ITMI20081565A1 - Allergoidi derivati da allergeni - Google Patents
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ALLERGOIDI DERIVATI DA ALLERGENI
Descrizione
La presente invenzione riguarda la preparazione di allergoidi derivati da allergeni mediante funzionalizzazione chimica, al fine di ridurre il rischio di indurre effetti collaterali quando impiegati come vaccini anti-allergici nella immunoterapia delle malattie allergiche.
Le malattie allergiche sono causate da una anomalia del sistema immunitario e sono determinate dalla produzione di particolari anticorpi della classe IgE, specifici nei confronti di sostanze ubiquitarie (denominate con il termine allergeni) di per sé del tutto innocue come principalmente pollini, acari, i derivati epiteliali, il veleno di imenotteri, spore fungine e diversi alimenti. Tali anticorpi IgE sono in grado di legarsi ad un recettore specifico presente sulla membrana, per esempio sulla membrana dei mastociti delle mucose ovvero dei basofili e, reagendo successivamente con gli allergeni verso cui sono rivolti, sono in grado di indurre il rilascio da parte delle suddette cellule di mediatori (tra cui l’istamina) che sono poi i veri sostenitori della reazione allergica. I sintomi allergici vanno dalla rinite-congiuntivite, all’orticaria all’asma fino ad arrivare allo shock anafilattico, evento quest’ultimo che può essere fatale.
Stime recenti indicano che più del 20% della popolazione che vive nei paesi industrializzati à ̈ affetta da questo tipo di patologia che, persistendo nel tempo, può determinare, se non opportunamente curata, un peggioramento dei sintomi (per esempio, comparsa di asma dopo la rinite) e del livello di sensibilizzazione che può estendersi anche ad altri allergeni, che incide ancor più pesantemente sulla qualità della vita dei soggetti che ne sono affetti e rende più complicata la individuazione del rimedio terapeutico più idoneo da usare nella cura degli stessi.
L’immunoterapia specifica iposensibilizzante (ITS), a differenza della terapia farmacologica che si limita a intervenire sul sintomo il quale poi riappare nel momento in cui cessa l’effetto del farmaco, à ̈ l’unica forma di trattamento eziologico delle patologie allergiche in grado di incidere positivamente sulle cause che determinano la cosiddetta “marcia allergica†attraverso l’attivazione di alcuni meccanismi immunologici che sono alla base del beneficio clinico indotto dalla ITS (Clin Exp Allergy. 2008;38:1074-88. Update on mechanisms of allergen injection immunotherapy. James LK, Durham SR.; Allergy. 2006;61 Suppl 81:11-4.Immunological mechanisms of sublingual immunotherapy.Akdis CA, Barlan IB, Bahceciler N, Akdis M.).
L’ITS consiste nella somministrazione a dosi crescenti di estratti standardizzati (vaccini), ottenuti a partire dalla stessa sostanza causa della malattia.
In questo modo nei confronti di tale sostanza si induce progressivamente nel paziente una sorta di “tolleranza immunologica†mediata da anticorpi IgG allergene-specifici, detti anche “anticorpi bloccanti†, che impedendo per fenomeno di competizione agli anticorpi IgE di reagire con l’allergene verso cui sono rivolti, inibiscono lo scatenamento della reazione allergica e conseguentemente inibiscono la comparsa dei sintomi.
I vaccini usati per l’ITS sono costituiti da una miscela piuttosto complessa di componenti proteiche ovvero glicoproteiche verso cui sono poi rivolti gli anticorpi IgE specifici che un soggetto allergico produce.
Seppure l’efficacia terapeutica dell’ITS sia stata dimostrata in numerosi studi clinici, essa non à ̈ priva di rischi legati alle reazioni indesiderate anche gravi (Immunopharmacol Immunotoxicol.
2008;30:153-61. Local and systemic reactions occurring during immunotherapy: an epidemiological evaluation and a prospective safety-monitoring study.Ventura MT, Giuliano G, Buquicchio R, Accettura F, Carbonara M.; Immunol Allergy Clin North Am.
2007;27:295-307 Anaphylactic reactions during immunotherapy.Rezvani M, Bernstein DI; Allergy.
2008;63:374. Anaphylactic shock because of sublingual immunotherapy overdose during third year of maintenance dose.Blazowski L.),
che possono verificarsi in seguito alla somministrazione del vaccino. Tali reazioni possono variare da reazioni locali circoscritte (pomfi, rossore, prurito, etc.) a reazioni sistemiche (riacutizzazione dei sintomi, asma fino allo shock anafilattico); per quanto tale rischio si sia notevolmente ridotto con l’impiego di vaccini a lento rilascio (vaccini ritardo) o somministrati per vie alternative a quella iniettiva, esso comunque ha limitato l’impiego dell’ITS nella terapia delle malattie allergiche, attualmente praticata su una percentuale esigua rispetto alla totalità dei pazienti allergici identificati a seguito di una opportuna indagine diagnostica.
Anche le allergie alimentari sono in forte crescita. Recentemente, a differenza di quanto sostenuto fino a pochi anni fa secondo cui l’unica terapia per queste forme di allergia sembrava essere rappresentata dalla eliminazione dalla dieta dell’alimento sospetto, sta sempre più affermandosi nel mondo allergologico l’idea che anche per le forme di allergia alimentare sia opportuna l’opzione di un approccio ITS specifica. E’ evidente però che l’impiego di allergeni nativi per la terapia delle forme di allergia alimentare presenterebbe gli stessi limiti (rischio di effetti indesiderati) incontrati nella ITS delle forme di allergia respiratoria. Anzi tali rischi potrebbero addirittura essere accentuati visto che spesso queste forme di allergia coinvolgono soggetti di pochi mesi o anni di vita.
Negli ultimi anni molta attenzione si à ̈ concentrata sullo sviluppo di vaccini più efficaci e con un maggior grado di sicurezza. In particolare l’individuazione di procedure di modifica chimica più o meno selettive ma comunque mirate a ridurre il potenziale allergenico dei vaccini preservandone il più possibile il loro potenziale immunogenico inteso come capacità di indurre la formazione di anticorpi IgG in grado di riconoscere, quando somministrati al soggetto, anche le componenti non modificate (native) che sono quelle a cui à ̈ poi esposto il soggetto allergico e che determinano lo sviluppo dei sintomi specifici, ha portato allo sviluppo dei cosiddetti allergoidi (J Allergy Clin Immunol. 1985;76:397-401. Modified forms of allergen immunotherapy.Grammer LC, Shaughnessy MA, Patterson R.; Int Arc hAllergy Appl Immunol.1971;41:199-215. Preparation and properties of ,allergoids, derived from native pollen allergens by mild formalin treatment.Marsh DG).
Lo sviluppo di allergeni anche di origine alimentare in forma di allergoide ed il loro impiego nella immunoterapia delle allergie alimentari specifiche potrebbe davvero risultare determinante nel fornire al soggetto allergico una sorta di tolleranza immunologica, evitando così allo stesso l’insorgenza di quelle reazioni che potrebbero mettere in pericolo la sua vita in seguito alla ingestione inconsapevole anche di minime quantità dell’allergene verso cui si à ̈ sensibilizzato.
Il livello di riduzione del potenziale allergenico di un estratto indotto dalla modifica chimica può essere diverso a seconda del tipo di reagente usato per la modifica e/o del tipo di estratto. Utilizzando il cianato di potassio come reagente “modificante†si ottengono dei derivati cosiddetti carbamilati caratterizzati da una ridotta allergenicità e da una preservata immunogenicità (Allergy. 1996;51:8-15. Monomeric chemically modified allergens: immunologic and physicochemical characterization.Mistrello G, Brenna O, Roncarolo D, Zanoni D, Gentili M, Falagiani P.).
E’ da notare però che, essendo gli estratti sottoposti a modifica chimica con cianato di potassio delle miscele proteiche molto eterogenee, il grado di modifica determinato mediante il dosaggio degli amino gruppi à ̈ strettamente legato al tipo di proteina presente e quindi il dato che si ottiene esprime un valore medio di grado di modificazione. Può infatti succedere che alcune proteine allergeniche non subiscano in maniera significativa l’effetto della modifica con cianato di potassio e quindi conservino buona parte della loro attività allergenica. A livello di estratto modificato l’eventuale preservazione dell’attività allergenica da parte di una componente dell’estratto potrebbe non essere evidenziata. Da diversi anni però sono state sviluppate tecniche diverse per purificare i singoli allergeni. Estendendo quindi la procedura di modifica chimica a livello di singole componenti à ̈ oggi possibile mettere in evidenza il grado di sostituzione che si può raggiungere con cianato di potassio. Nel caso per esempio dell’allergene Der p1, uno degli allergeni maggiori dell’acaro della specie Dermatophagoides pteronyssinus, presente nella polvere di casa, il grado di modifica determinato mediante reazione con acido 2,4,6 trinitrobenzensulfonico (TNBS) non supera il 50% a fronte di un grado di modifica dell’estratto intorno all’80%.
