DE4122906C2

DE4122906C2 - Impfstoffe gegen virale oder bakterielle Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE4122906C2
Application number: DE4122906A
Authority: DE
Inventors: Andras Dr Varga; Stephan Dr Kiesig; Tomas Prof Porstmann; Elsa Nugel; Ruediger Von Prof Baehr; Adam Dr Zureck; Rudolf Prof Ehwald; Ralf Dr Boldt; Helga Dr Meisel; Christel Riese
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Varga Andras Dr 10437 Berlin De Kiessig Step
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1991-07-08
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2011-07-09
Also published as: DE4122906A1; DD298884A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen antigene Epitope verschiedenen Ursprungs sowie Verfahrens zu ihrer Herstellung. Die neuen Impfstoffe führen zu einer verstärkten humoralen und zellulären Immunantwort gegenüber viralen, bakteriellen u. a. Proteinen bzw. Polypeptiden. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, Veterinärmedizin und die pharmazeutische Industrie.

Zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, vorzugsweise Viruskrankheiten, werden zahlreiche Impfstoffe hergestellt. So werden zum Beispiel von führenden Firmen Impfstoffe hergestellt, die entweder attenuierte Viren oder isolierte bzw. gentechnisch hergestellte virale Antigene enthalten (Behring-Werke-Mitteilung: Virus Hepatitiden, Hepatitis B, Mai 1988, Mitteilung: Röteln, Juli 1988). Im grundegenommen haben sich die Impfstoffe in den letzten 10 bis 15 Jahren nicht viel geändert. Es werden überwiegend Lebendimpfstoffe, Totvakzine oder Toxoide verwendet (Roitt, 1. M.: Essential Immunology, Blackwall, Oxford 1980; Schuster, G.: Virus und Viruskrankheiten, Ziemsen Verlag 1988). Neueste Ergebnisse mit virusmodifizierten, tumorspezifischen Vakzinen bringen bei der Krebsbekämpfung Hoffnungen (Schirrmacher, V.: DE-PS 38 06 565 vom 14.09. 1989). In dieser Patentschrift (PS) (Beispiel 3) wird auf die Wirkung der BCG (Bazille de Calmette Guerin) als Vakzine hingewiesen, wenn man sie mit Newcastle-Disease-Virus inkubierten, autologen und inaktivierten Tumorzellen mischt. Die "Verkleidung" von Bakterien (vorzugsweise BCG) mit partiell oxidierten Dextranen und viralen Proteinen zur Herstellung von Vakzinen ist bisher nicht beschrieben worden.

