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Verfahren zur Herstellung von arzneilich verwendbaren Allergenpräparaten
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung allergener Präparate, die zur prophylaktischen
und therapeutischen Behandlung von Allergien geeignet sind.
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Es ist bekannt, daß viele Materialien Wirkstoffe enthalten, deren
chemische Zusammensetzung nicht bekannt ist und die eine hohe physiologische Wirksamkeit
zeigen und bei empfindlichen Individuen bestimmte Formen von allergischen Symptomen
hervorrufen können. Diese Wirkstoffe sind allgemein als Allergene bekannt.
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Die vorliegende Erfindung betrifft Allergene, die allergische Reaktionen,
wie Asthma oder Heufieber, hervorrufen, und ist ganz allgemein auf alle einatembaren
Materialien (hinfort »Inhalantien« genannt), wie Stäube, Epithelmaterialien, Samen,
Insekten und Pollen, anwendbar.
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Bisher sind zahlreiche Versuche unternommen worden, Inhalantien bei
der therapeutischen Behandlung bestehender Allergien und in der Prophylaxe von Allergien
zu verwenden, indem ein immunologes Ansprechen bewirkt und dadurch ein Schutz gegen
die (oder mindestens eine Verringerung der) Wirkung eines akuten Anfalles erzielt
wird. Im Laufe dieser Untersuchungen wurde eine Vielzahl von Extrakten getestet,
die alle oder mindestens den größten Teil der aktiven Komponenten enthalten sollen;
einige dieser Präparate wurden auf den Markt gebracht.
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Der größte Teil der Inhalantien enthält beträchtliche Mengen mit
Wasser nicht mischbarer Öle. Auf Grund der Anwesenheit dieser nicht mit Wasser mischbaren
Öle liefert die Extraktion der gesamten Inhalantien mit wäßrigen extrahierenden
Flüssigkeiten trübe Lösungen. Die Ärzteschaft wehrt sich gegen trübe Lösungen, da
sie von verunreinigten Präparaten nicht leicht zu unterscheiden sind. Daher wurde
früher auf dem Gebiet der Allergieforschung vorgeschlagen, die öligen Substanzen
mit Äther zu entfernen, und ein Entfetten der Inhalantien vor der Extraktion ist
inzwischen ein übliches Verfahren auf diesem Gebiet geworden.
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Die Anwendung dieses Verfahrens ist schwer erklärlich im Hinblick
auf Forschungsarbeiten, die schon 1930 feststellten, daß in der 01- oder Fettfraktion
der Inhalantien eine allergen wirksame Komponente anwesend ist. Daher entfernt das
übliche Entfettungsverfahren vor der wäßrigen Extraktion die wirksame Ölfraktion.
Nachdem festgestellt wurde, daß keines der zahlreichen vorgeschlagenen Inhalantienextrakte,
die teilweise Jahre hindurch auf dem Markt waren, für Therapie oder
Prophylaxe völlig
zufriedenstellend war, wäre es logisch erschienen, die Untersuchungen in einer solchen
Richtung fortzusetzen, daß das gesamte Inhalantium einschließlich der Fettkomponente
verwendet und von irgendeiner Behandlung des Materials, die eine aktive Komponente
desselben beeinträchtigt oder umwandelt, abgesehen wird; dies war jedoch bis zur
vorliegenden Erfindung nicht der Fall. Dieser Fehler wurde zweifellos durch mehrere
Faktoren verursacht, von denen vermutlich der hauptsächlichste der war, daß es kein
Mittel gab, durch welches ein Extrakt aus dem gesamten Inhalantium hergestellt werden
konnte, ohne daß sich eine trübe Lösung ergab, die sehr schnell unter Bildung eines
harzartigen Rückstandes ölig wurde; weiterhin bestand die Gefahr der Einführung
von giftigen oder anderen unerwünschten Komponenten in den Extrakt, die schädliche
Nebenwirkungen verursachen konnten.
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Nach der Erfindung wird das ganze Inhalantium mit einer eine schwache
organische Base, insbesondere ein heterocyclisches tertiäres Amin, wie Pyridin,
Lutidin, Chinolin, und ein wäßriges Medium enthaltenden Extrahierflüssigkeit extrahiert.