Uno scopo della presente invenzione à ̈ mettere a disposizione una preparazione per la immunoterapia specifica (ITS) che sia dotata di una più elevata tollerabilità ed in particolare minimizzi ulteriormente il rischio di possibili effetti indesiderati evidenziati dagli allergoidi dello stato dell’arte, senza per questo diminuire l’effetto desensibilizzante proprio della terapia allergenica tradizionale.
Tale scopo viene raggiunto per mezzo di allergoidi in cui l’attività allergenica residua che permane dopo la modifica con cianato di potassio o altro reagente per reazione di carbamilazione o tiocarbamilazione viene ulteriormente ridotta grazie ad una seconda procedura di modifica chimica che prevede l’impiego di una dialdeide o dichetone, quale fenilgliossale od altri reagenti similari (gliossale, 2,3-butanedione, 1,2-cicloesanedione, paraidrossifenilgliossale, etc.). Mentre il cianato di potassio, o altro reagente di carbamilazione o tiocarbamilazione, reagisce in maniera specifica con gli ε-aminogruppi dei residui lisinici, il fenilgliossale ha come target specifico il gruppo guanidinico dei residui argininici delle proteine (Blazer AN. Specific chemical modification of proteins. Annu Rev Biochem. 1970;39:101-30). Il grado di modifica dei residui argininici à ̈ stato poi determinato come descritto da Shah e collab. (Shah MA, Tayyab S and Ali R. Probing Structure-activity relationship in diamine oxidase reactivities of lysine and arginine residues.Int. Journal of Biol. Macromolecules:18;77-81, 1996).
E’ stato visto che la modifica chimica di estratti allergenici o singole proteine effettuati mediante reazione con solo fenilgliossale induce una scarsa riduzione della loro attività allergenica. Analogamente, l’inversione della sequenza di modifica, fenilgliossale e successivamente cianato di potassio, non ha dato risultati incoraggianti sulla riduzione del potenziale allergenico.
Formano pertanto oggetto specifico della presente invenzione allergeni modificati aventi allergenicità ridotta rispetto al corrispondente materiale allergenico nativo e caratterizzati dal fatto che tutti o una parte dei gruppi amminici primari dei residui lisinici ed argininici delle molecole allergeniche sono funzionalizzati come mostrato in struttura (I), detti allergeni assumendo, dopo modifica rispettivamente con (i) reazione di carbamilazione o tiocarbamilazione e (ii) reazione con una dialdeide o dichetone, la seguente struttura (I):
n
OR
2
R O O
2
R R
N+ N
H N
prot NH
NH m
1
X R
(I)
in cui R e R<2>sono scelti indipendentemente tra H, C1-C5 alchile, fenile, eventualmente sostituito in orto, meta o para con un gruppo idrossi, C1-C4 alcossi, alogeno, ammino, alchilammino, dialchilammino, mercapto, C1-C4 alchilmercapto;
X rappresenta O, S o NR3, dove R3 Ã ̈ H, alchile con 1-6 atomi di carbonio, fenile o CN;
R1 rappresenta H, alchile con 1-8 atomi di carbonio, fenile o arilalchile con fino a 8 atomi di carbonio oppure alchile contenente un anello eterociclico;
prot rappresenta il residuo proteico dell’allergene; n à ̈ il numero di gruppi argininici funzionalizzati ed à ̈ compreso tra 1 ed il numero di gruppi argininici presenti nell’allergene;
m à ̈ il numero di gruppi lisinici funzionalizzati ed à ̈ compreso tra 1 ed il numero di gruppi lisinici presenti nell’allergene.
Allergeni modificati di formula (I) preferiti sono quelli in cui R Ã ̈ fenile, eventualmente sostituito in orto, meta o para con un gruppo idrossi, C1-C4 alcossi, alogeno, ammino, alchilammino, dialchilammino, mercapto, C1-C4 alchilmercapto, ed R2 Ã ̈ idrogeno.
Altri allergeni modificati preferiti sono quelli in cui X Ã ̈ O oppure S ed R1 Ã ̈ idrogeno e, preferibilmente, R ed R2 sono come definiti nel paragrafo precedente.
Allergeni modificati particolarmente preferiti sono quelli in cui R Ã ̈ fenile, R1 ed R2 sono idrogeno ed X Ã ̈ O oppure S.
A titolo d’esempio, lo schema 1 rappresenta la reazione della lisina con cianato di potassio:
Schema 1
Lo schema 2 seguente rappresenta un esempio della reazione di funzionalizzazione con fenilgliossale di un residuo argininico dell’allergoide:
Schema 2
Il materiale allergenico da sottoporre al procedimento secondo l’invenzione può essere ottenuto da fonti diverse quali acari, pollini, epiteli di animali, micofiti, proteine di origine alimentare (latte, uovo, cereali, pesca, mela, ecc.) mediante estrazione delle proteine allergeniche con opportuno solvente, di solito acquoso; tale materiale può essere altresì costituito da proteine purificate dalle materie prime ricordate sopra ovvero in forma ricombinante prodotte mediante tecniche convenzionali di biologia molecolare.
La funzionalizzazione per reazione di carbamilazione o tiocarbamilazione avviene per trattamento con cianato alcalino (KCNO o NaCNO) oppure con isocianati o tiocianati organici.
I derivati in cui X à ̈ NR3 si possono ottenere a partire dai composti in cui X à ̈ S per reazione di guanidilazione con un composto di formula R3-NH2, in accordo a procedure convenzionali e note all’esperto del settore, quale ad esempio l’uso del reagente di Mukaijama.
Per la modifica di un estratto con cianato di potassio (KCNO) à ̈ opportuno che la concentrazione finale del sale sia compresa tra 0.1 M e 1.5 M, preferibilmente tra 0.4 M e 0.8 M, mantenendo eventualmente il pH tra 7 e 11, preferibilmente tra 9 e 9.6; la temperatura può essere compresa tra quella ambiente e 50°C, preferibilmente tra 35 e 40°C per un tempo totale di reazione tra 12 e 36 ore, preferibilmente tra 16 e 24 ore. Nel caso di modifica con isocianati e isotiocianati organici, sostanze più reattive, la reazione dovrà essere effettuata a temperatura ambiente o inferiore, preferibilmente tra 0°C e 5°C, mentre il tempo di reazione potrà variare tra 30 minuti e 8 ore, preferibilmente tra 2 e 4 ore. A causa della loro scarsa solubilità in acqua, la reazione potrà essere condotta in presenza di un solvente organico compatibile.
Al termine della reazione, l’estratto così modificato viene sottoposto a gel-filtrazione per eliminare il reagente in eccesso e viene equilibrato con una soluzione salina opportuna.
Il grado di sostituzione dei gruppi -NH2 delle lisine presenti nelle molecole allergeniche che costituiscono l’estratto o delle singole molecole allergiche purificate o in forma ricombinante dopo modifica con cianato di potassio può essere determinato mediante un dosaggio con acido trinitrobenzensolfonico (Habeeb, Anal. Bioch. 14, 328, 1966) o analizzando la scomparsa dei residui lisinici e la comparsa di omocitrullina con opportune metodologie o analisi strumentali note all’esperto del settore.
Per la modifica con fenilgliossale (PGO), ai campioni modificati con KCNO alle condizioni descritte precedentemente viene aggiunta una quantità di bicarbonato di sodio 0.1 M in modo da portare il pH delle soluzioni a 8.0. La concentrazione proteica dei campioni à ̈ compresa tra 1 e 10 mg/ml (estratti)ovvero 0.1 e 2.5 mg/ml(proteine purificate) come determinata secondo Lowry (J. Biol. Chem,1970:193, 265-275. Protein measurement With Folin Phenol reagent. Lowry, Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J.). Successivamente viene aggiunto alle suddette soluzioni il PGO in modo da avere un eccesso molare dello stesso compreso tra 100 e 1600, preferibilmente tra 400 e 800. Per facilitare la dissoluzione del PGO, lo stesso à ̈ stato precedentemente sciolto in alcool etilico alla concentrazione di circa 50 mg/ml. Il tutto viene lasciato in blanda agitazione per un tempo variabile tra 30 minuti e 8 ore, preferibilmente 4 ore, a temperature comprese tra 20 e 37°C, preferibilmente 25°C. Quindi si procede alla dialisi o alla gel filtrazione contro tampone appropriato dell’estratto così trattato. La stessa procedura viene seguita utilizzando gli altri reagenti modificanti i residui argininici.
Analoga metodica verrà utilizzata per la funzionalizzazione con dialdeidi o dichetoni differenti.
Il grado di sostituzione dei residui argininici viene valutato secondo Shah. In base alla suddetta metodica il grado di sostituzione dei gruppi di arginina viene determinato considerando un coefficiente di estinzione molare di 11000 M<–1>cm<–1>, a 250 nm per il complesso difenil-arginina la cui formazione à ̈ la conseguenza della reazione con PGO.
In generale, la percentuale media di gruppi amminici primari modificati deve essere compresa tra il 75% ed il 100%, tipicamente intorno al 90%; mentre la percentuale media dei residui di arginina sostituiti deve essere compresa tra il 25 ed il 100%, tipicamente intorno al 40%.
