DE1951256A1

DE1951256A1 - Verfahren zur Herstellung formalinisierter Allergen enthaltender Substanzen

Info

Publication number: DE1951256A1
Application number: DE19691951256
Authority: DE
Inventors: Marsh David George
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1968-10-10
Filing date: 1969-10-10
Publication date: 1970-07-30
Also published as: FR2020311A1; DE1951256C3; DK134781B; FI48156B; CH525004A; FR2020311B1; ES372271A1; FI48156C; DK134781C; NO132132B; IL33140A; US4226853A; DE1951256B2; NL6915389A; NL158387B; IL33140A0; IT1060054B; LU59609A1; NO132132C; BE740136A

Description

- · DipUng. F. leickmann,

Dipl.ing. H.Welckniann, DIpLPhys.Dr.K.FIncke -

DipUng. F.A.^sIckniann, Dipl. Chem. B.Huber
8 München 27, yühliir.22

Sch/Gl . Oase 618

David George Marsh, Altadena, OaI. / USA

Verfahren zur Herstellung formalinisierter Allergenenthaltender Substanzen .

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Formaldehyd-behandelten Allergenen, die sich für eine Immunotherapie (Desensitisierung) von Lebewesen eignen, die an plötzlich auftretenden Allergien leiden. Diese forcialinisierten Allergen-enthaltenden Materialien eignen sich ferner zur Bildung von Antikörpern in Säugetieren, wobei diese Anti-. körper mit den natürlichen Allergen-enthaltenden Materialien reagieren.

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Patienten, die an plötzlich auftretenden Allergien (Atopien) leiden, vermögen spezielle Arten von allergischen Antikörpern -(Reaginen) bei der Behandlung mit bestimmten Substanzen (Allergenen), gegenüber welchen sie empfindlich sind, zu entwickeln. Me Reagine werden dabei fest mit bestimmten Geweben, insbesondere mit Epithelgeweben, verknüpft. Anschliessend an ein Einwirkenlassen des sensitisierenden allergenen Materials erfolgt eine physikalische Vereinigung zwischen dem bzw. den Allergenen und seinen bzw. ihren homologen Reaginen, was allergische Ausserungen an den Stellen der Reagin-Allergen-Kombination zur Folge hat. Allergische Lebewesen vermögen ferner sogenannte ".blockierende Antikörper" eines Nicht-Reagin-Typs zu entwickeln. Diese Antikörper vermögen sich mit dem Allergin zu vereinigen und dieses zu inaktivieren, und zwar im allgemeinen ohne unerwünschte Nebenreaktionen. Eine reaginische Aktivität wird dem Immunoglobulin E (IgE) und eine "blockierende" Aktivität hauptsächlich dem IgG in dem Serum sowie IgA in Sekretionen zugeschrieben.

Unter dem erfindungsgemäss verwendeten Begriff "allergisch" sollen Allergien des unmittelbaren (atopischen) Typs verstanden werden. .

Es ist seit langem klinische Praxis, einen allergischen Patienten mit allmählich zunehmenden Dosen wässriger Extrakte zu spritzen, welche das allergene Material bzw. die allergenen Materialien enthalten, gegenüber welchem bzw. welchen der Patient empfindlich ist. Die Absicht, welche hinter dieser Behandlung steht, besteht hauptsächlich darin, die Konzentration an schützendem blockierendem Antikörper in dem Serum (sowie anderen Körperflüssigkeiten) bis zu einem solchen Grad aufzubauen,

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bei welchem diese Antikörper in wirksamer Weise mit dem gewebefixierten Reagin für Allergen» welches in den Körper gelangt, reagieren kann, so dass auf diese "Weise die allergischen Reaktionen inhibiert werden. In bestimmten Fällen konnte diese Therapie die Erzeugung von Reaginen herabsetzen und die Zellempfindlichkeit gegenüber eingespritsen Allergenen vermindern. Die immunisierenden Dosen des allergehen Extrakts müssen allmählich während der Behandlung gesteigert werden, um die Gefahr eines allgemeinen allergischen (anaphylaktisehen) Ansprechens in dem Patienten auf einem Minimum zu halten.

Die Hauptnachteile dieser Immunοtherapie sind folgende:

1. Es sind über viele Wochen hinweg wiederholte Injektionen erforderlich.

2. Die Behandlung vermag selten das allergische Syndrom zu lindern und

5. die Gefahr einer. allgemeinen anaphylaktischea·" Reaktion Ist während einer jeden Stufe der Behandlung immer vorhanden.

Die ursprüngliche Therapie wurde daher mit dem Siel geändert,-diese Nachteile zu beseitigen. In neuerer Zeit entwickelte Behandlungsmethoden bestehen darin, den Patienten entweder mit Was s er-in-ul-EmujLs ionen des allergenen Extrakts zu immunisieren oder ein eine langsame Freisetzung ermöglichendes Adjuvans, wie beispielsweise ein Alginat, mit einem Extrakt; des allergenen Materials zu verabreichen. Derartige Methoden sind jedoch nicht vollständig befriedigend, und zwar wegen des Auftretens anaphylaktischer und manchmal toxischer Reaktionen in dem Patienten oder wegen des Yersagens derartiger Präparate bei der Durchführung von klinischen Tests.

Es wurden bereits allergene Materialien chemisch oder physika-

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lisch behandelt, um Ihre allergenen Eigenschaften merklich zu reduzieren. Dabei sollen diese Materialien jedoch ihr Vermögen beibehalten, ein allergisches Lebewesen gegenüber dem natürlichen Allergen zu schützen. Eine Immunotherapie allergischer Lebewesen'unter Einsatz derartig,modifizierter Al- " lergene sollte, wie man hoffte, die gewünschten immunisierenden Eigenschaften des natürlichen Allergens beibehalten, und zwar in erster Linie in dem Sinne, dass gegen das natürliche Allergen blockierende Antikörper in merklicher Menge erzeugt werden. Ferner sollte die reduzierte Allergenizität derartig modifizierter Materialien die Verwendung merklich gesteigerter Dosen des Immunisierungsmaterials ermöglichen und auf diese V/eise in erheblichem Ausmaß die Menge des erzeugten schützenden Blockierungs-Antikörpers erhöhen.

