DE1951256B2

DE1951256B2 - Verfahren zur Herstellung eines formalinisierten Allergens und dieses Allergen enthaltende Mittel

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Publication number: DE1951256B2
Application number: DE1951256A
Authority: DE
Inventors: David George Altadena Calif. Marsh (V.St.A.)
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1968-10-10
Filing date: 1969-10-10
Publication date: 1980-02-14
Also published as: CH525004A; NL6915389A; NO132132C; ES372271A1; DE1951256C3; DK134781B; IL33140A; DE1951256A1; FI48156B; NL158387B; FI48156C; FR2020311B1; LU59609A1; IL33140A0; NO132132B; FR2020311A1; DK134781C; BE740136A; US4226853A; IT1060054B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines formalinisierten Allergens mit niedriger allergener Aktivität auf menschliche Lebewesen, das sich von Allergenhaltigen Materialien herleitet und befähigt ist, in Säugern die Bildung von Antikörpern gegen das native Allergen in merklichen Konzentrationen zu induzieren, bei dem ein Extrakt des Allergen-haltigen Materials mit verdünnter Formaldehydlösung inkubiert wird.

Patienten, die an plötzlich auftretenden Allergien (Atopien) leiden, vermögen spezielle Arten von allergischen Antikörpern (Reaginen) bei der Behandlung mit bestimmten Substanzen (Allergenen), gegenüber welchen sie empfindlich sind, zu entwickeln. Die Reagine werden dabei fest mit bestimmten Geweben, insbesondere mit Epithelgeweben, verknüpft Anschließend an ein EinwirkenlaEsen des sensitisierenden allergenen Materials erfolgt eine physikalische Vereinigung zwischen dem. bzw. den Allergenen und seinen bzw. ihren homologen Reaginen, was allergische Äußerungen an den Stellen der Reagin-Allergen-Kombination zur Folge hat Allergische Lebewesen vermögen ferner sogenannte »blockierende Antikörper« eines Nicht-Reagin-Typs zu entwickeln. Diese Antikörper vermögen sich mit dem Allergin zu vereinigen und dieses zu inaktivieren, und zwar im allgemeinen ohne unerwünschte Nebenreaktionen. Eine reaginische Aktivität wird dem Immunoglobulin E (IgE) und eine »blockierende« Aktivität hauptsächlich dem IgG in dem Serum sowie IgA in Sekretionen zugeschrieben.

Unter dem erfindungsgemäß verwendeten Begriff »allergisch« sollen Allergien des unmittelbaren (atopisehen) Typs verstanden werden.

Es ist seit langem klinische Praxis, einen allergischen Patienten mit allmählich zunehmenden Dosen wäßriger Extrakte zu spritzen, welche das allergene Material bzw. die allergenen Materialien enthalten, gegenüber wel-

jt chem bzw. welchen der Patient empfindlich ist Die Absicht, welche hinter dieser Behandlung steht, besteht hauptsächlich darin, die Konzentration an schützendem blockierendem Antikörper in dem Serum (sowie anderen Körperflüssigkiten) bis zu einem solchen Grad

jo aufzubauen, bei welchem diese Antikörper in wirksamer Weise mit dem gewebefixierten Reagin für Allergen, welches in den Körper gelangt, reagieren kann, so daß auf diese Weise die allergischen Reaktionen inhibiert werden. In bestimmten Fällen konnte diese Therapie die

j5 Erzeugung von Reaginen herabsetzen und die Zellempfindlichkeit gegenüber eingespritzten Allergenen vermindern. Die immunisierenden Dosen des allergenen Extrakts müssen allmählich während der Behandlung gesteigert werden, um die Gefahr eines allgemeinen allergischen (anaphylaktischen) Ansprechens in dem Patienten auf einem Minimum zu halten.

Die Hauptnachteile dieser Immunotherapie sind folgende:

1. Es sind über viele Wochen hinweg wiederholte ⁴⁾ Injektionen erforderlich.

2. Die Behandlung vermag selten das allergische Syndrom zu lindern und

3. die Gefahr einer allgemeinen anaphylaktischen Reaktion ist während einer jeden Stufe der

⁾⁽⁾ Behandlung immer vorhanden.

Die ursprüngliche Therapie wurde daher mit dem Ziel geändert, diese Nachteile zu beseitigen. In neuerer Zeit entwickelte Behandlungsmethoden bestehen darin, den

Patienten entweder mit Wasser-in-Öl-Emulsionen des allergenen Extrakts zu immunisieren oder ein eine langsame Freisetzung ermöglichendes Adjuvans, wie beispielsweise ein Alginat, mit einem Extrakt des allergenen Materials zu verabreichen. Derartige Metho-

bo den sind jedoch nicht vollständig befriedigend, und zwar wegen des Auftretens anaphylaktischer und machmal toxischer Reaktionen in dem Patienten oder wegen des Versagens derartiger Präparate bei der Durchführung von klinischen Tests.

_b5 Es wurden bereits allergene Maferialien chemisch oder physikalisch behandelt, um ihre allergenen Eigenschaften merklich zu reduzieren. Dabei sollen diese Materialien jedoch ihr Vermögen beibehalten, ein

allergisches Lebewesen gegenüber dem natürlichen Allergen zu schützen. Ein Immunotherapie allergischer Lebewesen unter Einsatz derartig modifizierter Allergene sollte, wie man hoffte, die gewünschte immunisierenden Eigenschaften des natürlichen Allergens beibehalten, und zwar in erster linie in dem Sinne, daß gegen das natürliche Allergen blockierende Antikörper in merklicher Menge erzeugt werden. Ferner sollte die reduzierte Allergenizität derartig modifizierter Materialien die Verwendung merklicher gesteigerter Dosen des Immunisierungsmaterials ermöglichen und auf diese Weise in erheblichem Ausmaß die Menge des erzeugten schützenden Blockierungs-Antikörper erhöhen.

