CN103529059B - 人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法 - Google Patents

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一种人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法，主要包括稳定表达人乳腺癌耐药蛋白的狗肾近端小管上皮细胞系的建立以及人乳腺癌耐药蛋白药物代谢水平评价平台的建立两大步骤。本发明建立了人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)稳定表达细胞株，以细胞水平的药物转运为主要检测方法，建立了一套针对人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的药物代谢水平进行评价的方法。首次实现了在狗肾近端小管上皮细胞(MDCK？II)中稳定高效表达人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，首次建立并优化了人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的药物代谢水平评价高通量筛选平台。

Description

人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及一种人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法。
背景技术
药物转运蛋白在药物的吸收、分布、代谢和转运过程中起着非常重要的作用。药物转运蛋白按照药物转运方式，可以分为两种：药物摄取蛋白和药物外排蛋白。人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，其BCRP基因位于染色体4q22区域，编码有655个氨基酸，是一种重要的药物外排转运蛋白，能将进入细胞中的某些药物外排出细胞，降低胞内药物浓度，进而产生诸如药物耐药性、药物作用减弱及药物毒性增强等作用。
狗肾近端小管上皮细胞(MDCK II)是连接非常紧密的细胞系，具有低水平表达转运蛋白，低代谢活性。其许多生理特性均与血脑屏障相似，常用于体外药物透过血脑屏障的筛选模型。在药物的转运方面，狗肾近端小管上皮细胞和结肠腺癌细胞(Caco-2)之间具有很好的相关性，且其培养周期短，细胞不同代次间具有良好均一性，能获得高表达人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)等优点。因此狗肾近端小管上皮细胞能很好代替结肠腺癌细胞作为肠道细胞模型。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述现有技术存在的问题，提供一种人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法，包括如下步骤：
A、稳定表达人乳腺癌耐药蛋白的狗肾近端小管上皮细胞系的建立
A1、质粒转染
A11、在6孔板里，以100万细胞每孔植入狗肾近端小管上皮细胞，用DMEM／10％胎牛血清的培养基培养24小时；
A12、取脂质体5微升加入到250微升OptiMEM I低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；取2微克人乳腺癌耐药蛋白克隆质粒加入到250微升OptiMEM I低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后加入6孔板中，轻轻混匀；
A13、在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养24小时后，形成转染体细胞进行下一步骤；
A2、克隆筛选
A21、将DMEM/10％胎牛血清的培养基培养过夜，将步骤A13所得转染体细胞分别转移成1：20、1：40和1：80浓度，加入含有潮霉素200微克／毫升的上述培养基培养；
A22、接下来2周内每两天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出稳定表达人乳腺癌耐药蛋白细胞克隆进行下一步骤；
A3、Transwell药物转运实验筛选阳性克隆细胞
A31、将步骤A22挑选出的细胞克隆以50万个细胞／孔的密度植入24孔的transwell板中，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基；
A32、在缓冲液HBSS中配制20nM人乳腺癌耐药蛋白的特异性放射性配体[3H]-雌酮磺胺；
A33、在transwell板底部加入600微升HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板底部的HBSS缓冲液；
A34、在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板顶部的HBSS缓冲液；
A35、分别测定步骤A33、A34所收集HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率，流出比率大于6的细胞克隆为阳性克隆细胞；
B、人乳腺癌耐药蛋白药物代谢水平评价平台的建立
B1、在24孔transwell板里，每孔植入50万个步骤A35所得阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基，并测定跨上皮膜电阻值，及荧光黄的渗透率，达标的transwell板将用于人乳腺癌耐药蛋白药物筛选；
B2、在transwell板底部加入600微升含10微摩尔待筛选药物的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺及10uM待筛选药物的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板底部的HBSS缓冲液；
B3、在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺及10uM待筛选药物的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升10uM待筛选药物HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板顶部的HBSS缓冲液；
B4、分别测定步骤B2，B3所收集的HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率，流出比率<2的药物为能够被人乳腺癌耐药蛋白代谢的药物。