Ss"wurde nunmehr gefunden, dass bei Einhaltung eines neuen Verfahrens unter Verwendung einer Formaldehydlösung die Hauptmenge der Allergen-^enthaltenden Substanzen in einer solchen V/eise modifiziert werden kann, dass die Nachteile der natürlichen Allergene bezüglich ihrer Verwendung in der Immunotherapie beseitigt werden. Nachfolgend werden alle Allergen-enthaltenden Substanzen aus Einfachheitsgründen als Allergen bezeichnet, wobei man jedoch sich dessen be- . · wusst sein muss, dass nicht alle Komponenten einer Allergenenthaltenden Substanz in notwendiger V/eise Allergen .sind. Bezüglich der neuen Formaldehyd-Behandlung sollen die Begriffe "formalinisiert" und "Formalinisierung" die Behandlung Amino-enthaitender allergener Materialien mit Form- ~ aldehyd beschreiben, und zwar für die Fälle, in welchen definitiv eine chemische Reaktion zwischen Aminogruppen und Formaldehyd stattfindet und inter- oder intramolekulare •Methylenbrückenbindungen zwischen oder innerhalb der Allergenmoleküle selbst oder zwischen Allergen und anderen

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ORIGINAL !NSPECTED-

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reaktiven Molekülen, die in der Reaktionsinischung vorliegen, geschaffen werden.

Die neuen erfindungsgemäsaen formalinisierten Ällergene v/erden in der Weise erzeugt, dass·Allergene, die in einer nichtphenolischen wässrigen lösung gelost sind, chemisch unter milden Bedingungen mit verdünntem formaldehyd oder einer Formaldehyd-freisetzenden Substanz, wie beispielsweise Metheriamin, die ebenfalls in der Lösung vorhanden ist, reagieren gelassen werden. Die auf · diese Weise behandelten Allergene können in Form hochgereinigter Substanzen oder in Form roher Extrakte verwendet v/erden. Unter dem Begriff "nicht-phenolisch" ist zu verstehen, dass nur Spurenmengen an zugesetzten phenolischen Verbindungen in der Umgebung der Formalinisierungsreaktion zugegen sind. Dieser Begriff schliesst jedoch nicht das Vorliegen phenolischer Hydroxylgruppen in den Allergenen als solchen aus. Derartige Allergene enthalten bekanntlich in natürlicher Weise in einigen Fällen derartige Gruppen als Teil der komplexen proteinhaltigen Struktur

Es wurde gefunden, dass das erfindungsgemässe Verfahren zu formalinisierten Allergenen.mit den gewünschten immunisierenden Eigenschaften führt. Derartige formalinisierte Allergene eignen sich zur Durchführung einer Immunotherapie allergischer Personen. Diese Derivate sind ferner zur Immunisierung von anderen Säugetieren geeignet, wobei Antikörper erzeugt werden, die heftig mit dem natürlichen Allergen' reagieren.

Ohne sich an eine !Theorie binden .zu wollen* kann man annehmen, dass ein Hauptgrund* weshalb die formalinisierten Allergene den bisher hergestellten. Formaldehyd^behanaelten Aller-

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ORiGiMAL.ift-SFEGTED

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genen überlegen sind, darin liegt, dass Phenol von der Reaktionslösung ferngehalten wird. Phenol, das in den Reaktionslösungen bei der Durchführung der bisher bekannten Verfahren vorgelegen hat, wird vorzugsweise in die erhaltenen Produkte infolge einer chemischen Reaktion zwischen Aminomethylolgruppierungen an den Amino-enthaltenden Allergenen (Zwischenprodukte des Typs A in der folgenden Gleichung) und Phenol eingebaut. Eine derartige chemische Substitution von phenolischen Gruppen an Amino-enthaltenden Molekülen führt bekanntlich zu Derivaten, deren überwiegende immunisierende Eigenschäften in einem erheblichen Ausmaß davon abhängen, ob phenolische Stellen in dem Molekül vorkommen. Diese phenolischen Stellen spielen eine weit grossere Rolle als andere Stellen des Moleküls. So besitzen Formaldehyd-behandelte Allergene, in denen Phenol enthalten ist, nicht die gewünschten, vorstehend definierten immunisierenden Eigenschaften, da eine Immunotherapie unter Verwendung derartiger Materialien zu Antikörpern führt, v/elche hauptsächlich gegen die frisch eingebauten phenolischen Gruppen und nicht gegen ursprüngliche Teile des Allergens, gegen welche Antikörper in erheblichen Mengen produziert werden müssen,, falls gewünschte immunisierende Eigenschaften erzielt werden sollen, gerichtet sind.

Im Gegensatz zu den Erkenntnissen der bisher bekannten Arbeiten führt eine Immunisierung mit den erfindungsgemässen formalinisierten Allergenen zu einer übermässigen Erzeugung von Antikörpern gegen einige «natürliche Teile der Allergenmoleküle. Ein erheblicher Teil eines solchen Antikörpers ist dazu in der Lage, eine blockierende Wirkung auf die natürlichen Allergenmoleküle auszuüben,

ORIGINAL INSPECTED

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Werden rohe Allergene verwendet, dann sollten vorzugsweise fettartige Substanzen sowie iiicht-allergene Materialien mit niederem Molekulargewicht in den natürlichen Substanzen vor der Formalini3ierung entfernt werden, wobei jedoch diese Entfernung nicht unbedingt notwendig ist. Die Umsetzung zwischen den rohen oder stark gereinigten allergenen Materialien und dem Formaldehyd kann in G-egenwart eines Additivs mit niederem Molekulargewicht durchgeführt werden. Geeignete Additive, die gewöhnlich weniger als ungefähr 8 Kohlenstoffatome zusätzlich zu etwa vorhandenen funktionellen Gruppen aufweisen, sind folgende: Aliphatische Diamine., Guanidine, aliphatische Säureamide, aliphatische Garbonsäuren, welche Aminogruppen enthalten, z.B, aliphatische Aminosäuren (Monoaminomonocarbonsäuren, Monoaminodicarbonsäuren und Diaminomonocarbonsäuren), aliphatische Eydroxyaininosäuren und aliphatische Diaminodicarbonsäuren sowie aliphatische Verbindungen, welche Kombinationen und Abänderungen aus einer oder mehreren Amino-, Guanidino- und Säureamidogruppen enthalten. Ferner kann eine begrenzte Anzahl von Hydroxylgruppen in einem der vorstehend erwähnten Verbindungstypen vorliegen. Erwähnt seien 1,4-Diaminobutan, Lysin, Orithinin, 1,5-Diaminopimelinsäure, Arginin, Adipamid, Asparaginsäure, Serin und Alanin. Das Additiv soll derart sein, dass es sich chemisch mit den Pollenkomponenten während des Formalinisierungsverfahrens vereinigt. Im V-ergleich zu forinalinisierten Allergenen, die durch Behandlung mit Formaldehyd allein hergestellt worden sind, besitzen einige der formalinisierten Allergene, die in Kombination mit einem Additiv hergestellt worden sind, in einem'grösseren Ausmaß die gewünschten, vorstehend erörterten Immunisierungseigenschaften.

