DE3942638C2 - Anti-Aidsviralagenzien - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Anti-Aidsviral­ agens, welches Polysaccharide aufweist, die aus Nüssen extrahiert sind. Hauptsächlich von Nusschalen von großen Laubbäumen, die zum Genus (Gattung) Juglans oder dem Genus Cayra des Angiosperms Juglandaceae gehört.

Bislang wurden verschiedene Verbindungen als Anti-Aidsviral­ agenzien vorgeschlagen und als Heil­ mittel entwickelt. Jedoch ist die aktuelle Situation so, daß noch kein durchschlagendes Heilmittel im Hinblick auf die Effekte, Nebeneffkte usw. erhalten wurde.

Weiteres zum Stand der Technik enthält die US-Patent­ schrift 41 48 873, die ein Verfahren zur Behandlung der menschlichen Haut betrifft, das die Bräunung der Haut un­ terstützt, aber auch die Haut gegen Sonnenlichtstrahlung schützt, die Erythem bzw. eine Rötung hervorrufen kann. Das Verfahren umfaßt die örtliche Auftragung einer Son­ nenschutz-Zusammensetzung auf die Haut, die Behandlung benötigt. Die Zusammensetzung enthält ein aktives Sonnen­ schutzagens sowie einen physiologisch annehmbaren Träger für das Sonnenschutzagens, das zur Absorbtion erythemer­ zeugender UV-Strahlung wirkungsvoll ist, während UV- Strahlung, die Bräunung unterstützt, weitergeleitet wird. Bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung besteht das Sonnenschutzagens gewichtsanteilig zu minde­ stens ungefähr 2% aus einem durch eine organische Lösung lösbaren Extrakt bzw. Auszug aus Hopfen, wobei der Ex­ trakt bzw. Auszug Humulone und Lupulone enthält, die aus dem Hopfen extrahiert sind.

Die Erfinder haben herausgefunden, daß Substanzen mit einer extrem hohen physiologischen Aktivität in dem Extrakt aus Nußschalen einer Pinie (genus pinus) enthalten sind.

Es wurde durch Virustests und dergleichen eindeutig bestätigt, daß insbesondere Polysaccharide, die in dem Extrakt enthalten sind, Granulocyten in Leucocyten, welche im Blut vorhanden sind, aktivieren können und sie schützten gegen Infektions­ krankheiten mit E. coli und verschiedene Viren wie auch den Herpesvirus.

Daher haben die Erfinder weiterhin versucht, die wirksame Verbindung aus verschiedenen natürlichen Nußschalen zu ex­ trahieren. Als ein Ergebnis wurde offenbar, daß Polysaccharide gleich den oben genannten Substanzen, welche aus den Piniennusschalen extrahiert sind, auch in dem Extrakt aus Schalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehören, enthalten sind. Es wurde bestätigt, daß die Polysaccharide einen Hemmeffekt auf Virus­ infektionen haben. Das heißt, einen Effekt zur Verhinderung des Wucherns des Virus.

Die Erfindung bezieht sich darauf, ein Anti-Aidsviralagens vorzusehen, welches Polysaccharide als einen wirksamen Bestandteil aufweist, welche aus Nußschalen von Nüssen, die zum Genus Juglans oder dem Genus Carya des Angio­ sperms Juglandaceae gehören, extrahiert sind.

Die Fig. 1 und 2 sind Graphen, die die Ergebnisse des Zellen­ wachstumsverhinderungseffekt und die Cytotoxizität des Ex­ trakts gemäß der Erfindung als ein Anti-Aidsviralagens zeigen.

Als ein Mittel zum Erreichen des beschriebenen Zieles werden Nußschalen (trockene Schalen), die zum Genus Juglans oder zum Genus Carya des Angiosperms Juglandaceae gehören, mit einer Mühle oder dergleichen fein zermahlen. Dann werden die zermahlenen Schalen in eine wäßrige Alkalilösung eingetaucht und mit einem Alkaliwasser extrahiert.

