CN100371022C - 建立抗丙型肝炎病毒药物筛选实验动物模型的方法 - Google Patents
建立抗丙型肝炎病毒药物筛选实验动物模型的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，是将人工合成的丙型肝炎病毒注射入丙肝病毒阴性的树鼩体内，建立树鼩丙型肝炎自然感染模型，通过(1)人工合成丙型肝炎病毒；(2)将人工合成的丙型肝炎病毒注射入正常树鼩体内，每只动物体内病毒载量大于105c；(3)确认丙型肝炎病毒自然感染阳性树鼩模型；(4)通过丙型肝炎病毒阳性树鼩模型筛选抗筛选抗丙型肝炎病毒药物；等步骤来筛选抗丙型肝炎病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒领域。具体地说，本发明涉及一种建立抗丙型肝炎病毒药物筛选的方法及实验动物模型。
背景技术
全球约有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒(HCV)(AlterM，1997)。在发达国家的感染率近2％，我国的HCV自然感染率约为2-3％，属HCV高感染区(闻玉梅，1999)。急性丙型肝炎患者70-80会发展成慢性肝炎，其中5-10会发展成肝硬化和肝癌(金奇，2001)。自从1989年Choo等克隆分离HCV成功以来，对HCV的分子生物学研究已取得了较大进展。迄今已知HCV有6个基因型，30多种亚型。但是由于HCV的细胞受体还未完全确定、缺乏高效率的细胞培养体系，没有合适的HCV感染的动物模型，严重阻碍了我们对病毒生活史的认识，使HCV的疫苗研究和特异性抗病毒药物的研究步履艰难。到目前为止黑猩猩是感染HCV的最理想动物模型，其感染HCV的方式、发病类型、病理损害和免疫学改变均与人类十分相似。但由于黑猩猩属于濒临灭绝的动物、体形大、实验和维护费用十分昂贵，限制了它在HCV研究中的应用。
树鼩(tree shrew)(Tupaia belangi)是一种体形小、繁殖快、易于饲养、广泛分布于我国西南部及东南亚一带、在分类学上介于食虫目和灵长目之间的哺乳动物。已有报道树对多种医学病毒易感，如甲肝病毒(詹美云等，1981年)、乙肝病毒(严瑞琪等，1984年；Eike Walter et al，1996年)、丁肝病毒(李奇芬等，1995年，1996年)、轮状病毒(万新邦等，1982年，1985年)、疱疹病毒和基孔肯亚病毒(张海林等，1992年，1997年；Daral C，et al，1980年)等。国内曾有树鼩能感染HCV的报道(王海平等，1997；刘志等，1998；Xie(谢志春)et al，1998；Zhao et al，2002)。但是，由于研究用病毒来源于病人血清，病毒浓度不高，再者无有效可行的病毒浓宿方法和技术，建立的模型成功率低，基因型简单，无法满足抗病毒药物筛选对实验模型需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，建立丙型肝炎自然感染模型。
本发明的另一个目的是利用上述方法建立的动物模型进行抗丙型肝炎病毒药物的筛选。
本发明涉及一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，其包括如下步骤：
(1)体外检测丙型肝炎病毒感染阳性的、使用了安慰剂的丙型肝炎病毒病毒载量在105c-109c的血清中的HCV病毒载量；
(2)体外检测丙型肝炎病毒感染阳性的、使用了被筛选药物的树鼩的血清中的HCV病毒载量；
(3)比较步骤(1)和(2)中HCV病毒载量的变化。
上述方法中，丙型肝炎病毒感染阳性的树鼩优选是被人工合成的丙型肝炎病毒感染的。且更优选所述人工合成丙型肝炎病毒包括基因型1a或1b。
上述方法中，所述丙型肝炎病毒感染阳性的树鼩病毒载量大于105c，并优选病毒载量105c-109c。
更具体地讲，本发明涉及一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，其特征是，将人工合成的丙型肝炎病毒注射入丙肝病毒阴性的树鼩体内，建立树鼩丙型肝炎自然感染模型，通过以下四个步骤来筛选抗丙型肝炎病毒药物：
(1).工合成丙型肝炎病毒；
(2).将人工合成的丙型肝炎病毒注射入正常树鼩体内，每只动物体内病毒载量大于105c；
(3).确认丙型肝炎病毒自然感染阳性树鼩模型；
(4).通过丙型肝炎病毒阳性树鼩模型筛选抗筛选抗丙型肝炎病毒药物。
在本发明中，人工合成的丙型肝炎病毒包括包括6个基因型，如1a，1b。
本发明进一步公开了人工合成的丙型肝炎病毒是通过脂质体转染法将全长的pHCV转染入哺乳动物细胞，加入含T7启动子的痘病毒，35-37℃培养24-48小时，离心收集上清获得。人工合成丙型肝炎病毒的方法在授权专利01114678.8中已有详细描述和介绍。人工合成的病毒载量大于109c，远远大于病毒血清提取量104c。