Ohne sich an eine Theorie binden zu wollen, nimmt man an, . dass unter den erfindungsgemässen Reaktionsbedingungen der

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': iMAL-'.^3FECTED

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Formaldehyd in reversibler Weise mit freien Aminogruppen an Proteinen. Peptiden und Aminosäuren sowie mit den Aminogruppen von Aminozuckern, die in der Reaktionsmischung vorliegen, reagiert. Unter Verwendung der Symbole R, R oder dergleichen zur Kennzeichnung von Proteinresten, Peptidresten, Aminosäureresten, Glycoproteinresteh sowie anderen möglichen Resten, die chemisch mit den nachstehend angegebenen reaktionsfähigen Gruppierungen verknüpft werden können, kann die nachstehend angegebene Reaktlonsserie, welche wahrscheinlich abläuft, formuliert werden: .

Die instabile Aminomethylolgruppe (Zwischenprodukt A), die an den Allergenmolekülen selbst oder an Additiven oder anderen nicht-ailergenen Substanzen, die zusammen: mit dem Allergen vorkommen, vorhanden sein kann, kann, dann mit bestimmten anderen reaktionsfähigen Gruppen unter Bildung der stabileren Methylenbrückenstrukturen in der .folgenden. Weise reagieren:

(a) Mit Guanidinogruppen von Arginin (an Proteinen, Peptiden oder anderen, eine oder mehrere Guanidinogruppen enthaltenden Additiven, beispielsweise Arginin):

H₉N · ^B

^ H

R-NHCH₉OH + V-N-R¹ ~^E?.° v-R-MHGH₀NN * _T

^ά ·/?_. YL- +H₉O ,C-N-R¹

<L . y _H .

. NH.

(b) Mit Säureamiden Can Proteinen, Peptiden oder Additiven, welche eine oder mehrere Säureamidgruppen enthalten, beispielsweise Adipainid):

Q 0 9 8 3 T / ~t 7 1 0 . original !«spected..

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R-IIHCH₅OK + H₉N-C-R¹¹ ~^H9°

(c) Mit bestirnten aromatischen Gruppen (an Proteinen oder dergleichen, beispielsweise Tyrosyiresten in Frotoir.cr):

R-NHCH₅OH
²

CH₂-CH

OH

Diese Stabilität der Derivate liegt gewöhnlich in der Kelr.cnfolpe: D ^ C ^ B.

Daher kann Jede aller,.-:er.e Det^rrlrante, H^ eine /jniT:c_t'r^pp'-', eino Suanidino.^ruppe, ein Säurennid oder ei"e»:· reaktiver arotsatijscher. R Bt enthält (bei«;r>ieL£weiceTy or is, rrjrt·- phar odrr Histidin) r.-.'liiisierte usd durch ror-^aldeio·-:-"¹·---- lung nicht-allergen nc-acht vcrien. Ferner Jean η eine »Ι¹ τ-gene D^⁴:erninante, die nicht aus den rorsteherd arg*£««bcr.£:i Gruppienin^en besteht, durcn Res-ktionen, die an -benachbarten (oder so,-ar an relativ entfernten Stellen) an dem Aller.*-::nraolekül stattfinden, codlfitiert und nicht-allergen ger—ht werden, vorausgesetzt, dass eine sich anschlLessenäe e-»ris'.h< Veränderung in der alieigenen Deteminante in einer solcher. Weise etattfindet, dass sie nicht langer als solche du:ch daei hcnoioge lieagin erkannt wird.

Eb iet ferner dareuf hincuveieen, diiao, falle ein r*lntiv · gxooBer Überochusa an einem AdlitIt vorliegt, dieser

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weise an solchen Reaktionen teilnimmt, welche eich zwischen dessen reaktiven Gruppierungen und Formaldehyd abspielen. Derartige Reaktionen laufen eher ab als ähnliche Reaktionen zwischen analogen reaktionsfähigen Gruppierungen ar dem Allergcnmolekül mit Formaldehyd. Liegt beispielsweise Lysin als Additiv vor, dann werden die meisten der verfügbaren Guanidinoreste, Säurcamidreste und reaktionsfähigen aromatischen Reste eines Allergenraol.eküls durch Kethylonbrücken mit dem Lysinadditiv verknüpft. Derartige Verknüpfungen treten gegenüber einer Anknüpfung von I.ysir.res ten an das Allergenmolekül seibat bevorzugt auf.

Eng verwandte Iflarzen- und Tierspezies erzeugen viele Haterialien, die oft sowohl in antigener als auch in allergener Beziehung ähnlich sind. Beispielsweise enthalten praktisch alle Graapollon (insbesondere¹ die jenigon,' welche von hauptsächlicher 'Bedeutung im Zusanjcenhang mit Heuschnupfen sind) drei wichtige, jedoch voneinander verschiedene Gruppen immunocheniisch nahe verwandter Allorgene, die als Gruppen I, II und IXI eingeteilt worden sind. Dabei ist die Gruppe I in cllergf?ner Hinsicht von hauptsächlicher Bedeutung. Daher kann eir. Allergen der Gruppe I eines Graspollens dazu verwendet werden, ein. formnlinisiertes Derivat herzustellen, das die gewüiiochten immunisierenden Eigenschaften bezüglich der natürlichen Gruppe I vieler Spezies von Graspollen besitzt. Eine, angestrebte foriEalinieierte Graspollen-Allergen-Zubereitunr kann daher aus einem Extrakt aus einer Mischung einer relativ kleinen Anzahl verschiedener Graspollen hergestellt werden (beispielsweise aus vielleicht 4 bis 6 verschiedenen Spezies, die derart ausgewählt werden, dass sie i"inen repräsentativen Querschnitt verschiedener inrnunochemischer liergemer Graspollcngruppen enthalten, welche die Ur-

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BAD ORJGiNAL

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Sachen für Heuschnupfen sind).

Rohe allergene Zubereitungen, die besonders geeignet zur Durchführung einer Pormalinis-ierung sind, können in der Weise hergestellt werden, dass die natürlichen Allergen-enthaltenden Materialien mit wasserfreiem und peroxydfreiem Äther entfettet werden und die entfetteten Materialien mit einer wässrigen Lösung, die auf einen pH von 6-8 gepuffert ist ("beispielsweise 0,125m-NH,HCO~) extrahiert werden. Gegebenenfalls -vorliegende nicht-' allergene Substanzen mit niederem Molekulargewicht können anschliessend aus dem Extrakt durch Dialyse durch eine semipermeable Membran (beispielsweise ein Yisking-Rohr) entfernt werden, wobei jedoch auch eine Gelfiltration oder eine ähnliche Methode zur Erzielung ähnlicher Ergebnisse in Präge kommt. V/ahlweise können Materialien mit hohen Molekulargewichten aus dem Extrakt dvirch ein Salz- oder Lösungsmittelausfällungsverfahren ausgefällt werden, ohne dass dabei eine merkliche irreversible Denaturierung erfolgt. Diese Materialien mit hohem Molekulargewicht können aus den ausgefällten Materialien in 3?orm einer wässrigen lösung wieder hergestellt werden. Gereinigte oder teilweise gereinigte allergene Substanzen können nach Methoden hergestellt werden, wie sie in üblicher Weise zur Abtrennung von Makromolekülen aus komplexen Mischungen angewendet werden. Geeignete Reinigungsmethoden werden in der Literatur zur Reinigung von Pischallergenen, Ambrosiapflanzenpollen und Raigraspolleri beschrieben. Diese Materialien sind .jedoch nicht die einzigen "allergenen Materialien, die zur Durchführung des Pormalinisierungsverfahrens eingesetzt werden können. ". -■ . , . ■:. ^;

