DE2039223A1 - Desensibilisierungsmittel gegen Allergien und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

• "Desensibilisierungsmittel gegen Allergien und Verfahren zu seiner Herstellung Prioritäten: 6. August 1969, Grosebritannien, Nr. 39289/69 15. Mai 1970, Grossbritannien, Nr. 23621/70 16. Mai 1970, Grossbritannien, Nr. 23853/70 Die Erfindung betrifft ein Desensibilisierungs- oder Immunisierungsmittel zur Behandlung von Hypersensibilisierungserscheinun gen und Allergien, Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses Desensibilisierungsmittels.
• Es ist bekannt, dass manche Menschen gegen Allergene, wie Pollen, Zimmerstaub, Katzenfelle, Getreide und vielen andere Substanzen, überempfindlich sind. Diese Menschen können unter akuten Beschwerden infolge ihrer allergischen Reaktionen leiden, die sioh in Krankheiten, wie Asthma, Heuschnupfen, Ekzemen, Dermatitis oder Migräne, äussern.
• Ein zur Behundlung allemgisches Eischeinungen angewendetes Verfahren ist die sogenannte Desensibiliserungstherapie. Dem zu behandelnden Patienten werden wiederhalte allmählich ansteigende Dosen eines Extrakts des Allergene oder der Allergene verabreicht, gegen das bzw, gegen die zu empfindlich ist. Am Ende der Behandlung ist gewühnlich die Auflache Abwehrkraft des Patienten gegen dasAllergen steren angestiegen, vermutlich als Folge des Aufbaus von Antikörpern im Organismus, der durch den verabreichten Extrakt angeregt wird. Diese Desensibilisierungstherapie hat gewisse Nachteile. Bewegspielsweise kann versehentlich eine gefährlich hohe Dosis des Allergens verabreicht werden, was zu einer anaphylaktische Reaktion beim Patienten führt. Zur Lösung dieses Problems wurde bereite vorgeschlagen, das Allergen wenn möglich derart zu modifizieren, dass die Allergiewirkung gegenüber den Desensibilisierungs- und/oder Immunisierungseigenschaften vermindert wird.
• Aufgabe der Erfindung war es, das Allergen oder den allergenhaltigen Stoff für den empfindlichen Patienten unschädlich oder zumindest weniger schädlich zu machen, wobei jedoch die Fähigkeit der Allergene zur Anregung der Antikörperbildung beibehalten wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
• Gegenstand der Erfindung ist somit ein Desensibilisierungsmittel gegen Allergien aus einem allergenen Protein oder Glykoprotein, das intermolekular und/oder intramolekular mit einem Polyaldehyd, Polyketon, Carbodiimid, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat umgesetzt ist.
• Die Erfindung. betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Desensibilisierungsmittels gegen Allergien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein allergenes Protein oder Glykoprotein in wässriger Lösung mit einem Polyaldehyd, Polyketon, Carbodiimid, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat umsetzt, mit der Nassgabe, dass man die Umsetzung in einem sauren Nedium durchführt, wenn ein anorganisches Cyanat verwendet wird.
• Das erfindungsgemäss zu modifizierende allergenhaltige Ausgangsmaterial erhält man in an sich bekannter Weise aus einem allergenhaltigen Stoffs wie Pollen, durch Extrahieren mit einem Lösungsmittel, im allgemdinen Wasser Der erhaltene allergenhaltige Extrakt besteht hauptsächlich. aus Proteinen oder Glyko -proteinen, die gewöhnlich mit freien Kohlenhydraten verunreinigt sind. Der Extrakt wird hierauf gewöhnlich durch Abtrennung der Verunreinigungen, z.B. mittels Dialyse, Ausfällung oder Gelfiltration, gereinigt und kann anschliessend nach dem Verfahren der Erfindung behandelt werden. Eine eingehendere Beschreibung- einiger der ueblichen Methoden findet sich in dem Aufsatz von J.N. Newell, Journal of AlIergy, Bd. 13, 1942, S. 177 bis 203, insbesondere S. 187. Gemäss einem anderen brauchbaren Extraktionsverfahren wird das allergenhaltige Ausgangsmaterial oder dessen wässriger Extrakt mit einer wässrigen Phenollösung behandelt und der allergenhaltige Extrakt aus der Phenolphase abgetrennt.
• Beispiele für erfindungsgemäss verwendete Polyaldehyde und Polyketone sind Dialdehyde bzw. Diketon und höhere Aldehyde bzw.
• Ketone. Erfindungsgemäss werden vorzugsweise Dialdehyde, d.h.
• solche mit 2 bis etwa 24 Kohlenstoffatomen im Molekül, verwendet. Die Dialdehyde können aliphatisch, cycloaliphatisch, heterocyclisch oder aromatisch und verzweigt oder unverzweigt sein, wie z.B. Glyoxal, 1,3-Propandial, 1,4-Butadial, Glutaraldehyd und α,#-Dialdehyde mit 14 bis 24 Köhlenstoffatomen im Molekül.
• Erfindungsgemäss besonders bevorzugt ist Glutaraldehyd.
• Der Ausdruck "Carbodiimid" belet Verbindungen der allgemeinen Formel I R - N = 0 = N - R9 (I) in der R und R' gleich oder verschieden sein können und jeweils einen aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Rest bedeuten, und deren Salze. Erfindungsgemäss werden vorzungsweise wasserlösliche Carbodiimide verwendet z.3. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimldX ho-p-toluolsulfonat.
• Der Ausdruck "Epihalogenhydrin" bedeutet Verbindungen der allgemeinen Formel II in der X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chlor- oder Bromatom ist. Erfindungsgemäss besonders bevorzugt ist Epichlorhydrin.
• Beispiele für erfindungsgemäss verwendbare anorganische Cyanate.
• sind Alkalimetallocyanate, insbesondere Kaliumcyanat, und Erdalkalimetallcyanate.
• In der Regel sind Allergenproteine gegenüber einer Denaturierung ziemlich widerstandsfähig. Sie können daher gewöhnlich auf relativ hohe Temperaturen erhitzt werden, ohne dass sie denaturieren.
• Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Desensibilisierungsmittel kann daher innerhalb eies verhältnismässig breiten Temperaturbereichs durchgeführt werden. In der Praxis ist es jedoch meist nicht notwendig bzw. erwünscht, oberhalb 100°C zu arbeiten. Bei Verwendung von Dialdehyden wird vorzugsweise unterhalb 37°C gearbeitet, und in der Praxis wird die Reaktion in allen Fällen vorzungsweise bei Raumtemperatur, d.h.
• bei etwa 20 bis 25°C durchgeführt. Bei Verwendung von Dialdehyden müssen nämlich extreme Reaktionsbedingungen vermeiden werden, um die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten z.B. durch Selbetkondensation der Aldehyde zu verhindern.
• Bei Verwendung von Polyaldehyden und Polyketonen ist es nicht kritisch, bei welchem pH-Wert die Umsetzung durchgeführt wird.
• Man arbeitet vorzungsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 8, insbesondere bei etwa 5. Sehr niedrige pH-Werte sind zur Verhinderung der Selbstkondensation der Aldehyde zu vermeiden.
• Bei Verwendung von Epihalogenhydrinen oder Carbondiimiden kann die Umsetzung nebenfalls bei beliebigen pH-Wert durchgeführt wer- Die erfindungsgemäss verwendeten Reaktionsteilnehmer wirken vermutlich gegenüber dem Allergen als Vernetzungsmittel und verc ursachen intermolekulare und/oder intramolekulare Vernetzungen.
• Daher sind zwar die erfindungsgemäss verwendeten allergenhaltigen Ausgangsstoffe wasserlöslich, die erfindungsgemäss modifizierten Produkte jedoch im allgemeinen nur schwer löslich. Die Löslichkeit der modifizierten Produkte scheint vom Vernetsungsgrad abzuhängen, der wiederum von- Art und Menge des verwendeten Reaktionsteilnehmers und den Reaktionsbedingungen abhängt.
• Bisher ist keine empirische Methode zur Vorherbestimmung der Löslichkeitseigenscha£ten der modifizierten allergenen Produkte bekannt. Die erforderlichen Reaktionsvariablen zur Herstellung eines Produkts mit der gewünschten Löslichkeit müssen daher durch einfache Vorversuche ermittelt werden.
• Arzneipräparate können die Desensibilisierungsmittel der Erfindung sowie einen parenteral verträglichen Träger, wie eine isotonische Salzlösung, eine Pufferlösung oder ein Öl, oder einen anderen bekannten Trägerstoff, enthalten. Sie können ausserdem ein Adjuvans, wie Tyrosin, Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat-, enthalten. Das Desensibilisierungsmit tel wird im allgemeinen subcutan injiziert. Die Höhe der verabreichten Dosis hängt von dem allergischen Zustand des Patienten ab.
• Im allgemeinen sollen die Desensibilisierungsmittel der Erfindung eine geringere Löslichkeit als das Ausgangsmaterial aufweisen, jedoch in vivo soweit löslich sein, dass sie in gewünschter Weise freigesetzt werden. Es wurde festgestellt, dass sich dies bei Verwendung eines nur in geringem Masse löslichen, modifi-oder -hydroxid vierten und an Aluminlumoxid/oder Shnlichen Stoffe adsorbierten Allergens erzielen lässt. Der Löslichkeitsgrad des vernetzten Allergens kann durch Adsorption an Aluminiumoxid verändert werden. Durch Routineversuche lassen sich die optimalen Freisetzungseigenschaften in vivo ermitteln.
• Bei parenteraler Verabreichung des erfindungsgemässen Desensibilisierungsmittels an Tiere wurde festgestellt, dass sich beträchtliche Mengen von Antikörpern mit Kreusspezifität für das nichtmodifizierte allergenhaltige Material bilden. Die untersuchten erfindungsgemäss modifizierten Allergene verursachten auch bei überempfindlichen Tieren keine anaphylaktischen Reaktionen.
• Die Beispiele erläutern die Erfindung.
• B e i s p i e l 1 Herstellung eines unlöslichen Allergen-Derivate mit Glutaraldehyd 5 ml eines teilweise gereinigten Extraktes aus Bandgraspollen (Dactylis glomerata), der 10 mg Protein/ml in 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,3 enthält, wird mit 5 ml einer 0,5prozentigen Glutaraldehydlösung umgesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert und Zur Abtrennung des löslichen Rückstands mit destilliertem Wasser gewaschen Die Lösung wird schliesslich in einer Phenol-Kochsalzlösung suspendiert und gelagert Allrgiewirkung Die Suspension des unlöslichen Pollens wird in einer Konzentration von 10 mg/ml gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Gleichzeitig wird das Ausgangsmaterial und die Phenol-Kochsalzlösung getrennt in andere Hautbereiche der gleichen Patienten injiziert. Nach 10 Minuten werden die Quaddelgebiete gemessen, sie sind in Tabelle I in mm2 angegeben. Es zeigt sich, dass das unlösliche Ällergenpräparat bei der 200-fachen Konzentration des Ausgangsmaterials knapp 10 % von dessen Allergiewirkung aufweist. Die beibehaltene Allergiewirkung ist daher gegenüber der des Ausgangsmaterials vernachlässigbar.
• Immunisierungswirkung Das unlösliche Material und das Ausgangsmaterial werden jeweils im vollständigen Preundischen Adjuvans emulgiert, so dass sich eine Konzentration von 1 mg/ml ergibt. Gruppen von Meerschweinchen werden jeweils 0,5 ml der einen bzw. der anderen Emulsion subcutan injiziert. Nach 22 Tagen werden die Tiere an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des gereinigten Bandgraspollenextrakts intradermal injiziert. 0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau wird sofort anschliessend intravenös in ziert; Nach 20 Minuten werden die Durchmesser der entstandenen Quaddeln gemessen; sie sind in Tabelle II angegeben.
• Es zeigt sich, dass das mit Glutaraldehyd modifizierte Pollenallergen die Bildung von Antikdrpern bewirkt, die mit dem Ausgangsmaterial reagieren, jedoch besitzt das modifizierte Aller gen eine bessere Immunisierungswirkung als das Ausgangsmaterial.
• Tabelle 1