Als nächstes wird eine passende Säure, wie Essigsäure oder dergleichen zum Neutralisieren zu der extrahierten Flüssigkeit dazugegeben. Danach werden Salze durch Dialyse, Membran­ trennung oder dergleichen herausgezogen und zur gleichen Zeit wird die Mischung durch eine Zentrifugiermaschine oder dergleichen zentrifugiert und die extrahierten Substanzen werden niedergeschlagen oder ausgeschieden. Die Niederschläge werden gefiltert und das Filtrat wird konzentriert. Die resultierende feste Substanz wird trockengefroren, um das pudrige Extrakt wieder zu gewinnen.

Beispiel der Extrahierungsbehandlung

In dem Beispiel werden Schalen von Nüssen, die zum Genus Carya gehören, mit einer Mühle gemahlen und 10 l von 0,85%igem Ammoniakwasser wurde zu 1 kg der gemahlenen Schalen hinzugege­ ben. Die Mischung wurde 5 Stunden bei 40°C gerührt.

Als nächstes wurde die Flüssigkeit gefiltert und Essigsäure wurde dem Filtrat (9,5 l) hinzugegeben, um den pH-Wert auf 6,5 zu neutralisieren. Nach dem Dialysieren durch eine Dialysemem­ bran wurde die erhaltene Substanz trockengefroren. Als ein Er­ gebnis kann ein pudriges Extrakt mit einer leicht braunen Farbe erhalten werden. Der Ertrag war 40 g, basierend auf 1 kg der gemahlenen Schalen.

1. Anti-Aidsviraltest mit dem Extrakt

Es werden MT-4 Zellen, eine HTLV-I tragende Zellgruppe a("cell line") verwendet. Die Anti-HIV-Tests (Wuchern von Zellen oder lebensfähigen Zellen, Lebensfähigkeitsmenge von Zellen, HIV-Antigen positive Menge durch IF) des beschriebenen Extrakts in dem zellfreien Viralinfektionssystem und der Cytotoxizitätstest von HIV-uninfizierten MT-4 Zellen werden wie unten beschrieben durchgeführt.

Hinweise:
HIV: Aidsvirus
IF: Immunfluoreszenz

(1) Zellen, die für die Tests verwendet werden

Zellen für den Test wurden wie folgt hergestellt. MT-4 Zellen wurden in einem RPMI-1640 Medium plus 10%igem Kalbfötusserum kultiviert. Nachdem die Zelldichte auf 60 × 10⁴ Zählungen/ml eingestellt war, wurden die Zellen zentrifugiert und ein fri­ sches Medium wurde hinzugeführt, um es in zwei gleiche Portio­ nen aufzuteilen. Eine war für den Viralinfektionstest vorgese­ hen und die andere war für den Cytotoxizitätstest vorgesehen.

(2) Der in den Tests verwendete Virus

HIV (human immunodeficiency viruses) mit einer Zelldichte von 3,4 × 10⁵ PFU/ml

(3) Verfahren (a) Verfahren für die Virusinfektion

Die Zellen für die Tests, welche in (1) vorbereitet wurden, werden mit einem HIV-Probe aus (2) in m. o. i = 0,002 infiziert. Nachdem zum Absorbieren eine Temperatur von 37°C für eine Stunde beibehalten wurde, wurde wieder eine Zentrifugierung durchgeführt.

Das RPMI-1640 Medium plus 10% des Kalbfötusserum (Kulturme­ dium) wurde zugeführt, um die entsprechenden Zelldichten der infizierten Zellen bzw. der intakten Zellen auf 60 × 10⁴ (letztlich 30 × 10⁴) Zählungen/ml anzupassen.

(b)Verteilung der Zellen

In jedem Hohlraum einer 24-Hohlräume aufweisenden Mikroplatte wurden 0,5 ml der wie in (a) hergestellten infizierten und nicht-infizierten Zellen gefüllt.