本发明中将人工合成的丙型肝炎病毒按不同浓度注射入树鼩体内的，每只动物的丙型肺炎病毒含量在105c至109c之间，优先105c至108c，最优先106c至107c之间。
本发明建立的丙型肝炎动物模型，可以通过模拟人丙型肝炎病毒感染的自然过程，在用于研究丙型肝炎病毒的自然感染过程中的应用。也可应用在筛选抗丙型肝炎药物中。
本发明与现有技术相比，有以下几个显著特点：
1，丙型肝炎病毒模型成功率高。因为合理的病毒接种量，模型成功率达90％以上。
2，可以建立有针对性的基因型动物模型，如丙肝病毒1a基因型，或丙肝病毒混合基因型动物模型。
3，3动物体形小，且易于获得，实验和维护费用降低，扩大它在HCV研究中的应用。
附图说明
附图1是本发明接种病毒体后ALT变化曲线图；
附图2是肝脏HCV-RNA RT-PCR检测图；
附图3是免疫组化以core为一抗，core，×400结果图；
附图4是免疫组化以NS5A为一抗，NS5A，×400结果图；
附图5是免疫组化以NS3-NS4为一抗，NS3-NS4，×400结果图；
附图6是免疫组化以E2为一抗，E2，×400结果图。
具体实施例
下面结合附图与具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1、丙型肝炎病毒的人工合成和定量
①丙型肝炎病毒的合成
将专利200311111111获得的载体pHCV-2(CCTCC M201013)，取1μg ScaI酶切过pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中置室温15分钟；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染105个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过6个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-3(ATCC NO VR-2153)重组痘病毒，并加入利福平10毫克/每毫升。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48-72小时的温育后，收集含有丙肝病毒体的细胞培养物上清液。
②用RT-PCR测定扩增病毒的滴度
在24孔板中加入Huh 7细胞，每孔106个细胞，24小时后，去上清，加入实施例⑤获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入1ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，收集细胞，并从细胞中提取全部的RNA。用RT-PCR检测丙肝病毒的电泳带，PCR引物序列为：RT-PCR引物为SEQ ID NO：14，PCR引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：116。每孔加800微升Trizol Reagent，反复吹打使细胞充分裂解，并于室温放置5分钟；加160微升氯仿，摇动EP管15秒，室温放置2-3分钟；于4℃，12000转离心15分钟，弃上清；加入400微升异丙醇，室温放置10分钟，于4℃12000转离心10分钟，弃上清；加入75％乙醇800微升沉淀RNA，并于4℃，7500转离心5分钟；弃上清，沉集的RNA空气干燥，加20-40μl无菌水溶解RNA备用。RNA逆转录总体积30μl，反应体系如下：RNA 15微升，引物1微升，75℃变性分钟，置-3℃，3分钟；加入5x buffer 6微升，dNTP 6微升，Rnasin 1微升，总体积29微升，在42℃停留2分钟，加入MMLVRTase，1微升，37℃停留50分钟，70℃15分钟灭活得到丙肝病毒cDNA。PCR扩增反应体系为Buffer 5微升，cDNA 2微升，MgCl24微升，dNTP 4微升，上下游引物各1微升，Taq酶0.5微升，双蒸水36.5微升；PCR反应条件为95℃1分钟，95℃30秒-56℃30秒-72℃40秒-72℃5分钟，Tn32个循环。扩增产物于-20℃贮存。
电泳条件2％琼脂糖，18V/厘米电压，电泳10-15分钟，可见300bp带，即为丙肝病毒电泳带。
③用RT-PCRR荧光定量检测扩增病毒的滴度
根据深圳达尔安生物工程有限公司产品丙肝病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书进行操作。检测结果判定：计算Ax＝A1-A0(A0为反应前值，A1为反应后值)；实验有效性判别将阴性对照管的Ax称为N，监界阳性标准品的Ax值称为P1，强阳性标准值Ax称为P2，若此3值满足P2＞P1＞N，则本次实验有效。否则，实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。结果判定，在实验有效的前提下，样品Ax＞N+0.6×(P1-N)判定阳性；如果N+0.6×(P1-N)＞Ax＞N+0.4×(P1-N)则属于实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果Ax值＞N+0.4×(P1-N)判为阳性，否则判为阳性；如果Ax值＜N+0.4×(P1-N)判为阴性。
