DE60009146T2

DE60009146T2 - Pharmazeutische zubereitungen zur behandlung von dns viraler infektionen, welche ein schleifendiureticum und ein herzglykosid enthalten

Info

Publication number: DE60009146T2
Application number: DE60009146T
Authority: DE
Inventors: Edward Christopher HARTLEY
Original assignee: Henderson Morley Research and Development Ltd
Current assignee: Henderson Morley Research and Development Ltd
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-13
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2020-12-14
Also published as: KR100843790B1; MXPA02006489A; AU777339B2; WO2001049242A3; AU1873401A; DK1242119T3; DE60009146D1; KR20030005162A; BR0016831A; CA2395016A1; WO2001049242A2; JP2003519163A; EP1242119A2; PT1242119E; CA2395016C; TR200401363T4; ES2218254T3; CN1414863A; EP1242119B1; IL150286A0

Description

Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen für Antivirusbehandlungen und insbesondere Zusammensetzungen für prophylaktische und therapeutische Behandlungen von DNA-Virus-Infektionen, wie Herpesvirus-Infektionen.
Herpesviren sind DNA-Viren, die einen zentralen Kern aus DNA innerhalb einer Proteinstruktur aufweisen. Die DNA trägt den genetischen Code zur Reproduktion des Virus. Viren müssen eine lebende Zelle infizieren, um sich zu reproduzieren. Es gibt zahlreiche Virusproteine, die gut charakterisiert sind, einschließlich wichtiger Enzyme, die ideale Ziele für eine Antivirus-Chemotherapie darstellen. Diese sind beispielsweise DNA-Polymerase und Thymidinikinase, welche für die DNA-Replikation nötig sind. Die Replikation von Virus-DNA ist für die Virusinfektivität notwendig. Es ist bekannt, dass infizierende Viren im Laufe ihrer Replikation die natürlichen Ionengleichgewichte einer lebenden Zelle verändern können.
Die EP-A-0442744 beschreibt die Verwendung gewisser Glycoside zum Behandeln des Herpes-simplex-Virus und des Varicella-Zoster-Virus. Die WO 00/10574 , welche nach dem Datum der Prioritätsanmeldungen für die vorliegende PCT-Anmeldung veröffentlicht worden ist, beschreibt die Verwendung eines Schleifendiureticums bei der Behandlung eines Retrovirus, in diesem Fall zum Behandeln einer HIV-Infektion. Wir haben nun unerwarteterweise gefunden, dass die kombinierte Anwendung eines Glycosids und eines Schleifendiureticums eine verbesserte Wirkung ergibt, verglichen mit der Verabreichung eines Schleifendiureticums oder eines Glycosids allein.
Gemäß der Erfindung wird entsprechend einem Aspekt eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die bei der Behandlung von Virusinfektionen nützlich ist und eine synergistische Kombination aus einem Schleifendiureticum und einem Kardialglycosid enthält.
Entsprechend einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Schleifendiureticums und eines Kardialglycosids für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Verfügung, um eine synergistische Wirkung bei der Behandlung von Virusinfektionen auszuüben.
Das Schleifendiureticum kann aus einem breiten Bereich von erhältlichen Mitteln ausgewählt werden. Vorzugsweise ist das Schleifendiureticum eine oder mehrere der Stoffe Frusemid, Bumetanid, Etacrynsäure oder Torasemid. Gemäß unseren Untersuchungen vermitteln Schleifendiuretica ihre Antiviruswirkungen durch eine Änderung der Zellkonzentration von Ionen, der Zellionengleichgewichte, des Zellionenmilieus und der elektrischen Potentiale.
Frusemid ist ein Anthrilsäuredrivat und stellt chemisch 4-Chlor-N-furfuryl-5-sulfamoylanthranilsäure dar. Es ist in Wasser bei einem neutralen pH-Wert praktisch unlöslich, jedoch in Alkali gut löslich. Frusemid übt seine physiologische Wirkung durch Hemmen des Transports von Chloridionen durch die Zellmembranen aus. Frusemid ist ein Schleifendiureticum mit einer kurzen Wirkungsdauer. Es wird zur Behandlung von Ödemen, die auf ein hopatisches oder renales Versagen oder ein Herzversagen zurückzuführen sind, und zur Behandlung einer Hypertension eingesetzt. Die biologische Verfügbarkeit von Frusemid liegt zwischen 60 und 70%, und es wird hauptsächlich durch Filtration und Sekretion als unverändertes Arzneimittel ausgeschieden. Frusemid wirkt auf den Na⁺/K⁺/2Cl^–-Cotransformer. Bei seinem diuretischen Effekt liegt seine Hauptwirkung in dem auf steigenden Glied der Henle-Schleife in der Niere. Schleifendiuretica fördern wesentlich die K⁺-Ausscheidung und hinterlassen Zellen, die frei von intrazellulärem Kalium sind. Dies kann zu der sehr deutlichen Komplikation einer systemischen Langzeitanwendung von Frusemid, nämlich einem verringerten Serumkalium, führen. Wir nehmen an, dass es diese Wirkung ist, die Schleifendiuretica als Mittel gegen DNA-Viren nützlich macht.