Die vorliegende Erfindung ist'nicht auf besondere Allergen-enthaltende Materialien oder ,Extrakte.·-beschränkt. Erfindungsgemäss können Pflanzenpollen-Allergen-enthaltende Materialien, insbesondere diejenigen von Gräsern, Bäumen und Unkräutern, die

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Allergien auslösen, erfindungsgemäss extrahiert und mit formaldehyd "behandelt werden. Beispiele für Pollen aus der Grasfamilie (Gramineae), die sich zur Durchführung der Erfindung eignen, sind Wiesenschwingel (Festuca elatior), glattstieliges Gras (Poa pratensis) und Knäuelgras (Dactylis glomerata) des Tribus Festuceae, gemeines Raigras (Lolium perenne) und italienisches Raigras (Lolium multifluorum) des Tribus Hordeae, Timotheusgras (Phelum pratense) und feines Straussgras (Agrostis palustris) des Tribus Agrostideae sowie süsses Geruchgras (Anthoxanthum odoratum) des Tribus Phalarideae. Tergleichbare Beispiele von Baumpollen sind verschiedene Spezie von Walnuss, wie beispielsweise Juglans californica, Birke, Oaeispielsweise Betula alba) Eiche (beispielsweise Quercus alba) und Ulmen (beispielsweise Ulmus parvifolia). Geeignete Unkrautpollen sind beispielsweise die kurze Ambrosiapflanse (Ambrosia elatior), die länge Anibrosiapflanae (Ambrosia trifida), die russische Distel (Salsola pestifer), gemeiner SaI- , bei (Artemisia tridentata) und englischer Wegerich (Plantago lanceolata). Andere allergene Materialien, die ver\-/endet werden können, sind beispielsweise: Extrakte, die ganze Körper und/oder Ausscheidungen und S.ekrete von Hausstaubmilben des Genus Dermatophagoides und verwandter. Genera enthalten, Lösungen von Eahrungsmittel-Allergenen, wie beispielsweise Ovalbumin, das von Hühnereiern extrahiert worden ist, Schimmelpilzextrakte (beispielsweise Alternaria, Peniciilium Aspergillus, Helminthosporium oder dergleichen), Extrakte aus Pflanzenkeimen und -fasern (beispielsweise Baumwolle, Rizinus oder dergleichen) sowie Extrakte von Stechinsekten (beispielsweise Bienen und. Wespen). ■

Hochgereinigte oder teilweise gereinigte Allergene können ebenfalls formalinisiert werden, ,beispielsweise die Graspollen-Allergene der Gruppe'Ti das Antigen· E von Ambrosiapflanzen-

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pollen sowie teilweise gereinigte Hausstaubmilben-Extrakte.

Die Konzentrationen an Allergen, Formaldehyd sowie in der Reaktionsmischung etwa vorhandenen·Additiven sov/ie die Temperatur, der pH und die Zeitspanne der Inkubation der Reaktionsmischung, welche optimale Formalinisierungsbedingungeri zur Folge hat, stehen in gewissem Grad in einer Wechselbeziehung zueinander. Die nachstehend angegebenen Bedingungen werden vorzugsweise eingehalten; wobei jede Bedingung zur Aufrechterhaltung anderer Bedingungen innerhalb bestimmter Grenzen gehalten wird, um das gewünschte formalinisierte Allergen zu erhalten. Jeder Reaktionslösung kann ein Konservierungsmittel, wie beispielsweise Natrium-o-(äthylq^uecksilberthio)-benzoat ("Merthiolate"), zugesetzt werden. Die Zugabe kann in einem Verhältnis von 1:10 000 erfolgen.

Die Endkonzentration der allergenen Materialien, die zur Durchführung der Formaldehydreaktion eingesetzt werden, sollte vorzugsweise 1. derart sein, dass alle Komponenten vollständig löslich sind, 2. nicht so hoch sein, dass eine übermassige intermolekulare Vernetzung zwischen den allergenen Komponenten während der Reaktion erfolgt, und 3. mit der Konzentration an Formaldehyd sowie an etwa eingesetzten Additiven verträglich sein. Die Lösungen sollten in einem wässrigen Puffer hergestellt werden, der vorzugsweise einen pH von ungefähr 7»5 und eine geeignete Molarität besitzt, um diesen pH innerhalb eines Bereiches von ungefähr + 1,0 während des Verlaufs der Reaktion aufrecht zu erhalten, damit das Auftreten der gewünschten Formaldehydreaktionen optimiert wird. Konzentrationen von bis zv ungefähr 4 mg der allergenen Materialien pro ml eines 0,Im-Natriumphosphatpuffers mit einem pH von 7,5 entsprechen gewöhnlich, den vorstehend erwähnten Anforderungen.

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Die Formaldehydkonzentration sollte in der iteaktionsmischung (Formaldehyd liegt in einer wässrigen Lösung teilweise in Form von hydratisieren Polymeren und Formaldehyd-hydraten vor) nicht so gross sein, dass in nachteiliger Weise die angestrebten Iminunisierungseigenschaften des erhalte·- nen formalinisierten Allergens "beeinflusst werden. DLe Konzentration sollte jedoch, dazu ausreichen, dass eine praktisch vollständige Zerstörung der Allergenizität des natürlichen Allergens erzielt wird. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Paktoren richten sich die "bevorzugten Formaldehydkonzentrationsbereiche nach der Stabilität und der Reinheit des zu behandelnden Allergens..."

Bei Verwendung relativ stabiler roher Allergene, aus welchen nicht-allergene Materialien mit niederem Molekulargewicht entfernt worden sind (beispielsweise dialysierte Graspollen-Extrakte), haben sich Formaldehydkonzentrationen zwischen 0,24 πι und 0,50 m, vorzugsweise ungefähr 0,36 m, als geeignet zusammen mit dialysierten Pollen-Feststoffkonzentrationen von 2 mg/ml erwiesen, falls keine Additive vorliegen. In derartigen Fällen führen wesentlich niedrigere JFcrmaldehydkonzentrationen (beispielsweise 0,06 m) zu ziemlich allergenen Derivaten, während höhere Pormaldehydkonzentrationen ('beispielsv/eise 5ni) eine übermässige Denaturierung, eine teilv/else oder vollständige Ausfällung der Allergene sowie einen Verlust der angestrebten Immunislerungseigenschaften zur Folge haben.