Es ist das Ziel der Erfindung, einen neuen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, der schwach immunogene Proteine bzw. Polypeptide in die Lage versetzt, eine verstärkte Immunantwort auszulösen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Impfstoffe gegen antigene Epitope verschiedenen Ursprungs sowie Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe dadurch gelöst, daß partiell oxidiertes Polysaccharid an die Oberfläche von impfstoffgeeigneten Bakterien gebunden und die derart beladenen Bakterien mit viralen oder bakteriellen Epitopen (Proteinen bzw. Polypeptiden u. a.) überzogen werden. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben. Die derart modifizierten Bakterien werden ggf. mit Zusatzstoffen versehen, z. B. 3-7%iger Dextranlösung zur Stabilisierung. Als Polysaccharide eignen sich Dextrane, Amylose, Amylopectin oder Glycogen, aber auch andere Polysaccharide, wie z. B. Pectin, Glucomannan, Chitosan oder Lipopolysaccharide. Als Bakterien kommen vorzugsweise Mycobakterien - sowohl in vivo als auch in denaturiertem Zustand - in Frage. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß schwach immunogene virale oder bakterielle Antigene bzw. Epitope eine verstärkte Immunantwort hervorrufen, wenn sie auf Bakterien, die mit partiell oxidierten Polysacchariden beladen sind, aufgezogen werden. Derart "verkleidete" Bakterien (umhüllte Bakterien) zeigen sich als wirksame Impfstoffe. Die partiell oxidierten Polysaccharide (vorzugsweise Dextran) binden sich kovalent durch die aktiven Aldehydgruppen an die Bakterienoberflächen, indem sie mit vorhandenen Aminogruppen reagieren. Gibt man die partiell oxidierten Polysaccharide im Überschuß zu attenuierten (vorzugsweise BCG) oder zu getöteten Bakterien, bleiben noch freie Aldehydgruppen übrig, um die Bakterien mit Epitopen, Polypeptiden oder anderen freien aminogruppenhaltigen Antigenen zu beschichten. Nur Epitope bzw. Polypeptide, die keine eigenen freien Aminogruppen enthalten, müssen geringfügig mit einer entsprechenden Aminosäure, wie z. B. Arginin, durch Kopplung modifiziert werden. Nach der Oxidation der Polysaccharide muß das Oxidationsmittel schonend entfernt werden. Nach der Beschichtung der Bakterien mit den partiell oxidierten Polysacchariden wird nach dem Ablauf der Bindungsreaktion der Überschuß der oxidierten Polysaccharide durch einfache Waschvorgänge entfernt. Als Waschflüssigkeit ist die nichtoxidierte Polysaccharidlösung am besten geeignet. Wirkt die Polysaccharidlösung stabilisierend (wie z. B. Dextran), kann die zweite Reaktion - die Antigenbeschichtung - in dieser Lösung durchgeführt werden. Bei der Durchführung der Reaktion muß der optimale pH-Wert, individuell entsprechend den Bakterieneigenschaften leicht alkalisch oder leicht acid, eingestellt werden. Bevorzugt ist, daß die Bindungsreaktion zwischen Aldehyd- und Aminogruppen auf den attenuierten Bakterienoberflächen stattfindet. Bei toten Bakterien wird die Kopplungsreaktion bei pH 4,0 oder bei pH 9,0 durchgeführt. Die Antigenbindung wird immunchemisch, z. B. durch Immunfluoreszenzmikroskopie, mittels spezifischer Antikörper geprüft. Sämtliche Lösungen werden vor der Verwendung sterilisiert. Die Dextranlösung kann autoklaviert und/oder bakterienfiltriert werden. Bei attenuierten Bakterien muß ein Vitalitätstest durchgeführt werden. Auch Antigendriftproteine - man versteht darunter instabile virale Antigene - als Gemische einer großen Zahl von Epitopen können auf Bakterien vorteilhaft konzentriert werden (1 mg Feuchtbakteriumoberfläche entspricht ca. 50 cm²). Die umhüllten (divestierten) Bakterien können ampulliert und als Impfstoff ohne Adjuvanszusatz verwendet werden. Antigene Epitope verschiedenen Ursprungs können mit den partiell oxidierten Polysacchariden (vorzugsweise Dextran) extra in einer Lösung reagieren, und diese Lösung kann als Stabilisator zum Impfstoff verwendet werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1: Herstellung eines Impfstoffes gegen Hepatitis-B mittels umhüllter Bakterien

50 ml (20 g/l) Dextran 35-Lösung wurden mit 40 ml 45 mM HJO₄ bei pH 4,5 unter Kühlung langsam oxidiert. Man erreicht einen Oxidationsgrad von 12% (2 × 12 Aldehydgruppen auf 100 Glukoseeinheiten). Durch 2malige Fallung mit 60%- bzw. 96%igen Ethanol wurde die partiell oxidierte Dextranlösung gereinigt und anschließend bis zur weiteren Bearbeitung als Feststoff im Kühlschrank lichtgeschützt aufbewahrt. Vor der Anwendung bringt man das partiell oxidierte Dextran in wäßrige Lösung.

