DE2461439C3 - Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel

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DE2461439C3 DE2461439A DE2461439A DE2461439C3 DE 2461439 C3 DE2461439 C3 DE 2461439C3 DE 2461439 A DE2461439 A DE 2461439A DE 2461439 A DE2461439 A DE 2461439A DE 2461439 C3 DE2461439 C3 DE 2461439C3
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines schützendes Antigens von Bordetella pertussis durch Extraktion der Keime und eine anschließende Adsorption der extrahierten Antigene an ein Trägermaterial, ferner Pertussis-lmpfstoffe, welche diese Antigene enthalten.
Die herkömmlichen Pertussis-lmpfstoffe zur aktiven Immunisierung gegen Keuchhusten enthalten meist abgetötete Keime der Bordetella pertussis. Von den Pertussiskeimen ist bekannt, daß sie beim Impfling häufig lokal an der Impfstelle Schmerzen und Entzündungen, aber auch Fieber und in seltenen Fällen zudem neurologische Komplikationen wie die gefürchtete Enzephalitis verursachen.
Es ist deshalb schon versucht worden, den keimhaltigen Impfstoff durch einen Extraktimpfstoff mit dem Ziel einer besseren Verträglichkeit zu ersetzen. Die mehrfach beschriebene Herstellung von Extrakten aus Pertussiskeimen mittels Salzlösungen führt zwar zu einer Solubilisierung eines geringen Teils des Schutzantigenkomplexes; die Ausbeuten sind relativ niedrig, die Extrakte bestehen wie die Keime aus einer Vielzahl von Komponenten, die z.T. toxisch sind und zu keiner Verbesserung der Verträglichkeit des Impfstoffes beim Impfling führen.
Eine weitere Reinigung der Salzextrakte ist wegen der Polydispersität des antigenen Materials stark eingeschränkt. Mit den üblichen biochemischen Reinigungsverfahren erreicht man im wesentlichen eine Verteilung der schützenden Aktivität in mehrere Fraktionen, ohne dabei die spezifische Schutzaktivität wesentlich erhöhen zu können.
Zur Verbesserung der Ausbeute wurde auch schon versucht, die Pertussiskeime beispielsweise mit Ultraschall aufzuschließen. Abgesehen von dem erhöhten apparativen Aufwand ist diese Verfahren ebenso unbefriedigend, weil damit das Problem der höheren Reinheit des Schutzantigens nicht gelöst werden konnte.
Es ist hier erwähnenswert, daß der sogenannte histaminsensibilisierende Faktor der Pertussiskeime durch Behandlung mit einer wäßrigen Kochsalzlösung, die 4M Harnstoff enthält gewonnen werden kann. Dabei war es nicht möglich, den Harnstoff ohne Aktivitätsverlust in bezug auf Histaminsensibilisierung
■> zu entfernen. Es ist strittig, ob die histaminsensibilisierende Aktivität dem Schutzantigen ganz oder teilweise entspricht Neben Hinweisen darauf, daß es sich um verschiedene Komponenten handelt, ist von S a t ο, Y, Symp. Series Immunobiol. Standard, VoL 13, S. 214—
ίο 220, beschrieben, daß die Behandlung eines 22 S-Pertussisantigens mit Harnstoff zu einer Zerstörung der schützenden Aktivität führt
Der hier vorgelegten Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen schützenden Antigenkomplex in löslieher Form aus Pertussiskeimen in größeren Ausbeuten und ggf. höherer Reinheit als bisher zu gewinnen und das gereinigte Antigen als wesentlich wirksamen Anteil in Pertussisimpfstoffen zu verwenden.
Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren erreicht werden kann, dessen Kernpunkt darin besteht daß Pertussiskeime mit Lösungen denaturierender Agenzien behandelt werden, die Keime abgetrennt und das solubilisierte Material entweder sofort oder nach weiterer Reinigung im denaturierenden Milieu an ein
>r, wasserunlösliches Trägermaterial adsorbiert wird.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wäßrigen
)» Lösung eines der Denaturierungsmittel Harnstoff, Guanidin oder deren Salze und eines Neutralsalzes in einer Konzentration von 0,3 bis 3 Mol/l bei einem pH-Wert von 6—10 bei einer Temperatur von 1—40°C und für eine Dauer von 0,5 bis 48 Stunden mischt, den
ι·'■ flüssigen Überstand vom Rückstand der Keime abtrennt und danach das Denaturierungsmittel, gegebenenfalls nach Zusatz eines wasserunlöslichen Adsorptionsmittels von der wäßrigen Suspension des schützenden Antigens abtrennt.