(c)Verdünnung und Hinzufügen des Extrakts (Heilmittels)

Die Extraktlösung (Heilmittel) der Erfindung, welche durch Auflösen des Extraktes in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) in einer Konzentration von 5 mg/ml erhalten wurde, wurde durch Filtern durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm sterilisiert. Jedoch war das Extrakt nicht völlig aufgelöst, so daß tatsächlich ein Rest zurückblieb. Daher wurde das Filtrieren in Reihenfolge durchgeführt, wobei Filter mit Porengrößen von 0,8; 0,45 und 0,22 µm hintereinander verwendet wurden. Die entsprechenden Lösungen, die aus den auf diese Weise gefilterten Extraktlösungen (Heilmittel) gesammelt wurden, wurden mit dem RPMI-1640-Medium eingestellt, um die Konzentrationen innerhalb der Klammern zu zeigen.
2048 (1020 Nach der Einstellung), 1024 (512), 512 (256), 256 (128), 128 (64), 64 (32), 32 (16), 16 (8), 8 (4), 4 (2), 2 (1), 0 (Test Standard).

Aus diesen Lösungen mit diesen Konzentrationen wurden je 0,5 ml genommen, und der 24 Hohlräume aufweisenden Mikroplatte zugeführt, in welche die Zellen verteilt waren und die infizierten und uninfizierten MT-4 Zellen schon durch das Verfahren aus (a) geladen waren, um eine minimale Zelldichte 30 × 10⁴ /ml zu erreichen.

2. Test an HIV-induzierter Cytotoxizität und an Cytotoxizität, welche durch das Extrakt der Erfindung induziert ist

Lebensfähige Zellen wurden gezählt und die Lebensfähigkeits­ rate wurde am 3. und 6. Tag visuell beobachtet. Weiterhin wur­ de ein Test zum Finden des HIV-spezifischen Antigens am 3. und 6. Tag durchgeführt, wobei indirekte Immunfluoreszenz verwendet wurde.

Die Ergebnisse sind unten in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.

Tabelle 1

Tabelle 2

(3) Ergebnisse des Tests mit HIV

Die Zellwucherung in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmit­ tel) der Erfindung zugeführt war (1 bis 256 µg/ml), war fast gleich zu der in der intakten Gruppe ohne Heilmittel (siehe Fig. 1A).

Aufgrund diesen Ergebnissen wird angenommen, daß die Cytotoxizität des Extrakts (Heilmittel) der Erfindung extrem gering sein würde. Am Tag 6 nach der Inkubation waren die HIV-infizierten Zellen fast getötet, aber in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmittel) der Erfindung zugeführt war (64 bis 512 µg/ml) waren die meisten Zellen am Leben (60 bis 90% der nicht-infizierten Zellen waren am Leben) (siehe Fig. 2A und B). Weiterhin war am Tag 6 nach der Inkubation die Frequenz der HIV-antigen positiven Zellen 90% in der heilmittelfreien Kontrollgruppe, aber in der Gruppe, bei der das Extrakt (Heilmittel) der Erfindung zugeführt war (128 µg/ml oder mehr), waren die viralantigen-positiven Zellen fast negativ (0,2% oder weniger) (siehe Fig. 2C). Aus den vorhergehenden experimentellen Ergebnissen wurde bewiesen, daß die Verwendung des Extrakt gemäß der Erfindung als ein Heilmittel in einer Konzentration von 64 bis 512 µg/ml, nachdem es mit PBS verdünnt wurde, einen Anti-HIV-Effekt zeigt.

Während die Erfindung detailliert und in Bezug auf ein spezi­ fisches Ausführungsbeispiel beschrieben wurde, ist es dem Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen darin gemacht werden können, ohne von dem Ge­ danken und dem Bereich der Erfindung abzuweichen.

Zusammenfassend bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Polysacchariden, die aus Nußschalen von Nüssen des Genus Juglans oder des Genus Carya mit Hilfe einer wäßrigen Alkalilösung extrahiert worden sind, zur Behandlung von AIDS. Das Extrakt hat einen Anti-HIV-Effekt bei einer Konzentration, die sich von 64 bis 512 µg/ml erstreckt und zeigt eine erhöhte Lebensspanne bei Tieren.

Claims (1)

1. Verwendung von Polysacchariden, die aus Nußschalen von Nüssen des Genus Juglans oder des Genus Carya mit Hilfe einer wäßrigen Alkalilösung extrahiert worden sind, zur Behandlung von AIDS.