CN102818878B - GHSR1a激动剂药物的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
一种GHSR1a激动剂药物的筛选方法，主要包括以下步骤：1)给药前多次预刺激以稳定基础生长激素水平；2)给药后5，15，30，60，180及300分钟取血30μL；3)分离10μL血浆，使用Rat/Mouse GH ELISA试剂盒测定血浆中生长激素含量；4)挑选出使血浆生长激素浓度-时间曲线下面积升高率大于50％的药物。本发明GHSR1a激动剂药物的筛选方法采取给药前多次假采血的手段，建立了稳定敏感可重复的GHSR1a激动剂药物的筛选模型，可提供在动物体内筛选GHSR1a激动剂药物的可靠和有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的筛选方法，尤其涉及一种GHSR1a激动剂药物的筛选方法。
背景技术
近年来，生长激素促分泌素受体1a(growth hormone secretagogue receptor，GHSR1a)选择性配体的研发成为热点，已经证明有着广阔的临床应用前景。GHSR1a激动剂能够刺激食欲和生长激素释放，因而可以用于厌食症和恶病质的治疗，GHSR1a激动剂还具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、调节睡眠和记忆等功能，有可能用于治疗与老年或退行性疾病相关的肌肉萎缩症等等。根据其作用机制建立敏感稳定的GHSR1a选择性激动剂的动物筛选模型就显得尤为重要。然而生长激素的分泌受多种环境，病理或非病理因素的影响因而并不稳定。例如外界因素刺激(温度，噪音，异物接触等)手术应激、热源或大剂量血管加压素的使用都能刺激生长激素的分泌，干扰筛选效果。
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种GHSR1a激动剂药物的筛选方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种GHSR1a激动剂药物的筛选方法，包括以下步骤：
1)确定目标药物，以雄性小鼠为给药对象；
2)给药前多次预刺激雄性小鼠以稳定其体内的基础生长激素水平；
3)对雄性小鼠按1mg/kg体重的剂量给药；
4)于给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、180分钟和300分钟各取30μL血样；
5)每份30μL血样分别分离出10μL血浆，分别使用Rat/Mouse GH ELISA试剂盒测定各份血浆中生长激素含量，建立目标药物的血浆生长激素浓度-时间曲线；
6)用生理盐水作为对照按上述步骤2)-5)建立生理盐水的血浆生长激素浓度-时间曲线；
7)对比目标药物的血浆生长激素浓度-时间曲线和生理盐水的血浆生长激素浓度-时间曲线，如果目标药物的血浆生长激素浓度-时间曲线下的面积AUC0～300相对于生理盐水的血浆生长激素浓度-时间曲线下的面积AUC0～300的增加率大于50％，则目标药物为GHSR1a激动剂药物。
所述的预刺激为对尾静脉进行假取血刺激。
所述的血浆生长激素浓度-时间曲线下的面积AUC0～300为以给药时的时间为0，至给药后300分钟这一段时间内曲线下的面积。
所述的给药为腹腔注射。
所述的多次预刺激为3-5次。
本发明GHSR1a激动剂药物的筛选方法采取给药前多次假采血的手段，建立了稳定敏感可重复的GHSR1a激动剂药物的筛选模型，可提供在动物体内筛选GHSR1a激动剂药物的可靠和有效的方法。
附图说明
图1是无预先处理，直接给予GHSR1a激动剂生长激素释放肽时血浆中的生长激素分泌情况；
图2是有无预先处理对生长激素分泌的影响对比；
图3是使用GHSR1a激动剂生长激素释放肽对此方法进行验证；
图4、图5是用本发明的方法考察GHSR1a激动剂生长激素释放肽量效关系图。
具体实施方式
一、动物饲养
雄性C57/BL6J小鼠，20～25g，动物SPF级饲养，室温22.7±0.8℃，湿度60％，采用12∶12小时昼夜循环。进场后适应性饲养一周，随机分组，每组6只，每笼2只。动物使用严格遵守动物饲养和使用伦理标准。
