DE2749961C2

DE2749961C2 -

Info

Publication number: DE2749961C2
Application number: DE2749961A
Authority: DE
Inventors: Takashi Fujisawa Kanagawa Jp Okonogi; Zenpachiro Tokio/Tokyo Jp Hattori; Akira Mitaka Tokio/Tokyo Jp Ogiso; Seiji Tokio/Tokyo Jp Mitsui
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1976-11-08
Filing date: 1977-11-08
Publication date: 1989-08-24
Also published as: FR2370056A1; AU511811B2; AU3041477A; DE2749961A1; US4172126A; FR2370056B1; GB1548787A

Description

Toxine, die durch mikrobische Mittel, beispielsweise durch Bakterien gebildet werden, können als Antigene bei dem Verfahren zu aktiven Immunisierung verwendet werden, bei dem die Bildung von Antikörpern durch das Einbringen eines spezifischen Antigens stimuliert wird. Häufig muß das Toxin inaktivert werden derart, daß es sicher verabreicht werden kann, während gleichzeitig seine antigene Wirkung beibehalten werden muß. Ein inaktiviertes Toxin, das als Toxoid bekannt ist, wird gewöhnlich aus verschiedenen Mikroorganismen durch Zugabe von Formaldehyd hergestellt. Eine andere für diesen Zweck verwendete Verbindung ist Tanninsäure, die aus fermentierten Eichengallen erhalten wird.

Die Herstellung von Toxoiden und Vakzinen umfaßt eine sehr genaue Qualitätskontrolle und die Produkte machen eine spezielle Handhabung und Lagerung erforderlich. In zahlreichen Ländern erfolgte eine Gesetzgebung zur Kontrolle der Herstellung, der Lagerung und der Verwendung von Vakzinen, um eine maximale Sicherheit zu gewährleisten.

Dessen ungeachtet jedoch zeigen biologische Präparate dieses Typs verschiedenartige Nebenwirkungen, die selbst unter genauester Kontrolle unvermeidlich sind. Beispielsweise ist bekannt, daß Pertussis-Vakzine, die epidemiologisch insbesondere in Entwicklungsgebieten wie Südostasien und Afrika als eine Notwendigkeit angesehen wird, Nebenwirkungen hervorruft, wie das Anschwellen an der Stelle der Inokulation, Schmerzen, systemisches Fieber, Erbrechen und auch Schocksymptome oder gelegentlich einen ernsthaften Gehirnschaden. Es besteht daher tatsächlich ein Bedürfnis nach einem Verfahren, das die unerwünschten Nebenwirkungen einer derartigen Vakzine beseitigt, während gleichzeitig die prophylaktische Wirkung beibehalten wird.

Es wurde nun gefunden, daß aus der Frucht der Pflanzengattung Diospyros wie aus der Perismone bzw. Kaki- bzw. Dattelpflaume erhaltenes Tannin verwendet werden kann, um mikrobische Toxine zu inaktivieren und die Vakzine ohne Beeinträchtigung ihrer Antigenität abzuschwächen.

Die Frucht der Persimone (Diospyros Kaki Thumb.) enthält Tannin, von dem ein einfacher wäßriger Extrakt in Japan als Adstringens und als Klärmittel bei der Herstellung von Sake bekannt ist. Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Sachverhalt, daß in bestimmter Weise erhältliches Tannin aus der Persimonefrucht und der Frucht verwandter Species von Diospyros eine völlig unerwartete Wirkung im Hinblick auf die von Mikroorganismen gebildeten Toxine und im Hinblick auf die Nebenwirkungen verschiedener Vakzine besitzt. Dies gilt auch im Hinblick darauf, daß die toxische Wirkung von Tanninen auf Viren und Antigene an sich bekannt war [vgl. C. A. (1958), Seite 17 502 g und C. A., Vol. 64 (1966), Seite 20 226c] und daß Substanzen der vorliegenden Art als Gerbstoffe bereits vorbeschrieben sind [vgl. Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Springer-Verlag, Berlin, 1973, Band IV, Seiten 678 bis 680, und C. A., Vol. 68 (1968), 65 797p].

Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der aus der Frucht der Pflanzengattung Diospyros erhaltenen Tannine, die erhältlich sind durch

a) die Extraktion der Frucht mit Wasser oder mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder mit einer Mischung von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und die Entfernung von unlöslichen Bestandteilen;
1b) mit Ausnahme dessen, daß ein alkoholisches Extraktionslösungsmittel bei der Stufe a) verwendet wird, die Einengung des flüssigen Extrakts, die Verdünnung mit einem niedrigen Alkohol und die Entfernung von unlöslichen Bestandteilen;
c) das Ausfällen von Tannin durch Zugabe eines Nichtlösungsmittels für Tannin zu der alkoholischen Phase;
d) die Auflösung des ausgefällten Tannins in Wasser, die Sterilisierung der Lösung und eine Gefriertrocknung,

wobei in der Stufe d) gegebenenfalls die wäßrige Lösung bei einem sauren pH vor der Sterilisierung dialysiert werden kann.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung wird das Toxin mit dem Tannin, das aus einer Frucht der Gattung Diospyros stammt, in Kontakt gebracht oder ein derartiges Tannin wird in die Vakzine eingebracht.

Die Gattung Diospyros gehört der Familie Ebenaceae an und umfaßt beispielsweise die Persimone selbst (Diospyros Kaki Thumb.), die kleine Persimone (Diospyros lotus L.) und Ebenholz (Diospyros ebenum Koenig).

Das Extraktionslösungsmittel in der Stufe a) ist vorzugsweise Aceton, jedoch kann alternativ ein anderes mit Wasser mischbares Lösungsmittel wie Methanol oder Äthanol verwendet werden. Das Nichtlösungsmittel für das Tannin, das zu der alkoholischen Lösung zugegeben wird, um das Tannin auszufällen, ist zweckmäßigerweise ein organisches nicht polares "Lösungsmittel" wie ein aliphatischer Äther, z. B. Diäthyläther.

Vorzugsweise wird die Frucht, die reif oder unreif sein kann, zuerst erhitzt, bevorz sie in der Stufe a) extrahiert wird. Vorteilhaft ist eine Wärmebehandlung, beispielsweise bei 100-120°C. Danach wird die Stufe a) vorzugsweise an der zerkleinerten Frucht entweder bei Raumtemperatur oder bei erhöhter Temperatur durchgeführt.

In der Stufe d) wird die wäßrige Lösung des Tannins vorzugsweise vor der Sterilisation, gewöhnlich bei einem sauren pH, z. B. bei pH 3 bis 5, insbesondere pH 4, der durch Zugabe einer Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure erhalten wird, dialysiert.

Das Tannin wird in Form eines blaßbraunen Pulvers erhalten.

Das vorstehend erläuterte Extraktionsverfahren führt zu einem kondensierten Tannin, das frei von anderen Tanninmaterialien ist.

Das nach der angegebenen Verfahrensweise erhältliche kondensierte Tannin besitzt die folgenden Eigenschaften:

a) blaßbraunes Pulver in gefriergetrockentem Zustand;
b) wasserlöslich; wenig löslich in Methanol, Äthanol, Pyridin, Essigsäure, unlöslich in Diäthyläther, Äthylacetat und Chloroform;
c) die wäßrige Lösung gibt mit Ferrichlorid eine dunkelblaue Färbung und mit Bleiacetat eine braune Färbung;
d) das Infrarotabsorptionsspektrum, wie es im wesentlichen in der Fig. 2 gezeigt wird, besitzt bei einer Messung in flüssigem Paraffin Hauptabsorptionsbanden bei 3400, 1615, 1530, 1380, 1200, 1100 und 1040 cm^-1;
e) das Ultraviolettabsorptionsspektrum, wie es im wesentlichen in Fig. 1 gezeigt wird, besitzt bei einer Messung in wäßriger Lösung ein Absorptionsmaximum bei ca. 275 nm;
f) ein Chromatogramm, wie es im wesentlichen in Fig. 3 gezeigt wird, besitzt einen einzigen Peak bei der Gelfiltration unter Verwendung einer Säule mit einem stark sauren Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat-Sulfonat-Harz und Wasser als beweglicher Phase und
g) es besitzt ein Ultrazentrifugen-Schlierenmuster bei 46 633 Umdr./Min. nach 26 Min., wie es im wesentlichen vorliegend in Fig. 4 gezeigt wird.