Breve descrizione delle figure
Figura 1 mostra la valutazione dell’attività allergenica dell’estratto di DP nativo e dopo modifica con KCNO o KCNO/fenilgliossale;
Figura 2 mostra la reattività IgG nel siero di topi immunizzati con estratto di DP modificato con KCNO/fenilgliossale;
Figura 3 mostra il profilo proteico di estratto di DP nativo, modificato con KCNO o KCNO/fenilgliossale;
Figura 4 mostra la valutazione dell’attività allergenica del Der p1 nativo e dopo modifica con KCNO o KCNO/fenilgliossale;
Figura 5 mostra la reattività IgG nel siero di topi immunizzati con Der p1 modificato con KCNO/fenilgliossale;
Figura 6 mostra il profilo dell’allergene Der p1 nativo, modificato con KCNO o con KCNO/fenilgliossale;
Figura 7 mostra la valutazione dell’attività allergenica dell’Ovalbumina nativa e dopo modifica con KCNO o KCNO/fenilgliossale;
Figura 8 mostra la reattività IgG nel siero di topi immunizzati con Ovalbumina modificata con KCNO/fenilgliossale;
Figura 9 mostra il profilo di Ovalbumina nativa, modificata con KCNO o con KCNO/fenilgliossale;
Figura 10 mostra la valutazione dell’attività allergenica di Pru p3 ricombinante nativa e dopo modifica con KCNO o KCNO/fenilgliossale;
Figura 11 mostra la reattività IgG nel siero di topi immunizzati con Pru p3 ricombinante modificato con KCNO/fenilgliossale;
Figura 12 mostra il profilo dell’allergene ricombinante Pru p3 nativo o dopo modifica con KCNO o con KCNO/fenilgliossale.
PARTE SPERIMENTALE
In accordo con le metodiche descritte in precedenza, vengono preparati campioni di allergoide ottenuti dopo reazione con KCNO ovvero presentanti la doppia sostituzione KCNO/PGO.
Successivamente i campioni “doppiamente†modificati vengono confrontati con quelli modificati con KCNO ovvero nativi in termini di potenza allergenica mediante EAST-inibizione, dimensioni molecolari mediante SDS-PAGE e attività immunogenica mediante ELISA.
La presente invenzione verrà ora descritta più in dettaglio a titolo esemplificativo ma non limitativo, relativamente alla procedura di modifica con KCNO/PGO di alcuni allergeni sia sotto forma di estratto che di proteine singole purificate dall’estratto stesso o commerciali ovvero prodotte in forma ricombinante mediante tecniche di biologia molecolare. Come esempio di estratto allergenico per uso terapeutico à ̈ stato scelto l’ estratto di acari di DP in quanto, in virtù della loro ubiquitarietà , possono essere causa di allergia specifica in tutto il mondo. In questo senso l’estratto di DP può essere ritenuto rappresentativo della categoria. La procedura di modifica chimica à ̈ stata però estesa anche a proteine singole purificate quali l’allergene noto come Der p1 (uno degli allergeni maggiori dell’estratto di DP ottenuto mediante opportuno processo di purificazione dall’estratto stesso), la cui attività allergenica à ̈ per buona parte preservata anche dopo la modifica con KCNO, ed a proteine purificate di origine alimentare, causa anch’esse di allergie specifiche che possono risultare purtroppo fatali al soggetto che ne à ̈ affetto.
Sono stati quindi presi in considerazione per i nostri esperimenti anche due allergeni di origine alimentare: l’ovalbumina (OVA), una proteina commerciale purificata dall’albume di uovo, quest’ultimo spesso causa di un allergia specifica nei bambini; l’allergene noto come LTP (lipid transfer protein, Pru p3), che costituisce l’allergene maggiore dell’estratto di pesca (ma à ̈ presente in molti altri alimenti vegetali) ed à ̈ anch’esso responsabile di reazioni allergiche anche gravi. Quest’ultimo allergene à ̈ stato ottenuto in forma ricombinante mediante l’applicazione di tecniche di biologia molecolare. Ciascun esempio à ̈ accompagnato dalle relative prove sperimentali.
ESEMPIO 1
Procedura di modifica chimica di un estratto di acari del genere Dermatophagoides pteronissinus mediante KCNO, ovvero una combinazione in sequenza KCNO/PGO.
L’estratto di acari del genere Dermatophagoides pteronissinus (Greer Labs, Lenoir, NC, USA) à ̈ stato preparato, previo sgrassamento con etere etilico, unendo a 5 gr di corpi di acari disidratati 100 ml di PBS (tampone fosfato 0.015 M, NaCl 0.135 M a pH 7.2) contenente 0.05% azide (PBS-A) e sottoponendo poi il tutto ad un trattamento con ultrasuoni per 1 minuto (Branson Ultrasonics, Sonifier 450, Darbury CT,USA) al fine di rompere l’esoscheletro degli acari e favorire l’estrazione delle proteine allergeniche in essi contenute. Al termine la preparazione à ̈ stata posta in agitazione a 4 °C per una notte. Dopo centrifugazione a 14000 rpm per 30 min ed eliminazione del pellet insolubile, il supernatante à ̈ stato dializzato contro H20 distillata e liofilizzato.
L’estratto liofilo viene poi ripreso in un volume di tampone sodio fosfato 20 mM, pH 6,86 in modo da avere una concentrazione proteica di 2.5 mg/ml secondo Lowry. Tale estratto à ̈ stato successivamente gel-filtrato su Sephadex<TM>G-25 (GE Healthcare Uppsala, Sweden), eluendo con lo stesso tampone e raccogliendo il picco escluso. Questa operazione viene fatta per eliminare i composti a basso peso molecolare che potrebbero interferire nella successiva procedura di modifica chimica. A 50 ml di tale soluzione si sono aggiunti 1,92 g di sodio tetraborato decaidrato e 2,05 g di potassio cianato. I sali sono stati portati in soluzione mediante lenta agitazione ed il pH eventualmente corretto a 9,3 con NaOH 1 M. La soluzione risultante à ̈ stata tenuta in lenta agitazione per 16 ore in bagno termostatato a 40°C in beuta chiusa. Nelle prime ore il pH à ̈ stato monitorato ed eventualmente corretto mediante aggiunta di acido fosforico 1 M. Il preparato così ottenuto à ̈ stato di nuovo gel-filtrato su colonna G-25 per eliminare l'eccesso di reattivo e sterilizzato su membrana Millipore 0,22 micron. Una minima parte dello stesso à ̈ stato utilizzato per le successive analisi. La percentuale di sostituzione dei gruppi amminici dell’estratto, valutata con il test del TNBS, à ̈ risultata del 76%. Il resto dell’estratto modificato con KCNO à ̈ stato sottoposto ad una seconda procedura di modifica chimica con PGO alle condizioni sperimentali sotto descritte.
L’estratto di DP modificato con KCNO ovvero l’estratto di DP prima della modifica alla concentrazione proteica di 2.0 mg/ml (Lowry), viene portato a pH 8 con aggiunta di bicarbonato di sodio 0.1 M. Successivamente al campione modificato con KCNO viene aggiunto il PGO in un eccesso molare di 800 rispetto alle proteine. Per calcolare l’eccesso molare, trattandosi di un estratto e non di una singola proteina, sono state scaricate dalla banca dati UniProtKB tutte le sequenze note di allergeni dell’estratto di DP. Considerando la massa molecolare di ciascun allergene noto, il numero di residui di arginina in base alla sequenza aminoacidica dichiarata e la relativa quantità dei vari allergeni in base all’intensità delle bande visibili dopo SDS-PAGE dell’estratto di DP, si à ̈ arbitrariamente stabilito di considerare per l’estratto di DP un peso molecolare medio di 40 kDa e un numero medio di residui di arginina di 15. Per facilitare la dissoluzione del PGO, lo stesso à ̈ stato precedentemente sciolto in alcool etilico alla concentrazione di 0.3 M. Il tutto viene lasciato in blanda agitazione per 4 ore a 25°C. Quindi si procede alla dialisi o alla gel filtrazione contro PBS 20 mM. Il grado di sostituzione dei residui di arginina nel campione in esame risulta essere del 37%. Successivamente, ove possibile, il campione di DP modificato con KCNO/PGO à ̈ stato confrontato con quello modificato con KCNO ovvero nativo in termini di potenza allergenica mediante EAST-inibizione, di capacità immunogenica mediante ELISA e di dimensioni molecolari mediante SDS-PAGE.
Valutazione allergenicità mediante EAST-inibizione A questo scopo, sfere di polistirene, previamente trattate con glutaraldeide, sono state attivate con estratto di DP in ragione di 1 µg di proteina per sfera.
Parallelamente viene preparato un pool di sieri umani, selezionati tra i pazienti allergici all’estratto di DP con storia clinica di allergia agli acari.