RT-PCR荧光定量检测结果
| 编号 | 实施例 | 转染HeLa细胞上清(HCV基因考贝数/ml) | 感染Huh-7细胞裂解液(HCV基因考贝数/ml) |
| 1 | ⑤ | 7.0×10<sup>10</sup> | 4.4×10<sup>9</sup> |
| 2 | ⑥ | 8.0×10<sup>9</sup> | 3.2×10<sup>8</sup> |
| 3 | ⑦ | 6.8×10<sup>8</sup> | 2.8×10<sup>8</sup> |
| 4 | vTF7-3对照 | 阴性 | 阴性 |
| 5 | 正常细胞对照 | 阴性 | 阴性 |
实施例2、动物模型的建立及确认：
抽取动物血液，PCR方法检测动物体内丙型肝炎病毒，筛查动物的丙型肝炎。所有实验动物在接种人工合成的丙型肝炎病毒前，PCR检测呈阴性。人工合成的病毒从尾静脉接种0.8ml，第二天第三天分别再腹腔注射0.6ml，接种量为2ml，每只动物的病毒载量为105c以上，共分7组。病毒载量不同，接种后阳性模型的成功率不同，每只动物接种病毒载量在104c包括104c，建立丙型肝炎病毒动物模型的成功率在34％以下。每只动物接种病毒载量在109c包括109c，建立丙型肝炎病毒动物模型的成功率在86％以上，但动物的死亡率也高，达15％以上。优先105c至108c，最优先106c至107c之间。
动物阳性通过以下方式确认：
1.重组HCV病毒感染树HCV RNA检测情况：
| 周次 | S2 |
| 第一周第二周第三周第五周第八周 | -+++--- |
2.接种病毒体后ALT变化曲线，见附图1。
3.肝脏HCV-RNART-PCR检测，见附图2。HCV体外增殖体系病毒感染树，肝脏HCV-RNART-PCR检测结果：
1.100bp DNA Ladder Marker(TAKARA)；
2.pHCV；
3.S1；
4.S2；
5.S7；
6.S8；
7.S10；
8.S13；
9.S14；
10.pHCV转染Hela上清；
11.D1(对照组动物)；
12.D2(对照组动物)；
13.空白对照(PCR反应体系中加入扩增引物，不加模板)；
14.100bp DNA Ladder Marker(TAKARA)；
S1，S2，S7，S8为pHCV转染Hela上清感染组；
S10为2次感染HCV(pHCV转染Hela上清感染Huh-7)感染组；
S13，S14HCV病人血浆感染组(阳性感染对照)。
4.免疫组化结果
4.1以core为一抗，core，×400，见附图3；
4.2以NS5A为一抗，NS5A，×400，见附图4；
4.3以NS3-NS4为一抗，NS3-NS4，×400，见附图5；
4.4以E2为一抗，E2，×400，见附图6；
确认丙型肝炎病毒自然感染阳性树鼩模型。
实施例3、丙型肝炎病毒阳性树鼩模型筛选抗筛选抗丙型肝炎病毒药物。
挑选成功感染的动物(RT-PCR，免疫组化阳性)40只随机分成A、B二组，每组10只分别抽取血液检测HCV病毒载量用安慰剂(生理盐水)、PEG IFN-α-2a(Roche)、PEG IFN-α-2bRoche)、利巴韦林ribavirin，RBV Roche)给药，剂量按PEG IFN-α-2a 1.5μg/kgSQ(皮下注射)每周一次PEG IFN-α-2bRoche)1.0μg/kg SQ(皮下注射)每周一次RBV，体重小于150g2mg每天2次口服，体重大于150g 3mg每天2次口服给药后分别于1，2，4，8周抽取血液检查HCV病毒载量。
A组10只动物8周内病毒载量变化
| 1周 | 2周 | 4周 | 8周 | |
| A1 | 1.37×10<sup>3</sup> | 1.10×10<sup>3</sup> | 8.30×10<sup>2</sup> | 8.95×10<sup>2</sup> |
| A2 | 2.46×10<sup>4</sup> | 7.39×10<sup>4</sup> | 2.30×10<sup>4</sup> | 9.27×10<sup>3</sup> |
| A3 | 1.98×10<sup>3</sup> | 7.54×10<sup>3</sup> | 4.98×10<sup>3</sup> | 9.50×10<sup>2</sup> |
| A4 | 5.42×10<sup>5</sup> | 2.01×10<sup>5</sup> | 3.69×10<sup>5</sup> | 6.38×10<sup>5</sup> |
| A5 | 8.21×10<sup>4</sup> | 1.77×10<sup>5</sup> | 1.05×10<sup>5</sup> | 2.14×10<sup>5</sup> |