So ist aus der US-PS 20 19 808 ein Verfahren zum Entgiften eines Pollenextraktes bekannt, bei dem man den Extrakt mit Formaldehyd versetzt und zusammen inkubiert Unter den dort vorgeschlagenen Inkubationsbedingungen werden jedoch die Proteinmaterialien, aus denen das Allergen hauptsächlich besteht, vollständig denaturiert und desaktiviert

In der FR-PS 13 20 769 ist ein Verfahren zur Herstellung von Toxoiden beschrieben, bei dem ein bakterielles Toxin mit Formaldehyd in Gegenwart von Aminen behandelt wird. Diese Verfahrensweise ist jedoch nicht unmittelbar auf Allergene übertragbar, da Toxoide andere Eigenschaften als Allergene aufweisen.

Es wurde nun gefunden, daß bei Einhaltung bestimmter Verfahrensbedingungen auch bei Verwendung einer Formaldehydlösung die Hauptmenge der Allergen-enthaltenden Substanzen in einer solchen Weise modifiziert werden kann, daß die Nachteile der natürlichen Allergene bezüglich ihrer Verwendung in der Immunotherapie beseitigt werden. Nachfolgend v/erden alle Allergen-enthaltenden Substanzen einfach als Allergen bezeichnet, obwohl nicht alle Komponenten einer Allergen-enthaltenden Substanz notwendigerweise Allergene sind. Bezüglich der erfindungsgemäßen Formaldehyd-Behandlung sollen die Begriffe »formalinisiert« und »Formalinisierung« die Behandlung Aminofunktioneller allergener Materialien mit Formaldehyd beschreiben, und zwar für die Fälle, in welchen definitiv eine chemische Reaktion zwischen Aminogruppen und Formaldehyd stattfindet und inter- oder intramolekulare Methylenbrückenbindungen zwischen oder innerhalb der Allergenmoleküle selbst oder zwischen Allergen und anderen reaktiven Molekülen, die in der Reaktionsmischung vorliegen, geschaffen werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren der eingangs geschilderten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man so

a) das Allergen-haltige Material mit einem wäßrigen Puffer mit einem pH von 6 bis 8,5 extrahiert,

b) die nicht-allergenen Substanzen auf übliche Weise aus dem löslichen Teil des Extraktes entfernt, und

c) die praktisch sämtliche Allergen-haltigen Materia- " lien enthaltende Lösung von b) in einer nicht-phenolischen Umgebung mit 0,025 bis 0,5 molarer Formaldehydlösung bei einer Temperatur von 15 bis 34° C gegebenenfalls in Gegenwart eines Additivs aus der Reihe der aliphatischen Aminosäu- ^b0 ren, aliphatischen Carbonsäureamide oder aliphatischen Diamine mit jeweils bis zu zu 7 Kohlenstoffatomen inkubiert

Die auf diese Weise behandelten Allergene können in (,5 Form hochgereinigter Substanzen oder in Form roher Extrakte verwendet werden. Unter dem Begriff »nicht-phenoisch« ist zu verstehen, daß nur Spurenmengen an zugesetzten phenolischen Verbindunen in der Umgebung der Formalinisierungsreaktion zugegen sind. Dieser Begriff schließt jedoch nicht das Vorliegen phenoüscher Hydroxylgruppen in den Allergenen als solche aus. Derartige Allergene enthalten bekanntlich in natürlicher Weise in einigen Fällen derartie Gruppen als Teil der komplexen proteinhaltigen Struktur.

Die Formalinisierung erfolgt im Verfahren der Erfindung mit verdünnter Formaldehydlösung oder einer Lösung einer Formaldehyd freigesetzten Verbindung, wie Hexamethylentetramin (Methenamin).

Die im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen formalinisierten Allergene eignen sich zur Durchführung einer Immunotherapie (Desensitierung) bei Lebewesen, die an plötzlich auftretenden Allergien leiden. Die Allergene sind ferner zur Immunisierung von Säugetieren geeignet, wobei Antikörper erzeugt werden, die mit dem natürlichen Allergen reagieren.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, kann man annehmen, daß ein Hauptgrund, weshalb die formalinisierten Allergene den bisher hergestellten Formaldehyd-behandelten Allergenen überlegen sind, darin liegt, daß Phenol von der Reaktionslösung ferngehalten wird. Phenol, das in den Reaktionslösungen bei der Durchführung der bisher bekannten Verfahren vorgelegen hat, wird vorzugsweise in die erhaltenen Produkte infolge einer chemischen Reaktion zwischen Aminomethylolgruppierungen an den Aminoenthaltenden Allergenen (Zwischenprodukte des Typs A in der folgenden Gleichung) und Phenol eingebaut. Eine derartige chemische Substitution von phenolischen Gruppen an Amino-enthaltenden Molekülen führt bekanntlich zu Derivaten, deren überwiegende immunisierende Eigenschaften in einem erheblichen Ausmaß davon abhängen, ob phenolische Stellen in dem Molekül vorkommen. Diese phenolischen Stelllen spielen eine weit größere Rolle als andere Stellen des Moleküls. So besitzen formaldehyd-behandelte Allergene, in denen Phenol enthalten ist, nicht die gewünschten, vorstehend definierten immunisierenden Eigenschaften, da eine Immunotherapie unter Verwendung derartiger Materialien zu Antikörpern führt, welche hauptsächlich gegen die frisch eingebauten phenolischen Gruppen und nicht gegen ursprüngliche Teile des Allergens, gegen welche Antikörper in erheblichen Mengen produziert werden müssen, falls gewünschte immunisierende Eigenschaften erzielt werden sollen, gerichtet sind.

Im Gegensatz zu den Erkenntnissen der bisher bekannten Arbeiten führt eine Immunisierung mit den erfindungsgemäßen formalinisierten Allergenen zu einer übermäßigen Erzeugung von Antikörpern gegen einige natürliche Teile der Allergenmoleküle. Ein erheblicher Teil eines solchen Antikörpers ist dazu in der Lage, eine blockierende Wirkung auf die natürlichen Allergenmoleküle auszuüben.