Nei pozzetti di una piastra ELISA vengono aggiunti 30 µl di diluizioni seriali in PBS-2% BSA (diluente) dei campioni in esame (estratto di DP nativo, estratto di DP modificato con KCNO, estratto di DP modificato con KCNO/PGO), previamente portati alla stessa concentrazione, e 20 µl del pool di sieri; il tutto viene lasciato in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Parallelamente viene allestito un campione di controllo positivo in cui l’inibitore à ̈ costituito da diluente. Al termine delle due ore si aggiunge in ogni pozzetto una sfera attivata con DP e 50 µl di PBS-2% BSA e si mantiene la piastra in agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente. Le sfere sono quindi lavate e ad ogni pozzetto vengono aggiunti 100 µl di una soluzione di anticorpo anti IgE umane coniugate a perossidasi ed incubate in agitazione per 2 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 50 µl di HCl 1N, quindi 100 µl di miscela da ogni pozzetto vengono trasferiti in una nuova piastra e l’intensità del colore sviluppato à ̈ valutata mediante lettura spettrofotometrica a 450 nm.
Le densità ottiche rilevate vengono trasformate in percentuali di inibizione rispetto al controllo positivo e viene costruito un grafico in cui sono riportati sull’asse Y la percentuale di inibizione e sull’asse X il logaritmo del volume di campione utilizzato nel test. Dai punti riportati si costruisce una retta di regressione lineare sulla quale si misura il valore IC50, che rappresenta il volume in microlitri di campione necessario ad inibire il 50% del legame delle IgE alla sfera. Tale valore à ̈ inversamente proporzionale alla potenza allergenica del campione in esame.
I risultati, mostrati in figura 1, dimostrano che la modifica con KCNO riduce l’attività allergenica di 18 volte mentre la modifica combinata KCNO/PGO ha un effetto sinergico, riducendo l’attività allergenica dell’estratto di DP di 227 volte. E’ assai probabile che tale ulteriore riduzione dell’attività allergenica dell’estratto di DP dopo modifica con KCNO/PGO sia riconducibile all’effetto della doppia modifica sull’allergene Der p1 (vedi Esempio 2).
Valutazione immunogenicità dell’estratto di DP modificato con KCNO/PGO mediante ELISA del siero di topi previamente immunizzati.
a)Protocollo di immunizzazione dei topi
Un gruppo di topi costituito da quattro esemplari femmina di ceppo Balb/c (Charles River) sono stati immunizzati, per via sottocutanea, con 200 Î1⁄4l di un’emulsione composta da 100 Î1⁄4l di adiuvante completo di Freund e 20 Î1⁄4g di estratto di DP modificato con KCNO/PGO in 100 Î1⁄4l di soluzione fisiologica. Altri tre richiami sono stati effettuati ad intervalli di due settimane sostituendo l’adiuvante completo con quello incompleto. Sette giorni dopo l’ultima immunizzazione viene effettuato un prelievo di sangue dalla coda dei topi ed il campione viene controllato mediante ELISA per quanto riguarda la risposta anticorpale nei confronti dell’immunogeno così come la capacità di riconoscere la proteina nativa.
b) Procedura del test
Il test viene effettuato per verificare se l’estratto di DP modificato con KCNO/PGO mantiene un potenziale immunogenico inteso come capacità di indurre nel topo, quando somministrato secondo il protocollo indicato più avanti, una risposta IgG che à ̈ rivolta anche nei confronti dell’estratto di DP nativo, non modificato. A tale scopo eguali quantità (0,25 µg) di estratto di DP nativo o modificato con KCNO/PGO, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (25% siero di cavallo, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, thiomersal 0,01% in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Eguali aliquote (100 µl) di diluizioni seriali in base 10 del pool di sieri di topo in tampone diluente, sono aggiunte a ogni pozzetto e fatte incubare a 25 °C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero di coniglio anti-IgG di topo coniugato a perossidasi alla diluizione 1:2000 in tampone diluente, il tutto à ̈ incubato a 25 °C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. In Figura 2 sono mostrati i risultati sulla reattività IgG specifica del pool di sieri dei topi immunizzati con l’estratto di DP modificato con KCNO/PGO nei confronti delle proteine sia dell’estratto usato per immunizzare che della controparte non modificata (nativa). Come si può osservare gli anticorpi IgG indotti dal trattamento con estratto di DP modificato con KCNO/PGO sono in grado di riconoscere anche le proteine native di DP (seppure ad un livello inferiore rispetto a quello verso le proteine modificate), a dimostrazione del fatto che nell’estratto di DP modificato con KCNO/PGO sono conservati epitopi T analoghi a quelli presenti nell’estratto DP nativo. L’estratto modificato con KCNO/PGO mantiene quindi la capacità di stimolare in maniera opportuna il sistema immunitario affinché produca anticorpi IgG specifici diretti anche verso le proteine dell’estratto di DP nativo.
Questa osservazione, se trasferita all’uomo, à ̈ importante perché significa che l’estratto di DP modificato con KCNO/PGO, a fronte di un’ulteriore riduzione dell’attività allergenica, rimane potenzialmente in grado di indurre una risposta IgG anche nei confronti delle proteine di DP native ed à ̈ quindi potenzialmente capace di indurre un beneficio clinico visto che la produzione di anticorpi IgG specifici à ̈ un elemento importante nell’espressione dell’efficacia terapeutica dell’ITS (Int Arch Allergy Immunol. 2003;132:13-24. Renaissance of the blocking antibody concept in type I allergy., Flicker S, Valenta R).
Elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE)
L’elettroforesi à ̈ stata eseguita utilizzando dei gel in gradiente 4-12% di acrilamide, preconfezionati ed utilizzati secondo le indicazioni del produttore (NuPAGE<®>Novex<®>mini gels, Invitrogen, Milano). Questo sistema di elettroforesi discontinua a pH neutro, permette una migliore risoluzione delle bande nell’intervallo di pesi molecolari di nostro interesse.
I campioni di estratto di DP nativo o modificato con KCNO o KCNO/PGO sono stati valutati mediante la suddetta tecnica, in condizioni riducenti (presenza di 2-mercaptoetanolo al 5%) caricando nel gel la stessa quantità di campione (20 Î1⁄4g). La separazione à ̈ fatta avvenire collegando l’apparecchio all’alimentatore Microcomputer Electrophoresis Power Supply 400/1000 e applicando una corrente di 180 mA costanti per circa un’ora. Al termine il gel viene colorato con Coomassie colloidale (Colloidal Blue staining kit, Novex<®>, Invitrogen). I risultati osservabili in figura 3 evidenziano la presenza di numerose bande sia nel campione di DP nativo che in quello modificato con KCNO ovvero KCNO/PGO. I profili SDS-PAGE sembrano sostanzialmente simili anche se in effetti à ̈ difficile valutare, in un campione così complesso, un eventuale aumento di dimensioni molecolari indotto dalla reazione con KCNO/PGO. Negli esempi successivi, effettuati su singole proteine, risulta però evidente che la modifica con KCNO/PGO non comporta aumenti significativi delle dimensioni molecolari delle proteine in studio.
ESEMPIO 2
Procedura di modifica chimica dell’allergene maggiore Der p1 purificato con KCNO ovvero mediante una combinazione KCNO /PGO.
a) Fase di purificazione dell’allergene Der p1 dall’estratto di DP
L’allergene Der p1 à ̈ stato purificato dall’estratto di DP mediante una cromatografia d’affinità , utilizzando un anticorpo monoclonale specifico (isotipo IgG1, prodotto presso i laboratori Lofarma) legato in maniera covalente ad una matrice opportuna quale il CNBr-Sepharose (GE Helthcare, Milano), secondo la procedura raccomandata dalla casa produttrice. L’allergene Der p1, trattenuto in colonna, à ̈ eluito dalla stessa utilizzando un tampone 5 mM glicina, 50% etilenglicole, pH 10.0. L’allergene purificato à ̈ stato quantificato mediante lettura spettrofotometrica a 280 nm, considerando il suo coefficiente di estinzione molare (E280) pari a 47330, da cui un valore di assorbenza, ad una concentrazione di 1 mg/ml, pari a 1.89. Infine il Der p1 à ̈ stato liofilizzato in presenza di saccarosio all’1%.
Il campione di Der p1 liofilo viene poi ripreso in un volume di tampone sodio fosfato 20 mM, pH 6,86 in modo da avere una concentrazione proteica di 0.2 mg/ml. Per la modifica con KCNO a 2.5 ml di soluzione di Der p1 si sono aggiunti 50.25 mg di sodio tetraborato anidro e 101.4 mg di potassio cianato. I sali sono stati portati in soluzione mediante lenta agitazione ed il pH eventualmente corretto a 9,3 con NaOH 1 M. La soluzione risultante à ̈ stata tenuta in lenta agitazione per 16 ore in bagno termostatato a 40°C in beuta chiusa. Nelle prime ore il pH à ̈ stato monitorato ed eventualmente corretto mediante aggiunta di acido fosforico 1 M. Il preparato così ottenuto à ̈ stato di nuovo gel-filtrato su colonna G-25 per eliminare l'eccesso di reattivo e sterilizzato su membrana Millipore 0,22 micron. Una minima parte dello stesso à ̈ stata utilizzata per le successive analisi. La percentuale di sostituzione dei gruppi amminici dell’estratto, valutata con il test del TNBS, à ̈ risultata del 50%. Il resto del campione modificato con KCNO à ̈ stato sottoposto ad una seconda procedura di modifica chimica con fenilgliossale alle condizioni sperimentali sotto descritte.