Werden natürliche Rohextraktp, die noch merkliche Mengen an Materialien mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, • verwendet (beispielsweise natürliche Graspollen-Extrakte, die bis zu ungefähr 85 Gewichts-^ an nicM-allergenen Ver-

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bindungen mit einem Molekulargewicht unterhalb ungefähr 5000 enthalten), dann sollten Formaldehydkonzentrationen eingehalten werden, die merklich höher als 0,56 in sind, falls die Extrakte das Äquivalent von ungefähr 2 mg/ml an nicht-dialysierbaren Peststoffen enthalten.- In derartigen Fällen stellen die Substanzen mit niederem Molekulargewicht *inr wesentlichen unerwünschte "Additive" in den Lösungen dar. Daher werden erfindungsgemäss vorzugsweise keine formalinisfisFten Allergene aus derartigen natürlichen Eohextrakten her-gest'ellt»

Bei Verwendung von höchgereinigten und relativ stabilen Allergenen, wie beispielsweise der G-raspollen-Allergene der Gruppe I, werden Formaldehydkonzentrationen zwischen ungefähr 0,025 m und 0,12 ι bevorzugt, und zwar bei Allergenkonzentrationen von ungefähr 1 mg/inl.

Bei Verwendung von sehr instabilen Allergenen, insbesondere des Ambrosia-Antigen Ξ, gelten die vorstehend angegebenen Bereiche nicht unbedingt. In derartigen Fällen werden tiefere Inkubationstemperatiiren und kurze Inkubationszeiten bevorzugt, wobei die F'ormaldehydkonzentration zur Optimierung des Allergenizitätsverliistes sov/ie der Beibehaltung der gewünschten Inununisierungseigenschaften eingestellt werdenr sollte.

Ist· ein Additiv mit einem niederen Molekulargewicht zugegen, so sollte es sicli--^rdäbei vorzugsweise unE.eia aliphatisches Amin oder Diamin ohne weitere funktionelle Gruppen, welche entv/eder mit dem Eormaldehyd oder einer Aminomethylölgruppe (Zwischenprodukt A, vergleiche die vorstehende Diskussion) zu reagieren vermögen, handeln. Wahlweise kann das Additiv eine aliphatische Verbindung sein, welche eine Garbonsäureamid-Gruppe oder Oarbonsäureamid-Gruppen oder sowohl Amino- als auch Carbonsäure-

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amid-Gruppen enthält. Guanidinoverbindungen, wie beispielsweise Arginin, können ebenfalls verwendet werden. Beispiele für Additive, die besonders- wirksam zur Übertragung der gewünschten Eigenschaften auf die erhaltenen formalinisierten Allergene sind, sind α, cC-aliphatische Diamine sowie bestimmte Derivate davon, vorzugsweise mit-einer linearen Paraffinkohlenstoff-Kettenlänge'von 4 oder 5 Kohlenstoffatomen (beispielsweise Lysin), oder Dicarbonsäuren, wie beispielsweise Adipamid. Additivmischungen können .ebenfalls verwendet werden. Die Gesamtkonzentration des Additivs sollte mit der eingesetzten Formaldehydkonzentration. verträglich sein. Ein bevorzugter Additiv-Arbeitsbereich liegt zwischen ungefähr 0,02 und 0,2 m, in noch bevorzugterer Weise bei 0,05 m, bei Verwendung gereinigter Allergene (i mg/ml), behandelt mit 0,06 in-iOrmaldehyd, und bei 0,1m bei Verwendung dialysierter roher allergener Extrakte (2 mg/ml).

Bei Verwendung von Allergenen, ale in Lösung relativ stabil sind, beträgt eine bevorzugte Inkubationstemperatur 32°C (+ 2⁰C). Eine zu hohe Temperatur kann die Bildung unerwünschter: formalinisierter Produkte zur Folge haben. Beispielsweise kann bei hohen Temperaturen eine erhebliche Vernetzung und Denäturierung auftreten. Bei Verwendung von relativ stabilen Allergenen, wie beispielsweise der Graspollen-Allergene der Gruppe I, beträgt die Inkubationszeit im allgemeinen ungefähr 4 Wochen. Allergene, die bei 52°0 (+ 2°C) während kürzerer Inkubationszeiten (ungefähr 2 Wochen oder darunter) inkubiert worden sind, sind allergener als diejenigen," die v/ährend einer Zeitspanne von 4 V/ochen unter den gleichen Bedingungen behandelt worden sind. Längere Inkubationszieiten bei Temperaturen vcn 32°C oder darunter

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können angewendet werden, wobei sich diese Zeitspannen in erster Linie nach der Wirtschaftlichiceit sowie dem Wirkungsgrad richten.

Bei Verwendung von wafmelabilen Allergenen, wie beispielsweise des Ambrosia-Antigens E, werden Temperaturen in der Grössenordnung von 15⁰C oder darunter bevorzugt. In derartigen Fällen sollte die Inkubationszeit im allgemeinen herabgesetzt werden, um den Allergenizitätsveriust und die Beibehaltung der angestrebten Immunisierungseigenschaften zu optimieren.

Das Additiv mit niederem Molekulargewicht kann zu jedem Zeitpunkt während der. Inkubation zugesetzt werden, vorausgesetzt, dass eine ausreichende Zeitspanne für die Reaktion zwischen dem Allergen und dem Additiv zur Verfügung steht. Ist die'Mischung nach Beendigung der Inkubationsperiode noch merklich allergen, dann können weitere Formaldehyd- lösungsmengen mit oder ohne Additiv zugesetzt werden, wobei die Inkubationszeit solange verlängert werden kann, bis eine stabile nicht-allergene Mischung mit den gewünschten Immunisierungseigenschaften erzeugt worden ist.

Die auf diese Weise hergestellten wässrigen formalinisierten Allergenzubereitungen enthalten immunisierende Substanzen, die frei von nicht-umgesetztem Formaldehyd und Additiven gemacht werden können, und zwar durch Dialyse, Gelfiltration oder durch Ausfällen des Allergen-enthaltenden Materials aus der Lösung mittels eines geeigneten Salzes oder Lösungsmittels. In bestimmten Fällen können die Konzentrationen an freiem Formaldehyd, so niedrig sein» dass sich derartige Maßnahmen erübrigen. Die formalinisierten - Allergen-

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Zubereitungen können in lösung bei ungefähr 4°0 unter sterilen Bedingungen oder in gefrorenem Zustand gelagert v/erden. Wahlweise können sie gefriergetrocknet und trocken gelagert" werden, sofern ein normales Gefriertrocknen nicht die ge-'"' wünschten Immunisierungseigenschaften der jeweiligen forrnalinisierten Allergenzubereitungen beeinflusst.

Die in der vorstehend beschriebenen Weise formalinisierten Allergene eignen sich als immunotherapeutisehe Mittel für Säugetiere, einschliesslich allergische menschliche Patienten. Ein Adjuväns, wie beispielsweise eis-Alaun oder ein Alginat, kann in die immunisierende Zubereitung zur Erhöhung der immunogenen Wirkung eingemengt werden. Das formalinisier- te Allergen kann ferner zum diagnostischen Testen sowohl vor als auch während der Immunotherapie allergischer menschlicHer Patienten verwendet werden.

Die erfindungsgemässen formalinisierten Allergene können Warmblütern in üblicher Weise verabreicht werden, beispielsweise intradermai, subkutan oder intramuskulär. Zusätzlich ermöglicht die niedrige Allergenizität dieser Materialien eine Verabreichung in Form eines Aerosolsprays in die Hase und/oder in den Mund, wobei auf diese Weise die immuaisierung auf transmukosalem Wege erfolgt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. .

Beispiel 1 .._.-■ · ' ..

Eine gefriergetrocknete Allergenzubereitung der Gruppe I aus dem Pollen von üblichem Raigras (Lolium perenne) Wird nach der von Johnson & Marsh beschriebenen Methode (European

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Polymer J.-, 1, 63 (1965)) in einer hohen Reinheit hergestellt.

Zur Durchführung der Methode 1a wird eine Vorratslösung dieses Allergens der Gruppe I in der/Weise hergestellt, dass 100 mg des trockenen Allergens in 72,0 ml einer 0,1m -MapHPO,-Lösung, die 1 Teil'"Merthiolate" pro 10 000- Teile der Lösung enthält, aufgelöst werden. Einem Aliquot dieser Lösung (21,6 ml) werden 50 ul einer 36 $igen (Gev/icht/Vclumen) Formaldehydlösung langsam unter ,,,konstantem Rühren mittels eines Magnetrührers zugesetzt. Der pH der Mischung wird durch Zugabe einer O,5n-liaCH-Lösung auf 7» 50 + 0,10 eingestellt, worauf die Misehung-'Sehl'iesslich auf ein Gesamtvolumen von 24,0 ml d&asch Zugabe einer Lösung A gebracht wird. Die Lösung A besteht aus einer 0, 1 m-ifapHPO,-ITaHpPO .-Pufferlösung mit einem pH von 7»50, welche 1 Teil "Merthiolate" pro 10 000 Teile des Puffers enthält.

Zur Durchführung der Methode Ib werden 100 mg des trockenen Allergens in 50 ml der Lösung A gelöst, Auf diese Weise wird eine zweite Vorratslösung des Allergens hergestellt. Einem Aliquot dieser Lösung (12^0 ml) werden 6,0 ml der Lösung A zugesetzt, worauf sich die Zugabe von 4,8 ml einer 0,3m-Pormaldehydlösung anschlieast^Diese Lösung wird in der Losung A hergestellt. Die Misciamg^Wird^gut gerührt. Der pH der Mischung wird auf 7»50 eingestellt, während das Gesamtvolumen nach der in Methode 1a_:beschriebenen Weise auf 24,0 ml eingestellt wird.

Die bei der Durchführung der Methoden Ta und Ib erhaltenen fertigen Mischungen enthalten Formaldehyd in Konsentrationen von O,O25m und 0,06m, während die Allergenkonzentrationen 1,25 bzw. 1,0 mg/ml betragen. In beiden Fällen werden die

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Mischungen durch Membranfiltration vor.der Inkubation, bei 32°C + 1⁰G während einer Zeitspanne von 28 - 32 Tagen ■sterilisiert. Nach Beendigung der Inkubationsperiode werden die Mischungen gegen die Lösung A zur Entfernung von nicht-umgesetztem Formaldehyd dialysiert und in gefrorenem Zustand getrocknet. Wahlweise werden die Mischungen gegen eine 0,002m-NH,HC0~-Lösung dialysiert, gefriergetrocknet und bei -20⁰G gelagert. Diese Zubereitungen werden als "normales formalinisiertes Allergen" der Baigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet.

Beispiel 2 '

Die durchgeführten Methoden entsprechen entweder der Methode 1a oder 1b, mit der Ausnahme, dass bei der Durchführung der Methode 2a 219 mg L-L'ysinmonohydrochlorid in einem zweiten Aliquot (21,6 ml) der Allergen-Vorratslösung von Methode 1a vor der Zugabe des" lOrmaldehyds aufgelöst werden. Bei der Durchführung der Methode 2b werden 6,0 ml einer O,2m-Lösung von L-Lysinmonöhydrochlorid, hergestellt in einer 0,1m-Na₂HP0₄-Lösung, die »Merthiolate» (1:10 000) enthält, einem zweiten Aliquot (12,0 ml) der Allergen-Vorratslösung von Methode Ib zugesetzt, wobei 6,0 al der Lösung A, die zu diesem Zeitpunkt bei der Durchführung der Methode 1b verwendet wird, ersetzt werden. Bei der Durchführung von-beiden Methoden enthalten die Inkubationsmischungen Lysin in einer Konzentration von 0,05m als Additiv. Diese Zubereitungen werden als "Lysin-formalinisiertes Allergen" der Raigras-Allergen-Gruppe Γ bezeichnet.

Beispiel 3

Die durchgeführte Arbeitsweise entspricht der Methode 2b, mit der Ausnahme, dass einem dritten Aliquot (12,0 ml) der

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Allergen-Vorratslösung von Methode 1b 6,0 ml einer 0,2m-L-Argininmonohydrochlorid-Lösung in 0,Im-Na₂HPO., enthaltend "Merthiolate" (1:10 000), anstelle der äquivalenten Menge L-LysinmonohydroChlorid, das zur Durchführung der Methode 2b verwendet wird, zugesetzt werden. Diese Zubereitung wird als "Arginin-formalinisiertes Allergen" der Raigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet. . .

Beispiel 4

Es wird die in Beispiel 1, Methode 1b, beschriebene Arbeitsweise eingehalten, mit der Ausnahme, dass die frisch hergestellte sterile Lösung (24,0 ml) mit einem pH von 7,50, die das Raigras-Allergen der Gruppe I (1,0 mg/ml) und 0,06m-Formaldehyd enthält, in eine vorsterilisierte Flasche eingespritzt wird, welche steriles Adipamid in einer Menge von 172,8 ing entsprechend einer 0,05m-Lösung enthält. Die Flasche wird langsam geschüttelt, um das Adipamid vor der Inkubation bei 32⁰O soweit wie möglich aufzulösen. Das Adipamid, -das anfänglich teilweise unlöslich ist, löst sich während der Inkubationallmählich auf. Die erhaltene Zubereitung wird als ⁿAdipamid-formalinisiertes Allergen" der Raigras-Allergen-Gruppe I bezeichnet. - '

Beispiel 5 *

Eine Mischung aus gleichen Gewichtsteilen der getrockneten Pollen von fünf Gräsern, und zwar italischem Raigras (lölium multiflorum), Wiesenschwingelgras (Festuca elatior), Knäuelgras (Dactylis glonerata), Timotheusgras (Phleum pratense) und glattstieligem Wiesengras (Poa pratensis), wird durch Extraktion mit trockenem peroxydfreiem Äther entfettet. Die Pollenmisclmng wird anschliessend mit dem 10-fachen ihres

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ursprünglichen Gesamtgewichts mit O,125m-Na.HCO~ (pH während einer Zeitspanne von 24 Stunden bei 4°C (End-pH-Wert des Extrakts: 7,7) extrahiert. Der Extrakt wird zentrifugiert und unter Verwendung eines Visking-Dialyserohres mit einem Durchmesser von 14 min (18/32 inch) gegen eine 0,002m-HELHGO^-Iosung (sechsmal) sowie abschliessend gegen ' destilliertes Wasser dialysiert. Die Lösung, in dem Dialysesack wird durch Zentrifugieren geklärt und gefriergetrocknet.

Eine Lösung des trockenen dialysierten Pollenraaterials in einer Konzentration von 4 mg/ml wird in der Lösung A (vergleiche Beispiel 1) hergestellt und zur Entfernung einer Spur unlöslichen Materials zentrifugiert. Die Formaldehydbehandlung eines Aliquots dieser Lösung (12,0 ml) erfolgt in der gleichen Weise wie bei der Durchführung der Methode 1b (Beispiel 1). In diesem Falle beträgt die Gesamtkonzentration an Pollenfeststoffen in der Inkubationsmischung 2,0 mg/ml. Die Jormaldehydkonzentration ist wie-bei der Durchführung der Methode Ib 0,36m. Diese Zubereitung wird als "normales formalinisiertes Allergen" eines dialysierten gemischten Graspollen-Extrakts bezeichnet.

Beispiel 6

Eine Mischung aus dialyiserten Graspollen-Materialien, die 3 Gewichtsteile Knäuelgras (Dactylis glomerata), 3 Teile SJimotheus-Gras (Phelum pratense), 2 Teile süsses Geruchgras (Anthoxanthum odoratum), 1 Teil eines glattstieligen Wiesengrases (Poa pratensis) und 1 ,{Deil feines Straussgras (Agrostis palustris) enthält, wird anstelle des dialysierten gemischten Grasextraktes von Beispiel 5 verwendet. Im übrigen sind alle Reaktionsbedingungen und Reaktantenkonzentrationen die gleichen wie in Beispiel 5.

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Beispiel 7

Eine Lysin-formalinisierte Allergeηzubereitung wird aus der Lösung des dialysierten gemischten Graspollen-Materials ge~ mäss Beispiel 6 durch Inkubation in Gegenwart einer 0,56m-Formaldehydlösung und einer 0,Im-L-Lysinlösung unter Anwendung der in Beispiel 2, Methode 2b beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Die Konzentration des Pollen-Materials in der Inkubationsmischung beträgt 2 mg/ml wie in Beispiel 6.

Beispiel 8 .

Ein dialysierter Extrakt des Pollens von kalifornischer schwarzer Walnuss (Juglans californica) wird hergestellt und -mit Formaldehyd in einer V/eise umgesetzt, die der in Beispiel 5 beschriebenen Methode zur Behandlung des dialysierten Graspollen-Extrakts analog ist. ■

Beispiel 9 ·

Ein dialysierter Extrakt des Pollens einer chinesischen immergrünen Ulme (Ulmus parvifolia) wird hergestellt und mit formaldehyd nach der in Beispiel 5 beschriebenen Weise umgesetzt.

Beispiel 10

Ein Extrakt einer rohen Zubereitung von Hausstaubmilben (Derma tophagoides pteronyssinus), die auf menschliehen Hautschuppen und Hefeextrakt gezüchtet worden sind, wird hergestellt und in der in Beispiel 5 beschriebenen Weise dialysiert. Mit Ausnahme des Ersatzes des dialysierten Graspollen-Sxtraktes gemäss Beispiel 5 durch den dialysierten Milbenextrakt (2 mg/ml) werden alle anderen Eeaktionsbedingungen und Reaktantenkonzentrationen, wie sie in Beispiel 5 geschildert werden, eingehalten.

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ORlOfMAL HvSPECTED

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Beispiel 11

Die Kaigras-Gruppe I (vergleiche die vorstehend beschriebenen. Methoden 1b und. 2b) werden durch Ovalburain (dreimal kristallisiert, aus Hühnereiern) ersetzt. Dann wird die Reaktion mit Formaldehyd in der vorstehend beschriebenen Weise durchgeführt.

Die allergenen und antigenen Eigenschaften formalinisierter Allergene werden: untersucht und mit den entsprechenden Eigenschäften der natürlichen Allergene, von denen-sie sich ableiten, verglichen.,

Die allsrgenen Eigenschaften-werden qualitativ durch Hautkratz.-Ie s ta bei einer Vielzahl· allergischer- menschlicher Patienten untersucht. Ferner werden halb quantitative Untersuchungen durch intradermales lesten der- Haut sowie durch direktes Reizen der Luftröhre an: allergischen menschlichen Patienten durchgeführt. Schliesslich wird, quantitativ das Histamin gemessen, das aus menschlichen Leukozytensuspensionen (isoliert von ungefähr 15 verschiedenen allergischen Personen) anschliessend an einen"Immunitätstest mit formalinisierten oder natürlichen Allergenen in Freiheit gesetzt wird. "

Es werden zwei Aspekte einer Querantigenizität zwischen for~ malinisierten und natürlichen Allergenen untersucht, und zwar 1. guerreaktogene Eigenschaften, d.h. die Fähigkeit eines formalinisierten Allergens, sich mit Antiseren zu kombinieren, die (in Kaninchen) gegen das natürliche Allergen erzeugt worden sind, und 2. querimmunogene Eigenschaften, d.h. die Fähigkeit eines formalinisierten Allergens, die Bildung (in

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Meerschweinchen) von Antikörpern au induzieren, welche eine natürliche Allergen-induzierte allergische Histaminfreisetzung aus isolierten allergischen menschlichen Leukozyten blockieren und mit dem natürlichen Allergen bei der Durchführung von Tests querreagieren, beispielsweise bei Durchführung einer passiven kutanen Anaphylaxe (PCA) in normalen Meerschweinehen. Bezüglich der quantitativen Bestimmung des Vorliegens der gewünschten immunisierenden Eigenschaften eines formalinisierten Allergens ist das Blockieren.einer Allergen-bewirkten allergischen Histaminfreisetzung aus menschlichen Leukozyten ein kritischer Test. ..