Kürzliche Belege lassen vermuten, dass das hauptsächliche Biotransformationsprodukt von Frusemid ein Glucoronid ist. Frusemid ist in ausgedehntem Maß an Plasmaproteine, hauptsächlich an Albumin, gebunden. Plasmakonzentrationen im Bereich von 1 bis 400 mcg/ml sind bei gesunden Individuen zu 91 bis 99% gebunden. Die ungebundene Fraktion liegt im Bereich von 2,3–4,1% bei therapeutischen Konzentrationen. Die terminale Halbwertszeit von Frusemid beträgt etwa 2 Stunden, und es wird hauptsächlich in den Urin ausgeschieden.
Die Herzglycoside können einer oder mehrere der Stoffe Digoxin, Digitoxin, Medigoxin, Lanatosid C, Proscillaridin, k-Strophantin, Peruvosid und Ouabain sein. Pflanzen der Art Digitalis (zum Beispiel Digitalis purpura, Digitalis lanata) enthalten Herzglycoside, wie Digoxin und Digitoxin, die insgesamt als Digitalis bekannt sind. Andere Pflanzen enthalten Herzglycoside, die mit den Digitalis-Glycosiden chemisch verwandt sind und auch oft als Digitalis bezeichnet werden. Somit wird der Ausdruck "Digitalis" verwendet, um die ganze Gruppe der Glycoside zu bezeichnen. Die Glycoside sind aus zwei Komponenten, einem Zucker und einem Cardenolid, zusammengesetzt. Ouabain stammt von der afrikanischen Pflanze Strophanthus gratus (auch bekannt als Strophanthidin G) und ist in intravenöser Form zugänglich (es wird oral nicht absorbiert). Es wird auch für viele Laborexperimente bei der Untersuchung von Glycosiden verwendet, weil es eine größere Löslichkeit aufweist. Es hat eine im Wesentlichen identische Wirkungsweise wie Digoxin.
Digoxin wird chemisch als (3b, 5b, 12b)-3-[0-2,6-Dideoxy-b-D-riob-hexopyranosyl-(1"4)-0-2,6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl-(1"4)-2,6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl)-oxy]-12,14-dihydroxy-card-20-22)-enolid beschrieben. Seine Summenformel lautet C₄₁H₆₄O₁₄, und sein Molekulargewicht beträgt 780,95. Digoxin existiert in Form von geruchlosen weißen Kristallen, die über 230°C unter Zersetzung schmelzen. Der Arzneistoff ist praktisch unlöslich in Wasser und Ether, wenig löslich in verdünntem (50%) Alkohol sowie in Chloroform und gut löslich in Pyridin.
Da einige Patienten gegenüber Nebenwirkungen durch Digoxin besonders anfällig sein können, soll die Dosis des Arzneistoffs immer sorgfältig gewählt und entsprechend dem klinischen Zustand des Patienten angepasst werden.
Bei der zellulären Menge übt Digitalis die Hauptwirkung durch eine Hemmung des Natriumtransportenzyms Natriumkaliumadenosintriphosphatase (Na/K ATPase) aus. Dieses ist für die elektrophysiologischen Wirkungen des Herzmuskels direkt verantwortlich und nach unserem Verständnis auch für seine Aktivität gegen DNA-Viren. Diese Aktivität hat aufgrund sekundärer Veränderungen im intrazellulären Calcium auch einen Effekt auf die Wirksamkeit der myokardialen Kontraktilität. Bei sehr niedrigen intrazellulären Konzentrationen von Digitalis können die entgegengesetzten Effekte mit einer verminderten Wirksamkeit der Herzkontraktionen beobachtet werden, da durch Digitalis die Na/K ATPase stimuliert wird.
Eine bevorzugte Kombination besteht aus dem Schleifendiureticum Frusemid und dem Herzglycosid Digoxin. Es ist bevorzugt, dass die Konzentration von Frusemid 1 mg/ml und von Digoxin 30 μg/ml beträgt. Es liegt innerhalb des Umfangs der Erfindung, die Verabreichung der beiden Wirkstoffbestandteile durch einen kurzen Zeitraum zu trennen.
Untersuchungen (einschließlich einer Röntgenmikroanalyse) haben gezeigt, dass die Wirkungen einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung gegen die Virus-DNA von einer Erschöpfung der intrazellulären Kalumionen abhängen. Kurz gesagt, zeigen diese Untersuchungen Folgendes:

– Das Ersetzen von Kalium stellt die DNA-Synthese wieder her;
– die Verwendung von Frusemid und Digoxin in Kombination führt zu Wirkungen, die mit der Kaliumerschöpfung vergleichbar sind;
– das Ausmaß der Kaliumerschöpfung ist ausreichend, um eine normale Zellfunktion zu ermöglichen;
– die Kaliumerschöpfung hat keine zytotoxischen Wirkungen.

Somit ist es durch Ändern der zellulären Konzentrationen von Ionen, der zellulären Ionengleichgewichte, des zellulären Ionenmilieus und der zellulären elektrischen Potentiale auf Grund des Verabreichens eines Schleifendiureticums und eines Herzglycosids möglich, den Stoffwechsel der Zelle ohne Schaden für die Zelle zu ändern, jedoch in der Weise, dass eine Virusreplikation inhibiert wird. Dementsprechend werden wir in unserer Ansicht bestärkt, dass der Einsatz eines Schleifendiureticums und eines Herzglycosids für das Verhindern oder Steuern der Virusreplikation durch Hemmung der Replikation der Virus-DNA vorteilhaft ist. Die Antivirus-Wirksamkeit wurde gegenüber den DNA-Viren HSV1 und HSV2, CMV, VZV und Pseudorabies aufgezeigt. Andere Viruskandidaten sind Parvoviren, Papoviren, Adenoviren, Hepadnoviren und Poxviren.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können an eine externe oder eine interne Verabreichung angepasst werden. Topische und systemische Anwendungen sind wahrscheinlich am nützlichsten. Die Formulierungen können an eine langsame Freigabe angepasst werden. Ein sehr bevorzugtes Merkmal der Erfindung besteht darin, dass die Zusammensetzungen für eine topische Anwendung formuliert werden. Es können andere Bestandteile anwesend sein, vorausgesetzt, dass sie die Antivirus-Aktivität nicht beeinträchtigen. Ein Beispiel ist ein Konservierungsstoff. Vorzugsweise stellt die Erfindung eine Kombination aus Frusemid und Digoxin für eine topische Anwendung in einer gepufferten Salzlösungsformulierung zur Behandlung von Hornhautinfektionen des Auges zur Verfügung. Soweit wir wissen, ist die Kombination von existierenden lizenzierten Verbindungen zur Behandlung von Virusinfektionen ohne Präzedenzfall.
Eine bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung lokaler Konzentrationen eines Schleifendiureticums und eines Herzglycosids zur hochwirksamen Behandlung von Virusinfektionen des Auges. Wiederkehrende Herpesinfektionen der Hornhaut ist beim Menschen die häufigste Virusursache der Erblindung.
Die Anwendung durch Tragen von Kontaktlinsen, die beispielsweise mit einem Schleifendiureticum und einem Herzglycosid imprägniert sind, wäre eine sichere und wirksame Methode zur Erzeugung hoher intrazellulärer Konzentrationen zur Verhinderung oder Behandlung der Erkrankung. Eine Depotanwendung eines Schleifendiureticums und eines Herzglycosids in intraoccularer Form wäre eine geeignete Methode zur Behandlung einer Retinitis durch einen Cytomegalie-Virus, einer Hauptursache der Erblindung von Patienten, die an AIDS leiden.
Die Erfindung wird nun nur unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele erläuternd beschrieben:
BEISPIEL 1
Es wurden Biotests mit dem Virus Herpes simplex in vitro durchgeführt, um die Antivirusaktivität der gleichzeitigen Verabreichung von Frusemid (1 mg/ml) und Digoxin (30 μg/ml) festzustellen. Die Züchtungs- und Testmethoden entsprechen jenen, die von Lennette und Schmidt (1979) für den Virus Herpes simplex und Vero-Zellen beschrieben wurden, mit kleinen Modifizierungen.
Eingesetzte Stämme von Herpes simplex
Typ 1 des Stamms Herpes simplex HFEM, der ein Derivat des Rockerfeller-Stamms HF (Wildy 1955) darstellt, und Typ 2 des Stamms 3345 von Herpes simplex, ein Penisisolat (Skinner et al. 1977) wurden als Prototypstämme eingesetzt. Diese Prototypen wurden bei –80°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Zellkulturen
Leberzellen (vero) von afrikanischen Grünaffen wurden vom National Institute of Biological Standards and Control UK erhalten und als die einzige Zelllinie für alle Versuche in den Beispielen verwendet.
Züchtungsmedien
Die Zellen und Viren wurden auf einem modifizierten Glasgows-Medium gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt wurde. Ergebnisse
Dieses Beispiel zeigt, dass durch die Anwendung niedriger Konzentrationen der Frusemid und Glycosid enthaltenden Lösung auf Vero-Zellen, die mit hsv1 infiziert waren, die Virusaktivität fast beseitigt wurde. Bei höheren Konzentrationen wurde die Virusaktivität vollständig verhindert. Die Antiviruswirkungen dieser Vorratslösung waren wesentlich größer als die Wirkungen von Frusemid oder Digoxin allein. Es gab keine direkte viruzide Wirkung auf einen extrazellulären Virus.
Diese Versuche wurden unter Einsatz eines hsv2-Stamms wiederholt, und es wurden fast identische Ergebnisse erzielt.
BEISPIEL 2
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Einsatz des Herpes-Virus-Stamms kos, Typ 1, wiederholt. Es wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
BEISPIEL 3
Es wurden in-vitro-Biotests durchgeführt, um die Antivirusaktivität von Frusemid und Digoxin festzustellen, wenn sie sowohl gleichzeitig als auch allein eingesetzt werden.
Die Zusammensetzungen wurden auf verschiedene Arten von Verozellen (Nierenzellen von afrikanischen Grünaffen und BHK1-Zellen) angewandt und mit dem Herpes-simplex-Virus (3345 und 180) bei geringer, mittlerer und hoher Vervielfachung der Infektion (VI) infiziert. Die Hemmung der Virusreplikation wurde nach der folgenden Einteilung bewertet:

keine Inhibierung –

20% Inhibierung +

40% Inhibierung ++

60% Inhibierung +++

80% Inhibierung ++++

100% Inhibierung +++++

T bedeutet Arzneistofftoxizität
Die folgenden Ergebnisse wurden unter Einsatz von Nierenzellen eines afrikanischen Grünaffen und des Stamms 3345 von Herpes simplex, Typ 2, erhalten:
Die größte Wirkung von Digoxin allein (+++) trat nur bei 30 mcg/ml Digoxin bei einer geringen Vervielfachung der Infektion auf.
Die größte Wirkung von Frusemid allein (+++) trat bei der Anwendung von 1 mg/ml Frusemid bei geringer und mittlerer Vervielfachung der Infektion auf.
Wenn das Schleifendiureticum und das Herzglycosid gleichzeitig auf die infizierten Zellen angewandt wurden, wurde die größte Wirkung (+++++) erreicht, wenn Digoxin mit 30 mcg/ml und Frusemid mit 1 mg/ml eingesetzt wurden. Eine 100%ige Hemmung der hsv2-Replikation wurde bei niedriger, mittlerer und hoher Vervielfachung der Infektion festgestellt.
Ähnliche Ergebnisse wurden beim Einsatz anderer Kombinationen von Verozellen und Stämmen von Herpes simplex, Typ 2, erhalten.
Dieses Beispiel zeigt, dass die Replikation von hsv2 durch Anwenden von Frusemid oder Digoxin allein nicht maximal gehemmt wird. Jedoch haben Frusemid und Digoxin in Kombination die hsv2-Replikation vollständig gehemmt.

Claims

Verwendung eines Schleifendiureticums und eines Kardialglycosids für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von DNA-Virusinfektionen.
Therapeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung von DNA-Virusinfektionen nützlich ist und eine synergistische Kombination aus einem Schleifendiureticum und einem Kardialglycosid enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die für eine topische Anwendung angepaßt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die für eine systemische Anwendung angepaßt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, die 1 mg/ml eines Schleifendiureticums und 30 μg/ml eines Kardialglycosids enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, die für eine Intraokulardepot-Anwendung angepaßt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Schleifendiureticum Frusemid ist.
Kontaktlinsen, imprägniert mit einem Schleifendiureticum und einem Kardialglycosid.