•κι Die Behandlung der Pertussiskeime mit der Lösung, die zu einer Extraktion der Keime führt, erfolgt im einfachsten Fall durch Stehenlassen der in der Lösung möglichst homogen suspendierten Keime. Bei dieser Maßnahme muß jedoch mit den längsten Extraktions-
■r> zeiten gerechnet werden. Schon ein sachtes Bewegen der Keime, wie es durch einfaches Rühren erreicht werden kann, verbessert den Wirkungsgrad der Extraktion. Geräte, wie sie für Homogenisierungszwekke bekannt sind, können zur Erhöhung der Ausbeute
mi und zur Verkürzung der Zeit mit Vorteil eingesetzt werden. Je nach dem angewandten Bewegungsmittel beträgt die Extraktionszeit etwa 0,5—48 Stunden. Im Durchschnitt muß mit einer Extraktionsdauer von 18 Stunden gerechnet werden.
r>r> Die Extraktionstemperatur beträgt 1 —400C. Temperaturen unter Raumtemperatur, etwa im Bereich zwischen 1 und 10° C sind bevorzugt.
Die Mischung wird während der Extraktionszeit bei einem pH-Wert zwischen 6 und 10, vorzugsweise bei
wi pH 8 gehalten. Falls sich dieser pH-Wert nicht von allein einstellt, kann er durch Zusatz geeigneter Pufferlösungen geschaffen werden.
Die Trennung von Extrakt und Keimrückstand erfolgt zweckmäßig durch Zentrifugieren. Auch Filtrationsvor-
«iri richtungen, die Mikroorganismen zurückzuhalten vermögen, sind zur Gewinnung des zellfreien Extraktes geeignet.
Es hat sich überraschend gezeigt, daß das schützende
Antigen in einer Lösung, die Denaturierungsmittel enthält, die Eigenschaften eines relativ einheitlich aufgebauten Stoffes aufweist. Seine weitere Reinigung ist deshalb in Gegenwart des Denaturierungsmittels möglich. Eine geeignete Maßnahme hierzu ist beispielsweise die Gelchromatographie, bei der eine Abtrennung von toxischen Komponenten vom schützenden Antigen erreicht werden kann, wenn die Entwicklung mit einem Denaturierungsmittel enthaltenden Puffer vorgenommen wird. Als Medium für die Gelchromatographie eignen sich besonders mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran, im Handel als SephadexW der Firma Pharmacia, Uppsala, oder Copolymere von Acrylamid und Methylenbisacrylamid, im Handel als Bio-Gel P(R> der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond/USA.
Als Puffersubstanzen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kommen die bei biochemischen Arbeiten zur Stabilisierung des pH-Wertes der Lösung eingesetzten chemischen Verbindungen in Frage, vorteilhaft jene, die von N.E Good et al (1966) in Biochemistry 5, 467—477, beschrieben sind, beispielsweise Tris-{hydroxymethyl)-aminomethan. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, den verwendeten Pufferlösungen geringe Mengen (etwa 1 —20 mM) an sogenannten Chelat- oder Komplexbildern, beispielsweise Äthy- !endiamin-tetraacetat (EDTA) zuzusetzen.