Es kann einfaches destilliertes Wasser verwendet werden
jedoch wird
eine salzhaltige Lösung mit etwa 0,30/0 Natriumbicarbonat oder 0,90/0 Natriumchlorid
oder 5 Olo Dextrose oder eine n/10-Natriumhydroxydlösung oder ein Phosphatpuffer
mit einem p-Wert von 7,0 bevorzugt, wobei die Prozentangaben nur als Beispiel gegeben
sind. Die schwache organische Base und die wäßrige Lösung werden zweckmäßig in etwa
gleichen Teilen verwendet.
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Es wurde festgestellt, daß die Extraktion von Flüssigkeiten mit der
oben angegebenen Zusammen setzung sowohl die Öl- oder Fettfraktion als auch irgendwelche
proteinhaltigen Komponenten, wie wasserlösliche Proteine, Polypeptide, aus dem ganzen
Inhalantium extrahiert. Die öligen Fraktionen sowie irgendwelche wasserunlöslichen
proteinhaltigen Fraktionen, die im ganzen Inhalantium vorliegen können, enthalten
vermutlich saure Endgruppen, mit welchen die schwache tertiäre Base unter Bildung
von quaternären Verbindungen, z. B. Pyridiniumsalzen, oder vernetzten Verbindungen
reagiert; das Pyridin oder eine ähnliche schwache tertiäre Base kann mit den Aminodicarbonsäuren
reagieren, die bekanntlich in allen proteinhaltigen Fraktionen, einschließlich der
wasserunlöslichen Komponenten, die mit den Öl- oder Fettfraktionen in ganzen Inhalantien
eng assoziiert sind, reichlich vorhanden sind.
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Nach der vorliegenden Erfindung wird der ganze Inhalantienextrakt,
der durch Extraktion mit einer pyridinhaltigen oder ein ähnliches Material enthaltenden
extrahierenden Flüssigkeit hergestellt wurde, mit Alaun zwecks Ausfällung eines
allergen wirksamen, wasserunlöslichen Inhalantienkomplexes behandelt.
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Wurden z. B. 50"10 Äthylalkohol, 50t/o Aceton, 500/0 Glycerin oder
37°/0 Resorcin in wäßriger Lösung zum Extrahieren ganzer Pollen verwendet, so konnte
aus dem erhaltenen Extrakt mit Kaliumalaun kein solcher Niederschlag erhalten werden,
wie er auftritt, wenn ein 500/oiger Pyridinextrakt damit versetzt wurde.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf alle Inhalantien,
insbesondere auf solche, die Asthma, Heufieber und andere Reizungen der Atmungsorgane
bewirken und durch die Luft verbreitet werden. Zu den erfindungsgemäß mit Erfolg
behandelten Materialien, die in allergen wirksame wasserunlösliche Inhalantienkomplexe
mit guter Wirksamkeit bei der Prophylaxe und Therapie von Asthma und Heufieber umgewandelt
werden konnten, gehören Stäube, wie gewöhnlicher Staub aus Haushaltsabsaugern, und
Staub von verschiedenen Fabriken oder Geschäften, wie Kehrgut von Holzverarbeitungsfabriken,
Pelzwerkstätten und Bäckereien; Epithelmaterialien, einschließlich Katzen-, Hunde-,
Kaninchen- und Ziegenhaare und Hühner-, Enten- und Gänsefedern; Samen, wie Baumwollsamen
und Kapoksamen; Insekten, wie die verschiedenen Wespenarten, Bienen, Hornissen,
Mücken und andere stechende Insekten, und Pollen von Unkraut, Gräsern und Bäumen,
insbesondere Ambrosia trifida und Ambrosia artemisiaefolia (»high ragwood« und »low
ragwood«), Platanen, Phleum pratense (»timothy grass«), Dactylis giomerata (»orchard
gras«). Eschen, Buchen, Birken, Ulmen, Eichen, Hickory-Nußbaum, Pappeln und Ahorn.
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Das Inhalantium kann nach dem effindungsgemäßen Verfahren in einem
weiten Bereich von Konzentration extrahiert werden.
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Die Extraktion kann mit oder ohne Rühren bei Zimmertemperatur oder
unter Kühlung erfolgen und liefert eine Lösung, die das Reaktionsprodukt der schwachen
tertiären Base, z. B. Pyridin, mit physiologisch aktiven allergenen Komponenten
des Inhalantiums, einschließlich der wichtigen Ölfraktion desselben, enthält.