Dieses kondensierte Tannin kann in ein nicht-toxisches Salz wie ein Alkalimetallsalz, z. B. das Natrium- oder Kaliumsalz, übergeführt und erfindungsgemäß verwendet werden.

Die chemische Natur des kondensierten Tannins wurde durch die folgenden Tests bestätigt. Das Material wurde 3 Min. in 20%iger wäßriger Salzsäure gekocht. Der überwiegende Teil des Tannins wurde in Form eines phlobaphenartigen Niederschlags erhalten, der abfiltriert wurde. Das rötliche purpurne Filtrat enthielt Cyanidin und Delphinidin.

Die Substanz wurde auch 2 Std. in 5% Salzsäure enthaltendem n-Butanol auf 100°C erhitzt. Die so gebildeten Anthocyanidine wurden isoliert und quantitativ bestimmt, wobei ein Verhältnis von Cyanidin/Delpinidin von 1 : 3 ermittelt wurde.

Man unterzog eine Probe des kondensierten Tannins einem Verschmelzen mit einem Alkali bei 185°C unter Stickstoff während 10 Min., um Protocatechusäure und Gallussäure in einem Verhältnis von 1 : 3 zusätzlich zu etwas Phloroglucin zu ergeben.

Diese Tests zeigten zusammen mit den vorstehend angegebenen physikalischen Eigenschaften, daß das kondensierte Tannin in der Tat ein einziges kondensiertes Tannin ist, das als strukturelle Einheit Gallocatechin und Catechin enthält.

Das Persimonentannin, insbesondere das gereinigte kondensierte Tannin, scheint beträchtlich weniger toxisch zu sein als Tanninsäure. Somit wurde bei männlichen Ratten von Wistar-Imamichi-Stamm mit einem Körpergewicht von 200-250 g kein peritoneal stimulierendes Syndrom (z. B. Retention von Asciten oder Adhäsion des Peritoniums) beobachtet, wenn 0,1 ml einer 0,5%igen wäßrigen Tanninlösung intraperitoneal injiziert wurden. Es wird bei einer Injektion einer 1- bis 5%igen wäßrigen Lösung eine peritoneale Irritation beobachtet, jedoch werden keine Todesfälle beobachtet. Eine Injektion von 0,1 ml einer 1%igen wäßrigen Lösung auf intravenösem Weg in den Schwanz ist nicht tödlich, jedoch verursacht eine Injektion von 0,1 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung einige Unannehmlichkeiten.

Es wird keine lokale Irritation oder ein Anschwellen beobachtet, wenn 0,05 ml einer 1,25%igen wäßrigen Lösung von Persimonentannin in den plantaren Bereich der Pfote einer männlichen Maus vom ddY-Stamm (5 Wochen alt) injiziert werden. Im Gegensatz hierzu wird eine starke Irritation beobachtet, wenn lediglich eine 0,1%ige wäßrige Lösung von Tanninsäure (pharmazeutisch rein) injiziert wird.

Ein Modelltest zur Inaktivierung von Toxinen und zur Abschwächung von Nebenwirkungen hervorrufenden Substanzen umfaßt die Beobachtung der Wirkung des Tannins im Hinblick auf verschiedene Schlangengifte.

Test A

Man neutralisierte in einem Testrohr 0,1 ml einer Lösung von 40 γ eines Gifts der Erabu Seeschlange (Lacticauda semifasciata) in dest. Wasser mit einer gleichen Menge einer wäßrigen Tanninlösung und injizierte die erhaltene Lösung intraperitoneal in 5 Wochen alte männliche Mäuse vom ddY-Stamm. Es zeigte sich, daß das Gift bei einer Tanninkonzentration von höchstens 0,039% inaktiviert wurde, während das gereinigte kondensierte Tannin bei einer Konzentration von 0,025% aktiv ist. Im Gegensatz hierzu wird das Gift nicht durch Tanninsäure J. P.-Konzentrationen von bis zu 1,25% inaktiviert.