Die Wahl des Adsorptionsmittels richtet sich im wesentlichen nach dem gewünschten Verwendungszweck des schützenden Antigens. Im Falle des bevorzugten Anwendungsbereiches eines Pertussisimpfstoffes wird als Adsorbens ein in der Vakzineherstellung erprobtes immunologisches Adjuvans bevorzugt Dies kann anorganischen Ursprungs sein, wie Calciumphosphat oder Aluminiumoxid; vorzugsweise wird AIPO4 und/oder Cy-Aluminiumhydroxid in einer Endkonzentration (Feststoffkonzentration im fertigen Produkt) von 0,05% bis 0,4% (w/v) verwendet. Es kommen jedoch auch organische Polymere, insbesondere polyanionische Adjuvantien in Frage, die in den Lösungen der vorliegenden Denaturierungsmittel unlöslich sind, z. B. Derivate der Polyacrylsäure. Ist eine Applikation an Menschen und Tieren nicht beabsichtigt, kann jedes beliebige für die Adsorption von Proteinen verwendete Adsorbens der Lösung des schützenden Antigens zugefügt werden.
Die Entfernung des Denaturierungsmittels erfolgt zweckmäßig durch Dialyse. Da das schützende Antigen im physiologischen Milieu durch die Dialysemembran nicht durchtreten kann, wird bei zunehmendem Austritt des Denaturierungsmittels durch die Membran das schützende Antigen auf dem Adsorbens niedergeschlagen.
Falls ein steriles Präparat gewünscht wird, kann die Aufarbeitung von der Extraktion bis zu dem adsorbierten Material unter sterilen Bedingungen erfolgen. Alternativ wird vor der Entfernung des Denaturierungsmittels und vor der Zugabe des Adsorbens eine Keimfreifiltration vorgenommen. Die weitere Aufarbeitung hat sodann unter sterilen Bedingungen zu erfolgen.
Unter Denaturierungsmitteln im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten, insbesondere durch Lösung von Wasserstoffbindungen bewerkstelligt werden kann. Besonders geeignet sind hierfür Harnstoff oder Guanidin sowie deren Salze, insbesondere auch Guanidinhydrochlorid. Die Denaturierungsmittel werden in Konzentrationen von 2—6 Mol/l, vorzugsweise 4—6 Mol/l bezogen auf die Gesamtlösung, angewandt
An Neutralsalzen werden bevorzugt die wasserlöslichen Alkalihalogenide wie NaCl oder KCl und zwar in einer Konzentration von 0,5—3 Mol/l, vorzugsweise 1 Mol/1 bezogen auf die Gesamtlösung. Denaturierungsmittel und Neutralsalze haben bei der Extraktion des schützenden Antigens eine synergistische Wirkung.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren kommen Bordetella-pertussis-Keime in Frau ge. Sie werden auf bekannte Weise beispielsweise durch Züchten in Cohen-Wheeier-Nährlösung bei ca. 35° C unter Rühren vermehrt und durch Säurefällung, durch Fällung mit organischen Lösungsmitteln oder durch Zentrifugation gewonnen. Man geht bei der Anreiche-
ιϊ rung der Keime beispielsweise so vor, daß man die Bordetella-pertussis-Fermenterkultur einer sauren Fällung bei pH 3—5, vorzugsweise pH 4, unterwirft Zur Säurefällung sind alle Mineralsäuren vorzugsweise 1 N Salzsäure, geeignet; ferner organische Säuren, z. B.
Essigsäure. Keime, die durch Zentrifugation von dem Kulturmedium getrennt wurden, eignen sich ebenso gut wie mit Hilfe von Aceion oder Säure gefällte Keime. Die Keime werden vorteilhaft in wäßriger Suspension eingesetzt. Die Konzentration kann 1SO · 109—
« 1000 · 109, vorzugsweise 100 ■ 109—400 · 1υ9 pro ml betragen.
Die Prüfung der Wirksamkeit von Pertussisimpfstoffen wird im Tierversuch nach einem von Kendrick 1947 angegebenen Verfahren durchgeführt (P. L K e η d -
id rick, G. Eidering, M. K. Dixon und J. M isηer, Amer. J. Publ. Health 37, 803 (1947) und Fed. Reg. 33, No. 118,8818, Paragraph 73 404 (1968). Hierbei werden je 18 Mäuse mit dem Pertussisantigen in drei Verdünnungsstufen immunisiert und die belastungsfähi-
!■"> ge Immunität nach 13 Tagen durch eine intracerebrale Infektion mit 200 LD» lebenden Keimen von B. pertussis geprüft. Als Standard-Präparat wird stets eine Vakzine mit bekanntem Schutzwert mitgeführt. Der in diesem Test gefundene Schutzwert ist ein Maß für die
w schützende Wirkung des Impfstoffes am Menschen (vgl. hierzu Medical Res. Council Brit. Med. J. No. 5128, 994 (1959).