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Die erfindungsgemäßen neuen antigenen Inhalantienkomplexe werden
durch Behandlung der Extrakte mit Alaun erhalten. So werden z.B. 10 g Staub mit
100 ccm einer Pyridinbicarbonatlösung 48 Stunden extrahiert, der Extrakt abfiltriert
und anschließend durch Seitz-Filtration sterilisiert. Der 10 0/obige Pyridinbicarbonat-Staub-Extrakt
wird mit einem gleichen Volumen sterilem destilliertem Wasser vereinigt; dann wird
langsam die gleiche Menge einer Lösung aus sterilem 20/oigem Kaliumaluminiumsulfat
in 0,25 n-Schwefelsäure zugegeben, wodurch ein allergen wirksamer wasserunlöslicher
Staubkomplex ausfällt.
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Der Niederschlag und die Lösung werden stehengelassen, worauf die
Mischung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen wird. Der Rückstand
kann mehrmals mit steriler Kochsalzlösung gewaschen werden, und das endgültige Volumen
dieser Suspension kann auf ein solches Volumen aufgefüllt werden, das der Hälfte
des ursprünglichen Volumens des verwendeten öligen Pyridinbicarbonat-Staub-Extraktes
entspricht.
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Dieses Produkt ist mit Wasser praktisch unlöslich, zeigt eine sehr
starke antigene Wirksamkeit und läßt sich zur Verabreichung durch subkutane Injektion
bei prophylaktischer und therapeutischer Behandlung von Asthma leicht in isotonischer
Kochsalzlösung suspendieren. Die allergene Wirksamkeit des Produktes wird selbst
bei langer Lagerung bei Zimmertemperatur praktisch nicht beeinflußt.
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Die vorliegenden Suspensionen lassen sich durch Wiegeverfahren unter
Berücksichtigung aller V01-liegenden antigenen Fraktionen, einschließlich der in
der bisherigen Praxis vor der Herstellung eines wäßrigen Extraktes entfernten öligen
Fraktion, leicht standardisieren.
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Die erfindungsgemäßen neuen aliergenen Produkte sind ungiftig und
nicht reizend, wie durch die folgende Versuchsreihe festgestellt wurde: Zwölf aufs
Geratewohl ausgewählten Personen ohne irgendwelche vorherige Überempfindlichkeit
wurden subkutane Injektionen des Produktes in verschiedener Verdünnung verabreicht,
ohne daß irgendeine örtliche oder allgemeine Reaktion feststellbar wurde.
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Die Stabilität der erfindungsgemäßen neuen antigenen Produkte wurde
durch Kaninchenversuche veranschaulicht, die eine praktisch unverminderte Wirksamkeit
der erfindungsgemäßen, mit Alaun ausgefällten Pyridininhalantienextrakte mit 3jähriger
Lagerung bei Zimmertemperatur zeigten.
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Die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Inhalantienextrakte zeichnen
sich durch eine stark verringerte Absorptionsgeschwindigkeit im Vergleich mit üblichen
wäßrigen entfetteten Extrakten aus. Dies wurde durch passive Übertragungsversuche
an sechs geeigneten, nichtempfindlichen Erwachsenen mit gegen Ambrosia trifida empfindlichen
Stellen veranschaulicht, wobei ein gewöhnlicher wäßriger Extrakt von A. trifida
und ein erfindungsgemäßer wasserunlöslicher Extrakt von A. trifida verwendet wurde.
Die Zeitspanne und das Maß an Reaktion an den Übertragungsstellen
wurden
notiert und eine erhebliche Verringerung der Absorptionsgeschwindigkeit des erfindungsgemäßen
Produktes (das Dreifache oder mehr) gegenüber der Absorption des gewöhnlichen wäßrigen
Extraktes von A. trifida festgestellt.
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Die erfindungsgemäßen neuen allergenen Produkte sind nicht giftig
und nicht reizend und wesentlich wirksamer als die bisher zur prophylaktischen und
therapeutischen Behandlung von Asthma und Heufieber erhältlichen Produkte.
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Verfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung werden durch die
folgenden Beispiele veranschaulicht.
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Beispiel 1 10 g gewöhnlicher Staub aus einem Staubsauger wurden in
eine Schale gegeben und so viel extrahierende Flüssigkeit (bestehend aus 500/0 Pyridin
und 500/0 einer wäßrigen, einen Phosphatpuffer mit einem p11-Wert von 7,0 enthaltenden
Lösung) zugegeben, daß die antigene Masse gerade bedeckt war. Der Staub wurde unter
gelegentlichem Rühren 2 Tage bei Zimmertemperatur extrahieren gelassen, der größte
Teil des Staubes dann durch eine Presse oder Filtertuch entfernt und der Extrakt
durch normales Filterpapier abfiltriert und dann zwecks Sterilisation durch einen
Seitz-Filter geführt. 40 ccm des so erhaltenen Pyridin-Staub-Extraktes wurden unter
sterilen Bedingungen mit 40 ccm sterilem destilliertem Wasser vereinigt und zu dieser
Mischung 40 ccm einer 0,25 n-Schwefelsäurelösung, die 2 Gewichtsprozent steriles
Kaliumaluminiumsulfat enthielt, unter ständigem Rühren langsam zugegeben. Das Reaktionsprodukt
fiel als voluminöser, gelber bis brauner Niederschlag aus, der einen allergen wirksamen
wasserunlöslichen Staubkomplex darstellte. Der Niederschlag und die Lösung wurden
über Nacht bei 5"C stehengelassen, die Mischung dann zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit verworfen. Der Rückstand wurde dreimal mit großen Mengen steriler Kochsalzlösung
gewaschen, wobei sterile Glasperlen zur Trennung der feinzerteilten Teilchen des
Niederschlages und zwecks leichterem Waschen verwendet wurden. Dann wurde der Niederschlag
in isotonischer Lösung suspendiert, wobei das endgültige Volumen dieser Suspension
so eingestellt wurde, daß es der Hälfte des ursprünglichen Volumens des verwendeten
Pyridin-Staub-Extraktes entsprach. Die Suspension dieses Produktes in isotonischer
Kochsalzlösung erwies sich zur Verabreichung durch subkutane Injektion als geeignet.
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Beispiel 2 Ein getrocknetes Katzenfell wurde durch Schneiden oder
Vermahlen in einer Kugelmühle oder ähnlichen Vorrichtung zerkleinert. Das Material
wurde ohne vorheriges Waschen oder Sterilisieren, was den Verlust von antigener
Wirksamkeit verursachen konnte, gesammelt und gemäß Beispiel 1 behandelt. Es wurde
ein ähnliches Produkt wie im Beispiel 1 erhalten, das sich nach Suspension in isotonischer
Kochsalzlösung zur Verabreichung durch subkutane Injektion als geeignet erwies.
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Beispiel 3 Hühnerfedern wurden ohne vorheriges Waschen oder Sterilisieren
in einer Kugelmühle oder ähnlichen Vorrichtung vermahlen und dieses Material wie
im
Beispiel 1 behandelt. Es wurde ein ähnliches Produkt wie im Beispiel 1 erhalten,
das sich nach Suspension in isotonischer Kochsalzlösung zur Verabreichung durch
subkutane Injektion als geeignet erwies.
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Beispiel 4 Baumwollsamen wurde ohne vorheriges Entfetten, Waschen
oder Sterilisieren in einer Kugelmühle vermahlen und dieses Material wie im Beispiel
1 behandelt. Es wurde ein ähnliches Produkt wie im Beispiel 1 erhalten, das sich
nach Suspension in isotonischer Kochsalzlösung zur Verabreichung durch subkutane
Injektion als geeignet erwies.
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Beispiel 5 Wespen (sogenannte »yellow jackets«) wurden lebend gesammelt,
eingefroren und bis zur Extraktion unter Tiefkühlung gehalten. Ohne vorheriges Waschen
oder Sterilisieren wurden 5g dieses Insektenmaterials mit 100 ccm einer Extraktionsflüssigkeit
aus 500/0 Pyridin und 500/0 wäßriger 0,30/oiger Natriumcarbonatlösung extrahiert
und der erhaltene Extrakt dann weiter wie im Beispiel 1 behandelt.
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Nach Suspension in isotonischer Kochsalzlösung erwies sich das Produkt
zur Verabreichung durch subkutane Injektion als geeignet.