Bacille de Calmette Guerin (BCO) vom BCG-Institut Jena, die für unspezifische Immunisierung von Krebskranken verwendet wird, wurde mit dem partiell oxidierten Dextran bei schwach alkalischem pH beschichtet. (Bei vitalen Bakterien arbeitet man leicht acid bei pH 5,5.) Die Beschichtung wurde auf mit 70%igem Ethanol behandelten und anschließend gewaschenen Bakterienoberflächen durchgeführt. Der Überschuß des partiell oxidierten Dextrans wurde durch mehrere Waschvorgänge mit Dextran Lösung entfernt und die Bakterien mit Hepatitis-B-S-Antigen, das aus den Seren von asymptomatischen HBS-Trägern isoliert wurde, beschichtet. Die erfolgreiche Beschichtung wurde mittels monoklonalem Anti-HBS durch indirekten Immunfluoreszenztest bestätigt.

Die mit den HBS-umhüllten-Bakterien geimpften Mäuse produzieren Anti-HBS-Antikörper schon im low-toleranten Bereich, verglichen mit der Immunantwort von Mäusen, die nur mit HBS geimpft wurden. Ein vollkommenes Fehlen des Antikörpers gegenüber dem schwach immunogenen HBS konnte nur bei der letzten Gruppe festgestellt werden.

Beispiel 2: Herstellung eines Impfstoffes gegen HIV-gp-I 20

Als Antigen wurde ein Nonapeptid der V3 Region gp-120 des HIV, gekoppelt mit Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH-9) verwendet. BCG wurde wie im Beispiel 1 mit partiell oxidiertem Dextran beschichtet (BCG-D).

60 mg BCG-D wurden in 3 ml 4%iger Dextran-35 Lösung aufgenommen und der pH-Wert auf 9,0 eingestellt.

Unter Kühlung wurde 30 µl (2 mg/ml) KHL-9 langsam zugegeben und lichtgeschützt bei +4°C vorsichtig geschüttelt.

Die Suspension mit umhüllten Bakterien können portioniert in Ampullen bis zur Verwendung aufbewahrt werden.

Beispiel 3: Herstellung eines modifizierten Impfstoffes gegen HIV-pg-120 nach Beispiel 2

70 µl 4%ige partiell oxidierte Dextranlösung wurde bei pH 9,0 mit 30 µl 2 mg/ml KHL-9 unter Kühlung und lichtgeschützt über 12 Stunden geschüttelt und diese Lösung zu dem in Beispiel 2 hergestellten Impfstoff gemischt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen gegen virale oder bakterielle Antigene oder Epitope, dadurch gekennzeichnet, daß partiell oxidiertes Polysaccharid an die Oberfläche von Bakterien, die zur Herstellung von Impfstoffen geeignet sind, gebunden und die derart modifizierten Bakterien mit viralen oder bakteriellen Proteinen oder Polypeptiden überzogen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Polysaccharid Stärke, Glucomannan, Pectin, Cellulose, Chitosan oder Liposaccharide, besonders bevorzugt Dextran, verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Antigen-Drift- Proteine eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mit partiell oxidierten Polysacchariden und danach mit Proteinen überzogenen Bakterien nachträglich denaturiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die umhüllten Bakterien in einer partiell oxidierten Polysaccharidlösung, die vorher mit dem gewünschten Antigen reagiert hat, stabilisiert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die umhüllten Bakterien mit einer Mono- oder Polysaccharidlösung, bevorzugt Glucose, Mannose, Lactose oder Dextran stabilisiert werden.

7. Impfstoffe gegen virale oder bakterielle Antigene oder Epitope, erhältlich durch eine Umhüllung von Bakterien, die zur Herstellung von Impfstoffen geeignet sind, mit partiell oxidierten Polysacchariden und Überziehen der derart modifizierten Bakterien mit viralen oder bakteriellen Proteinen oder Polypeptiden.

8. Umhüllte Bakterien, enthaltend kovalente Bindungen zwischen einem Bakterium, einer Bakteriums-Umhüllung aus partiell oxidiertem Polysaccharid und einem viralen oder bakteriellen Protein bzw. Polypeptid.

9. Umhüllte Bakterien nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Hülle aus partiell oxidiertem Polysaccharid enthalten, die mit Epitopen verschiedenen Ursprungs überzogen ist.