Bei Extraktion von Pertussis-Keimsuspensionen mit einer Keimdichte von 100 - 109 Keimen pro ml je nach
•r. den angewandten Bedingungen des hier beschriebenen Verfahrens wurden Werte von 25 bis 75 I E/ml gefunden. Ein Impfstoff mit mindestens 8 IE/ml wird als wirksamer Impfstoff allgemein anerkannt. Die Toxität wird nach den Richtlinien des U. S. Department of Health,
w Education und Weifare bestimmt.
10 Mäuse erhalten 0,5ml der 1:2 verdünnten zu prüfenden Pertussis-Vakzine. Gemäß den Forderungen der National Institutes of Health (NIH) in Federal Reg. 33, No. 118, 8818 (1968), Paragraph 73 403, werden
v> Gewichtszunahmen von 3 g/7 Tage gefordert. Bei einem erfindungsgemäß hergestellten Pertussis-Antigen beträgt die durchschnittliche Gewichtszunahme der Tiere nach 72 Stunden 1 — 3 g und nach 7 Tagen 5—6 g. Es enthält somit keine toxischen Anteile der Pertussis-
W) Keime und ist gut verträglich.
Gegenstand der Erfindung sind auch Mittel, die das erfindungsgemäße schützende Pertussis-Antigen enthalten, insbesondere Pertussis-Impfstoffe zur Prophylaxe des Keuchhustens oder zur Herstellung von
h'> therapeutisch oder diagnostisch verwendbaren Pertus-,is-Antiseren, aber auch diagnostische Präparate, die das schützende Pertussis-Antigen oder davon gewonnene Antiseren enthalten.
Die Suspension des Antigens kann mit antimikrobiellen Konservierungsmitteln wie Natrium-timerfonat versetzt werden. Das Pertussis-Antigen kann zur Herstellung eines Polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt einen wesentlichen Fortschritt bei der Herstellung des schützenden Pert'jssis-Antigens bzw. von Pertussis-Impfstoffen dar. Das Verfahren ist einfach. Die erzielte Schutzaktivität des adsorbierten Extrakt-Antigens ist im Hinblick auf bisher aus der Literatur bekannten Daten überraschend hoch. Die hohe Ausbeute in dem Extrakt wird auch dadurch verdeutlicht, daß Keime, die einer 6M-Harnstoffextraktion unterzogen werden, 80% oder mehr ihrer Schutzaktivität verlören haben. Bei salzextrahierten Keimen dagegen findet man nach Abtrennung des Extraktes lediglich einen Verlust von 10—20% an Schutzaktivität. Dadurch, daß der Antigen-Extrakt in einem denaturierenden Milieu keine wesentliche Polydispcrsität aufweist, ist eine Abtrennung von toxischen Komponenten möglich. Danach ist eine bedeutende Steigerung der Verträglichkeit des Antigens bei seiner Applikation bei Menschen, insbesondere Kindern, zu erwarten.
Das Verfahren wird in den folgenden Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Zu 401 einer Pertussis-Keimsuspension mit 100 · 109 K/ml werden 6 11 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCL-Puffer pH 8,0 enthaltend 50 mM EDTA hinzugefügt. Nach dem Mischen werden 14,4 kg Harnstoff und 3,48 kg NaCl zugesetzt, das Volumen wird mit Wasser auf ein Volumen von 60 1 eingestellt und die Suspension über Nacht mit einem Magnetrührer gerührt. Nach Entfernung der Keime durch Zentrifugation (Shurpless-Durchlaufzentrifuge) werden 3 1 einer 2%igen Suspension von AIPO4 im Gemisch mit einer Suspension von 1% Al (OH)3 hinzugefügt Der Harnstoff wird anschließend durch Dialyse gegen sterile 0s15M NaCl, in einem Hollow-Fiber-Gerät der Fa. Amicon, entfernt Nach Absitzen des Adsorbals wird
■> das Gesamtvolumen mit isotonischer Kochsalzlösung auf 401 eingestellt. Ein so hergestelltes Immunogen brachte im Schutztest nach Kendrick 25 IE/ml.
