CN106562982A - 强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了强心苷类药物在抗埃博拉病毒感染中的应用，所述感染阶段包括入侵和转录及复制，所述强心苷类药物包括但不限于地高辛、洋地黄毒苷、毛花苷C和毒毛旋花苷G。该四个代表性的强心苷药物可有效地阻断埃博拉病毒感染宿主细胞，为开发以强心苷类为主要成分的抗病毒组合药物提供理论基础，并对病毒新发传染病的防控提供科技技术支撑。

Description

强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用
技术领域
本发明属于化合物新用途领域，具体涉及强心苷类化合物在抗博拉病毒感染中的应用，其中强心苷类化合物包括但不限于地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C以及毒毛旋花苷G。
背景技术
埃博拉出血热是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一种急性出血性传染病。主要通过接触病人或感染动物的血液、体液、分泌物和排泄物等而感染，临床主要表现为突起发热、出血和多脏器损害。2014年爆发的埃博拉病毒疫情席卷了西非各地，极高的致死率引起了全世界的恐慌。
埃博拉病毒(EBOV)属于丝状病毒科，呈长丝状，是单股负链RNA病毒，有18959个碱基，有囊膜。纯病毒粒子由一个螺旋形核糖核壳复合体构成，含负链线性RNA分子和4个毒粒结构蛋白。埃博拉的病毒基因组编码含七个结构蛋白和一个非结构蛋白。基因的顺序是：3’端－NP－VP35－VP40－GP－VP30－VP24－L－5’端，其中每一种蛋白产物由一种单独的mRNA所编码。至今，已发现5种不同的埃博拉病毒。其中4种首次发现于非洲，对人类和非人类灵长类动物具有致病能力。五种病毒分别为苏丹埃博拉病毒(SEBOV，发现于1976年)、扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV，发现于1976年)、科特迪瓦埃博拉病毒(CIEBOV，发现于1994年)和本迪布焦埃博拉病毒(BEBOV，发现于2007年)。第5种病毒，即雷斯顿埃博拉病毒(REBOV，发现于1989年)，仅发现于菲律宾，迄今似乎只在非人类、灵长类动物和家猪中引起疾病。不同的病毒株具有不同的毒性，其中扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)致死率最高。
由于尚无有效的经过系统研究的药物用于EVD患者的治疗，目前的治疗方法以积极的对症和支持治疗为主，主要包括：维持水、电解质平衡，补充体液和电解质；预防和控制出血，维持血氧及血压平衡，及时控制继发感染；治疗肾功能衰竭和出血，弥散性血管内凝血(DIC:disseminate intravascular coagula tion)等并发症。另外由于埃博拉康复者的血清在治疗疾病中无显著作用，常见的抗病毒方法，如干扰素，利巴韦林均无效。EBOV的疫苗研发始于20年前，目前已有多种免疫策略和模型动物，但尚无一种疫苗通过FDA批准。EBOV糖蛋白是唯一处于病毒表面的糖蛋白，也是最主要的免疫靶标。EBOV疫苗依据抗原递送方式主要分为三类包括基于非复制性病毒载体的疫苗，基于复制性病毒载体的疫苗和基于病毒蛋白抗原的疫苗，其中由葛兰素史克公司与美国国家过敏和传染病研究所联合开发的ChAd3-ZEBOV和由加拿大公共卫生署开发的VSV-EBOV混合型疫苗是最具潜力的，目前已进入临床研究阶段，但仍需更多研究证明其有效性。
与疫苗相比，小分子药物生产迅速、产能大性质稳定，能够耐受常温储存及运输，可以通过非侵入性的口服方式进行给药，无需依赖特殊设备，对于通过体液、接触传播的埃博拉病毒感染具有较好的治疗安全性，能够克服疫苗生产周期长、价格高、活性不稳定及抗原多样性的缺点。另外，以上市药物为基础，筛选能够有效阻断EBV进入和复制的小分子化合物，不仅能够使新药的研发机率大幅度提升而且可以有效的缩短生产周期和降低制药成本，为国家埃博拉病毒感染的紧急防治提供支持。
发明内容
本发明提供了强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，尤其是提供了如地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C及毒毛旋花苷G可有效抑制埃博拉病毒感染的效果。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用。
优选地，所述强心苷类化合物在阻断埃博拉病毒入侵感染中的应用。
优选地，所述强心苷类化合物在抑制埃博拉病毒转录复制中应用。
优选地，所述强心苷类化合物由一个醇基或醇样基团结合至少一个以上的糖分子构成，其结构如图9所示：其中所述a为糖分子R1，所述b为配基，所述配基中含有固醇核，且配基的17位碳原子连以一个不饱和的内酯环R2，其3位碳原子与所述糖分子相连。
优选地，所述强心苷类化合物包括但不限于地高辛、洋地黄毒苷、毛花苷C和毒毛旋花苷G。
优选地，所述强心苷类化合物为地高辛，所述地高辛结构式如下所示：