Werden rohe AHergene verwendet, dann sollten vorzugsweise fettartige Substanzen sowie nicht-allergene Materialien mit niederem Molekulargewicht in den natürlichen Substanzen vor der Formalinisierung entfernt werden, wobei jedoch diese Entfernung nicht unbedingt notwendig ist. Die Umsetzung zwischen den rohen oder stark gereinigten allergenen Materialien und dem Formaldehyd kann in Gegenwart eines Additivs mit niederem Molekulargewicht durchgeführt werden. Geeignete Additive, die gewöhnlich weniger als 8 Kohlenstoffatome zusätzlich zu etwa vorhandenen funktionellen Gruppen aufweisen, sind aliphatische Diamine, aliphatische Carbonsäureamide und aliphati-

sehe Aminosäuren. Spezielle Beispiele sind 1,4-Diaminobutan, Adipamid, Lysin, Ornithin, Arginin, Asparaginsäure, Serin und Alanin. Das Additiv soll derart sein, daß es sich chemisch mit den Pollenkomponenten während des Formalinisierungsverfahrcns vereinigt Im Vergleich zu formalinisierten Allergenen, die durch Behandlung mit Formaldehyd allein hergestellt worden sind, besitzen einige der formalinisierten Allergene, die in Kombination mit einem Additiv hergestellt worden sind, in größerem Ausmaß die gewünschten, vorstehend erörterten Immunisierungseigenschaften.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, nimmt man an, daß unter den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen der Formaldehyd in reversibler Weise mit freien Aminogruppen an Proteinen, Peptiden und Aminosäuren sowie mit den Aminogruppen von Aminozuckern, die in der Reaktionsmischung vorliegen, reagiert Unter Verwendung der Symbole R, R¹ oder dergleichen zur Kennzeichnung von Proteinresten, Peptidresten, Aminosäureresten, Glycoproteinrestei. sowie anderen möglichen Resten, die chemisch mit den nachstehend angegebenen reaktionsfähigen Gruppierungen verknüpft werden können, kann die nachstehend angegebene Reaktionsserie, welche wahrscheinlich abläuft, formuliert werden:

R-NH₂ + CH,O

R-NHCH₂OH (A)

10

15 Die instabile Aminomethylolgruppe (Zwischenprodukt A), die an den Allergenmolekülen selbst oder an Additiven oder anderen nicht-allergenen Substanzen, die zusammen mit dem Allergen vorkommen, vorhanden sein kann, kann dann mit bestimmten anderen reaktionsfähigen Gruppen unter Bildung der stabileren Methylenbrückenstrukturen in der folgenden Weise reagieren:

(a) Mit Guanidinogruppen von Arginin (an Proteinen, Peptiden oder anderen, eine oder mehrere Guanidinogruppen enthaltenden Additiven, beispielsweise Arginin):

R-NHCH₂OH +

H₂N

\ - H₂O H

C —Ν—R¹ R-NHCH₂N

/" H +H₂O \

HN C —Ν—R¹

/ H
HN

(b) Mit Säureamiden (an Proteinen, Peptiden oder Additiven, welche eine oder mehrere Säureamidgruppen enthalten, beispielsweise Adipamid):

R-NHCH₂OH + H₂N-C-R"

R-NHCH₂N-C-R"

+ H₂O H Il

(c) Mit bestimmten an matischen Gruppen (an Proteinen oder dergleichen, beispielsweise Tyrosylresten in Prote inen):

DlII

R"¹ /

CH₂-CH (D)

_RIV

R-NHCH₂OH +

-H₂O R-NHCH₂

OH

Diese Stabilität der Derivate liegt gewöhnlich in der Reihenfolge: D >C> B.

Daher kann jede allergene Determinate, die eine Aminogruppe, eine Guanidinogruppe, ein Säureamid oder einen reaktiven aromatischen Rest enthält (beispielsweise Tyrosin, Tryptophan oder Histidin) modifiziert und durch Formaldehydbehandlung nicht-allergen gemacht werden. Ferner kann eine allergene Determinate, die nicht aus den vorstehend angegebenen Gruppierungen besteht, durch Reaktionen, die an eo benachbarten (oder sogar an relativ entfernten Stellen) an dem Allergenmolekül stattfinden, modifiziert und nicht-allergen gemacht werden, vorausgesetzt, daß eine sich anschließende sterische Veränderung in der allergenen Determinate in einer solchen Weise stattfindet, daß sie nicht länger als solche durch das homologe Reagin erkannt wird.

Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß. falls ein relativ großer Überschuß an einem Additiv vorliegt, dieser vorzugsweise an solchen Reaktionen teilnimmt, welche sich zwischen dessen reaktiven Gruppierungen und Formaldehyd abspielen. Derartige Reaktionen laufen eher ab als ähnliche Reaktionen zwischen analogen reaktionsfähigen Gruppierungen an dem Allergenmolekül mit Formaldehyd. Liegt beispielsweise Lysin als Additiv vor, dann werden die meisten der verfügbaren Guanidinoreste, Säureamidreste und reaktionsfähigen aromatischen Reste eines Allergenmoleküls durch Methylenbrücken mit dem Lysinadditiv verknüpft. Derartige Verknüpfungen treten gegenüber einer Anknüpfung von Lysinresten an das Allergenmolekül selbst bevorzugt auf.

Eng verwandte Pflanzen- und Tierspezies erzeugen viele Materialien, die oft sowohl in antigener als auch in allergener Beziehung ähnlich sind. Beispielsweise enthalten praktisch alle GrasDollen (insbesondere

diejenigen, welche von hauptsächlicher Bedeutung im Zusammenhang mit Heuschnupfen sind) drei wichtige, jedoch voneinander verschiedene Gruppen immunochemisch nahe verwandter Allergene, die als Gruppen I, II und HI eingeteilt worden sind. Dabei ist die Gruppe I in allergener Hinsicht von hauptsächlicher Bedeutung. Daher kann ein Allergen der Gruppe I eines Graspollens dazu verwendet werden, ein formalinisiertes Derivat herzustellen, das die gewünschten immunisierenden Eigenschaften bezüglich der natürlichen Gruppe I vieler Spezies von Graspollen besitzt. Eine angestrebte formalinisierte Graspollen-Allergen-Zubereitung kann daher aus einem Extrakt aus einer Mischung einer relativ kleinen Anzahl verschiedener Graspoilen hergestellt werden (beispielsweise aus vielleicht 4 bis 6 verschiedenen Spezies, die derart ausgewählt werden, daß sie einen repräsentativen Querschnitt verschiedener immunochemischer allergener Graspollengruppen enthalten, welche die Ursachen für Heuschnupfen sind).