Die erfindungsgemässen formalinisierten Allergene haben im wesentlichen die allergenen Eigenschaften verloren, jedoch in einem hohen Ausmaß die antigenen Eigenschaften (einschliesslieh der gewünschten immunisierenden Eigenschaften) des natürlichen Allergens beibehalten. Der Allergenizitätsverlust schwankt in Abhängigkeit von dem getesteten Individuum, von der !Datsache, ob Additive in dem formalinisierten Allergen vorliegen sowie dem Typ des angewendeten Allergenizitätstests. Der Allergenizitätsverlust ist bei dem formalinisierten Allergen gegenüber dem natürlichen Allergen um das ungefähr 200-fache bis 1 000 000-fache (in üblicher Weise um das 1 000-fache bis 10 000-fache) niedriger. Die Querantigenisität zwischen dem formalinisierten Allergen und dem natürlichen Allergen beträgt in Üblicher Weise 20 - 100 #. In vielen Fällen sind die angestrebten Imraunisierungseigenschaften des formalinisierten Allergens gegenüber denjenigen des natürlichen Allergens in einem Ausmaß von 60 - 100 $> beibehalten worden. ·

Die formalinisj.erten erfindungsgemässen Allergene sind gegen-

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über den natürlichen Allergenen daher bei einer Verwendung in der Humanimmunotherapie weit überlegen, da das Ausmaß der angestrebten Immunisierungseigenschaften im Vergleich zu der Allergenizität erheblich gesteigert ist.

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Claims

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Patentansprüche

1.J JFormalinisiertes Allergen mit einer niedrigen allergenen Aktivität auf menschliche Lebewesen, das in Warmblütern die Bildung von Blockierungs-Antikörpern gegen das natürliche Allergen in merklichen Mengen zu induzieren vermag, dadurch gekennzeichnet, dass· es durch Behandlung eines wässrigen Extrakts eines Materials, welches das natürliche Allergen enthält, mit einer verdünnten JFormaldehydlösung in einer nicht-phenolischen Umgebung sowie durch Inkubation derselben hergestellt worden ist.

2. Allergen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Behandlung eines wässrigen Extrakts eines Katerials, welches das natürliche Allergen enthält, mit einer ,Fprmaldehydlösung und wenigstens einem Additiv, wobei das Additiv aus einer aliphatischen Verbindung besteht, die wenigstens eine funktioneile Aminogruppe, Amidogruppe oder Guanidinogruppe oder eine Kombination derartiger Gruppen enthält, wobei diese Gruppen dazu in der Lage sind, mit Formaldehyd oder einem Aminomethylolrest zu reagieren, und Inkubation desselben hergestellt worden ist.

5. Allergen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Behandlung eines wässrigen Extrakts eines Materials, welches das natürliche Allergen enthält, von welchem nicht-allergene Substanzen mit niederem Molekulargewicht entfernt worden sind, mit einer verdünnten Pormaldehydlösung in einer nicht-phenolischen Umgebung und Inkubation desselben hergestellt worden ist.

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ORlGSMAL INSPECTED

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4. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-enthaltende Material ein wässriger Extrakt einer Graspollen-Substanz ist.

5.-Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass daß Allergen—enthaltende Material eine Graspollen-Aller— genzubereitung der Gruppe I enthält. .

6. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-en thai tende Material ein wässriger Extrakt einer Unkrautpöllen-Substanz ist.

7. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-enthaltende Material das Ambrosiapollen-Antigen E enthält»

8. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-enthal tende Material ein wässriger Extrakt einer Baumpollen-Substanz ist.

9. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-enthaltende Material ein wässriger Extrakt ist, der Hausstaubmilben oder ihre Rückstände enthält.

10. Allergen nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen-enthaltende Material eine gereinigte Allergenzubereitung ist*

11. Verfahren zur Herstellung eines formalinisierten Allergens gemäss Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass ein wässriger Extrakt eines Materials, weiches natürliches Allergen

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enthält, mit einer verdünnten' Formaldehydlösung in einer nicht-phenolischen Umgehung behandelt und anschliessend .dieselbe inkubiert -wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit einer verdünnten Formaldehydlösung in Gegenwart wenigstens eines Additivs durchgeführt wird, das aus einer aliphatischen Verbindung besteht, welche wenigstens

• eine funktionelle Aminogruppe, Amidogruppe oder Guanidinogruppe, die mit dem Formaldehyd oder einem Aminomethylolrest zu reagieren vermag, enthält.

13. Verfahren nach Anspruch 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass von dem eingesetzten natürlichen Allergen in dem extrahierten Material nicht-allergene Substanzen mit niederem Molekulargewicht entfernt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Allergen-renthaltendes Material e.in wässriger Extrakt einer Graspollen-Substanz verwendet wird.

15. Verfahren nach Anspruch IT, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Allergen-enthaltende Material eine Graspollen-Allergenzubereitüng der Gruppe I enthält,

16. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Allergen-eiithältendes Material ein wässriger Extrakt einer linkrautpollen-Substanz verwendet wird,

17. Verfahre» nach Anspruch Ti, 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Allergen-enithaltende Material Ambrosiapflsnzenpöllen-Antigen E enthält.

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18. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass als A^Llergen-enthaltendes Material, ein wässriger Extrakt einer Baumpollen-Substanz verwendet wird..

19. Verfahren naeh Anspruch 11, 12 oder 13, dadurcii gekennzeichnet, dass als Allergen-enthalt end es. Material ein •wässriger Extrakt verwendet wird, der Hausstaubmirben oder ihre Rückstände: enthält* · .

20. Yerfähren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Allergen-enthaltendes Material eine gereinigte Allergenzubereitung verv/endet wird.

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in merklicher Menge gegen das natürliche Allergen tieren,, dadurch gekennzeichnet, dass an dag^iidflPlstier ein formalinisiertes Allergen gemäss Ajgsgeffch 1 - IC- verabreicht wird.

Verfahre

Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass inisierte Allergen auf transmukosalein Wege verab-

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"'*** -3/ '' 12. MFl 1970

Patentansprüche

21, Verwendung eines Allergens nach Anspruch 1 bis 10 zur .Erzeugung von. Elockierungsantikörpern in merklicher Menge gegen das natürliche Allergen in Säugetieren.

22, Verwendung nach Anspruch 21 durch Verabreichung auf Üransmucosalem Wege.

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BAD

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