Il campione di Der p1 modificato con KCNO alla concentrazione proteica di 0.14 mg/ml (Abs 280 nm), viene portato a pH 8 con aggiunta di bicarbonato di sodio 0.1 M. Successivamente ad esso viene aggiunto il PGO in un eccesso molare di 800 rispetto alla proteina. Per calcolare l’eccesso molare, abbiamo considerato per l’allergene Der p1 una dimensione molecolare di 25 KD secondo la banca dati UniProtKB da cui risultano 15 residui di arginina. Per facilitare la dissoluzione del PGO lo stesso à ̈ stato precedentemente sciolto in alcool etilico alla concentrazione di 0.15 M. Il tutto viene lasciato in blanda agitazione per 4 ore a 25°C. Quindi si procede alla dialisi o alla gel filtrazione contro PBS 20 mM. Il grado di sostituzione dei residui di arginina risulta essere di 41%. Successivamente, ove possibile, il campione di Der p1 modificato con KCNO/PGO, à ̈ stato confrontato con quello modificato con KCNO ovvero con PGO ovvero nativo in termini di potenza allergenica mediante EAST-inibizione, di capacità immunogenica mediante ELISA e di dimensioni molecolari mediante SDS-PAGE.
Valutazione allergenicità mediante EAST-inibizione A questo scopo, sfere di polistirene, previamente trattate con glutaraldeide, sono state attivate con il Der p1 in ragione di 1 µg di proteina per sfera.
Parallelamente viene preparato un pool di sieri umani, selezionati tra i pazienti allergici all’estratto di DP con storia clinica di allergia agli acari.
Nei pozzetti di una piastra ELISA vengono aggiunti 30 µl di diluizioni seriali in PBS-2% BSA (diluente) dei campioni in esame (Der p1 nativo, Der P1 modificato con KCNO, Der p1 modificato con KCNO/PGO), previamente portati alla stessa concentrazione, e 20 µl del pool di sieri; il tutto viene lasciato in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Parallelamente viene allestito un campione di controllo positivo in cui l’inibitore à ̈ costituito da diluente. Al termine delle due ore si aggiunge in ogni pozzetto una sfera attivata con Der p1 e 50 µl di PBS-2% BSA e si mantiene la piastra in agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente. Le sfere sono quindi lavate e ad ogni pozzetto vengono aggiunti 100 µl di una soluzione di anticorpo anti IgE umane coniugate a perossidasi ed incubate in agitazione per 2 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 50 µl di HCl 1 N, quindi 100 µl di miscela da ogni pozzetto vengono trasferiti in una nuova piastra e l’intensità del colore sviluppato à ̈ valutata mediante lettura spettrofotometrica a 450 nm.
Le densità ottiche rilevate vengono trasformate in percentuali di inibizione rispetto al controllo positivo e viene costruito un grafico in cui sono riportati sull’asse Y la percentuale di inibizione e sull’asse X il logaritmo del volume di campione utilizzato nel test. Dai punti riportati si costruisce una retta di regressione lineare sulla quale si misura il valore IC50, che rappresenta il volume in microlitri di campione necessario ad inibire il 50% del legame delle IgE alla sfera. Tale valore à ̈ inversamente proporzionale alla potenza allergenica del campione in esame.
I risultati, mostrati in figura 4, dimostrano che la modifica con KCNO riduce l’attività allergenica del Der p1 di 16 volte mentre la modifica con KCNO/PGO mostra un effetto sinergico, riducendo l’attività allergenica dello stesso di 303 volte.
Valutazione immunogenicità del Der p1 modificato con KCNO/PGO mediante ELISA del siero di topi previamente immunizzati
a)Protocollo di immunizzazione dei topi
Un gruppo di topi costituito da quattro esemplari femmina di ceppo Balb/c (Charles River) sono immunizzati, per via sottocutanea, con 200 Î1⁄4l di un’emulsione composta da 100 Î1⁄4l di adiuvante completo di Freund e 20 Î1⁄4g di Der p1 modificato con KCNO/PGO in 100 Î1⁄4l di soluzione fisiologica. Altri tre richiami sono effettuati ad intervalli di due settimane sostituendo l’adiuvante completo con quello incompleto. Sette giorni dopo l’ultima immunizzazione viene effettuato un prelievo di sangue e viene controllata mediante ELISA la risposta anticorpale IgG specifica nei confronti dell’immunogeno così come la capacità di riconoscere la proteina nativa.
b) Procedura del test
Il test viene effettuato per verificare se il Der p1 modificato con KCNO/PGO mantiene un potenziale immunogenico inteso come capacità di indurre nel topo, quando somministrato secondo il protocollo indicato più avanti, una risposta IgG che à ̈ rivolta anche nei confronti dell’estratto del Der p1 nativo, non modificato. A tale scopo eguali quantità (0,1 µg) di Der p1 nativo o modificato con KCNO/PGO, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (25% siero di cavallo, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, thiomersal 0,01% in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Eguali aliquote (100 µl) di diluizioni seriali in base 10 del pool di sieri di topo in tampone diluente sono aggiunte a ogni pozzetto e fatte incubare a 25 °C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero di coniglio anti-IgG di topo coniugato a perossidasi alla diluizione 1:2000 in tampone diluente, il tutto à ̈ incubato a 25 °C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. In figura 5 sono mostrati i risultati sulla reattività IgG specifica del pool di sieri dei topi immunizzati con Der p1 modificato con KCNO/PGO nei confronti sia dell’allergene usato per immunizzare che della controparte non modificata (nativa). Come si può osservare gli anticorpi IgG indotti dal trattamento con Der p1 modificato con KCNO/PGO sono in grado di riconoscere anche le proteine native di Der p1 (seppure ad un livello inferiore rispetto a quello verso le proteine modificate), a dimostrazione del fatto che nel Der p1 modificato con KCNO/PGO sono conservati epitopi T analoghi a quelli presenti nella controparte nativa. Il Der p1 modificato con KCNO/PGO mantiene quindi la capacità di stimolare in maniera opportuna il sistema immunitario affinché produca anticorpi IgG specifici diretti anche verso il Der p1 nativo.
Elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE)
L’elettroforesi à ̈ stata eseguita utilizzando dei gel in gradiente 4-12% di acrilamide, preconfezionati, ed utilizzati secondo le indicazioni del produttore (NuPAGE<®>Novex<®>mini gels, Invitrogen, Milano). Questo sistema di elettroforesi discontinua a pH neutro permette una migliore risoluzione delle bande nell’intervallo di pesi molecolari di nostro interesse.
I campioni di Der p 1 nativo ovvero modificato con KCNO ovvero KCNO/PGO sono stati valutati mediante la suddetta tecnica, in condizioni riducenti (presenza di 2-mercaptoetanolo al 5%) caricando nel gel la stessa quantità di campione (5 Î1⁄4g). La separazione à ̈ fatta avvenire collegando l’apparecchio all’alimentatore Microcomputer Electrophoresis Power Supply 400/1000 e applicando una corrente di 180 mA costanti per circa un’ora. Al termine il gel viene colorato con Coomassie colloidale (Colloidal Blue staining kit, Novex<®>, Invitrogen). I risultati mostrati in figura 6 indicano che non esiste alcuna differenza nei profili dei campioni in esame, dimostrando quindi che la dimensione molecolare dell’allergene Der p1 non viene modificata dalle reazioni con KCNO/PGO e mantiene, anche quando modificata, la sua forma monomerica.
ESEMPIO 3
Procedura di modifica chimica dell’allergene maggiore Ovalbumina (OVA) con KCNO, ovvero una combinazione KCNO /PGO
Una opportuna quantità di allergene OVA commerciale (Sigma Aldrich, Milano), purificato da albume d’uovo, viene pesato e dissolto in un volume di tampone sodio fosfato 20 mM, pH 6,86 in modo da avere una concentrazione proteica di 2 mg/ml secondo Lowry. Per la modifica con KCNO a 2.5 ml di soluzione di OVA si sono aggiunti 50,25 mg di sodio tetraborato decaidrato e 101 mg di potassio cianato. I sali sono stati portati in soluzione mediante lenta agitazione ed il pH eventualmente corretto a 9,3 con NaOH 1 M. La soluzione risultante à ̈ stata tenuta in lenta agitazione per 16 ore in bagno termostatato a 40°C in beuta chiusa. Nelle prime ore il pH à ̈ stato monitorato ed eventualmente corretto mediante aggiunta di acido fosforico 1 M. Il preparato così ottenuto à ̈ stato di nuovo gel-filtrato su colonna G-25 per eliminare l'eccesso di reattivo e sterilizzato su membrana Millipore 0,22 micron. Una minima parte dello stesso à ̈ stato utilizzato per le successive analisi. La percentuale di sostituzione dei gruppi amminici dell’allergene, valutata con il test del TNBS, à ̈ risultata dell’82%. Il resto del campione modificato con KCNO à ̈ stato sottoposto ad una seconda procedura di modifica chimica con fenilgliossale alle condizioni sperimentali sotto descritte.
Il campione di OVA modificato con KCNO alla concentrazione proteica di 1.4 mg/ml (Lowry) viene portato a pH 8 con aggiunta di bicarbonato di sodio 0.1 M. Successivamente ad esso viene aggiunto il PGO in un eccesso molare di 800 rispetto alla proteina. Per calcolare l’eccesso molare, abbiamo considerato per l’allergene OVA una dimensione molecolare di 43 KD secondo la banca dati UniProtKB da cui risultano 15 residui di arginina. Per facilitare la dissoluzione del PGO, lo stesso à ̈ stato precedentemente sciolto in alcool etilico alla concentrazione di 0.3 M. Il tutto viene lasciato in blanda agitazione per 4 ore a 25°C. Quindi si procede alla dialisi o alla gel filtrazione contro PBS 20 mM. Il grado di sostituzione dei residui di arginina del campione risulta essere del 35%. Successivamente, il campione di OVA modificato con KCNO/PGO à ̈ stato confrontato, ove possibile, con quello modificato con KCNO ovvero nativo in termini di potenza allergenica mediante EAST-inibizione, di capacità immunogenica mediante ELISA e di dimensioni molecolari mediante SDS-PAGE.
Valutazione allergenicità mediante EAST-inibizione A questo scopo, sfere di polistirene, previamente trattate con glutaraldeide, sono state attivate con OVA in ragione di 1 µg di proteina per sfera.
Parallelamente viene preparato un pool di sieri umani, selezionati tra i pazienti con storia clinica di allergia all’uovo, confermata mediante test sierologico specifico.
Nei pozzetti di una piastra ELISA vengono aggiunti 30 µl di diluizioni seriali in PBS-2% BSA (diluente) dei campioni in esame (OVA nativa, OVA modificata con KCNO, OVA modificata con KCNO/PGO), previamente portati alla stessa concentrazione, e 20 µl del pool di sieri; il tutto viene lasciato in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Parallelamente viene allestito un campione di controllo positivo in cui l’inibitore à ̈ costituito da diluente. Al termine delle due ore si aggiunge in ogni pozzetto una sfera attivata con OVA e 50 µl di PBS-2% BSA e si mantiene la piastra in agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente. Le sfere sono quindi lavate e ad ogni pozzetto vengono aggiunti 100 µl di una soluzione di anticorpo anti IgE umane coniugate a perossidasi ed incubate in agitazione per 2 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 50 µl di HCl 1 N, quindi 100 µl di miscela da ogni pozzetto vengono trasferiti in una nuova piastra e l’intensità del colore sviluppato à ̈ valutata mediante lettura spettrofotometrica a 450 nm.
Le densità ottiche rilevate vengono trasformate in percentuali di inibizione rispetto al controllo positivo e viene costruito un grafico in cui sono riportati sull’asse Y la percentuale di inibizione e sull’asse X il logaritmo del volume di campione utilizzato nel test. Dai punti riportati si costruisce una retta di regressione lineare sulla quale si misura il valore IC50, che rappresenta il volume in microlitri di campione necessario ad inibire il 50% del legame delle IgE alla sfera. Tale valore à ̈ inversamente proporzionale alla potenza allergenica del campione in esame.
I risultati, mostrati in figura 7, dimostrano che la modifica con KCNO riduce l’attività allergenica dell’OVA di 178 volte mentre la modifica con KCNO/PGO induce un’ulteriore riduzione dell’attività allergenica dell’OVA, più precisamente di 1687 volte, dimostrando anche in questo caso che la combinazione in sequenza KCNO/PGO agisce mediante un effetto sinergico.
Valutazione immunogenicità di OVA modificata con KCNO/PGO mediante ELISA del siero di topi previamente immunizzati
a)Protocollo di immunizzazione dei topi
Un gruppo di topi costituito da quattro esemplari femmina di ceppo Balb/c (Charles River) sono immunizzati, per via sottocutanea, con 200 Î1⁄4l di un’emulsione composta da 100 Î1⁄4l di adiuvante completo di Freund e 20 Î1⁄4g di OVA modificata con KCNO/PGO in 100 Î1⁄4l di soluzione fisiologica. Altri tre richiami sono effettuati ad intervalli di due settimane sostituendo l’adiuvante completo con quello incompleto. Sette giorni dopo l’ultima immunizzazione viene effettuato un prelievo di sangue dalla coda dei topi e viene controllata mediante ELISA la risposta anticorpale nei confronti dell’immunogeno così come la capacità di riconoscere la proteina nativa.
b) Procedura del test
Il test viene effettuato per verificare se l’allergene OVA modificato con KCNO/PGO mantiene un potenziale immunogenico inteso come capacità di indurre nel topo, quando somministrato secondo il protocollo indicato più avanti, una risposta IgG che à ̈ rivolta anche nei confronti dell’OVA nativa, non modificata. A tale scopo eguali quantità (0,1 µg) di OVA nativa o modificata con KCNO/PGO, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (25% siero di cavallo, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, thiomersal 0,01% in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Eguali aliquote (100 µl) di diluizioni seriali in base 10 del pool di sieri di topo in tampone diluente, sono aggiunte a ogni pozzetto e fatte incubare a 25 °C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero di coniglio anti-IgG di topo coniugato a perossidasi alla diluizione 1:2000 in tampone diluente, il tutto à ̈ incubato a 25 °C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. In figura 8 sono mostrati i risultati sulla reattività IgG specifica del pool di sieri dei topi immunizzati con OVA modificata con KCNO/PGO nei confronti sia dell’allergene usato per immunizzare che della controparte non modificata (nativa). Come si può osservare, gli anticorpi IgG indotti dal trattamento con OVA modificato con KCNO/PGO sono in grado di riconoscere anche le proteine native di OVA (seppur ad un livello inferiore rispetto a quello verso le proteine modificate), a dimostrazione del fatto che in OVA modificata con KCNO/PGO sono conservati epitopi T analoghi a quelli presenti nella controparte nativa. L’OVA modificata con KCNO/PGO mantiene quindi la capacità di stimolare in maniera opportuna il sistema immunitario affinché produca anticorpi IgG specifici diretti anche verso l’OVA nativa.
Elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE)
L’elettroforesi à ̈ stata eseguita utilizzando dei gel in gradiente 4-12% di acrilamide, preconfezionati, ed utilizzati secondo le indicazioni del produttore (NuPAGE<®>Novex<®>mini gels, Invitrogen, Milano). Questo sistema di elettroforesi discontinua a pH neutro permette una migliore risoluzione delle bande nell’intervallo di pesi molecolari di nostro interesse.
I campioni di OVA nativa ovvero modificata con KCNO ovvero con KCNO/PGO sono stati valutati mediante la suddetta tecnica, in condizioni riducenti (presenza di 2-mercaptoetanolo al 5%) caricando nel gel la stessa quantità di campione (5 Î1⁄4g). La separazione à ̈ fatta avvenire collegando l’apparecchio all’alimentatore Microcomputer Electrophoresis Power Supply 400/1000 e applicando una corrente di 180 mA costanti per circa un’ora. Al termine, il gel viene colorato con Coomassie colloidale (Colloidal Blue staining kit, Novex<®>, Invitrogen). I risultati in figura 9 dimostrano che la reazione con KCNO/PGO non comporta variazioni significative della dimensione molecolare dell’allergene OVA che mantiene, anche quando modificata, la sua monomericità .
ESEMPIO 4
Procedura di modifica chimica dell’allergene maggiore di pesca Pru p3 ottenuto in forma ricombinante con KCNO ovvero con una combinazione KCNO /PGO
Fase di produzione dell’allergene rPru p r in E. coli Il cDNA di Pru p3 à ̈ ottenuto mediante amplificazione della sequenza nucleotidica AY792996 contenuta nel clone PP LEa0029C22F (GenBank Acc. BU047210) fornito da Genomics Institute of Clemson University (USA). Gli oligonucleotidi utilizzati nella reazione di amplificazione tramite PCR (polymerase chain reaction) sono Pru p 3-6H ECO (5’ ccg gaa ttc cat atg cat cac cat cac cat cac ata aca tgt ggc caa gtg) e Pru p 3 Bam (5’ cgc gga tcc tca ctt cac ggt ggc gc), corrispondenti alle sequenze 5’ e 3’ terminali del trascritto corrispondente alla proteina matura. Le sequenze sottolineate sono i siti di taglio degli enzimi di restrizione Eco R I, Nde I e Bam H I, necessari per il clonaggio nei vettori di amplificazione e espressione, in italico à ̈ evidenziata la sequenza codificante per sei residui di istidina. Il cDNA ottenuto, dopo purificazione, à ̈ stato inserito nel vettore di espressione, amplificato e inviato per verificare la correttezza della sequenza mediante sequenziamento automatico (M-Medical/MWG-Biotech).