Rohe allergene Zubereitungen, die besonders geeignet zur Durchführung einer Formalinisierung sind, können in der Weise hergestellt werden, daß die natürlichen Allergen-enthaltenden Materialien mit wasserfreiem und peroxydfreiem Äther entfettet werden und die entfetteten Materialien mit einer wäßrigen Lösung, die auf einen pH von 6—8 gepuffert ist (beispielsweise 0,125m-NH4HCO3) extrahiert werden. Gegebenenfalls vorliegende nicht-allergene Substanzen mit niederem Molekulargewicht können anschließend aus dem Extrakt durch Dialyse durch eine semipermeable Membran (beispielsweise ein Visking-Rohr) entfernt werden, wobei jedoch auch eine Gelfiltration oder eine ähnliche Methode zur Erzielung ähnlicher Ergebnisse in Frage kommt. Wahlweise können Materialien mit hohen Molekulargewichten aus dem Extrakt durch ein Salz- oder Lösungsmittelausfällungsverfahren ausgefällt werden, ohne daß dabei eine merkliche irreversible Denaturierung erfolgt Diese Materialien mit hohem Molekulargewicht können aus den ausgefällten Materialien in Form einer wäßrigen Lösung wLier hergestellt werden. Gereinigte oder teilweise gereinigte allergene Substanzen können nach Methoden hergestellt werden, wie sie in üblicher Weise zur Abtrennung von Makromolekülen aus komplexen Mischungen angewendet werden. Geeignete Reinigungsmethoden werden in der Literatur zur Reinigung von Fischallergenen, Ambrosiapflanzenpollen und Raigraspollen beschrieben. Diese Materialien sind jedoch nicht die einzigen allergenen Materialien, die zur Durchführung des Formalinisierungsverfahrens eingesetzt werden können.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf besondere Allergen-enthaltende Materialien oder Extrakte beschränkt Erfindungsgemäß können Pflanzenpollen-Allergen-enthaltende Materialien, insbesondere diejenigen von Gräsern, Bäumen und Unkräutern, die Allergien auslösen, erfindungsgemäß extrahiert und mit Formaldehyd behandelt werden. Beispiele für Pollen aus der Grasfamilie (Gramineae), die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, sind Wiesenschwingel (Festuca elatior), glattstieliges Gras (Poa pratensis) und Knäuelgras (Dactyllis glomerata) des Tribus Festuceae, gemeines Raigras (Lolium perenne) und italienisches Raigras (Lolium multifluorum) des Tribus Hordeae, Timotheusgras (Phelum pratense) und feines Straußgras (Agrostis palustris) des Tribus Agrostideae sowie süßes Geruchgras (Anthoxanthum odoratum) des Tribus Phalarideae. Vergleichbare Beispiele von Baumpollen sind verschiedene Spezie von Walnuß, wie beispielsweise Juglans califomica, Birke, (beispielsweise Betula alba) Eiche (beispielsweise Quercus alba) und Ulmen (beispielsweise Ulmus parvifolia). Geeignete Unkrautpollen sind beispielsweise die kurze Ambrosiapflanze (Ambrosia elatior), die lange Ambrosiapflanze (Ambrosia trifida), die russische Distel (Salsola pestifer), gemeiner Salbei (Artemisia tridentata) und englischer

ίο Wegerich (Plantago lanceolata). Andere allergene Materialien, die verwendet werden können, sind beispielsweise: Extrakte, die ganze Körper und/oder Ausscheidungen und Sekrete von Hausstaubmilben des Genus Dermatophagoides und verwandter Genera enthalten, Lösungen von Nahrungsmittei-Aiiergenen, wie beispielsweise Ovalbumin, das von Hühnereiern extrahiert worden ist, Schimmelpilzextrakte (beispielsweise Alternaria, Penicillium Aspergillus, Helminthosporium oder dergleichen), Extrakte aus Pflanzenkeimen und -fasern (beispielsweise Baumwolle, Rizinus oder dergleichen) sowie Extrakte von Stechinsekten (beispielsweise Bienen und Wespen).

Hochgereinigte oder teilweise gereinigte Allergene können ebenfalls formalinisiert werden, beispielsweise die Graspollen-Allergene der Gruppe I, das Antigen E von Ambrosiapflanzenpollen sowie teilweise gereinigte Hausstaubmilben -Extrakte.

Die Konzentrationen an Allergen, Formaldehyd sowie in der Reaktionsmischung etwa vorhandenen Additiven sowie die Temperatur, der pH und die Zeitspanne der Inkubation der Reaktionsmischung, welche optimale Formalinisierungsbedingungen zur Folge hat, stehen in gewissem Grad in einer Wechselbeziehung zueinander. Die nachstehend angegebenen Bedingungen werden vorzugsweise eingehalten, wobei jede Bedingung zur Aufrechterhaltung anderer Bedingungen innerhalb bestimmter Grenzen gehalten wird, um das gewünschte formalinisierte Allergen zu erhalten. Jeder Reaktionslösung kann ein Konservierungsmittel, wie beispielsweise Natrium-o-(äthyiquecksiiberthio)-benzoat (»Merthiolate«), zugesetzt werden. Die Zugabe kann in einem Verhältnis von 1 :10 000 erfolgen.
Die Endkonzentration der allergenen Materialien, die zur Durchführung der Formaldehydreaktion eingesetzt werden, sollte vorzugseeise 1. derart sein, daß alle Komponenten vollständig löslich sind, 2. nicht so hoch sein, daß eine übermäßige intermolekulare Vernetzung zwischen den allergenen Komponenten während der

so Reaktion erfolgt, und 3. mit der Konzentration an Formaldehyd sowie an etwa eingesetzten Additiven verträglich sein. Die Lösungen sollten in einem wäßrigen Puffer hergestellt werden, der vorzugsweise einen pH von ungefähr 7,5 und eine geeignete Molarität besitzt, um diesen pH innerhalb eines Bereiches von ungefähr ±1,0 während des Verlaufs der Reaktion aufrecht zu erhalten, damit das Auftreten der gewünschten Formaldehydreaktionen optimiert wird. Konzentrationen von bis zu ungefähr 4 mg der allergenen Materialien pro ml eines O,lm-Natriumphosphatpuffers mit einem pH von 7,5 entsprechen gewöhnlich den vorstehend erwähnten Anforderungen.

