DE1617344B2 - Verfahren zur herstellung eines tetanus-impfstoffes - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffes.

Es sind bereits Verfahren zur Herstellung von Tetanus-Impfstoffen bekannt, die das inaktivierte Tetanus-Toxin, das sogenannte Tetanus-Toxoid, enthalten. Durch Impfstoffe dieser Art kann es teilweise zu Impfreaktionen und Unverträglichkeiten kommen. Es ist bisher kein Weg beschrieben worden, diese Nebenwirkungen auszuschalten.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise durch Züchten von Tetanusbakterien und anschließende Isolierung und Inaktivierung des Toxins gewonnenes Tetanustoxoid in Gegenwart von Harnstoff in einem pH-Bereich von 1,5 bis 6,0 vorzugsweise 4,0 bis 5,0 mit Pepsin behandelt, bis das Toxoid eine Sedimentationskonstante von 5,8 S aufweist, mittels eines Eiweißfällungsmittels in bekannter Weise reinigt und zu einem Impfstoff konfektioniert.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet man Tetanustoxoid, das auf bekannte Weise durch Züchten von Tetanusbazillen und anschließende Isolierung und Inaktivierung des Toxins gewonnen wird und das in den bekannten Vaccinen enthalten ist (vgl. U11 m a η η s Encyclopädie der technischen Chemie, 3. Auflage, Bd. 15, S. 611 ff, [1964]). Die Verträglichkeit dieser Toxoide wird durch das erfindungsgemäße Verfahren überraschenderweise verbessert. Da das Tetanustoxoid in dem angegebenen sauren pH-Bereich nicht löslich ist, wird die erfindungsgemäße Pepsinbehandlung in Gegenwart von Harnstoff, vorzugsweise von 4 bis 6, vorzugsweise 5 Mol Harnstoff, vorgenommen. In Harnstofflösung ist das Tetanustoxoid auch im sauren pH-Bereich, z. B. bei pH 4,5, löslich. Die verhältnismäßig hohe Harnstoffkonzentration beeinflußt die Fermentaktivität des Pepsins nicht. Zweckmäßig führt man die Behandlung mit einer Pepsin-Konzentration von 1 mg Pepsin/100 mg Tetanustoxoid durch. Die Einwirkungsdauer des Pepsins auf das Toxoid wird durch einen Vorversuch ermittelt. Sie hängt von dem Aggregationsgrad des Toxoids ab und beträgt 6 bis 60 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Nach der Pepsinbehandlung, die üblicherweise bei Körpertemperatur (37⁰C) durchgeführt wird, wird das aktive Material zweimal mit einem bekannten Eiweißfällungsmittel, vorzugsweise gesättigter Ammonsulfatlösung, zunächst zur Abtrennung der niedermolekularen Spaltprodukte ausgefällt, dann nach Auflösung des Niederschlages in zwei Stufen fraktioniert, wobei die Vorfällung unwirksam ist und verworfen werden kann, während die zweite Fraktion das Pepsin-behandelte Tetanustoxoid enthält. Auch andere bekannte Eiw'öißfällungsmittel, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, können für die Fraktionierung herangezogen werden. Zur Verwendung als Impfstoff muß das erfindungsgemäß modifizierte Tetanustoxoid noch sterilfiltriert werden. Es kann als sogenannte Fluid-Vaccine benutzt werden oder mit Adjuvans, z. B. Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat, versehen injiziert werden. Das Verfahrensprodukt weist eine gegenüber den bekannten Tetanusvaccinen wesentlich verbesserte Verträglichkeit auf, ist wirksam und bei 4 bis 6° C mindestens 1 Jahr ohne Aktivitätseinbuße haltbar.

Beispiel

Zu 100 ml Tetanus-Toxoid-Lösung, erhalten durch Züchten von Tetanusbakterien in bekannter Weise und anschließende Isolierung und Inaktivierung des Toxins, deren Eiweißgehalt 1,5% beträgt und deren pH-Wert mit etwa 0,5 ml 2 η-Essigsäure auf 4,5 eingestellt worden war, werden 30 g Harnstoff und anschließend 15 mg Pepsin gegeben und die Lösung bei 37° C inkubiert. Die Dauer der Einwirkung wird durch einen Vorversuch ermittelt. Sie hängt von dem Aggregationsgrad des Toxoids ab und betrug im vorliegenden Falle 24 Stunden.

Danach wird mit etwa 1,35 ml 1 n-NaOH auf pH 7,0 eingestellt und mit dem gleichen Volumen, das sind etwa 138 ml, einer gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung versetzt. Das Toxoid fällt dabei aus, wird durch Zentrifugation isoliert, in 50 ml physiologischer NaCl-Lösung gelöst und mit etwa 18,5 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung erneut versetzt. Dieser Niederschlag wird verworfen. Der Abguß wird salzfrei dialysiert und konzentriert.

Vorversuch

Nach 6, 12, 18, 24, 30 usw. Stunden werden Proben entnommen und in der Stärkeelektrophorese auf den Spaltungsgrad geprüft. Da für die Wanderungsgeschwindigkeit im Stärkegel wegen des Siebeffektes die Molekülgröße entscheidend ist, kann die Stärkegelelektrophorese als Beweis für die Molekülverkleinerung herangezogen werden.

Bei der Elektrophorese zeigt sich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Produkt schneller wandert als das Ausgangsprodukt. Im Ausgangsmaterial vorhandene Aggregate, die sich bei der Stärkegelelektrophorese durch eine langsamer wandernde Zone zu erkennen geben, sind im erfindungsgemäß hergestellten Präparat nicht mehr vorhanden. Die Verkleinerung des Moleküls kann auch durch Messung der Sedimentationskonstanten mit Hilfe der Ultrazentrifuge nachgewiesen werden:

Sedimentationskonstante
des Ausgangsmaterials 6,5 S

Sedimentationskonstante
des Verfahrensproduktes 5,8 S

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines Tetanus-Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man in bekannter Weise durch Züchten von Tetanusbakterien und anschließende Isolierung und Inaktivierung des Toxins gewonnenes Tetanustoxoid in Gegenwart von Harnstoff in einem pH-Bereich von 1,5 bis 6,0 vorzugsweise 4,0 bis 5,0 mit Pepsin behandelt, bis das Toxoid eine Sedimentationskonstante von 5,8 S aufweist, mittels eines Eiweißfällungsmittels in bekannter Weise reinigt und zu einem Impfstoff konfektioniert.