二、生长激素分泌的稳定方法的建立
两组动物，分别给予GHSR1a激动剂生长激素释放肽(1mg/kg，腹腔注射)或生理盐水作为溶剂对照。两组于给药后5，15，30，60及180分钟取血30μL。分离10μL血浆，使用Rat/Mouse GH ELISA试剂盒测定血浆中生长激素含量。结果如图1所示，显示由于小鼠应激状态下基础生长激素水平不稳定，使GHSR1a激动剂的作用难以被准确判断。
所以，我们将实验动物分为两组，每组6只，均给予生理盐水腹腔注射。一组于给药前-60、-45和-30分钟对尾静脉进行假取血刺激以模拟应激状态；另一组给药前不刺激，两组都于给药后5，15，30，60，180及300分钟取血30μL。分离10μL血浆，使用Rat/MouseGH ELISA试剂盒测定血浆中生长激素含量。结果如图2所示，证实尾静脉假取血刺激可以稳定生长激素基础水平。
三、稳定GHSR1a激动剂药物筛选方法的验证
两组动物，分别给予GHSR1a激动剂生长激素释放肽(1mg/kg，腹腔注射)和生理盐水。两组均于给药前-60、-45和-30分钟取血，并于给药时(0分钟)和给药后后5，15，30，60，180及300分钟取血30μL。分离10μL血浆，使用Rat/MouseGH ELISA试剂盒测定血浆中生长激素含量。实验结果如图3所示，证实进行取血刺激可以稳定生长激素基础水平，使GHSR1a激动剂促进生长激素分泌这一现象很容易被观察到，并使这一方法可用于药物筛选。
四、稳定GHSR1a激动剂药物筛选方法的应用实例
GHSR1a激动剂生长激素释放肽量效关系评价
四组动物，分别给予GHSR1a激动剂生长激素释放肽0.2、1及5mg/kg和生理盐水对照腹腔注射给药。四组均于给药前-60、-45和-30分钟假取血以稳定基础生长激素水平，并于给药后5，15，30，60，180及300分钟取血30μL。分离10μL血浆，使用Rat/Mouse GH ELISA试剂盒测定血浆中生长激素含量。
由图4可知，使用该方法，阳性药生长激素释放肽能够剂量依赖性地促进生长激素的分泌。低、中、高三个剂量的生长激素释放肽分别将生长激素浓度时间曲线下面积AUC0～300提高98％，163％和307％。从而可知，该方法可以成功的应用于GHSR1a激动剂的量效关系分析。
在筛选新的药物时，可以将生长激素浓度-时间曲线下面积AUC0～300提高率大于50％(相对于生理盐水对照组)的药物挑选出来，作为可能的GHSR1a激动剂药物进行进一步的研究。
Claims (4)
1.一种GHSR1a激动剂药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)确定目标药物，以雄性小鼠为给药对象；
2)给药前多次预刺激雄性小鼠以稳定其体内的基础生长激素水平；
3)对雄性小鼠按1mg/kg体重的剂量给药；
4)于给药后5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、180分钟和300分钟各取30μL血样；
5)每份30μL血样分别分离出10μL血浆，分别使用Rat/Mouse GH ELISA试剂盒测定各份血浆中生长激素含量，建立目标药物的血浆生长激素浓度—时间曲线；
6)用生理盐水作为对照按上述步骤2)－5)建立生理盐水的血浆生长激素浓度—时间曲线；
7)对比目标药物的血浆生长激素浓度—时间曲线和生理盐水的血浆生长激素浓度—时间曲线，如果目标药物的血浆生长激素浓度—时间曲线下的面积AUC0～300相对于生理盐水的血浆生长激素浓度—时间曲线下的面积AUC0～300的增加率大于50％，则目标药物为GHSR1a激动剂药物；
所述的预刺激为对尾静脉进行假取血刺激。
2.根据权利要求1所述的GHSR1a激动剂药物的筛选方法，其特征在于：所述的血浆生长激素浓度—时间曲线下的面积AUC0～300为以给药时的时间为0，至给药后300分钟这一段时间内曲线下的面积。
3.根据权利要求1所述的GHSR1a激动剂药物的筛选方法，其特征在于：所述的给药为腹腔注射。
4.根据权利要求1所述的GHSR1a激动剂药物的筛选方法，其特征在于：所述的多次预刺激为3-5次。
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