Die Formaldehydkonzentration sollte in der Reaktionsmischung (Fonnaldehyd liegt in einer wäßrigen Lösung teilweise in Form von hydratisierten Polymeren und Formaldehydhydraten vor) nicht so groß sein, daß in nachteiliger Weise die angestrebte Immunisierungseigenschaften des erhaltenen formalinisierten Allergens

beeinflußt werden. Die Konzentration sollte jedoch dazu ausreichen, daß eine praktisch vollständige Zerstörung der Allergenizität des natürlichen Allergens erzielt wird. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Faktoren richten sich die bevorzugten Formaldehyd- -, konzentrationsbereiche nach der Stabilität und der Reinheit des zu behandelnden Allergens.

Bei Verwendung relativ stabiler roher Allergene, aus welchen nicht-allergene Materialien mit niederem Molekulargewicht entfernt worden sind (beispielsweise ι ο dialysierte Graspollen-Extrakte), haben sich Formaldehydkonzentrationen zwischen 0,24 m und 0,50 m, vorzugsweise ungefähr 0,36 m, als geeignet zusammen mit dialysierten Pollen-Feststoffkonzentrationen von 2 mg/m! erwiesen, falls keine Additive vorliegen. In r, derartigen Fällen führen wesentlich niedrigere Formaldehydkonzentrationen (beispielsweise 0,06 m) zu ziemlich allergenen Derivaten, während höhere Formaldehydkonzentrationen (beispielsweise 5 m) eine übermäßige Denaturierung, eine teileise oder vollständige Ausfällung der Allergene sowie einen Verlust der angestrebten Immunisierungseigenschaften zur Folge haben.

Werden natürliche Rohextrakte, die noch merkliche Mengen an Materialien mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, verwendet (beispielsweise natürliche Graspollen-Extrakte, die bis zu ungefähr 85 Gewichts-% an nicht-allergenen Verbindungen mit einem Molekulargewicht unterhalb ungefähr 5000 enthalten), dann sollten Formaldehydkonzentrationen eingehalten jn werden, die merklich höher als 0,36 m sind, falls die Extrakte das Äquivalent von ungefähr 2 mg/ml an nicht-dialysierbaren Feststoffen enthalten. In derartigen Fällen stellen die Substanzen mit niederem Molekulargewicht im wesentlichen unerwünschte »Additive« in j-, den Lösungen dar. Daher werden erfindungsgemäß vorzugsweise keine formalinisierten Allergene aus derartigen natürlichen Rohextrakten hergestellt

Bei Verwendung von hochgereinigten und relativ stabilen Allergenen, wie beispielsweise der Graspollen-Allergene der Gruppe I, werden Formaldehydkonzentrationen zwischen ungefähr 0,025 m und 0,12 m bevorzugt und zwar bei Allergenkonzentrationen von ungefähr 1 mg/ml.

Bei Verwendung von sehr instabilen Allergenen, insbesondere des Ambrosia-Antigen E, gelten die vorstehend angegebenen Bereiche nicht unbedingt In derartigen Fällen werden tiefere Inkubationstemperaturen und kurze Inkubationszeiten bevorzugt wobei die Formaldehydkonzentration zur Optimierung des Aller- w genizitätsverlustes sowie der Beibehaltung der gewünschten Immunisierungseigenschaften eingestellt werden sollte.

Ist ein Additiv mit einem niederen Molekulargewicht zugegen, so sollte es sich dabei vorzugsweise um ein aliphatisches Diamin ohne weitere funktionell Gruppen, welche entweder mit dem Formaldehyd oder einer Aminomethylolgruppe (Zwischenprodukt A, vergleiche die vorstehende- Diskussion) zu reagieren vermögen, handeln. Beispiele für Additive, die besonders wirksam _bo zur Übertragung der gewünschten Eigenschaften auf die erhaltenen formalinisierten Allergene sind, sind aliphatische oyu-Diamine sowie bestimmte Derivate davon, vorzugsweise mit einer linearen Paraffinkohlenstoff-Kettenlänge von 4 oder 5 Kohlenstoffatomen b5 (beispielsweise Lysin), sowie Arginin und beispielsweise Adipamid. Additivmischungen können ebenfalls verwendet werden. Die Gesamtkonzentration des Additivs sollte mit der eingesetzten Formaldehydkonzentration verträglich sein. Ein bevorzugter Additiv-Arbeitsbereich liegt zwischen ungefähr 0,02 und 0,2 m, in noch bevorzugter Weise bei 0,05 m, bei Verwendung gereinigter Allergene (1 mg/ml), behandelt mit 0,06 m-Formaldehyd, und bei 0,1 m bei Verwendung dalysierter roher aliergener Extrakte (2 mg/ml).

Bei Verwendung von Allergenen, die in Lösung relativ stabil sind, beträgt eine bevorzugte Inkubationstempeatur32°C(±2°C). Eine zu hohe Temperatur kann die Bildung unerwünschter formalinisierter Produkte zur Folge haben. Beispielsweise kann bei hohen Temperaturen eine erhebliche Vernetzung und Denaturierung auftreten. Bei Verwendung von relativ stabilen Aüergenen, wie beispielsweise der Graspollen-Aüergene der Gruppe I, beträgt die Inkubationszeit im allgemeinen ungefähr 4 Wochen. Allergene, die bei 32°C (±2°C) während kürzerer Inkubationszeiten (ungefähr 2 Wochen oder darunter) inkubiert worden sind, sind allergener als diejenigen, die während einer Zeitspanne von 4 Wochen unter den gleichen Bedingungen behandelt worden sind. Längere Inkubationszeiten bei Temperaturen von 32° C oder darunter können angewendet werden, wobei sich diese Zeitspannen in erster Linie nach der Wirtschaftlichkeit sowie dem Wirkungsgrad richten.

Bei Verwendung von wärmelabilen Allergenen, wie beispielsweise des Ambrosia-Antigens E, werden Temperaturen in der Größenordnung von 15⁰C oder darunter bevorzugt. In derartigen Fällen sollte die Inkubationszeit im allgemeinen herabgesetzt werden, um den Allergenizitätsverlust und die Beibehaltung der angestrebten Immunisierungseigenschaften zu optimieren.

Das Additiv mit niederem Molkulargewicht kann zu jedem Zeitpunkt während der Inkubation zugesetzt werden, vorausgesetzt, daß eine ausreichende Zeitspanne für die Reaktion zwischen dem Allergen und dem Additiv zur Verfügung steht. Ist die Mischung nach Beendigung der Inkubationsperiode noch merklich allergen, dann können weitere Formaldehydlösungsmengen mit oder ohne Additiv zugesetzt werden, wobei die Inkubationszeit so lange verlängert werden kann, bis eine stabile nicht-allergene Mischung mit den gewünschten Immunisierungseigenschaften erzeugt worden ist.

Die auf diese Weise hegestellten wäßrigen formalinisierten Allergenzubereitungen enthalten immunisierende Substanzen, die frei von nichi-umgesetztem Formaldehyd und Additiven gemacht werden können, und zwar durch Dialyse, Gelfiltration oder durch Ausfällen des Allergen-enthaltenden Materials aus der Lösung mittels eines geeigneten Salzes oder Lösungsmittels. In bestimmten Fällen können die Konzentrationen an freiem Formaldehyd so niedrig sein, daß sich derartige Maßnahmen erübrigen. Die formalinisierten Allergenzubereitungen können in Lösung bei ungefähr 4° C unter sterilen Bedingungen oder in gefrorenem Zustand gelagert werden. Wahlweise können sie gefriergetrocknet und trocken gelagert werden, sofern ein normales Gefriertrocknen nicht die gewünschten Immunisierungseigenschaften der jeweiligen formalinisierten Allergenzubereitungen beeinflußt

Die in der vorstehend beschriebenen Weise formalinisierten Allergene eignen sich als immunotherapeutische Mittel für Säugetiere, einschließlich allergische menschliche Patienten. Ein Adjuvans, wie beispielsweise ein Alaun oder ein Alginat, kann in die immunisierende

Zubereitung zur Erhöhung der immunogenen Wirkung eingemengt werden. Das formalinisierte Allergen kann ferner zum diagnostischen Testen sowohl vor als auch während der Immunotherapie allergischer menschlicher Patienten verwendet werden. >

Die erfindungsgemäßen formalinisierten Allergene können Warmblütern in üblicher Weise verabreicht werden, beispielsweise intradermal, subkutan oder intramuskulär. Zusätzlich ermöglicht die niedrige Allergenizität dieser Materialien eine Verabreichung in ι ο Form eines Aerosolsprays in die Nase und/oder in den Mund, wobei auf diese Weise die Immunisierung auf transmukosalem Wege erfolgt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. ι ■>

Beispiel 1

Eine gefriergetrocknete Allergenzubereitung der Gruppe I aus dem Pollen von üblichem Raigras (Lolium perenne) wird nach der von Johnson & Marsh beschriebenen Methode (European Polymer J., 1, 63 (1965)) in einer hohen Reinheit hergestellt.

Zur Durchführung der Methode la wird eine Vorratslösuiig dieses Allergens der Gruppe I in der Weise hergestellt, daß 100 mg des trockenen Allergens >5 in 72,0 ml einer 0,1 m-NaiHPO₄-Lösung, die 1 Teil '•Merthiolate« pro 10 000 Teile der Lösung enthält, aufgelöst werden. Einem Aliquot dieser Lösung(21,6 ml) werden 50 μΐ einer 36%igen (Gewicht/Volumen) Formaldehydlösung langsam unter konstantem Rühren jo mittels eines Magnetrührers zugesetzt Der pH der Mischung wird durch Zugabe einer O,5n-NaCH-Lösung auf 7,50 ±0,10 eingestellt, worauf die Mischung schließlich auf ein Gesamtvolumen von 24,0 ml durch Zugabe einer Lösung A gebracht wird. Die Lösung A besteht r> aus einer 0,lm-Na2HPO₄-NaH₂PO₄-Pufferlösung mit einem pH von 7,50, welche 1 Teil »Merthiolate« pro 10 000 Teile des Puffers enthält.

Zur Durchführung der Methode Ib werden 100 mg des trockenen Allergens in 50 ml der Lösung A gelöst. Auf diese Weise wird eine zweite Vorratslösung des Allergens hergestellt Einem Aliquot dieser Lösung (12,0 ml) werden 6,0 ml der Lösung A zugesetzt, worauf sich die Zugabe von 4,8 ml einer O,3m-Formaldehydlösung anschließt Diese Lösung wird in der Lösung A ·»■> hergesielii. Die mischung wird gut gerührt Der pH der Mischung wird auf 7,50 eingestellt, während das Gesamtvolumen nach der in Methode 1 a beschriebenen Weise auf 24,0 ml eingestellt wird.