  Patient-Nr. Unlöslicher Gereinigter Phenol-

  Bandgraspollen- Bandgraspollen- Kochsalz-

  extrakt, 10mg/ml extrakt, 50µg/ml lösung

  1 1 21 84 12

  2 16 32 9

  3 13 57 23

  4 15 51 4

  Gesamt 65 224 48

  Gesamt minus Summe

  für Phenol-Koch- 17 176 -

  salzlösung

  Die Zahlen bedeuten die Fläche der Quaddeln (mm²) Tabelle II

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei versch.

  schwein- Stoff, Konzentrationen von intradermal inji-

  chen Nr. (0,5 mg) ziertem Bandgraspollenextrakt

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1) Gereinigter 15 0 0 0 0 0

  2) Bandgras- 16 0 0 0 0 0

  ) pollenextrakt

  3) 17 0 0 0 0 0

  4) 16 0 0 0 0 0

  5) mit Glutar- 14 0 0 0 0 0

  6) aldehyd 12 10 9 0 0 0

  ) modifizierter

  7) Bandgras- 14 13 12 12 10 8

  ) pollenextrakt

  8) 16 14 12 11 10 8

  9) 12 10 0 0 0 0

  10) 12 9 0 0 0 0

  B e i s p i e l 2 Herstellung von mit Carboiimid modifiziertem Allergen @@@ eines Extraktes verschiedener Graspollen, der durch Behandlung mit wässriger Phenollösung und anschliessendes Ausfällen von Protein aus der Phenolphase teilweise gereinigt worden -war, um möglichst viel Kohlenhydrate und niedermolcl.ulare Stofffe abzutrennen, werden in 5 ml einer 0,5 m Boratpufferlösung vom pH 8,85 gelöst 5 ml einer 2prozentigen wässrigen Lösung vob 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carboiimid-metho-ptoluolsulfonat werden langsam zugegeben, und die Lösung wird 8 .Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert, dreimal mit einer Boratpufferlösung gewaschen und in wässriger Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.
• Allergierwirkung Eine Suspension des vorstehenden modifizierten Extrakts und eine Lösung des Ausgangsmaterials, , beide in wässriger Phenol-Kochsalzlösung, und das Medium selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert Die Fläche der entstandenen Quaddeln wird nach 10 Minuten gemessen.
• Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle III angegeben.
• Tabelle III

  Patient Extrakt verschie- mit Carboiimid Phenol-
  Nr. dener Graspollen, modifizierter Kochsalz-
  50µg/ml Extrakt verschie- lösung
  dener Graspollen
  1 12 0 0
  2 3 2 0
  3 8 0 0
  4 12 0 0
  5 15 0 0
  6 62 3 0
  Gesamt 112 5 0

  Die Zahlen bedeuten die Fläche der Quaddeln (mm²) Immunisierungswirkung Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion des vorstehenden modifizierten Extrakts im vollständigen Freund'schen Adjuvans subcutan injiziert. Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial in dem gleichen Adjuvans in der gleichen Weise immunisiert. Nach 3 bis 4 Wochen werden die Tiere an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen wird intradermal jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials schliesslich 0,1 ml 1 n-Kochsalzlösung injiziert.
• Unmittelbar darauf werden 0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau intravenös injiziert. Nach 20 Minuten bilden sich an einigen intradermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln,, die die Gegenwart von Antikörpe.rn anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind. Die Durchmesser der Quaddeln werden gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle IV angegeben.
• Tabelle IV

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff, denen Konzentrationen von intradermal

  chen Nr. 5 mg injiziertem Extrakt aus versch. Gras-

  pollen

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Extrakt 14 12 10 9 8 8

  2 verschiedener 14 13 10 9 8 -

  3 Graspollen 16 14 12 10 9 9

  4 14 13 10 - - -

  5 mit Carbodiimid 14 12 10 10 9 -

  6 modifizierter 12 10 - - - -

  7 Extrakt verschie- 12 10 9 9 9 -

  8 dener Graspollen - - - - - 1

  Aus den Ergebnissen in Tabelle III und IV ist eraichtlich, dass durch die Immunisierung mit dem mit Carbodiimid modifizierten Allergen grössere Mengen an Antikörpern produziert werden. Die Allergiewirkung des Materials ist jedoch vernachlässigbar.
• B e i s p i e l 3 50 mg eines Extrakts verschiedener Graspollen, der zur Abtren-- nung der Kohlenhydrate und niedermolekularen Stoffe teilweise gereinigt worden war, wird in 5 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom PH 8,0 gelöst. 1 ml l-Chlor-2,3-epoxypropan wird langsam zugegeben, und das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Rillung wird abzentrifugiert, mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer wässrigen.
• Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.
• Allergiewirkung Eine Suspension des vorstehenden modifizierten Extraktes und eine Lösung des Ausgangsmaterials, beide in wässriger Phenol-Kochsalzlösung, und das Medium selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiz-iert. Nach 10 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen.
• Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle V angegeben.
• Tabelle V

  Patient Extrakt ver- mit Epichlorhydrin modifi Phenol-
  Nr. schiedener zierter Extrakt verschie- Kochsalz-
  Graspollen dener Graspollen, 1mg/ml lösung
  1 62 0 0
  2 15 1 0
  3 12 0 0
  4 8 2 0
  5 3 0 0
  6 12 0 0
  Gesamt 112 3 0

  Die Zahlen bedeuten die Quaddelflächen (mm²).
• Immunisierungswirkung Eine Gruppe von, Meerschsweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion, die den vortstehenden modifizierten Extrakt.
• im vollständigen Freund'schen Adjuvans enthält, subcutan injiziert. Eine ähnliche Gruppe vob Meerschweinchen wird mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial imgleichen Adjuvans auf die gleiche Weise immunierst. Nach 3 bis 4 Wochen werden die Tiere an den Flanken k kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgnagsmaterials und schliesslich 0,1 ml 1 n-Kochsalzlösung intradermal injiziert.
• 0,+ ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmerlblau werden sofort anschliessend intravenös injizierte Nach 20 Minuten bilden sich an einigen intradermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln, die die Anwesenheit von Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind. Die Quaddeldurchmesser werden gemessen. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle VI angegeben. .
• Tabelle VI

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen, injiziertem Extrakt verschiedener

  Nr. Graspollen

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Extrakt 14 13 10 - - -

  2 verschiedener 16 14 12 10 9 9

  3 Graspollen 14 13 10 9 8 -

  4 (5 mg) 14 12 10 9 8 8

  5 mit Epichlor- 12 10 - - - -

  6 hydrin modifi- 10 - - - - -

  zierter Extrakt

  7 verschiedener - - - - - -

  8 Graspollen 10 - - - - -

  (5 mg)

  9 Extrakt 12 9 - - - -

  10 verschiedener 14 12 9 - - -

  11 Graspollen 12 11 0 - - -

  12 (0,5 mg) 14 12 9 - - -

  13 mit Epichlor- 10 8 - - - -

  14 hydrin modifi- - - - - - -

  zierter Gras-

  15 pollenextrakt 10 8 - - - -

  16 (0,5 mg) - - - - - -

  Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass durch die Immunisierung mit Allergenen, die mit Epichlorhydrin modifiziert wurden, nachweisbare Mengen von Antikörpern produziert werden, während die Allergiewirkung auf ein vernachlässigbares Mass reduziert wird.
• B e i s p i e l 4 50 mg eines Extrakts aus Bandgraspollen werden in 10 ml einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 gelöst. 1 ml 1-Brom-2,3-epoxypropan wird langsam zugegeben und das Gemisch 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird abzentrifugiert, mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.
• Die Ergebnisse der biologischen Versuche sind in den nachstehenden Tabellen VII und VIII angegeben. Die Testmethoden sind identisch mit denen von Beispiel 3. Durch die Immunisierung bilden sich. nachweisbare Mengen von Antikörpern, während die Allergiewirkung vernachlässigbar^ ist.
• Tabelle VII Immunisierungswirkung von mit Epibromhydrin modifiziertem Allergen

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen, injiziertem Extrakt aus verschiedenen

  Nr. Graspollen

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Bandgraspollen- 16 10 - - - -

  2 extrakt 16 10 - - - -

  3 (0,5 mg) 16 10 - - - -

  4 mit Epibromhydrin 14 10 - - - -

  5 modifizierter 14 10 - - - -

  6 Bandgrasextrakt 15 10 - - - -

  (0,5 mg)

  Tabelle VIII Allergiewirkung von mit Epibromhydrin modifiziertem Allergen

  Patient Bandgraspollen- Mit Epibromhydrin modifi- Phenol-
  Nr. extrakt, 100µg/ml zierter Bandgraspollen- Kochsalz-
  extrakt lOOJlg/ml lösung
  1 9 1 0 0
  2 18 0 0
  3 22 0 0
  4 21 0 0
  Gesamt 70 0 0

  B e i s p i e l 5 Herstellung von mit Cyanat modifizierten Allergene Ein wässriger Extrakt aus verschiedenen Graspollen (straussgras, Bartgras, Bandgras, Kammgras, falscher Hafer, Schwingelgras, Fuchsschwanzgras, Raigras, Timotheusgras, Ruchgras, etc.) wird teilweise gereinigt, indem man ihn mit wässrigem Phenol behandelt und hierauf das Protein aus der Phenolphase ausfällt, um möglichst viel Kohlenhydrate und niedermolekulare Stoffe abzutrennen. 50 mg des erhaltenen, teilweise gereinigten allergenen Proteinmaterials werden in 5 ml Wasser gelöst und mit Natriumhydroxidlösung auf pK 8 eingestellt. Hierauf wird der pH-Wert mit Essigsäure auf 5,0 eingestellt, und es werden 0,2 g Kaliuncyanat zugegeben, Das Gemisch wird hierauf 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung vom PH 8 gewaschen und hierauf in einer wässrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert.
• Allergiewirkung Eine Suspension des wie vorstehend beschrieben hergestellten modifizierten Allergens, eine Suspension des nichtmodifizierten, teilweise gereinigten Allergenextrakts, beide in einer wässrigen Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Nach 10 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle IX'in mm2 angegeben. Es zeigt sich, dass das mit Cyanat modifizierte Allergen gegenüber dem nicht-modifizierten Allergen nur eine vernachlässigbare Allergiewirkung aufweist.
• Tabelle IX

  Tabelle IX
  Patient- Extrakt aus ver- mit Cyanat modifizier- Phenol-
  Nr. schiedenen Gras- ter Extrakt aus ver- Kochsalz-
  pollen, 50µg/ml schiedenen Graspollen, lösung
  im ml
  1 12 4 0
  2 3 2 0
  3 8 6 0
  4 12 3 0
  5 15 5 O
  6 62 24 0
  Gesamt 112 44 0

  Immunisierungswirkung' Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsion, die das mit Cyanat modifizierte Allergen im vollständigen Freundtschen Adjuvans enthält, subcutan inåiziert. Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial in dem gleichen Adjuvans auf die gleiche Weise immunisiert. Nach 3 bis 4 Wochen werden beide Gruppen von Tieren an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schliesslich 0,1 ml 1 n-Kochsalzlösung intradermal inji ziert.
• 0,4 ml einer 5prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau werden unmittelbar darauf intravenös injiziert, Nach 20 Minuten entstehen an einigen intradermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln, die die Anwesenheit von Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind. Wiederum werden die Quaddeldurchmesser gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle X -angegeben. Es zeigt sich, dass das mit Cyanat modifizierte Allergen die für das Ausgangsmaterial spezifische Immunisierungswirkung beibehält.
• Tabelle X

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen, injiziertem Extrakt verschiedener