Ein aus dem gleichen Ausgangsmaterial durch Behandlung der Keime mit 0,5 M NaCl hergestellter
ι ο Extrakt zeigte im Schutzversuch lediglich 4,5 I E/ml.
An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3: +3,2 g; Tag 7:+5,8 g.
Beispiel 2
n Bei einem Extraktionsverfahren nach Beispiel 1, jedoch ausgehend von 200 - 109 K/ml und einer wäßrigen Lösung von 6 M Guanidin-Hydrochlorid + 1 M NaCl wurde der Schutzwert des Extraktes mit 76 ΙΕ/ml gemessen.
.«ι An der Maus gemessene Toxizität: Tag 3: +1,Og; Tag 7:+5,2 g.
Beispiel 3
Der Extrakt gewonnen laut Beispiel 1, jedoch mit :; 9,6 kg Harnstoff statt 14,4 kg wird an einem Ultrafilter auf 2 I eingeengt und auf eine Säule von SephadexW G-150, äquilibriert mit dem Extraktionspuffer (enthaltend 4 M Harnstoff), aufgetragen. Der eingeengte Extrakt brachte vor der Chromatographie bei einem zu j" 80 10s K/ml äquivalenten Volumen 8,25 1 E/ml entsprechend 130 ΙΕ/mg Protein. Das Material entsprechend dem Ausschlußvolumen der Säule bis zu einem Molekulargewicht von ca. 90 000 wird gepoolt und der Harnstoff durch Dialyse gegen 0,15 M Kochsalzlösung entfernt. Die nach der Chromatographie gewonnene Fraktion wurde auf ein der Keimdichte von 360 · 109 k/ml äquivalenten Volumen eingeengt und brachte in dem Schutzversuch 84,3 ΙΕ/ml entsprechend 525 I E/mg Protein.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella pertussis, dadurch gekennzeichnet, daß man Keime von Bordetella pertussis mit einer wäßrigen Lösung eines der Denaturierungsmittel Harnstoff, Guanidin odar deren Salze und eines Neutralsalzes in einer Konzentration von 03—3 Mol/l bei einem pH-Wert von 6—10 bei einer Temperatur von 1—40°C und für die Dauer von 0,5 bis 48 Stunden mischt den flüssigen Überstand vom Rückstand der Keime abtrennt und danach das Denaturierungsmittel, ggf. nach Zusatz eines wasserunlöslichen Adsorptionsmittels, von der wäßrigen Dispersion des schützenden Antigens abtrennt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der flüssige Überstand in Gegenwart des Denaturierungsmittels vor dem Zusatz des wasserunlöslichen Adsorptionsmittels gereinigt wird.
3. Keuchhusten-Impfstoff enthaltend Pertussisantigen hergestellt nach Ansprüchen 1 bis 2.
DE2461439A 1974-12-24 1974-12-24 Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel Expired DE2461439C3 (de)

Priority Applications (18)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE2461439A DE2461439C3 (de) 1974-12-24 1974-12-24 Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von Bordetella Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel
ES443624A ES443624A1 (es) 1974-12-24 1975-12-18 Procedimiento para la preparacion de un antigeno protector de bordetella pertussis.
NL7514858A NL7514858A (nl) 1974-12-24 1975-12-19 Beschermend kinkhoest-antigeen, zijn bereiding en preparaten daarvan.
US05/643,123 US4029766A (en) 1974-12-24 1975-12-22 Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen
DK586575A DK143317C (da) 1974-12-24 1975-12-22 Fremgangsmaade til udvinding af et antigen fra bordetella pertussis
LU74088A LU74088A1 (de) 1974-12-24 1975-12-22
CH1660875A CH628246A5 (de) 1974-12-24 1975-12-22 Verfahren zur herstellung eines schuetzenden pertussis-antigens.