Die bei der Durchführung der Methoden la und Ib erhaltenen fertigen Mischungen enthalten Formaldehyd in Konzentrationen von 0,025 m und 0,06 m, während die Allergenkonzentrationen 1,25 bzw. 1,0 mg/ml betragen. In beiden Fällen werden die Mischungen durch Membranfiltration vor der Inkubation bei ss 32°C±1°C während einer Zeitspanne von 28—32 Tagen sterilisiert Nach Beendigung der Inkubationsperiode werden die Mischungen gegen die Lösung A zur Entfernung von nicht-umgesetztem Formaldehyd dialysiert und in gefrorenem Zustand getrocknet Wahlweise t>o werden die Mischungen gegen eine 0,002ITi-NH₄HCO₃-Lösung dialysiert, gefriergetrocknet und bei — 20⁰C gelagert Diese Zubereitungen werden als »normales formalinisiertes Allergen« der Raigras-Allergen-Grup-

pe I bezeichnet bs

Beispiel 2

Die durchgeführten Methoden entsprechen entweder der Methode 1 a oder Ib, mit der Ausnahme, daß bei der Durchführung der Methode 2a 219 mg L-Lysinmonohydrochlorid in einem zweiten Aliquot (21,6 ml) der Allergen-Vorratslösung von Methode la vor der Zugabe des Formaldehyds aufgelöst werden. Bei der Durchführung der Methode 2b werden 6,0 ml einer O,2m-Lösung von L-Lysinmonohydrochlorid, hergestellt in einer 0,Im-Na₂HP(VLösung, die »Merthiolate« (1 :10 000) enthält, einem zweiten Aliquot (12,0 ml) der Allergen-Vorratslösung von Methode Ib zugesetzt wobei 6,0 ml der Lösung A, die zu diesem Zeitpunkt bei der Durchführung der Methode Ib verwendet wird, ersetzt werden. Bei der Durchführung von beiden Methoden enthalten die Inkubationsmischungen Lysin in einer Konzentration von 0,05m als Additiv. Diese Zubereitungen werden als »Lysin-formalinisiertes Allergen« der Raigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet.

Beispiel 3

Die durchgeführte Arbeitsweise entspricht der Methode 2b, mit der Ausnahme, daß einem dritten Aliquot (12,0 ml) der Allergen-Vorratslösung von Methode Ib 6,0 ml einer 0,2 m-L-Argininmonohydrochlorid-Lösung in 0,lm-Na2HPO4, enthaltend »Merthiolate« (1:10 000), anstelle der äquivalenten Menge L-Lysinmonohydrochlorid, das zur Durchführung der Methode 2b verwendet wird, zugesetzt werden. Diese Zubereitung wird als »Arginin-formalinisiertes Allergen« der Raigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet.

Beispiel 4

Es wird in die in Beispiel 1, Methode Ib, beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, daß die frisch hergestellte sterile Lösung (24,0 ml) mit einem pH von 7,50, die das Raigras-Allergen der Gruppe I (1,0 mg/ml) und 0,06m-Formaldehyd enthält, in eine vorsterilisierte Flasche eingespritzt wird, welche steriles Adipamid in einer Menge von 172,8 mg entsprechend einer O,05m-Lösung enthält. Die Flasche wird langsam geschüttelt, um das Adipamid vor der Inkubation bei 32° C soweit wie möglich aufzulösen. Das Adipamid, das anfänglich teilweise unlöslich ist, löst sich während der Inkubation allmählich auf. Die erhaltene Zubereitung wird als »Adipamid-formalinisiertes Allergen« der Raigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet

Beispiel 5

Eine Mischung aus gleichen Gewichtsteilen der getrockneten Pollen von fünf Gräsern, und zwar italischem Raigras (Lolium multiflorum), Wiesenschwingelgras (Festuca elatior), Knäuelgras (Dactylis glomerata), Timotheusgras (Phleum pratense) und glattstieligem Wiesengras (Poa pratensis), wird durch Extraktion mit trockenem peroxydfreiem Äther entfettet Die Pollenmischung wird anschließend mit dem lOfachen ihres ursprünglichen Gesamtgewichts mit 0,12Sm-Na₄HCO₃ (pH 7,8) während einer Zeitspanne von 24 Stunden bei 4°C (End-pH-Wert des Extraktes: 7,7) extrahiert Der Extrakt wird zentrifugiert und unter Verwendung eines Visking-Dialyserohres mit einem Durchmesser von 14 mm (18/32 inch) gegen eine 0,002m-NH₄HCO₃-Lösung (sechsmal) sowie abschließend gegen destilliertes Wasser dialysiert Die Lösung in dem Dialysesack wird durch Zentrifugieren geklärt und gefriergetrocknet

Eine Lösung des trockenen dialysierten Pollenmaterials in einer Konzentration von 4 mg/ml wird in der Lösung A (vergleiche Beispiel 1) hergestellt und zur Entfernung einer Spur unlöslichen Materials zentrifugiert Die Formaldehydbehandlung eines Aliquots

dieser Lösung (12,0 ml) erfolgt in der gleichen Weise wie bei der Durchführung der Methode Ib (Beispiel 1). In diesem Falle beträgt die Gesamtkonzentration an Pollenfeststoffen in der Inkubationsmischung 2,0 mg/ml. Die Formaldehydkonzentration ist wie bei der Durchführung der Methode Ib 0,36 m. Diese Zubereitung wird als »normales formalinisiertes Allergen« eines dialysierten gemischten Graspollen-Extrakts bezeichnet.

Beispiel 6

Eine Mischung aus dialysierten Graspollen-Materialien, die 3 Gewichtsteile Knaulgras (Dactylis glomerata), 3 Teile Timotheus-Gras (Phelum pratense), 2 Teile süßes Geruchgras (Anthoxanthum odoratum), 1 Teil eines giattstieligen Wiesengrases (Poa pratensis) und i Teil feines Straußgras (Agrostis palustris) enthält, wird anstelle des dialysierten gemischten Grasextraktes von Beispiel 5 verwendet. Im übrigen sind alle Reaktionsbedingungen und Reaktantenkonzentrationen die gleichen wie in Beispiel 5.

Beispiel 7

Eine Lysin-formalinisierte Allergenzubereitung wird aus der Lösung des dialysierten gemischten Graspollen-Materials gemäß Beispiel 6 durch Inkubation in Gegenwart einer O,36m-Formaldehydlösung und einer O,lm-L-Lysinlösung unter Anwendung der in Beispiel 2, Methode 2b beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Die Konzentration des Pollen-Materials in der Inkubationsmischung beträgt 2 mg/ml wie in Beispiel 6.

Beispiel 8

Ein dialysierter Extrakt des Pollens von kalifornischer schwarzer Walnuß (Juglans califomica) wird hergestellt und mit Formaldehyd in einer Weise umgesetzt, die der in Beispiel 5 beschriebenen Methode zur Behandlung des dialysierten Graspollen-Extrakts analog ist.