  Nr. Graspollen

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Extrakt aus 14 12 10 9 8 8

  2 verschiedenen 14 13 10 9 8 -

  3 Graspollen 16 14 12 10 9 9

  4 (5 mg) 14 13 10 - - -

  5 mit Cyanat mo- 12 9 7 - - -

  6 difizierter Ex- 12 9 7 - - -

  trakt aus ver-

  7 schiedenen Gras- 10 - - - - -

  8 pollen (5 mg) 12 - - - - -

  9 Extrakt aus 14 12 9 - - -

  10 verschiedenen 12 11 9 - - -

  11 Graspollen 14 12 9 - - -

  12 (0,5 mg) 12 9 - - - -

  B e i s p i e 1 6 Zur Bestätigung der Ergebnisse der biologischen Versuche wird das Verfahren von Beispiel 5 wiederholt. Die Ergebnisse des Allergieversuchs mit dem modifizierten Allergen sind in nachstehender Tabelle XI und die Ergebnisse der Immunitätsversuche mit dem mit -Cyanat modifizierten Allergen sind in nachstehender Tabelle XII angegeben.
• Tabelle XI

  Produkt Extrakt aus ver- mit Cyanat modifi- Phenol-
  schiedenen Gras- zierter Extrakt aus Kochsalz-
  pollen, 100µg/ml verschiedenen Gras- lösung
  pollen 2 mg/ml
  1 23 1 1
  2 6 0 0
  3 2 0 0
  4 19 0 0
  Gesamt 50 1 1

  Die Zahlen bedeuten die Quaddelflächen(mm2) Tabelle XII

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen Nr. injiziertem Extrakt aus verschiedenen

  Graspollen

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Extrakt aus 12 10 9 8 - -

  2 verschiedenen 12 10 7 - - -

  3 Graspollen 12 10 8 - - -

  4 (0,5 mg) 12 10 9 - - -

  5 Mit Cyanat mo- 12 10 - - - -

  6 difizierter Ex- 12 9 - - - -

  trakt aus ver-

  7 schiedenen Gras- 14 12 9 - - -

  8 pollen (5 mg) 14 10 - - - -

  9 Extrakt aus 14 10 - - - -

  10 verschiedenen 12 11 9 - - -

  11 Graspollen 10 9 - - - -

  12 (0,5 mg) - - - - - -

  13 Mit Cyanat mo- 12 11 8 - - -

  14 difizierter Ex- 12 - - - - -

  trakt aus ver-

  15 schiedenen Gras- 10 - - - - -

  16 pollen (0,5 mg) - - - - - -

  B e i s p i e l 7 Modifizierung von Pollenextrakt mit Phenylglyoxal Eine 3prozentige Lösung von Phenylglyoxal-hydrat in einer 0,1 m Phosphatpufferlösung vom PH 8 wird zu einem gleichen Volumen von 50 mg eines Extrakts aus Bandgraspollen gegeben, der vorher mit Phenol gereinigt worden war und in der gleichen Pufferlösung gelöst ist Die Umsetzung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die entstandene Fällung wird mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung vom p, 8 gewaschen und hierauf in einer wässrigen Pheno-Kochsalzlsöung suspendiert.
• Allergiewirkung Eine Suspension des wie vorstehend hergestellten, mit Phenylglyoxal modifizierten Extrakts, eine Suspension des nichtmodifizierten, mit Phenol behandelten Bandgrasextrakte, beide in wässriger Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst werden jeweils gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten intradermal injiziert. Die Flächen der entstandenen Quaddeln werden nach 10 Minuten gemessen. Sie sind in nachstehender Tabelle XIII in mm angegeben.
• Tabelle XIII

  Patient Bandgraspollen- Mit Phenylglyoxal modi- Phenol-

  Nr, extrakt 50g/ml fizierter Extrakt Kochsalz-

  1 in ml Lösung

  1 35 * 0 0

  2 27 4 o

  3 19 2 1

  Gesamt 91 6 1

  Immunisierungswirkung Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren eine Emulsich, die den mit Phenylglyoxal modifizierten: trakt im ßrollstandigen Freund'schen Adjuvans enthält, subcutan injiziert. Auf die gleiche Weise wird eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial im gleichen Adjuvans immunisiert. Nach 4 Wochen werden die Tiere beider Gruppen an den Flanken kahigeschoren. In die kahlen Flächen werden jeweils 0,1 mL einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schliesslich 0,1 ml einer 1 n-Kochsalzlösung intradermal injiziert. Unmittelbar darauf werden 0,4 ml einer 5pr;)zentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau intravenös injiziert. Nach 20 Minuten bilden sich an einigen intrdermalen Injektionsstellen blaugefärbte Quaddeln, die die Anwesenheit son Antikörpern anzeigen, die für das Ausgangsmaterial spezifisch sind, Die Flächen der Quaddeln werden gemessen und sind in nachstehender Tabelle XIV angegeben.
• Tabelle XIV

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen Nr. injiziertem Bandgraspollenexrtrakt

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Bandgraspollen- 14 14 10 10 9 7