优选地，所述强心苷类化合物为洋地黄毒苷，所述洋地黄毒苷结构式如下所示：
优选地，所述强心苷类化合物为毛花苷C，所述毛花苷C的结构式为：
优选地，所述强心苷类化合物为毒毛旋花苷G，所述毒毛旋花苷G的结构式为：
优选地，所述埃博拉病毒包括扎伊尔型，苏丹型，莱斯顿型，科特迪瓦型和乌干达本迪布焦型。
优选地，所述埃博拉病毒为扎伊尔型。
本发明的有益效果体现在：强心苷作为强心药已在临床长期应用，其安全性，药物代谢特性，毒副作用已经明确，而此次发现的四个代表性的强心苷药物可有效地阻断埃博拉病毒的入侵和抑制复制，为开发以强心苷类为主要成分的抗病毒组合药物提供理论基础，并对病毒新发传染病的防控提供科技技术支撑。
附图说明
图1为地高辛阻断埃博拉入侵的效果评价。
图2为洋地黄毒苷阻断埃博拉入侵的效果评价。
图3为毛花苷C阻断埃博拉入侵的效果评价。
图4为毒毛旋花苷G阻断埃博拉入侵的效果评价。
图5为地高辛抑制埃博拉转录复制的效果评价。
图6为洋地黄毒苷抑制埃博拉转录复制的效果评价。
图7为毛花苷C抑制埃博拉转录复制的效果评价。
图8为毒毛旋花苷G抑制埃博拉转录复制的效果评价。
图9为强心苷类化合物结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例具体阐述本发明的技术方案及其性能研究。
实施例1：筛选模型原理
埃博拉病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。EBOV包膜表面糖蛋白(Glycoprotein.GP)是介导埃博拉病毒吸附并进入靶细胞的关键蛋白。我们合成了扎伊尔型埃博拉病毒的包膜GP基因(EBV-Zaire GP,Gene AccesionNo.L11365).通过共转染EBV-GP和将pNL4-3.Luc.R-E-共转染细胞，可获得EBV-GP为外壳包裹的HIV核心的EBV重组病毒EBV-GP/H IV。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于EBOV-GP的特性；2)由于HIV载体上的env,nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶的活性就可表示细胞被病毒感染的程度。
EBOV小型复制子可有效模拟野生型EBOV的在细胞内的过程。在该系统中，在荧光素酶基因两端分别构建上病毒的引导(leader)序列和尾巴(trailer)序列，组成一个单顺反子微基因组。当这种单顺反子微基因表达质粒与分别表达病毒蛋白NP、VP35、VP30和L的表达质粒共转染细胞后，在T7聚合酶驱动下产生的单顺反子微基因被NP、VP35、VP30和L这些负责病毒基因组复制与转录的蛋白所识别，催化单顺反子微基因的转录与复制，同时使得报告基因得以表达，检测到的荧光素酶活性则反映了病毒基因转录复制的活性。
在本发明中应用EBV-Zaire(Gene Accession No.L11365)对强心苷类化合物抗埃博拉病毒感染进行药理活性评价
实施例2：利用埃博拉假病毒报告系统(EBVG/HIV-Luc)评价地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C，毒毛旋花苷G在埃博拉病毒入侵感染中的作用
重组病毒制备：共转染2ug pcDNA3.1/EBV-GP质粒和20ug pNL4-3.Luc.R-E-质粒至293T细胞，转染48h后收集上清，上清液经0.45uM滤膜过滤，该上清中含有EBV-GP/HIV病毒颗粒，该重组病毒可用于感染。
感染与检测：感染前一天，按每孔104个细胞的密度将Hela细胞接种到96孔板上。用甲醇溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以甲醇作为空白对照,每孔加入0.1ul的EBV-GP/HIV-luc的病毒液(109rluc/ml)感染细胞，感染48小时后，弃去上清，用PBS洗两遍，然后向被感染的细胞每孔加入50ul细胞裂解液，将25ul荧光素酶底物与25ul细胞裂解液混合后用MD酶标仪检测细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反应了病毒的感染水平，结果显示地高辛(Digoxin)，洋地黄毒苷(Digitoxin)，毛花苷C(La natoside-C)；毒毛旋花苷G(Ouabain)等药物可以有效阻断埃博拉病毒(EBV-GP/HIV)的入侵感染，结果见图1、图2、图3、图4和表1。
实施例3：利用埃博拉小型复制子系统(EBOV-Minigenome System)评价地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C，毒毛旋花苷G在埃博拉病毒转录复制中的作用具体实施方式如下：