Test B

Man inhibierte bei einem in vitro-Test, bei dem 0,1 ml einer Lösung von 20 γ eines Gifts der Habu-Schlange (Trimeresurus flavoviridis) mit 0,1 ml einer wäßrigen Persimonentanninlösung gemischt wurden, die subkutane Blutung bei Kaninchen bei einer Konzentration von 0,078% oder höher. Es ist eine Konzentration von zumindest 5% für eine anologe Inhibierung durch Tanninsäure J. P. erforderlich.

Test C

Mit Persimonentannin gebundenes Schlangengift kann nicht mit einer Zentrifuge abgetrennt werden und es wird keine Ausfällungslinie bei einer Ausfällungsreaktion mit Antiserum unter Verwendung der Geldiffusionsmethode beobachtet. Im Gegensatz hierzu kann an Tanninsäure J. P. gebundene Schlangengift in einer Zentrifuge abgetrennt werden, worauf das Gift wieder virulent wird. Auch kann eine Ausfällungslinie bei einer Ausfällungsreaktion durch die Geldiffusionsmethode beobachtet werden.

Das in der beschriebenen Weise erhältliche Tannin kann somit zur Inaktivierung von Toxinen, insbesondere von mikrobischen Toxinen, verwendet werden. Spezielle Toxine von Interesse sind diejenigen aus Bakterien, wie Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Staphylococcus und Streptococcus. Die Abschwächung von Nebenwirkungen hervorrufenden Substanzen, wie z. B. pyrogenen Substanzen in Vakzinen, wie Typhoid, Paratyphoid, Cholera, Pertussis, Pferdedruse und Anthrax kann ebenfalls bewirkt werden.

Während Tannin aus der Persimonenfrucht selbst bevorzugt ist, können gleichfalls Früchte von anderen Species von Diospyros verwendet werden wie D. Kaki, D. lotus und D. ebenum.

Die Menge des zu dem Toxin oder der Vakzine zuzugebenden Tannins hängt von der Natur des Toxins oder der Vakzine und der Stärke ab. Im allgemeinen ist es zufriedenstellend, eine geringere Menge einer wäßrigen Lösung mit einer Persimonentanninkonzentration von nicht mehr als 0,1% zuzugeben.

Die Verwendung des wie beschrieben erhältlichen Tannins besitzt zahlreiche Vorteile, die wie folgt zusammengefaßt werden können:

1. eine ausgeprägte Inaktivierung einer toxischen Wirkung kann unter Verwendung einer relativ geringen Tanninmenge erreicht werden derart, daß auf eine Toxizität des Tannins selbst wenig geachtet werden muß;
2. die wäßrigen Tanninlösungen sind thermisch stabil;
3. es wird eine irreversible Bindung mit toxischen Substanzen gebildet;
4. die gewünschte Antigenität wird aufrechterhalten, wenn ein Toxin inaktiviert wird, oder eine Nebenwirkungen hervorrufende Substanz geschwächt wird, und
5. das Material kann leicht nach einer einfachen Methode in guter Ausbeute aus einem einfach zugänglichen Ausgangsmaterial erhalten werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Extraktion und Isolierung des kondensierten Tannins

Man erhitzte Persimonenfrüchte (Diospyros Kaki Thumb.), bei denen die Kerne und die Kelche entfernt worden waren (10 kg) und eine geringe Menge dest. Wasser 1 Std. auf 120°C. Die Früchte wurden dann zerkleinert und man fügte 15 l Aceton zu und beließ die Mischung 24 Std. bei Raumtemperatur, um eine Durchtränkung zu ermöglichen. Die Mischung wurde dann abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf ca. 2 l eingeengt. Zu diesem Konzentrat fügte man 10 l Methanol und filtrierte die Mischung erneut. Zu dem Filtrat fügte man 6 bis 10 l Diäthyläther und man gewann den sich abscheidenden Niederschlag. Der Niederschlag wurde in 7,5 l dest. Wasser gelöst, mit verünnter Salzsäure auf pH 4 eingestellt, in ein Celluloserohr eingebracht und dann gegen fließendes Wasser dialysiert. Der Rohrinhalt wurde dann filtriert und unter hohem Druck 20 Min. bei 120°C sterilisiert. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab 50 g. kond. Tannin in Form eines blaßbraunen feinen Pulvers.