Be spiel 9

Ein dialysierter Extrakt des Pollens einer chinesischen immergrünen Ulme (Ulmus parvifolia) wird hergestellt und mit Formaldehyd nach der in Beispiel 5 beschriebenen Weise umgesetzt

Beispiel 10

Ein Extrakt einer rohen Zubereitung von Hausstaubmilben (Dermatophagoides pteronyssinus), die auf menschlichen Hautschuppen und Hefeextrakt gezüchtet worden sind, wird hergesellt und in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise dialysiert Mit Ausnahme des Ersatzes des dialysierten Graspollen-Extraktes gemäß Beispiel 5 durch den dialysierten Milbenextrakt (2 mg/ml) werden alle anderen Reaktionsbedingungen und Reaktantenkonzentrationen, wie sie in Beispiel 5 geschildert werden, eingehalten.

Beispiel 11

Die Raigras-Gruppe I (vergleiche die ■ vorstehend beschriebenen Methoden Ib und 2b) werden durch Ovalbumin (dreimal kristallisiert, aus Hühnereiern) ersetzt Dann wird die Reaktion mit Formaldehyd in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt

Die allergenen und antigenen Eigenschaften formalisierter Allergene werden untersucht und mit den entsprechenden Eigenschaften der natürlichen Allergene, von denen sie sich ableiten, verglichen.

-, Die allergenen Eigenschaften werden qualitativ durch Hautkratz-Tests bei einer Vielzahl allergischer menschlicher Patienten untersucht Ferner werden halbquantitative Untersuchungen durch intradermales Testen der Haut sowie durch direktes Reizen der Luftröhre an

ίο allergischen menschlichen Patienten durchgeführt. Schließlich wird quantitativ das Histamin gemessen, das aus menschlichen Leukozytensuspensionen (isoliert von ungefähr 15 verschiedenen allergischen Personen) anschließend an einen Immunitätstest mit formalinisierten oder natürlichen Allergenen in Freiheit gesetzt wird.

Es werden zwei Aspekte einer Querantigenizität

zwischen formalinisierten und natürlichen Allergenen untersucht, und zwar 1. querreaktogene Eigenschaften,

d. h. die Fähigkeit eines formalinisierten Allergens, sich mit Antiseren zu kombinieren, die (in Kaninchen) gegen das natürliche Allergen erzeugt worden sind, und 2. querimmunogene Eigenschaften, d. h. die Fähigkeit eines formalinisierten Allergens, die Bildung (in Meerschweinchen) von Antikörpern zu induzieren, welche eine natürliche Allergen-induzierte allergische Histaminfreisetzung aus isolierten allergischen menschlichen Leukozyten blockieren und mit dem natürlichen Allergen bei der Durchführung von Tests querreagieren, beispielsweise bei Durchführung einer passiven kutanen Anaphylaxe (PCA) in normalen Meerschweinchen. Bezüglich der quantitativen Bestimmung des Vorliegens der gewünschten immunisierenden Eigenschaften eines formalinisierten Allergens ist das Blockieren einer Allergen-bewirkten allergischen Histaminfreisetzung aus menschlichen Leukozyten ein kritischer Test.

Die erfindungsgemäßen formalinisierten Allergene haben im wesentlichen die allergenen Eigenschaften verloren, jedoch in einem hohen Ausmaß die antigenen Eigenschaften (einschließlich der gewünschten immunisierenden Eigenschaften) des natürlichen Allergens beibehalten. Der Allergenizitätsverlust schwankt in Abhängigkeit von dem getesteten Individuum, von der Tatsache ob Additive in dem formalinisierten Allergen vorliegen sowie dem Typ des angewendeten Allergenizitätstests. Der Allergenizitätsverlust ist bei dem formalinisierten Allergen gegenüber dem natürlichen Allergen um das ungefähr 200fache bis 1 000 OOOfache (in üblicher Weise um das 1 OOOfache bis 10 OOOfache) niedriger. Die Querantigenizität zwischen dem formalinisierten Allergen und dem natürlichen Allergen beträgt in üblicher Weise 20—100%. In vielen Fällen sind die angestrebten Immunisierungseigenschaften des formalinisierten Allergens gegenüber denjenigen des natürlichen Allergens in einem Ausmaß von 60—100% beibehalten worden.

Die formalinisierten erfindungsgemäßen Allergene sind gegenüber den natürlichen Allergenen daher bei einer Verwendung in der Humanimmunotherapie weit überlegen, da das Ausmaß der angestrebten Immunisierungseigenschaften im Vergleich zu der Allergenizität erheblich gesteigert ist

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines formalinisierten Allergens mit niedriger allergener Aktivität auf menschliche Lebewesen, das sich von Allergen-haltigen Materialien herleitet und befähigt ist, in Säugern die Bildung von Blockierungs-Antikörpern gegen das native Allergen in merklichen Konzentrationen zu induzieren, bei dem ein Extrakt des Allergen-haltigen Materials mit verdünnter Formaldehydlösung inkubiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man

c) die praktisch sämtliche Allergen-haltigen Materialien enthaltende Lösung von b) in einer nichtphenolischen Umgebung mit 0,025 bis 0,5 molarer Formaldehydlösung bei einer Temperatur von 15 bis 34° C gegebenenfalls in Gegenwart eines Additivs aus der Reihe der aliphatischen Aminosäuren, aliphatischen Carbonsäureamide oder aliphatischen Diamine mit jeweils bis zu 7 Kohlenstoffatomen inkubiert

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Additiv Lysin oder Adipamid verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Additivkonzentration 0,02 bis 0,2 molar ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Allergen-haltige Material von Graspollen herleitet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Allergen-haltige Material von Unkrautpollen herleitet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Allergen-haltige Material von Baumpollen herleitet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Allergen-haltige Material Hausstaubmilben oder ihre Rückstände enthält.

8. Mittel zur Erzeugung von Blockierungs-Antikörpern in merklicher Menge gegen das native Allergen in Säugern auf transmukosalem Wege, enthaltend ein formalinisiertes Allergen nach den Ansprüchen 1 bis 7.