转染前一天按每孔104个293T细胞铺96孔板，次日，按每孔200ng(NP:12.5ng；VP35:12.5ng；VP30:7.5ng；L:100ng；MINI-Rluc:25ng；T7:50ng)的小型复制子体系进行转染(其中每孔转染2ng的内参质粒)，24h后，不同浓度梯度(500nM；250nM；125nM；62.5nM；31.25nM,0nM)的分别加入地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C；毒毛旋花苷G药物孵育(甲醇作为对照组)；8h后，去掉上清，更换新的培养基，再过24h,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，结果显示地高辛(Digoxin)，洋地黄毒苷(Digitoxin)，毛花苷C(Lanatoside-C)；毒毛旋花苷G(Ouabain)等药物可以很强地抑制埃博拉病毒的转录和复制，结果见图5至图8及表1。
表1：强心苷类化合物对埃博拉病毒感染的抑制作用
实施例4：细胞毒性检测试验
应用MTS法测定了所有涉及的药物在我们实验体系中对Hela和293T的细胞毒性，结果显示地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C和毒毛旋花苷G在我们实验体系中，2uM的终浓度下均无细胞毒性。
我们使用可在P-2实验室进行研究的埃博拉病毒报告系统(EBV GP/HIV和E BOVMinigenome)评价多种临床应用的药物，通过研究发现强心苷类化合物(地高辛，洋地黄毒苷，毛花苷C，毒毛旋花苷G等)在埃博拉病毒感染中有明显的抑制作用。
苷或称甙、配糖体，是一类有机化合物，其分子由一个醇基或醇样基团(配基、苷元或甙元)结合于数量不等的糖分子而构成。若配基中含固醇核(甾核)，其17位碳原子连以一个不饱和内酯环，其3位碳原子与糖分子相连，这种苷即为强心苷。强心苷是一类具选择性强心作用的药物，又称强心甙或强心配糖体。基是强心苷的药理活性部分，配基本身对心肌的作用微弱而短促，但与糖结合后其作用的强度和持久性均增加。糖的部分影响强心苷的药物动力学性质(吸收、半衰期、代谢等)。强心苷类药物具有增强心肌收缩力(正性肌力作用)和减慢心率(负性频率作用)，可增加心排血量而不增加心肌耗氧量，临床上主要用以治疗慢性心功能不全，此外又可治疗某些心律失常，尤其是室上性心律失常，为常用的强心药物，其作用机制是直接或间接地抑制心肌细胞膜上的钠，钾-三磷酸腺苷酶(Na,K-ATP)，影响心肌兴奋-收缩偶联的收缩性及影响心脏的传入神经从而增强心脏收缩和提高心肌兴奋。但目前关于强心苷类药在埃博拉病毒感染中的应用未见报道。因此，本发明将为开发以强心苷类为主要成分的抗病毒组合药物提供理论基础，并对病毒新发传染病的防控提供科技技术支撑。
本发明尚有多种具体的实施方式。凡采用等同替换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

Claims (11)

1.强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用。
2.如权利要求1所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用,其特征在于，所述强心苷类化合物在阻断埃博拉病毒入侵感染中的应用。
3.如权利要求1所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用,其特征在于，所述强心苷类化合物在抑制埃博拉病毒转录复制中应用。
4.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于，所述强心苷类化合物由一个醇基或醇样基团结合至少一个以上的糖分子构成，其结构如图9所示：其中，所述a为糖分子R1，所述b为配基，所述配基中含有固醇核，且配基的17位碳原子连以一个不饱和的内酯环R2，其3位碳原子与所述糖分子相连。
5.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述强心苷类化合物为地高辛、洋地黄毒苷、毛花苷C和毒毛旋花苷G。
6.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述强心苷类化合物为地高辛，所述地高辛结构式如下所示：
7.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述强心苷类化合物为洋地黄毒苷，所述洋地黄毒苷结构式如下所示：
8.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述强心苷类化合物为毛花苷C，所述毛花苷C的结构式为：
9.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述强心苷类化合物为毒毛旋花苷G，所述毒毛旋花苷G的结构式为：
10.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述埃博拉病毒包括扎伊尔型，苏丹型，莱斯顿型，科特迪瓦型和乌干达本迪布焦型。
11.如权利要求1至3中任意一种所述的强心苷类化合物在抗埃博拉病毒感染中的应用，其特征在于：所述埃博拉病毒优选为扎伊尔型。
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