  2 extrakt 14 12 8 7 6 -

  3 (5 mg) 12 11 10 9 7 -

  4 12 11 9 9 8 -

  1 Mit Phenylglyo- 12 11 - - - -

  2 xal modifizier- 13 10 - - - -

  ter Bandgraspol-

  3 lenextrakt 12 - - - - -

  4 (0,5 mg) - - - - - -

  Beispiel 8 Herstellung von mit Nitroindandion modifiziertem Pollenextrakt 1 ml einer 0,5 prozentigen Lösung von 2-Nitroindan -1,3-dion in Wasser wird zu 9 ml Bandgraspollenextrakt gegeben, der vorher mit Phenol gereinigt worden war und in einer 0,01 m Phosphatpufferlösung vom pH 8 gelöst ist, Das Gemisch wird 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die entstandene Fällung wird mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung vom PH 8 gewaschen und hierauf in einer wässrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert. Allergiewirkung Gegen Gras empfindlichen Patienten werden intradermal jeweils eine Suspension des wie vorstehend hergestellten, mit Nitroindandion modifizierten Extrakts, eine Suspension des nichtmodifizierten Extrakts, beide in Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst injiziert. Nach 10 Minuten werden die Plächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind in nachstehend ei Tabelle XV in mm2 angegeben.
• Tabelle XV

  Patient Bandgraspollen- Mit Nitroindandion Phenol-
  Nr. extrakt, 50yg/ml modifizierter Extrakt Kochsalz-
  1 mg/ml lösun
  1 3 0 0
  2 . 11 2 1
  3 8 2 0
  4 5 1 0
  esamt 27 5 1

  Immunisi erungswirkung Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren subcutan eine Emulsion injiziert, die den mit Nitroindandion modifizierten Extrakt im vollständigen Freund'schen Adjuvans enthält. Auf die gleiche Weise wird eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen mit dem nichtmodifizierten Ausgangsmaterial im gleichen Adjuvans immunisiert. Nach 4 Wochen werden beide Gruppen von Tieren an den Flanken kahlgeschoren. In die kahlen Stellen werden jeweils 0,1 ml einer Verdünnungsreihe des Ausgangsmaterials und schliesslich 0,1 ml 1 n-Kochsalzlösung intradermal injiziert. Unmittelbar darauf werden intravenös 0,4 ml seiner 5 prozentigen Lösung von Pontamin-Himmelblau injiziert. Nach 20 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind nachstehend in Tabelle XVI angegeben.
• Tabelle XVI

  Meer- Immunisierender Quaddeldurchmesser (mm) bei verschie-

  schwein- Stoff denen Konzentrationen von intradermal

  chen Nr. injiziertem Bandgraspollenextrakt

  100 10 1 0,1 0,01 0,001

  µg µg µg µg µg µg

  1 Bandgraspollen- 13 13 9 9 - -

  2 extrakt 13 13 5 4 3 -

  3 (0,5 mg) 12 11 10 9 7 -

  4 12 11 9 9 8 -

  1 Mit Nitroindan- 10 - - - - -

  2 dion modifi- 14 11 - - - -

  zierter Extrakt

  3 (0,5 mg) 14 11 - - - -

  4 9 - - - - -

  Beispiel 9 Modifizierung von Pollenextrakt mit Glutaraldehyd und anschliessende Adsorption an Aluminiumhydroxid 1 ml einer Sprozentigen Glutaraldehydlösung wird zu 9 ml eines wässrigen Extrakts aus Timotheuspullen mit einer Konzentration von 1 mg/ml (PH 5,3) gegeben, Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. 6 ml einer 2prozentigen Aluminiumhydroxidlösung werden zugegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde gerührt.
• .Die Fällung wird abzentrifugiert und zweimal in einer 0,01 m P,hosphatpufferlösung vom PH 8 und hierauf dreimal in destilliertem Wasser gewaschen und schliesslich erneut in einer wässrigen Phenol-Kochsalzlösung suspendiert, so dass sich eine Pollenkonzentration von 1 mg/ml ergibt. Das Verfahren wird wiederholt, jedoch ohne Zugabe von Glutaraldehyd, und die erhaltene Suspension wird im Immunisierungsspezifitätsversuch als Vergleichssubstanz verwendet.
• Allergiewirkung Gegen Gras empfindlichen allergischen Patienten wird jeweils eine Suspension des vorstehend beschriebenen Stoffes, eine Lösung des nichtmodifizierten Pollenextrakts, beide in einer wässrigen Phenol-Kochsalzlösung, und die Phenol-Kochsalzlösung selbst, intradermal injiziert. Nach 10 Minuten werden die Flächen der entstandenen Quaddeln gemessen. Sie sind nachstehend in Tabelle XVII in m2 angegeben, Tabelle XVII