L’espressione di Pru p 3 avviene in cellule di Escherichia coli BL21 Origami (DE3) (Stratagene), cresciute a 37° C in presenza di antibiotici (Amp 100 g/ml, Kan 15 g/ml e Tet 12.5 g/ml) fino a una densità corrispondente a OD600= 0.6, ed à ̈ indotta mediante aggiunta di IPTG 1 mM al terreno di coltura. Dopo 16 ore di crescita a 25° C, le cellule sono raccolte per centrifugazione, risospese in 50 mM NaH2PO4 pH8 e lisate mediante sonicazione. Le proteine ricombinanti solubili, separate dai detriti insolubili mediante centrifugazione, sono purificate per cromatografia di affinità su colonna di NiNTA Agarose (Qiagen, Italia) che lega la sequenza di istidine, seguendo le istruzioni della casa produttrice.
La proteina così purificata, con un grado di purezza superiore al 98% come mostrato dal profilo SDS-PAGE, viene quantificata mediante lettura allo spettrofotometro a 280 nm, considerando il suo coefficiente di estinzione molare (E280) pari a 3480, da cui l’assorbanza a una concentrazione di 1 mg/ml pari a 0.345. Infine la soluzione di Pru p3 viene dializzata contro H2O e poi liofilizzata in presenza di saccarosio all’1%.
Il campione di rPru p3 liofilo viene poi ripreso in un volume di tampone sodio fosfato 20 mM, pH 6,86 in modo da avere una concentrazione proteica di 0.7 mg/ml. Per la modifica con KCNO a 2.5 ml di soluzione di rPru p3 si sono aggiunti 50.25 mg di sodio tetraborato decaidrato e 101.4 mg di potassio cianato. I sali sono stati portati in soluzione mediante lenta agitazione ed il pH eventualmente corretto a 9,3 con NaOH 1 M. La soluzione risultante à ̈ stata tenuta in lenta agitazione per 16 ore in bagno termostatato a 40°C in beuta chiusa. Nelle prime ore il pH à ̈ stato monitorato ed eventualmente corretto mediante aggiunta di acido fosforico 1 M. Il preparato così ottenuto à ̈ stato di nuovo gel-filtrato su colonna G-25 per eliminare l'eccesso di reattivo e sterilizzato su membrana Millipore 0,22 micron. Una minima parte dello stesso à ̈ stato utilizzato per le successive analisi. La percentuale di sostituzione dei gruppi amminici del Pru p3, valutata con il test del TNBS, à ̈ risultata del 74%. Il resto del campione modificato con KCNO à ̈ stato sottoposto ad una seconda procedura di modifica chimica con fenilgliossale alle condizioni sperimentali sotto descritte.
Il campione di Pru p3 modificato con KCNO alla concentrazione proteica di 0.5 mg/ml viene portato a pH 8 con aggiunta di bicarbonato di sodio 0.1 M. Successivamente ad esso viene aggiunto il PGO in un eccesso molare di 800 rispetto alla proteina. Per calcolare l’eccesso molare, abbiamo considerato per l’allergene Pru p3 una dimensione molecolare di 10 KD secondo la banca dati UniProtKB da cui risultano 4 residui di arginina. Per facilitare la dissoluzione del PGO lo stesso à ̈ stato precedentemente sciolto in alcool etilico alla concentrazione di 0.3 M. Il tutto viene lasciato in blanda agitazione per 4 ore a 25°C. Quindi si procede alla dialisi o alla gel filtrazione contro PBS 20 mM. Il grado di sostituzione dei residui di arginina risulta essere del 50%. Successivamente, il campione di Pru p3 modificato con KCNO/PGO à ̈ stato confrontato con quello modificato con KCNO ovvero nativo in termini di potenza allergenica mediante EAST-inibizione, di capacità immunogenica mediante ELISA e di dimensioni molecolari mediante SDS-PAGE.
Valutazione allergenicità mediante EAST-inibizione A questo scopo sfere di polistirene, previamente trattate con glutaraldeide, sono state attivate con Pru p3 in ragione di 1 µg di proteina per sfera.
Parallelamente viene preparato un pool di sieri umani, selezionati tra i pazienti con storia clinica di allergia alla pesca, confermata mediante test sierologico specifico.
Nei pozzetti di una piastra ELISA vengono aggiunti 30 µl di diluizioni seriali in PBS-2% BSA (diluente) dei campioni in esame (Pru p3 nativo, Pru p3 modificato con KCNO, Pru p3 modificato con KCNO/PGO), previamente portati alla stessa concentrazione, e 20 µl del pool di sieri; il tutto viene lasciato in agitazione per 2 ore a temperatura ambiente. Parallelamente viene allestito un campione di controllo positivo in cui l’inibitore à ̈ costituito da diluente. Al termine delle due ore si aggiunge in ogni pozzetto una sfera attivata con Pru p3 e 50 µl di PBS-2% BSA e si mantiene la piastra in agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente. Le sfere sono quindi lavate e ad ogni pozzetto vengono aggiunti 100 µl di una soluzione di anticorpo anti IgE umane coniugate a perossidasi ed incubate in agitazione per 2 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 50 µl di HCl 1 N, quindi 100 µl di miscela da ogni pozzetto vengono trasferiti in una nuova piastra e l’intensità del colore sviluppato à ̈ valutata mediante lettura spettrofotometrica a 450 nm.
Le densità ottiche rilevate vengono trasformate in percentuali di inibizione rispetto al controllo positivo e viene costruito un grafico in cui sono riportati sull’asse Y la percentuale di inibizione e sull’asse X il logaritmo del volume di campione utilizzato nel test. Dai punti riportati si costruisce una retta di regressione lineare sulla quale si misura il valore IC50, che rappresenta il volume in microlitri di campione necessario ad inibire il 50% del legame delle IgE alla sfera. Tale valore à ̈ inversamente proporzionale alla potenza allergenica del campione in esame.
I risultati, mostrati in figura 10, dimostrano che la modifica con KCNO riduce l’attività allergenica dell’allergene rPru p3 di 64 volte, mentre la modifica con KCNO/PGO riduce ulteriormente la suddetta attività che risulta essere 1422 volte più bassa rispetto alla controparte nativa.
Valutazione immunogenicità dell’allergene Pru p3 modificato con KCNO/PGO mediante ELISA del siero di topi previamente immunizzati
a)Protocollo di immunizzazione dei topi
Un gruppo di topi costituito da quattro esemplari femmina di ceppo Balb/c (Charles River) sono immunizzati, per via sottocutanea, con 200 Î1⁄4l di un’emulsione composta da 100 Î1⁄4l di adiuvante completo di Freund e 20 Î1⁄4g di Pru p3 modificato con KCNO/PGO in 100 Î1⁄4l di soluzione fisiologica. Altri tre richiami sono effettuati ad intervalli di due settimane sostituendo l’adiuvante completo con quello incompleto. Sette giorni dopo l’ultima immunizzazione viene effettuato un prelievo di sangue dalla coda dei topi e viene controllata mediante ELISA la risposta anticorpale nei confronti dell’immunogeno così come la capacità di riconoscere la proteina nativa.
b) Procedura del test
Il test viene effettuato per verificare se il Pru p3 modificato con KCNO/PGO mantiene un potenziale immunogenico inteso come capacità di indurre nel topo, quando somministrato secondo il protocollo indicato più avanti, una risposta IgG che à ̈ rivolta anche nei confronti del Pru p3 nativo, non modificato. A tale scopo eguali quantità (0,1 µg) di Pru p3 nativo o modificato con KCNO/PGO, in tampone carbonato/bicarbonato 50 mM pH 9.6, sono adsorbite sui pozzetti di piastre di polistirene per saggi ELISA mediante incubazione a 4°C per 16 ore. I pozzetti sono quindi lavati con soluzione di lavaggio (tampone fosfato 60 mM pH 6,5 contenente Tween-20 allo 0,05%) e i siti liberi sono saturati con soluzione diluente (25% siero di cavallo, EDTA 1 mM, Tween 20 0,05%, thiomersal 0,01% in tampone fosfato 150 mM pH 7,4). Eguali aliquote (100 µl) di diluizioni seriali in base 10 del pool di sieri di topo in tampone diluente, sono aggiunte a ogni pozzetto e fatte incubare a 25 °C per 2 ore. Dopo tre lavaggi à ̈ aggiunto il siero di coniglio anti-IgG di topo coniugato a perossidasi alla diluizione 1:2000 in tampone diluente, il tutto à ̈ incubato a 25 °C per 1,5 ore. Dopo tre lavaggi, lo sviluppo della reazione colorimetrica si ottiene aggiungendo 100 µl di reagente TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e incubando 15 minuti a 25 °C. La reazione à ̈ bloccata con l’aggiunta di 100 µl di HCl 1 N e valutata con lettura a 450 nm allo spettrofotometro. In Figura 11 sono mostrati i risultati sulla reattività IgG specifica del pool di sieri dei topi immunizzati con Pru p3 modificato con KCNO/PGO sia nei confronti del Pru p3 usato per immunizzare che della controparte non modificata (nativa). Come si può osservare in figura 11 gli anticorpi IgG indotti dal trattamento con Pru p3 modificato con KCNO/PGO sono in grado di riconoscere anche le proteine native di Pru p3 a dimostrazione del fatto che nel Pru p3 modificato con KCNO/PGO sono conservati epitopi T analoghi a quelli presenti nella controparte nativa. Il Pru p3 modificato con KCNO/PGO mantiene quindi la capacità di stimolare in maniera opportuna il sistema immunitario affinché produca anticorpi IgG specifici diretti anche verso il Pru p3 nativo.
Elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE)
L’elettroforesi à ̈ stata eseguita utilizzando dei gel in gradiente 4-12% di acrilamide, preconfezionati ed utilizzati secondo le indicazioni del produttore (NuPAGE<®>Novex<®>mini gels, Invitrogen, Milano). Questo sistema di elettroforesi discontinua a pH neutro permette una migliore risoluzione delle bande nell’intervallo di pesi molecolari di nostro interesse.
I campioni di Pru p3 nativo ovvero modificato con KCNO ovvero KCNO/PGO sono stati valutati mediante la suddetta tecnica, in condizioni riducenti (presenza di 2-mercaptoetanolo al 5%) caricando nel gel la stessa quantità di campione (5 Î1⁄4g). La separazione à ̈ fatta avvenire collegando l’apparecchio all’alimentatore Microcomputer Electrophoresis Power Supply 400/1000 e applicando una corrente di 180 mA costanti per circa un’ora. Al termine il gel viene colorato con Coomassie colloidale (Colloidal Blue staining kit, Novex<®>, Invitrogen). I risultati in figura 12 dimostrano che la dimensione molecolare dell’allergene rPru p3 non cambia dopo la modifica con KCNO/PGO, mantenendo quindi la sua forma monomerica.
L’estratto allergenico o le singole proteine purificate modificate come descritto sopra possono essere usati nella terapia dei pazienti allergici e somministrati per via parenterale ovvero nasale ovvero sublinguale ovvero oromucosale ovvero orale ovvero bronchiale con opportuno dispositivo. Il prodotto di cui sopra può essere preparato anche in forma liofila e poi ricostituito e somministrato come indicato per la forma acquosa ovvero inglobato in delivery systems (per es. liposomi) oppure come polvere incorporata in un eccipiente inerte, per es.
lattosio da somministrare per via nasale o bronchiale mediante apposito dispositivo oppure formulata in compresse eventualmente a dissoluzione rapida per una somministrazione sublinguale/oromucosale ovvero capsule eventualmente rese gastroresistenti mediante opportuna procedura per la somministrazione orale ovvero come biofilm o polveri mucoadesive per aumentare il tempo di contatto con la mucosa buccale e facilitare l’interazione con le cellule dendritiche locali.
Il prodotto di cui sopra può essere preparato anche sotto forma di sospensione oleosa, sciroppo, elisir, con eventuale aggiunta di eccipienti o sostanze in modo da renderlo gradevole al gusto per una somministrazione sublinguale, oromucosale o orale.
Il prodotto di cui sopra può altresì essere associato o coniugato a sostanze note esprimere una attività adiuvante di tipo Th1 o Treg come per es. CpG, derivati di batteri, micobatteri, micoplasmi, Neisseria, virus o protozoi inclusi CpG non metilati, lipoproteine o lipopeptidi triacilati, lipopolisaccaridi (LPS) e derivati tipo lipid A, sostanze di sintesi quali imiquimod, resiquimod, poly (I:C).
La composizione dell’invenzione potrà generalmente contenere vari eccipienti e/o carrier adatti al tipo di somministrazione scelto, secondo quanto noto all’esperto del settore e quanto riportato ad esempio in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17th edition, 1985.
In tutte queste formulazioni farmaceutiche, la preparazione dell’invenzione potrà essere presente in quantità comprese tra 0.5 µg (dose minima) e 200 µg (dose di mantenimento) di proteina totale, secondo la via di somministrazione utilizzata nell’attuazione della immunoterapia specifica.
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI l. Allergeni modificati aventi allergenicità ridotta rispetto al corrispondente materiale allergenico nativo e caratterizzati dal fatto che tutti o una parte dei gruppi amminici primari dei residui lisinici ed argininici delle molecole allergeniche sono funzionalizzati come mostrato nella struttura (I) e che detti allergeni modificati hanno la seguente struttura (I): n OR 2 R O O 2 R R N+ N H N prot NH NH m 1 X R (I) in cui R e R<2>sono scelti indipendentemente tra H, C1-C5 alchile, fenile, eventualmente sostituito in orto, meta o para con un gruppo idrossi, C1-C4 alcossi, alogeno, ammino, alchilammino, dialchilammino, mercapto, C1-C4 alchilmercapto; X rappresenta O, S o NR3, dove R3 à ̈ H, alchile con 1-6 atomi di carbonio, fenile o CN; R1 rappresenta H, alchile con 1-8 atomi di carbonio, fenile o arilalchile con fino a 8 atomi di carbonio oppure alchile contenente un anello eterociclico; prot rappresenta il residuo proteico dell’allergene; n à ̈ il numero di gruppi argininici funzionalizzati ed à ̈ compreso tra 1 ed il numero di gruppi argininici presenti nell’allergene; m à ̈ il numero di gruppi lisinici funzionalizzati ed à ̈ compreso tra 1 ed il numero di gruppi lisinici presenti nell’allergene.
- 2. Allergeni modificati secondo la rivendicazione 1, in cui detto materiale allergenico nativo sottoposto a modifica può essere ottenuto da acari, pollini, epiteli di animali, micofiti, proteine di origine alimentare, preferibilmente scelte tra proteine di latte, uovo, cereali, pesca, mela, mediante estrazione delle proteine allergeniche con opportuno solvente; oppure tale materiale allergenico nativo à ̈ costituito da proteine purificate dalle materie prime sopra elencate; oppure tale materiale allergenico nativo à ̈ ottenuto in forma ricombinante.
- 3. Allergeni modificati secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la percentuale media di gruppi amminici primari della lisina modificati à ̈ compresa tra il 75% ed il 100%, preferibilmente circa 90%; e la percentuale media dei residui di arginina sostituiti à ̈ compresa tra il 25 ed il 100%, preferibilmente circa 40%. 4. Allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui R à ̈ fenile, eventualmente sostituito in orto, meta o para con un gruppo idrossi, C1-C4 alcossi, alogeno, ammino, alchilammino, dialchilammino, mercapto, C1-C4 alchilmercapto, ed R2 à ̈ idrogeno. 5. Allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui X à ̈ O oppure S ed R1 à ̈ idrogeno. 6. Allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui R à ̈ fenile, R1 ed R2 sono idrogeno ed X à ̈ O oppure S. 7. Procedimento per l’ottenimento di allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, comprendente i seguenti passaggi: a) reazione di carbamilazione o tiocarbamilazione di tutti o parte dei residui lisinici di un materiale allergenico nativo di partenza; b) successivamente, reazione di tutti o parte dei residui argininici di detto materiale allergenico del passaggio a) con una dialdeide o dichetale. 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detta reazione di carbamilazione del passaggio a) à ̈ condotta facendo reagire detto materiale allergenico nativo con cianato di potassio ad una concentrazione finale del sale compresa tra 0.1 M e 1.5 M, preferibilmente tra 0.
- 4 M e 0.8 M, e mantenendo il pH tra 7 e 11, preferibilmente tra 9 e 9.6; ad una temperatura compresa tra temperatura ambiente e 50°C, preferibilmente tra 35 e 40°C per un tempo totale di reazione tra 12 e 36 ore, preferibilmente tra 16 e 24 ore. 9. Procedimento secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui, tra detto passaggio a) e detto passaggio b), il materiale allergenico nativo così modificato viene sottoposto a gel-filtrazione per eliminare il reagente in eccesso e viene equilibrato con una soluzione salina opportuna. 10. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 7 a 9, in cui detto passaggio b) viene condotto mediante reazione con fenilgliossale, in eccesso molare compreso tra 100 e 1600, preferibilmente tra 400 e 800, per un tempo variabile tra 30 minuti e 8 ore, preferibilmente 4 ore, a temperature comprese tra 20 e 37°C, preferibilmente 25°C. 11. Composizione farmaceutica comprendente una dose efficace per immunoterapia di uno o più allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, unitamente a eccipienti farmaceuticamente accettabili. 12. Allergeni modificati secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6, per l’uso in immunoterapia specifica, in cui detti allergeni modificati hanno una capacità di indurre anticorpi IgG specifici in grado di riconoscere anche il corrispondente allergene nativo, ma ridotta capacità di legame agli anticorpi IgE specifici.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| TCIRKOVIC ET AL.: "The influence of a residual group in low-molecular-weight allergoids of Artemisia vulgaris pollen on their allergenicity, IgE- and IgG-binding properties", ALLERGY., vol. 57, 2002, MUNSKGAARD, COPENHAGEN., pages 1013 - 1020, XP002532424 * |
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