IE2807/75A IE42622B1 (en) 1974-12-24 1975-12-23 Protective antigen from pertussis, process for its preparation and products containing this antigen
SE7514601A SE431057B (sv) 1974-12-24 1975-12-23 Forfarande for framstellning av ett skyddande antigen ur bordetella pertussis
AT980275A AT355203B (de) 1974-12-24 1975-12-23 Verfahren zur herstellung eines schuetzenden antigens von bordetella pertussis
CA242,453A CA1059027A (en) 1974-12-24 1975-12-23 Extraction of protective antigen from b pertussis and antigen
AU87808/75A AU496345B2 (en) 1974-12-24 1975-12-23 Protective antigen from pertussis process for its preparation and products containing this antigen
FR7539711A FR2295758A1 (fr) 1974-12-24 1975-12-24 Antigene protecteur de la coqueluche, son procede de preparation et produits contenant cet antigene
JP50153512A JPS6222970B2 (de) 1974-12-24 1975-12-24
IL7548730A IL48730A (en) 1974-12-24 1975-12-24 Protective pertussis antigen,process for its preparation and products containing this antigen
BE163118A BE837082A (fr) 1974-12-24 1975-12-24 Antigene protecteur de la coqueluche, son procede de preparation et produits contenant cet antigene
GB52894/75A GB1537849A (en) 1974-12-24 1975-12-24 Protective antigen from pertussis process for its preparation and products containing this antigen
MX766631U MX3785E (es) 1974-12-24 1976-01-05 Procedimiento para la preparacion de un antigeno protector de bordetella pertussis

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DE2461439A1 DE2461439A1 (de) 1976-07-01
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DE2461439C3 true DE2461439C3 (de) 1980-03-20

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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2393065A1 (fr) * 1977-05-31 1978-12-29 Merieux Inst Procede de separation de lipides d'endotoxines bacteriennes et notamment d'endotoxine de bordetella pertussis
US4275000A (en) * 1977-08-22 1981-06-23 National Research Development Corporation Peptide macromolecular complexes
US4196192A (en) * 1977-10-28 1980-04-01 American Cyanamid Company Combined Haemophilus influenzae type b and pertussis vaccine
NZ188211A (en) * 1977-10-28 1984-09-28 American Cyanamid Co Isolation of polyribosyl ribitol phosphate(prp)from haemophilus influenzae type b;vaccine comprising prp and bordetellapertussis antigens
DE2961293D1 (en) * 1978-02-17 1982-01-14 Nat Res Dev Immunogenic cell envelope preparations
US4247452A (en) * 1978-03-01 1981-01-27 The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland Purification of pertussis haemagglutinins
DE3043291A1 (de) * 1980-11-17 1982-07-01 Dso Pharmachim Vakzine gegen keuchhusten
GB2144129B (en) * 1981-08-24 1985-10-09 Vilas V Likhite Antigens as immunostimulant adjuvants
HU188847B (en) * 1983-02-22 1986-05-28 Human Oltoanyagtermeloe Es Kutato Intezet,Hu Process for producing liophylized combined vaccines
US4705686A (en) * 1986-05-09 1987-11-10 American Cyanamid Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine
US4845036A (en) * 1987-02-03 1989-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for isolation of the B oligomer of pertussis toxin
US5139776A (en) * 1987-04-24 1992-08-18 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Method for culturing Bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine
CA1337859C (en) * 1987-04-24 1996-01-02 Masashi Chazono Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
CN101784655A (zh) * 2007-04-27 2010-07-21 菲尼克斯股份有限公司 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3141824A (en) * 1961-05-19 1964-07-21 Lilly Co Eli Pertussis antigen
US3395219A (en) * 1964-12-11 1968-07-30 Merck & Co Inc Process for production of pertussis antigen
US3405218A (en) * 1965-09-22 1968-10-08 Parke Davis & Co Extracting bordetella pertussis antigens with lithium bromide
US3465078A (en) * 1965-10-21 1969-09-02 Sydney Z Spiesel Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6222970B2 (de) 1987-05-20
IL48730A (en) 1978-10-31
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LU74088A1 (de) 1976-11-11
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DE2461439B2 (de) 1979-07-12
SE7514601L (sv) 1976-06-25
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IE42622B1 (en) 1980-09-10

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