NO125455B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av en

tetanus-vaksine.

Oppfinnelsens gjenstand er en fremgangsmåte til fremstilling av en tetanus-vaksine.

Det er allerede kjent fremgangsmåter til fremstilling av tetanus-vaksiner som inneholder det inaktiverte tetanus-toksin,

det såkalte tetanus-toksoid. Ved vaksiner av denne type kan det del-vis komme til podningsreaksjoner og utålbarheter. Det er tidligere ikke omtalt noen måte til å utkople disse bivirkninger.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av tetanus-vaksine.ut fra tetanus-toksoid, fremstilt ved dyrkning av tetanus-bakterier og etterfølgende isolering og inaktivering av toksinet, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at man behandler toksoidet med pepsin i nærvær av urinstoff i et pH-område fra 1,5 til 6,0, renser det ved hjelp av et eggehviteutfellingsmiddel på kjent måte og opparbeider det til en vaksine.

Som utgangsmateriale for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvender man tetanustoksid, som er dannet på kjent måte' ved dyrkning av tetanusbasiller og etterfølgende isolering og inaktivering av toksinet og som er inneholdt i de kjente vaksiner, (sml. Ullmanns Encyclopådie der technischen Chemie, 3- opplag, bind 15, side 611 og følgende (196<*>1)). Tålbarheten av dette toksoid for-bedres overraskende ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Da tetanustoksoidet ikke er oppløselig i det angitte sure pH-området, foretas pepsinbehandlingen ifølge oppfinnelsen i nærvær av urinstoff, idet man fortrinnsvis anvender en urinstoffkonsentrasjon på 3-6, eksempelvis 5 mol urinstoff/liter. I urinstoffoppløsningen er tetanustoksoidet også oppløselig i surt pH-område, f.eks. ved pH 4,5. Den forholdsvis høye urinstoffkonsentrasjon innvirker ikke på pepsinets enzymaktivitet. Fortrinnsvis gjennomfører man behand-lingen med en pepsinkonsentrasjon fra 0,5 til 3,0, eksempelvis på 1 mg pepsin/100 mg tetanustoksoid. Pepsinets innvirkningstid på toksoidet fastslås ved hjelp av et forforsøk. Den avhenger av toksoidets aggregasjonsgrad og utgjør 6 til 60 timer, fortrinnsvis 24 til 48 timer. Etter pepsinbehandlingen som gjennomføres mellom

0 og 45°C, fortrinnsvis ved legemstemperatur (37°C), utfelles det aktive materiale med et kjent eggehviteutfellingsmiddel, fortrinnsvis det samme volum av en mettet ammoniumsulfatoppløsning, først for adskillelse av de lavmolekylære spaltprodukter, deretter opp-løsning av utfellingen fraksjoneres i to trinn, inntil den til en ammoniumsulfatmetning på 22-30$ foretatte forutfelling er uvirksom og kan kastes, mens den annen fraksjon som foregår til en metning på 50%, inneholder det pepsinbehandlede tetanustoksoid. Også andre kjente eggehviteutfellingsmidler, som metanol, etanol eller aceton, kan anvendes for fraksjoneringen. Por anvendelse som podningsstoff må det ifølge oppfinnelsen modifiserte tetanustoksoid dessuten

sterilfiltreres. Det kan benyttes som fluid^aksine eller injiseres utstyrt med et hjelpemiddel, f.eks. aluminiumhydroksyd eller alumi-niumfosfat. Premgangsmåteproduktet har en i forhold til de kjente tetanusvaksiner vesentlig forbedret tålbarhet, er meget godt virksom og ved 4-6°C holdbar minst 1 år uten aktivitetsnedgang. Tålbarheten av det ifølge oppfinnelsen fremstilte podningsstoff er god, vurdert ved hjelp av bevegelsessmerter av den podede og ved metrisk bestemt

diameter av den lokale podningsreaksjon. En ytterligere påvisning av tålbarheten ble foretatt ved hjelp av aktiv anafylaxifors^zSk på marsvin. Immuniserer man marsvin med et antigen, så får de sjokk og dør. Det er også tilfelle når man som antigen benytter til teknikkens stand hørende tetanustoksoid eller et handelsvanlig tetanuspodningsstoff. Av ti slike behandlede marsvin døde alle dyr. Injiseres derimot med tetanustoksoid immuniserte marsvin det i hen-hold til oppfinnelsens dannede fremgangsrnåteprodukt så iakttas en vesentlig bedre tålbarhet: Av ti marsvin overlevde 6 av det omtalte anafylaxiforsøk.

Fremgaagsmåteproduktets -virkning ble bestemt ved oppfriskningspodning. Skal i et akutt tilfelle., eksempelvis ved skader, hurtig oppnås et -høyt antistoffspeil, gjennomføres en oppfriskningspodning eller boosterung. Med boosteréffekten forstår man økningen av immuniteten -med steil, økning av antistoffspeilet ved hjelp av en oppfriskningspodnrng etter lengre tilbakeliggende grunnimmunisering.

Prøven ble utført på 14.1 prøveobjekter. Sammenlignet ble et tetanustoksoid (utgangsprodukt) dannet på kjent måte ved dyrkning av tetanusbakterierog etterfølgende isolering og inaktivering av toksinet med formaldehyd samt fremgangsmåteproduktene. Alle prøveobjekter var grunnimmunisert mot en tetanusinfeksjon.

Tetanustoksoidet inneholder 10 Lf/ml, det ifølge oppfinnelsen dannede fremgangsnråteprodukt 5 Lf/ml. (Med i.f = Limes floculationis forstår man den mengde antigen som utfnokker 1 I.E. av det spesifikke antiserum). Alle prøveobjekter fikk en dose på 0,5 ml. I følgende tabell er det oppstilt beskytteTsesenhetene (I.E. antitoksin/ml serum av prøveobjektet.) etter -oppfriskningspodning med tetanustoksoid og med fremgangsmåteproduktet.

Som oppstillingen viser, er virkningen av fremgangsmåteproduktene lagt mot de to høye titerklasser og således vesentlig bedre enn for tetanustoksoid. Videre ble denne overlegenhet oppnådd allerede ved bare 2,5 Lf/0,5 ml, dvs. ved halvparten av den antigen-mengde som var inneholdt i tetanustoksoidoppløsningen (5>0 Lf/0,5 ml).

Administrering av det ifølge oppfinnelsen fremstilte

podningsstoff foregår intramuskulært eller dypt subkutant.

Produktet fremstilt ifølge oppfinnelsen utmerker seg ved en sedimentasjonskoeffisient, som omtrent ligger mellom 5,5 og 6,3 S (40 til 100%) og 0,8 og 1,0 S (60 til 055).

Eksempel 1.

Til 100 ml tetanustoksoidoppløsning, dannet ved dyrkning av tetanusbakterier på kjent måte og etterfølgende isolering og

inaktivering av toksinet og hvis eggehviteinnhold utgjør 1, 5% og hvis pHrverdi med ca. 0,5 ml eddiksyre 2-n var innstilt til 4,5 settes

30 g urinstoff og deretter 15 mg pepsin og oppløsningen inkuberes ved

37°c« Innvirkningsvarigheten ble fastslått ved hjelp av et forforsøk. Det avhenger av toksoidets aggregasjonsgrad og utgjorde i forelig-gende tilfelle 24 timer.

Deretter innstilles med ca. 1,35 ml l-n NaOH til pH 7,0 og blandes med det samme volum, dvs. ca. 138 ml av en mettet am-moniumsulfatoppløsning. Toksoidet faller da ut og isoleres ved sentrifugering, oppløses i 50 ml fysiologisk NaCl-oppløsning og blandes igjen med 18,5 ml av en mettet ammoniumsulfatoppløsning. Denne utfelling kastes. Dekanteringen dialyseres saltfritt og kon-sentreres.

Forforsøk.

Etter 6, 12, 18, 24, 30 osv. timer uttas prøver og prøves i stivelseselektroforese på spaltningsgraden. Da molekyl-størrelsen er avgjørende for vandringshastigheten i stivelsesgel på grunn av sikteffekten, kan stivelsesgelelektroforese anvendes som bevis for molekylnedsettelse.

Ved elektroforesen viser det seg at det ifølge oppfinnelsen fremstilte produkt vandrer hurtigere enn utgangsproduktet. I utgangsmaterialet tilstedeværende aggregater som gir seg til kjenne ved stivelsesgelelektroforese ved hjelp av en langsomt vandrende sone er ikke mer til stede i preparatet fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Molekylnedsettelsen kan også påvises ved måling av sedimentasjons-koeffisienten ved hjelp av ultrasentrifuge:

Eksempel 2.

100 ml tetanustoksoidoppløsning hvis eggehviteinnhold utgjør 1, 5% og hvis pH-verdi var blitt innstilt med ca. 0, 5 ml 2-n eddiksyre ved 4,0 dialyseres mot 0,003 molar acetatpuffer av pH 4,0 som er 6 molar på urinstoff og inneholder 0,85$ natriumklorid. Deretter tilsettes 15 mg pepsin og oppløsningen inkuberes ved 37°C i 28 timer. Deretter renses spaltproduktet analogt eksempel 1.