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Bei Wiederholung dieses Beispiels unter Verwendung toter, getrockneter
Insekten bei der Extraktion schien die antigene Wirksamkeit des Komplexes vermindert.
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Beispiel 6 Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß 12g einer Mischung aus gleichen Teilen von A. trifida- und A. artemisiaefolia-Pollen
24 Stunden bei Zimmertemperatur mit 100 ccm einer Extraktionsflüssigkeit aus 50
ccm Chinolin und 50 ccm einer wäßrigen 0,90/obigen Natriumchloridlösung extrahiert
wurden. Dieser Extrakt wurde dann weiter wie im Beispiel 1 behandelt. Es wurde ein
ähnliches Produkt wie im Beispiel 1 erhalten, das sich nach Suspension in isotonischer
Kochsalzlösung zur Verabreichung durch subkutane Injektion als geeignet erwies.
Beispiel 7 Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 3
g einer Mischung aus gleichen Teilen von A. trifida- und A. artemisiaefolia-Pollen
24 Stunden bei Zimmertemperatur mit 100 ccm einer Extraktionsflüssigkeit aus 50
ccm Lutidin und 50 ccm n/10-Natriumhydroxydlösung extrahiert wurden. Dieser Extrakt
wurde weiter wie im Beispiel 1 behandelt und ein ähnliches Produkt wie in diesem
Beispiel erhalten, das nach Suspension in isotonischer Kochsalzlösung zur Verabreichung
durch subkutane Injektion geeignet war.
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Beispiel 8 Das Verfahren von Beispiel 7 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß 18 g einer Mischung aus gleichen Teilen von Pollen von A. trifida,
A. artemisiaefolia, Phleum pratense, Dactylis glomerata, Buchen und Pappeln an Stelle
der 3 g der Mischung aus Ambrosiapollen verwendet wurden. Das Endprodukt war - auch
in seiner Eignung ähnlich dem im Beispiel 7 beschriebenen Produkt und besaß den
deutlichen Vorteil einer mehrfachen Immunisierung.
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Beispiel 9 Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß an Stelle der dort verwendeten 40ccm einer Kaliumalaun enthaltenden
0,25 n-Schwefelsäurelösung 50 ccm einer 2 Gewichtsprozent Kaliumalaun enthaltenden
wäßrigen Lösung verwendet wurden. Das Endprodukt war - auch in seiner Eignung -
ähnlich dem im Beispiel 1 beschriebenen Produkt.
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Beispiel 10 Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß an Stelle der dort verwendeten 40 ccm einer Kaliumalaun enthaltenden
0,25 n-Schwefelsäurelösung 50 ccm einer 2 Gewichtsprozent Kaliumalaun enthaltenden
wäßrigen Lösung verwendet wurden. Das Endprodukt war - auch in seiner Eignung -
ähnlich dem im Beispiel 3 beschriebenen Produkt.
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Beispiel 11 Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der
Ausnahme, daß an Stelle des dort verwendeten Katzenfelles Kaninchenfell und an Stelle
von Pyridin in der Extrahierflüssigkeit Chinolin ver wendet wurde. Das Endprodukt
war - auch in seiner Eignung - ähnlich dem im Beispiel 2 beschriebenen Produkt.
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Beispiel 12 Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß an Stelle der dort verwendeten Hühnerfedern Gänsefedern und an Stelle
von Pyridin in der Extrahierflüssigkeit Lutidin verwendet wurden. Das Endprodukt
war - auch in seiner Eignung - ähnlich dem im Beispiel 3 beschriebenen Produkt.
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Beispiel 13 Das Verfahren von Beispiel 4 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß an Stelle der dort verwendeten Baumwollsamen Kapoksamen verwendet
wurden. Der Extrakt wurde weiter wie im Beispiel 4 behandelt und lieferte ein diesem
Beispiel ähnliches Produkt, das nach Suspension in isotonischer Kochsalzlösung zur
Verabreichung durch subkutane Injektion geeignet war.
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Beispiel 14 Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt mit der
Ausnahme, daß an Stelle der Wespen (»yellow jackets«) Bienen verwendet wurden. Das
Endprodukt war - auch in seiner Eignung - ähnlich dem im Beispiel 5 beschriebenen
Produkt.