  Patient Wässriger Mit Glutaraldehyd Nichtmodifi- Phenol-

  Nr, Timotjieus- modifizierter, an zierter an Koch-

  pollen- Aluminiumhydroxyd Aluminiumhy- salz-

  extrakt adsorbierter droxid adsor- lösung

  50µg/ml imotheuspollenex- bierter Thimo-

  trakt, lmgXml theuspollenex-

  '1 17 2

  2 2 o 3 o

  3 6 o

  Gesamt 25 2 12 O

  Immunisierungsspezifität Eine Gruppe von Meerschweinchen wird immunisiert, indem man den Tieren subcutan den mit Glutaraldehyd modifizierten, an Aluminiumhydroxid adsorbierten Extrakt injiziert. Eine ähnliche Gruppe von Meerschweinchen wird mit nichtmodifiziertem, an Aluminiumhydroxid adsorbiertem Timotheuspollenextrakt mit einer Pollenkonzentration von 1 mg/ml immunisiert. Nach 21 Tagen wird die Injektion wiederholt, und 10 Tage darauf treten bei den Tieren Blutungen auf.
• Mit den Seren wird der passive cutane Anaphylaxie-Test durchgeführt, indem man einer Gruppe von Meerschweinchen Reihenverdünnungen in die kahlgeschorenen Flanken intradermal injiziert.
• 5 Stunden später wird den Tieren als Reiz der nichtmodifizierte Timotheuspollenextrakt zusammen mit jeweils 0,4 ml einer Lösung von Pontamin-Himmelblau intravenös injiziert. Die Ergebnisse bei verschiedenen Antigenkonzentrationen sind in Tabelle XVIII für das modifizierte Material bzw. in Tabelle XIX für die, Der gleichssubstanz ohne Clutaraldehyd angegeben.
• Tabelle XVIII

  Meer- Gefriergetrockneter, Quaddeldurchmesser (mm) bei

  schwein- wässriger modifizier- verschiedenen Serunkonzentra-

  chen-Nr. ter Timötheuspollen- tionen

  extrakt 1/5 1 1 1 1 Koch-

  25 125 625 3125 salzlö-

  sung

  1 1 mg/ml 22 20 16 10 - -

  2 100 µg/ml 20 17 13 - - -

  3 10 µg/ml 20 18 - - - -

  4 5 µg/ml 14 - - - - -

  Tabelle XIX

  Meer- Gefriergetrockneter, Quaddeldurchmesser (mm) bei

  schwein- wässriger Timotheus- verschiedenen Serunkonzentra-

  chen-Nr. pollenextrakt tionen

  1/5 1 1 1 1 Koch-

  25 125 625 3125 salzlö-

  sung

  5 1 mg/ml 25 16 - - - -

  6 100 µg/ml 20 18 16 - - -

  7 10 Mg/ml - - - - - -

  8 5 µg/ml - - - - - -

Claims (1)

1. P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Desensibilisierungsmittel gegen Allergien aus einem allergenen Protein oder Glykoprotein, das intermolekular und/oder intramolekular mit einem Polyaldehyd, Polyketon, Carbodiimid, Epihalogenhydrin oder einem anorganischen Cyanat umgesetzt ist.

   2. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es als Allergen eine Protein- oder Glycoproteinfraktion aus einem wässrigen Extrakt eines oder mehrerer Graspollen entbält.

   5. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem Dialdehyd, vorzugsweise Glutaraldehyd oder Phenylglyoxal umgesetzt worden ist, 4, Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 und 2', dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem ein Diketon, vorzugsweise 2-Nitroindan-l,3-dion ungesetzt worden ist.

   5. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mit 1-Cyclohexyl-3-(morpholinoäthyl) carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat umgesetzt worden ist, .

   6. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch ge-.Xennzeichnet, dass es mit Epichlorhydrin oder Epibromhydrin umgesetzt worden ist.

   .7. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Kaliumcyanat umgesetzt worden ist, 8, Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich einen parenteral verträglichen Träger enthält.

   9. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als Träger eine isotonische Salzlösung, eine Pufferlösung oder ein Öl enthält.

   10. Desensibilisierungsmittel nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich ein Adjuvans, vorzugsweise Tyrosin, Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, enthält 11. Verfahren zur Herstellung des Desensibilisierungsmittels nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein allergenes Protein oder Glykoprotein in wässriger Lösung mit einem Polyaldehyd, Polyketon, Carbodiimic, Epihalogenhydrin, oder einem anorganischen Cyanat umsetzt, mit der Massgabe, dass die Umsetzung in einem sauren Medium durchgeführt wird, wenn ein anorganisches Cyanat verwendet wird.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit einem Polyaldehyd bei einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa 5, durchgeführt wird.

   13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit einem Carbodiimid bei einem px-Wert von etwa 5 und die Umsetzung mit einem Epihalogenhydrin bei einem pH-Wert von etwa 8 durchgefuhrt wird.

   14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit einem anorganischen Cyanat bei einem pH-Wert von etwa 5 durchgeführt wird,