DE2461439B2 - Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von BordeteUa Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines schützendes Antigens von Bordetella pertussis durch Extraktion der Keime und eine anschließende Adsorption der extrahierten Antigene an ein Trägermaterial, .'erner Pertussis-Impfstoffe, welche diese Antigene enthalten.

Die herkömmlichen Pertussis-lmpfstoffe zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten enthalten meist abgetötete Keime der Bordetella pertussis. Von den Pertussiskeimen ist bekannt, daß sie beim Impfling häufig lokal an der Impfstelle Schmerzen und Entzündungen, aber auch Fieber und in seltenen Fällen zudem neurologische Komplikationen wie die gefürchtete Enzephalitis verursachen.

Es ist deshalb schon versucht worden, den keimhaltigen Impfstoff durch einen Extraktimpfstoff mit dem Ziel einer besseren Verträglichkeit zu ersetzen. Die mehrfach beschriebene Herstellung von Extrakten aus Pertussiskeimen mittels Salzlösungen führt zwar zu einer Solubilisierung eines geringen Teils des Schutzantigenkomplexes; die Ausbeuten sind relativ niedrig, die Extrakte bestehen wie die Keime aus einer Vielzahl von Komponenten, die z.T. toxisch sind und zu keiner Verbesserung der Verträglichkeit des Impfstoffes beim Impfling führen.

Eine weitere Reinigung der Salzextrakte ist wegen der Polydispersität des antigenen Materials stark eingeschränkt. Mit den üblichen biochemischen Reinigungsverfahren erreicht man im wesentlichen eine Verteilung der schützenden Aktivität in mehrere Fraktionen, ohne dabei die spezifische Schutzaktivität wesentlich erhöhen zu können.

Zur Verbesserung der Ausbeute wurde auch schon versucht, die Pertussiskeime beispielsweise mit Ultraschall aufzuschließen. Abgesehen von dem erhöhten apparativen Aufwand ist diese Verfahren ebenso unbefriedigend, weil damit das Problem der höheren Reinheit des Schutzantigens nicht gelöst werden konnte.

Es ist hier erwähnenswert, daß der sogenannte histaminsensibiiisierende Faktor der Pertussiskeime durch Behandlung mit einer wäßrigen Kochsalzlösung, die 4 M Harnstoff enthält, gewonnen werden kann. Dabei war es nicht möglich, den Harnstoff ohne Aktivitätsverlust in bezug auf Histaminsensibilisierung zu entfernen. Es ist strittig, ob die histaminsensibilisierende Aktivität dem Schutzantigen ganz oder teilweise entspricht Neben Hinweisen darauf, dzß es sich um verschiedene Komponenten handelt, ist von S a t ο, Y, Symp. Series ImmunobioL Standard, Vol. 13, S. 214—

ίο 220, beschrieben, daß die Behandlung eines 22 S-Pertussisantigens mit Harnstoff zu einer Zerstörung der schützenden Aktivität führt

Der hier vorgelegten Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen schützenden Antigenkomplex in lösli^r> eher Form aus Pertussiskeimen in größeren Ausbeuten und ggf. höherer Reinheit als bisher zu gewinnen und das gereinigte Antigen als wesentlich wirksamen Anteil in Pertussisimpfstoffen zu verwenden.

Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren

2« erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht, daß Pertussiskeime mit Lösungen denaturierender Agenzien behandelt werden, die Keime abgetrennt und das solubilisierte Material entweder sofort oder nach weiterer Reinigung im denaturierenden Milieu an ein

2) wasserunlösliches Trägermaterial adsorbiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wäßrigen

jo Lösung eines der Denaturierungsmittel Harnstoff, Guanidin oder deren Salze und eines Neutralsalzes in einer Konzentration von 0,3 bis 3 Mol/l bei einem pH-Wert von 6—10 bei einer Temperatur von 1 —40⁰C und für eine Dauer von 0,5 bis 48 Stunden misch', den

)"> flüssigen Überstand vom Rückstand der Keime abtrennt und danach das Denaturierungsmittel, gegebenenfalls nach Zusatz eines wasserunlöslichen Adsorptionsmittels von der wäßrigen Suspension des schützenden Antigens abtrennt.

4(i Die Behandlung der Pertussiskeime mit der Lösung, die zu einer Extraktion der Keime führt, erfolgt im einfachsten Fall durch Stehenlassen der in der Lösung möglichst homogen suspendierten Keime. Bei dieser Maßnahme muß jedoch mit den längsten Extraktions-

Ί) zeiten gerechnet werden. Schon ein sachtes Bewegen der Keime, wie es durch einfaches Rühren erreicht werden kann, verbessert den Wirkungsgrad der Extraktion. Geräte, wie sie für Homogenisierungszwekke bekannt sind, können zur Erhöhung der Ausbeute

v> und zur Verkürzung der Zeit mit Vorteil eingesetzt werden. Je nach dem angewandten Bewegungsmittel beträgt die Extraktionszeit etwa 0,5—48 Stunden. Im Durchschnitt muß mit einer Extraktionsdauer von 18 Stunden gerechnet werden.

">^r> Die Extraktionstemperatur beträgt 1 —40°C. Temperaturen unter Raumtemperatur, etwa im Bereich zwischen 1 und 10°C sind bevorzugt.

Die Mischung wird während der Extraktionszeit bei einem pH-Wert zwischen 6 und 10, vorzugsweise bei

w) pH 8 gehalten. Falls sich dieser pH-Wert nicht von allein einstellt, kann er durch Zusatz geeigneter Pufferlösungen geschaffen werden.

Die Trennung von Extrakt und Keimrückstand erfolgt zweckmäßig durch Zentrifugieren. Auch Fiitrationsvor-

h^r> richtungen, die Mikroorganismen zurückzuhalten vermögen, sind zur Gewinnung des zellfreien Extraktes geeignet.

Es hat sich überraschend gezeigi, daß das schützende

Antigen in einer Lösung, die Denaturierungsmittel enthält, die Eigenschaften eines relativ einheitlich aufgebauten Stoffes aufweist Seine weitere Reinigung ist deshalb in Gegenwart des Denaturierungsmittels möglich. Eine geeignete Maßnahme hierzu ist beispielsweise die Gelchromatographie, bei der eine Abtrennung von toxischen Komponenten vom schützenden Antigen erreicht werden kann, wenn die Entwicklung mit einem Denaturierungsmittel enthaltenden Puffer vorgenommen wird Als Medium für die Gelchromatographie eignen sich besonders mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, im Handel als SephadexW der Firma Pharmacia, Uppsala, oder Copolymere von Acrylamid und Methylenbisacrylamid, im Handel als Bio-Gel PW der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond/USA.

Als Puffersubstanzen im Rahmen des erfindungsgiemäßen Verfahrens kommen die bei biochemischen Arbeiten zur Stabilisierung des pH-Wertes der Lösung eingesetzten chemischen Verbindungen in Frage, vorteilhaft jene, die von N.E. Good et al (1966) in Biochemistry 5, 467—477, beschrieben sind, beispielsweise Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, den verwendeten Pufferlösungen geringe Mengen (etwa 1—20 mM) an sogenannten Chelat- oder Komplexbildern, beispielsweise Äthylendiamin-letraacetat (EDTA) zuzusetzen.

Die Wahl des Adsorptionsmittels richtet sich im wesentlichen nach dem gewünschten Verwendungszweck des schützenden Antigens. Im Falle des bevorzugten Anwendungsbereiches eines Pertussisimpfstoffes wird als Adsorbens ein in der Vakzineherstellung erprobtes immunologisches Adjuvans bevorzugt. Dies kann anorganischen Ursprungs sein, wie Calciumphosphat oder Aluminiumoxid; vorzugsweise wird AlPO₄ und/oder Cy-Aluminiumhydroxid in einer Endkonzentration (Feststoffkonzentration im fertigen Produkt) von 0,05% bis 0,4% (w/v) verwendet. Es kommen jedoch auch organische Polymere, insbesondere polyanionische Adjuvantien in Frage, die in dan Lösungen der vorliegenden Denaturierungsmittel unlöslich sind, z. B. Derivate der Polyacrylsäure. 1st eine Applikation an Menschen und Tieren nicht beabsichtigt, kann jedes beliebige für die Adsorption von Proteinen verwendete Adsorbens der Lösung des schützenden Antigens zugefügt werden.

Die Entfernung des Denaturierungsmittels erfolgt zweckmäßig durch Dialyse. Da das schützende Antigen im physiologischen Milieu durch die Dialysemembran nicht durchtreten kann, wird bei zunehmendem Austritt des Denaturierungsmittels durch die Membran das schützende Antigen auf dem Adsorbens niedergeschlagen.

Falls ein steriles Präparat gewünscht wird, kann die Aufarbeitung von der Extraktion bis zu dem adsorbierten Material unter sterilen Bedingungen erfolgen. Alternativ wird vor der Entfernung des Denaturierungsmittels und vor der Zugabe des Adsorbens eine Keimfreifiltration vorgenommen. Die weitere Aufarbeitung hat sodann unter sterilen Bedingungen zu erfolgen.

Unter Denaturierungsmitteln im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten, insbesondere durch Lösung von Wasserstoffbindungen bewerkstelligt werden kann. Besonders geeignet sind hierfür Harnstoff oder Guanidin sowie deren Salze, insbesondere auch Guanidinhydrochlorid. Die Denaturierungsmittel werden in Konzentrationen von 2—6 Mol/i, vorzugsweise 4—6 Mol/l bezogen auf die Gesamtlösung, angewandt

An Neutralsalzen werden bevorzugt die wasserlöslichen Alkalihalogenide wie NaCl oder KCl und zwar in einer Konzentration von 03—3 Mol/l, vorzugsweise 1 Mol/i bezogen auf die Gesamtlösung. Denaturierungsmittel und Neutralsalze haben bei der Extraktion des schützenden Antigens eine synergistische Wirkung.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kommen Bordetella-pertussis-Keime in Fra ge. Sie werden auf bekannte Weise beispielsweise durch Züchten in Cohen-Wheeler-Nährlösung bei ca. 35° C unter Rühren vermehrt und durch Säurefällung, durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln oder durch Zentrifugation gewonnen. Man geht bei der Anreiche rung dsr Keime beispielsweise so vor, daß man die Bordetella-pertussis-Fermsnterkultur einer sauren Fällung bei pH 3—5, vorzugsweise pH 4, unterwirft Zur Säurefällung sind alle Mineralsäuren vorzugsweise 1 N Salzsäure, geeignet; ferner organische Säuren, z. B.

Essigsäure. Keime, die durch Zentrifugation von dem Kulturmedium getrennt wurden, eignen sich ebenso gut wie mit Hilfe von Aceton oder Säure gefällte Keime. Die Keime werden vorteilhaft in wäßriger Suspension eingesetzt Die Konzentration kann 50 · 10⁹— 1000 · 10⁹, vorzugsweise 100 - 10⁹—400 · ΙΟ³ pro ml betragen.

Die Prüfung der Wirksamkeit von Pertussisimpfstoffen wird im Tierversuch nach einem von Kendrick 1947 angegebenen Verfahren durchgeführt (P. L K e η d - rick, G. Eidering, M. K. DixonundJ. Misner, Amer. J. Publ. Health 37, 803 (1947) und Fed. Reg. 33, No. 118, 8818, Paragraph 73 404 (1968). Hierbei werden je 18 Mäuse mit dem Pertussisantigen in drei Verdünnungsstufen immunisiert und die belastungsfähi ge Immunität nach 13 Tagen durch eine intracerebrale Infektion mit 200 LD₅O lebenden Keimen von B. pertussis geprüft. Als Standard-Präparat wird stets eine Vakzine mit bekanntem Schutzwert mitgeführt. Der in diesem Test gefundene Schutzwert ist ein Maß für die schützende Wirkung des Impfstoffes am Menschen (vgl. hierzu Medical Res. Council Brit. Med. J. No. 5128, 994 (1959).

Bei Extraktion von Pertussis-Keimsuspensionen mit einer Keimdichte von 100 · 10⁹ Keimen pro ml je nach den angewandten Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens wurden Werte von 25 bis 75 ΙΕ/mi gefunden. Ein Impfstoff mit mindestens 8 IE/ml wird als wirksamer Impfstoff allgemein anerkannt. Die Toxität wird nach den Richtlinien des U. S. Department of Health,

so Education und Weifare bestimmt.

10 Mäuse erhalten 0,5ml der 1:2 verdünnten zu prüfenden Pertussis-Vakzine. Gemäß den Forderungen der 1 lational Institutes of Health (NIH) in Federal Reg. 33, No. 118, 8818 (1968), Paragraph 73 403, werden Gewichtszunahmen von 3 g/7 Tage gefordert. Bei einem erfindungsgemäß hergestellten Pertussis-Antigen beträgt die durchschnittliche Gewichtszunahme der Tiere nach 72 Stunden 1 —3 g und nach 7 Tagen 5—6 g. Es enthält somit keine toxischen Anteile der Pertussis-

bo Keime und ist gut verträglich.

Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, die das erfindungsgemäße schützende Pertussis-Antigen enthalten, insbesondere Pertussis-Impfstoffe zur Prophylaxe des Keuchhustens oder zur Herstellung von therapeutisch oder diagnostisch verwendbaren Pertussis-Antiseren, aber auch diagnostische Präparate, die das schützende Pertussis-Antigen oder davon gewonnene /-vniisercn entuäiten.