| A6 | 5.40×10<sup>3</sup> | 4.61×10<sup>3</sup> | 7.55×10<sup>3</sup> | 7.39×10<sup>3</sup> |
| A7 | 3.50×10<sup>3</sup> | 1.05×10<sup>3</sup> | 8.79×10<sup>2</sup> | 7.34×10<sup>2</sup> |
| A8 | 1.06×10<sup>5</sup> | 4.50×10<sup>5</sup> | 2.07×10<sup>5</sup> | 9.78×10<sup>4</sup> |
| A9 | 7.90×10<sup>3</sup> | 4.44×10<sup>3</sup> | 1.98×10<sup>3</sup> | 9.85×10<sup>2</sup> |
| A10 | 9.15×10<sup>4</sup> | 8.33×10<sup>4</sup> | 9.36×10<sup>4</sup> | 7.11×10<sup>4</sup> |
B组10动物8周内病毒载量变化
| 1周 | 2周 | 4周 | 8周 | |
| B1 | 7.11×10<sup>3</sup> | 4.15×10<sup>3</sup> | 2.50×10<sup>2</sup> | 1.43×10<sup>1</sup> |
| B2 | 4.93×10<sup>3</sup> | 7.16×10<sup>2</sup> | 4.60×10<sup>1</sup> | 阴性 |
| B3 | 1.98×10<sup>3</sup> | 7.54×10<sup>3</sup> | 4.98×10<sup>1</sup> | 9.50×10<sup>2</sup> |
| B4 | 5.42×10<sup>5</sup> | 2.01×10<sup>5</sup> | 3.69×10<sup>5</sup> | 6.38×10<sup>5</sup> |
| B5 | 8.21×10<sup>4</sup> | 1.77×10<sup>5</sup> | 1.05×10<sup>5</sup> | 2.14×10<sup>5</sup> |
| B6 | 5.40×10<sup>3</sup> | 4.61×10<sup>3</sup> | 7.55×10<sup>3</sup> | 7.39×10<sup>3</sup> |
| B7 | 3.50×10<sup>3</sup> | 1.05×10<sup>3</sup> | 8.79×10<sup>2</sup> | 7.34×10<sup>2</sup> |
| B8 | 1.06×10<sup>5</sup> | 4.50×10<sup>5</sup> | 2.07×10<sup>5</sup> | 9.78×10<sup>4</sup> |
| B9 | 7.90×10<sup>3</sup> | 4.44×10<sup>3</sup> | 1.98×10<sup>3</sup> | 9.85×10<sup>2</sup> |
| B10 | 9.15×10<sup>4</sup> | 8.33×10<sup>4</sup> | 9.36×10<sup>4</sup> | 7.11×10<sup>4</sup> |
Claims (1)
1.一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，其包括如下步骤：
(1)将人工合成的丙型肝炎病毒注射入正常树鼩体内，每只动物体内病毒载量为105c-109c；
(2)确认丙型肝炎病毒感染阳性的树鼩；
(3)体外检测丙型肝炎病毒感染阳性的、使用了安慰剂的树鼩的血清中的HCV病毒载量；
(4)体外检测丙型肝炎病毒感染阳性的、使用了被筛选药物的树鼩的血清中的HCV病毒载量；
(5)比较步骤(4)和(5)中的HCV病毒载量的变化。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Addressee: Li Weiyun Document name: Notification to Pay the Fees |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Li Weiyun Document name: Notification of Termination of Patent Right |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080227 Termination date: 20140510 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |