglutinationstestung mit Hilfe des Vibrio Cholerae Lipopolysaccharids findet man zu der Tabelle 1 analoge Resultate.

Die Adjuvanswirkung von Neuraminidase kann darüber hinaus auch für Virusantigene, z.B. das Röteln-Virus, nachgewiesen werden (s. Tabelle 2).

Tabelle 2

Immunisierung von Mäusen mit Röteln-Virus

Antigen + Adjuvans Mittlerer

Röteln-Virus (Vibrio Cholerae) Hämagglutinations-Neuraminidase) Hemmungs-Titer

± Standard-Abweichung ja 0,0 82+ 98

ja 0,5 E pro Maus 105+ 83

ja 5 E pro Maus 461 + 246

ja 50 E pro Maus 89 ± 47

nein 5 E pro Maus 8

Mit dem gleichen System kann demonstriert werden,

dass eine Zweit-Immunisierung (Boosterung) mit sehr gutem

Erfolg durchführbar ist, wobei ebenfalls die mit Neuraminidase versetzten Virussuspensionen eine erhöhte Immunantwort bewirken.

Statt mit partikulärem Antigenmaterial, wie dies beispiel-5 haft an der Keimsuspension von Escherichia Coli, Vibrio Cholerae und von Röteln-Virus gezeigt worden ist, kann die Adjuvanswirkung auch mit löslichen Antigenen nachgewiesen werden.

Wird beispielsweise eine Immunisierung von Mäusen mit io Rinderserum-Albumin vorgenommen, so findet man ebenfalls in den mit Neuraminidase versetzten Antigen-präparationen eine Steigerung der immunologischen Antwort. Sie ist mit Hilfe der indirekten Hämagglutination von mit Rinderserum-Albumin beladenen Hammelerythrozyten i5 nachweisbar.

Neuraminidase ist zudem geeignet, eine immunologische Toleranz zu durchbrechen. Hierfür haben sich Neuramini-dasemengen pro Dosis von etwa 0,5-5 Einheiten als wirksam erwiesen, wohingegen deutlich höhere Dosen zu weniger 20 ausgeprägten Reaktionen führten.

Mit Neuraminidase als Adjuvans lässt sich ferner experimentell eine Antikörper-Antwort gegen Schaferythrozyten steigern. Dies kann mit der als Jerne-Technik bekannten Methode des Nachweises der «plaque forming cells» aus den 25 Milzen der immunisierten Tiere nachgewiesen werden. Auch mit diesem Versuchsansatz ist belegbar, dass ein nachfolgendes Waschen der mit Neuraminidase inkubierten Erythrozyten die immunologische Antwort nicht zu stimulieren vermag^

30 Über die vorhergehend demonstrierten Versuche zur Steigerung der Antikörperbildung mit Hilfe des Enzyms Neuraminidase hinaus, führt das erfindungsgemässe Adjuvans zu einer verbesserten Infektionsabwehr.

Die Tabelle 3 zeigt das Ergebnis eines Versuchs, in wel-35 chem Mäuse mit S. typhimurium mit und ohne Adjuvans-zugabe immunisiert wurden. Dazu erhielten die Mäuse am 1. und 14. Tag jeweils 4 x 107 abgetötete Keime von S. typhimurium. Am 28. Tag nach der ersten Injektion wurden die Tiere mit 2 x 105 virulenten S. typhimurium intravenös in-40 fiziert. Zur Feststellung des Immunisierungserfolges wurden am 1., 3. und 8. Tag nach der Infektion einige Tiere aus den einzelnen Gruppen getötet, die Leber und die Milz entnommen und die darin enthaltenen Lebendkeime bestimmt. In der folgenden Tabelle sind die Lebendkeimzahlen aufge-45 führt. Die restlichen Tiere der einzelnen Gruppen wurden bis zum 28. Tag beobachtet und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt. Die prozentuale Überlebensrate der Tiere ist ebenfalls in der Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Antigen

Adjuvans

Lebendkeime in Leber und Milz am Tag + Standard-Abweichung 1 3

8

Über lebende

8 x 103

6 x 104

4 x 107

kein kein

+ 1 x 103

+2x 104

+3 x 107

30%

8x 103

2,5 x 105

6 x 105

S. typhi.

kein

+ 3x 103

+ 1 x 105

+ 3 x 105

45%

1,5 x 104

2,5 x 104

2,4 x 104

S. typhi.

Neuraminidase

+0,2 xlO4

+ 2,2 x 104

+2,3 x 104

70%

5 E pro Dosis

Das Neuraminidase enthaltende Antigen S. typhimurium führt zu einer deutlich verringerten Lebendkeimzahl in den Organen und einer verbesserten Überlebensrate der Tiere.

Wie in den Versuchsbeispielen gezeigt, ist die Neuraminidase als Adjuvans für verschiedenste Antigenpräparationen brauchbar. Es liegt demnach im Sinne der Erfindung, die 65 Neuraminidase sowohl löslich als partikulären, lebenden wie toten, von Mikroorganismen und von höheren Tieren gewinnbaren Antigenen einzusetzen. Erfindungswesentlich ist, dass die Neuraminidase gleichzeitig mit dem Antigen ap-

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pliziert wird, gegen das eine spezifisch gesteigerte immunologische Antwort des behandelten Wertes erreicht werden soll. Eine besondere praktische Bedeutung hat das Adjuvans ausser der erfindungsgemässen Verwendung unter anderem bei der Infektionsabwehr, aber auch in der Erhöhung der immunologischen Antwort bei der Verabreichung von Gewebezellen, beispielsweise aus Tumorgewebe. Erfindungsge-

mäss wird Neuraminidase als Adjuvans bei der Herstellung von Antiseren gegen definierte Antigene eingesetzt, da hierbei mit der gleichen Menge des erforderlichen Antigens eine bedeutende Erhöhung der Ausbeute des zu gewinnenden s Antikörpers aus dem Serum der immunisierten Tiere erreicht . werden kann.

Claims (3)

630807 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Mittel, bestehend aus einem Gemisch von Antigen und Neuraminidase einem Tier verabreicht, nach der Bildung von Antikörpern im Blut dieses entnimmt und das Serum gewinnt.

2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1.

3. Mittel nach Anspruch 2, enthaltend 0,01 bis 150 Einheiten Neuraminidase pro Antigendosis.