Ein ähnliches Material kann unter Verwendung von Früchten von Diospyros lotus und Diospyros ebenum erhalten werden.

Beispiel 2 Inaktivierung von α-Streptococcustoxin

a) Das verwendete Toxin besaß eine minimale letale Dosis (MLD) von 0,55 µg bei einer männlichen Maus von R.F.V.L.-Stamm mit einem Körpergewicht von 25 g ± 2 g.

Man mischte zu 0,1 ml Proben von Toxinlösungen, die 1,1 µg (2 MLD) enthielten, gleiche Volumine wäßriger Persimonentanninlösungen, die durch Mehrfachverdünnung von 0,5% auf 0,0019% hergestellt worden waren. Die Mischungen ließ man 10 Min. bei Raumtemperatur stehen und injizierte Gruppen von 3 Tieren jeweils intravenös mit 0,2 ml der Mischung je Tier. Man beobachtete dann den Zustand der Tiere 48 Std. Bei einem Kontrollversuch mischte man Proben des Toxins mit gleichen Volumina Tanninsäurelösungen, die bis zu 0,1% enthielten.

Bei Persimonentanninkonzentrationen von mehr als 0,0039% überlebten zumindest einige Tiere und bei einer Konzentration von 0,0078% oder höher überlebten sämtliche Tiere. Im Gegensatz hierzu starben sämtliche Tiere in den auf die Verabreichung folgenden 24 Std., wenn Tanninsäure selbst bei einer Konzentration von 0,1% verwendet wurde.

b) der obige Test verwendete einen relativ rohen Tanninextrakt, der nicht dialysiert worden war. Unter Verwendung des gereinigten kondensierten Tannins wurden bei männlichen Mäusen vom ddy-Stamm mit einem Körpergewicht von 25 ± 2 g bei Konzentrationen von 1,5, 2,0 und 2,5 MLD je 0,1 ml die folgenden Ergebnisse erhalten.

Ein Schutz gegenüber Todesfälle wurde bei einer Konzentration von 0,00125% beobachtet, wenn 1,5 MLD injiziert wurde und bei einer Konzentration von 0,0025%, wenn 2,5 MLD injiziert wurde.

Beispiel 3 Inaktivierung von Pertussis Gundel Toxin

Das Toxin war eine überstehende Flüssigkeit, die aus 200 µg/ml von lebenden Mikroorganismen durch Ultraschallzersetzung und anschließende Zentrifugation in der Kälte bei 10 000 g während 30 Min. hergestellt wurde. Diese toxische Lösung verursachte ein lokales Bluten beim Meerschweinchen nach der subkutanen Injektion von 0,05 ml einer tausendfach verdünnten Lösung.

Für den Test wurde die toxische Lösung hundertfach verdünnt und dann mit einem gleichen Volumen einer wäßrigen Persimonentanninlösung gemischt. Man stellte verschiedene Mischungen her, die verschiedene Tanninkonzentrationen enthielten. Man beließ die Mischungen 10 Min. und injizierte dann einen Anteil von 0,1 ml subkutan in Meerschweinchen. Nach 24 Std. wurde durch Beobachtung der herbeigeführten Blutung die Inaktivierung beurteilt.

Ergebnisse

Bei einer wäßrigen Tanninkonzentration von 0,125% wurde keine Blutung beobachtet. Eine leichte Blutung wurde bei einer 0,031%igen Lösung beobachtet, obgleich diese Blutung geringer war als diejenige, die von einer hundertfachen Verdünnung des als Kontrolle verwendeten Toxins hervorgerufen wurde.

Beispiel 4 Reduktion der Leukocytenzunahme durch Pertussis-Vakzine

Die Reduktion der Leukocytenzunahme, die als eine Nebenwirkung bei der Injektion einer Pertussis-Vakzine angesehen wird, wurde unter Verwendung von wäßrigen Persimonentanninproben einschließlich des gereinigten kondensierten Tannins untersucht.

Methode

Die verwendete Pertussis-Vakzine war eine Suspension in einem Phosphatpuffer, die 40 Billionen/ml Bordetella pertussis und Thimerosal bei einer 1/10 000 Konzentration enthielt. Man mischte gleiche Volumina der Pertussis-Suspension und der Persimomentanninlösungen mit verschiedenen Konzentrationen und beließ 10 Min. bei Raumtemperatur. Die Mischungen (0,5 ml Anteile) wurden dann intraperitoneal in 4 Wochen alte männliche Mäuse vom ddY-Stamm injiziert und man bestimmte 72 Std. danach die Anzahl der peripheren Leukocyten in jedem Tier.

Zur Kontrolle verwendete man zwei Tiergruppen, von denen eine mit einer zweifach verdünnten Probe der Pertussis-Suspension in Phosphatpuffer und die andere lediglich mit dem Phosphatpuffer injiziert wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. In der Tabelle bezieht sich die Spalte A auf die Verwendung eines relativ rohen Persimomentanninextrakts, während sich die Spalte B auf die Verwendung eines gereinigten kondensierten Tannins bezieht.

Tabelle für Beispiel 4

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß man eine vollständige Inhibierung der Leukocytenzunahme bei einer Persimonentanninkonzentration von 0,1% erreichen kann, während bei niedrigeren Konzentrationen eine mäßige Wirkung auf die Leukocytenzunahme ausgeübt wird, wobei eine Konzentration von 0,004% ausreichend ist, um die Leukocytenzunahme auf etwa die Hälfte ihres normalen Wertes zu reduzieren.

Beispiel 5 Einfluß auf die Antigenizität von Pertussis-Vakzine

Unter Verwendung der gleichen Mikroorganismensuspension wie in Beispiel 4 und einer 0,04%igen wäßrigen Persimonentanninlösung wurden gleiche Volumina der beiden Flüssigkeiten gemischt: Zur Kontrolle verwendete man eine zweifach verdünnte Mikroorganismensuspension in Phosphatpuffer.

Diese Vakzinen wurde auf das 5-, 25- und 125fache verdünnt und dann intraperitoneal in 4 Wochen alte männliche Mäuse vom ddY-Stamm in 0,5 ml Anteilen injiziert.

10 Tage nach der Injektion wurden die Tiere intracerebral mit lebenden Mikroorganismen infiziert und danach 14 Tage lang das Überleben der Tiere beobachtet. Hinsichtlich des Überlebens der Tiere stellte man keinen signifikanten Unterschied fest. Hieraus wurde ersichtlich, daß der immunogene Effekt in jedem Fall der gleiche war und das Persimonentannin keine nachteilige Wirkung auf die Antigenizität auswirkt.

Beispiel 6 Inaktivierung von Diphtherie-Toxin

Man verdünnte gereinigtes Diphtherie-Toxin vom 200fachen auf das 3200fache und mischte mit einem gleichen Volumen einer 0,2%igen wäßrigen Persimonentanninlösung mit jeder verdünnten Flüssigkeit. Man erhielt Kontrollproben, indem man physiologische Salzlösung anstelle des Persimonentannins mischte.

Man teilte männliche Meerschweinchen vom Hartley-Stamm mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 300 ± 10 g in zwei Gruppen von drei Tieren auf. Jedes Tier wurde subkutan mit 0,2 ml der Testflüssigkeit in den dorsalen Bereich injiziert und man beobachtete das Überleben während 7 Tagen.

Ergebnisse

Man beobachtete, daß die Kontrollgruppe der Tiere innerhalb von 24 Std. nach der Injetkion mit 200- und 400fachen Verdünnungen des Toxins und innerhalb von 48 Std. im Fall der Injektion mit 800fachen Verdünnungen des Toxins starb. Die Tiere, die mit Toxinlösungen behandelt worden waren, die zumindest auf das 1600fache verdünnt worden waren, überlebten.

Sämtliche Tiere in der Gruppe, die mit Toxin plus Tannin behandelt worden war, überlebten.

Die Autopsie der gestorbenen Meerschweinchen zeigten in jedem Fall eine merkliche Blutung in den Nebennieren.

Beispiel 7 Abschwächung des Tetanus-Toxins

Man mischte gleiche Volumina von Tetanustoxinlösung und wäßriger Persimonentanninlösung und beließ 10 Min. bei Raumtemperatur. Man teilte weibliche Mäuse vom R.F.V.L.-Stamm mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 23 ± 2 g in Gruppen von 3 Tieren auf und injizierte jedes Tier subkutan mit 0,4 ml der wie vorstehend hergestellten Testlösung. Man führte eine Reihe von Experimenten durch, wobei man sukzessive Gruppen verwendete, in denen das Tannin verdünnt worden war, während die Menge des Toxins konstant gehalten worden war.

Ergebnisse

Verwendete man ein Tetanus-Toxin von 150 MLD, so starben sämtliche Tiere innerhalb von 24 Std., wenn lediglich das Toxin injiziert wurde.

i) Sämtliche Tiere überlebten bei einer Tanninlösung von 0,75%, jedoch starben sämtliche Tiere bei einer Tanninlösung von 0,375%.
ii) Sämtliche Tiere überlebten bei einer kondensierten Tanninlösung von 0,5%, jedoch starben sämtliche Tiere bei einer Konzentration des kondensierten Tannins von 0,25%, wobei der Tod im Durchschnitt nach 72 Std. eintrat.

Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß das Tetanus-Toxin wirksam durch Persimonentannin abgeschwächt wird.

Beispiel 8 Bewertung des Persimonentannins unter Verwendung von Schlangengift

Methode: Man mischte das Gift der Erabu-Seeschlange (Lacticauda semifasciata) (40 γ ) in 0,1 ml mit volumengleichen Lösungen des gereinigten kondensierten Tannins bei verschiedenen Verdünnungen. Die erhaltene Mischung wurde intramuskulär in weibliche 5 Wochen alte Mäuse von ddY-Stamm injiziert (40 γ Gift entsprechend 2 MLD).

Ergebnisse

Ein Schutz gegenüber Todesfällen wurde unter Verwendung von 0,025%igen Lösungen des kondensierten Tannins beobachtet. Ein Schutz gegenüber 4 MLD erforderte 0,05%ige und gegenüber 6 MLD 0,1%ige Tanninlösungen.

Die Eigenschaften des gereinigten kondensierten Tannins sind in den Fig. 1 bis 4 veranschaulicht.

Fig. 1 zeigt ein Ultraviolettabsorptionsspektrum des in Beispiel 1 hergestellten kondensierten Tannins, das in einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration von 31,0 µg/ml gemessen wurde;

Fig. 2 zeigt ein Infrarotabsorptionsspektrum der gleichen Probe in flüssigem Paraffin;

Fig. 3 zeigt ein Gelfiltrationschromatogramm, das bei einer Ultraviolettabsorption bei einer Wellenlänge von 254 nm bei einer Temperatur von 50°C unter Verwendung eines stark sauren Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat-Sulfonat-Harzes mit Wasser als beweglicher Phase aufgenommen wurde;

Fig. 4 zeigt ein Ultrazentrifugen-Schliermuster der gleichen Probe, gemessen bei einer Auflösung der Probe in 0,1M Phosphatpuffer unter Erzielung einer Konzentration von 1% und unter Verwendung einer analytischen Ultrazentrifuge bei 46 633 Umdr./Min. während 26 Min.

Claims

1. Verwendung der aus der Frucht der Pflanzengattung Diospyros erhaltenen Tannine, die erhältlich sind durch

a) die Extraktion der Frucht mit Wasser oder mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder mit einer Mischung von Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und die Entfernung von unlöslichen Bestandteilen;
b) mit Ausnahme dessen, daß ein alkoholisches Extraktionslösungsmittel bei der Stufe a) verwendet wird, die Einengung des flüssigen Extrakts, die Verdünnung mit einem niedrigen Alkohol und die Entfernung von unlöslichen Bestandteilen;
c) das Ausfällen von Tannin durch Zugabe eines Nichtlösungsmittels für Tannin zu der alkoholischen Phase;
d) die Auflösung des ausgefällten Tannins in Wasser, die Sterilisierung der Lösung und eine Gefriertrocknung,

wobei in der Stufe d) gegebenenfalls die wäßrige Lösung bei einem sauren pH vor der Sterilisierung dialysiert werden kann, zur Inaktivierung mikrobischer Toxine oder zur Abschwächung einer Vakzine.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich das mikrobische Toxin von einem Stamm von Streptococcus, Bordetella pertussis, Clostridium sp. oder Corynebacterium diphteriae ableitet.