Die Suspension des Antigens kann mit antimikrobiellen Konservierungsmitteln wie Natrium-timerfonat versetzt werden. Das Pertussis-Antigen kann zur Herstellung eines Polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt bei der Herstellung des schützenden Pertussis-Antigens bzw. von Pertussis-Impfstoffen dar. Das Verfahren ist einfach. Die erzielte Schutzaktivität des adsorbierten Extrakt-Antigens ist im Hinblick auf bisher aus der Literatur bekannten Daten überraschend hoch. Die hohe Ausbeute in dem Extrakt wird auch dadurch verdeutlicht, daß Keime, die einer 6M-Harnstoffextraktion unterzogen werden, 80% oder mehr is ihrer Schutzaktivität verloren haben. Bei salzextrahierten Keimen dagegen findet man nach Abtrennung des Extraktes lediglich einen Verlust von 10—20% an Schutzaktivität Dadurch, daß der Antigen-Extrakt in einem denaturierenden Milieu keine wesentliche Polydispersität aufweist, ist eine Abtrennung von toxischen Komponenten möglich. Danach ist eine bedeutende Steigerung der Verträglichkeit des Antigens bei seiner Applikation bei Menschen, insbesondere Kindern, zu erwarten. 2^r>

Das Verfahren wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Zu 401 einer Pertussis-Keimsuspension mit J" 100 ■ IO⁹ K/ml werden 611 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCL-Puffer pH 8,0 enthaltend 50 mM EDTA hinzugefügt. Nach dem Mischen werden 14,4 kg Harnstoff und 3,48 kg NaCl zugesetzt, das Volumen wird mit Wasser auf ein Volumen von 601 eingestellt i > und die Suspension über Nacht mit einem Magnetrührer gerührt. Nach Entfernung der Keime durch Zentrifugation (Sharpless-Durchlaufzentrifuge) werden 3 1 einer 2%igen Suspension von AIPO4 im Gemisch mit einer Suspension von 1% Al (OH)₃ hinzugefügt Der Harnstoff wird anschließend durch Dialyse gegen sterile 0,15 M NaCl, in einem Hollow-Fiber-Gerät der Fa. Amicon, entfernt Nach Absitzen des Adsorbats wird das Gesamtvolumen mit isotonischer Kochsalzlösung auf 401 eingestellt Ein so hergestelltes Immunogen brachte im Schutztest nach Kendrick 25 IE/mL

Ein aus dem gleichen Ausgangsmaterial durch Behandlung der Keime mit 0,5 M NaCl hergestellter Extrakt zeigte im Schutzversuch lediglich 4,5 IE/mL

An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3: +3,2 g; Tag 7:+5,8 g.

Beispiel 2

Bei einem Extraktionsverfahren nach Beispiel 1, jedoch ausgehend von 200 - IO⁹ K/ml und einer wäßrigen Lösung von 6 M Guanidin-Hydrochlorid +1 M NaCl wurde der Schutzwert des Extraktes mit 76 ΙΕ/ml gemessen.

An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3: +1,0 g; Tag 7:+5,2 g.

Beispiel 3

Der Extrakt gewonnen laut Beispiel 1, jedoch mit 9,6 kg Hainstoff statt 14,4 kg wird an einem Ultrafilter auf 2 1 eingeengt und auf eine Säule von SephadexW G-150, äquilibriert mit dem Extraktionspuffer (enthaltend 4 M Harnstoff), aufgetragen. Der eingeengte Extrakt brachte vor der Chromatographie bei einem zu 80- 10⁹ K/ml äquivalenten Volumen 8,25 IE/ml entsprechend 130 I E/mg Protein. Das Material entsprechend dem Ausschlußvolumen der Säule bis zu einem Molekulargewicht von ca. 90 000 wird gepoolt und der Harnstoff durch Dialyse gegen 0,15 M Kochsalzlösung entfernt. Die nach der Chromatographie gewonnene Fraktion wurde auf ein der Keimdichte von 360 · IO⁹ k/ml äquivalenten Volumen eingeengt und brachte in dem Schutzversuch 84,3 I E/ml entsprechend 525 I E/mg Protein.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines schatzenden Antigens von Bore Hella pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wäßrigen Lösung eines der Denaturierungsmittel Harnstoff, Guanidin oder deren Salze und eines Neutralsalzes in einer Konzentration von 03—3 Mol/l bei einem pH-Wert von 6—10 bei einer Temperatur von 1—40⁰C und für die Dauer von 0,5 bis 48 Stunden mischt, den flüssigen Oberstand vom Rückstand der Keime abtrennt und danach das Denaturierungsmittel, ggf. nach Zusatz eines wasserunlöslichen Adsorptionsmittels, von der wäßrigen Dispersion des schützenden Antigens abtrennt

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der flüssige Überstand in Gegenwart des Denaturierungsmittels vor dem Zusatz des wasserunlöslichen Adsorptionsmittels gereinigt wird.

3. Keuchhusten-Impfstoff enthaltend Pertussisantigen hergestellt nach Ansprüchen 1 bis 2.