步骤B1中所述达标的transwell板是指跨上皮膜电阻值大于300Ohms／cm2，荧光黄的渗透率小于0.4％／小时。
本发明由于采用了以上技术方案，为人乳腺癌耐药蛋白药物代谢水平提供了一个稳定，有效的评价方法。
具体实施方式
本发明的人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法，包括以下步骤：
一、稳定表达人乳腺癌耐药蛋白的狗肾近端小管上皮细胞系的建立
1、质粒转染
在6孔板里，以100万细胞每孔植入狗肾近端小管上皮细胞，用DMEM／10％胎牛血清的培养基培养24小时。
稀释5微升脂质体到250微升OptiMEM I低血清培养基，温和混匀，室温放置5分钟。稀释2微克人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)克隆质粒到250微升OptiMEMI低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟。将两者温和混匀，室温放置30分钟后加入6孔板中，轻轻混匀。
在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养24小时后，形成转染体进行下一步筛选。
2、克隆筛选
将DMEM／10％胎牛血清的培养基培养过夜，转染后的转染体细胞分别转移成1：20，1：40和1：80浓度，加入含有潮霉素200微克／毫升的上述培养基培养。
接下来2周内每两天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出稳定表达人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)细胞克隆进行下一步骤。
3、Transwell药物转运实验筛选阳性克隆
将挑选出的阳性克隆以50万个细胞／孔的密度植入24孔的transwell板中。在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基。测定跨上皮膜电阻(TEER)大于300Ohms／cm2，且荧光黄(lucifer yellow)的渗透率小于0.4％／小时。
在缓冲液HBSS中配制20nM人乳腺癌耐药蛋白的特异性放射性配体[3H]-雌酮磺胺([3H]-estrone sulfa)。
顶部到底部(Apical-to-Basolateral)的药物转运实验时，在transwell板底部加入600微升HBSS缓冲液，在顶部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升底部的HBSS缓冲液。
底部到顶部(Basolateral-to-Apical)的药物转运实验时，在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在顶部加入300微升HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升顶部的HBSS缓冲液。
测定所收集HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率(Efflux ratio)，流出比率大于6的细胞克隆为阳性克隆。阳性克隆会被用来建立评价平台。
二、人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)药物代谢水平评价平台的建立
1、在24孔transwell板里植入每孔50万阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基，并测定跨上皮膜电阻值，及荧光黄的渗透率。跨上皮膜电阻(TEER)大于300Ohms／cm2，且荧光黄(lucifer yellow)的渗透率小于0.4％／小时的transwell板将用于人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)药物筛选。
2、顶部到底部(Apical-to-Basolateral)转运实验时，在transwell板底部加入600微升含10微摩尔药物Ko143的HBSS缓冲液，在顶部加入300微升含20nM[3H]-雌酮磺胺及10μM药物Ko143的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升底部的HBSS缓冲液。
3、底部到顶部(Basolateral-to-Apical)转运实验时，在transwell板底部加入600微升含20nM[3H]-雌酮磺胺及10μM药物Ko143的HBSS缓冲液，在顶部加入300微升含10μM药物Ko143的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升顶部的HBSS缓冲液。
4、测定所收集HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率(Efflux ratio)，由计算得知，加入10μM药物Ko143后，人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的[3H]-雌酮磺胺的流出比率<2(未加Ko143的流出比率为10)，故判定药物Ko143为能够被人乳腺癌耐药蛋白代谢的药物。

Claims (2)

1.一种人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、稳定表达人乳腺癌耐药蛋白的狗肾近端小管上皮细胞系的建立
A1、质粒转染
A11、在6孔板里，以100万细胞每孔植入狗肾近端小管上皮细胞，用DMEM/10％胎牛血清的培养基培养24小时；
A12、取脂质体5微升加入到250微升OptiMEM I低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；取2微克人乳腺癌耐药蛋白克隆质粒加入到250微升OptiMEM I低血清培养基中，温和混匀，室温放置5分钟；将上述两者温和混匀，室温放置30分钟后加入6孔板中，轻轻混匀；
A13、在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养24小时后，形成转染体细胞进行下一步骤；
A2、克隆筛选
A21、将DMEM/10％胎牛血清的培养基培养过夜，将步骤A13所得转染体细胞分别转移成1:20、1:40和1:80浓度，加入含有潮霉素200微克/毫升的上述培养基培养；
A22、接下来2周内每两天更换培养基，直到没有转染质粒的细胞全部死亡后，进行克隆挑选，挑选出稳定表达人乳腺癌耐药蛋白细胞克隆进行下一步骤；
A3、Transwell药物转运实验筛选阳性克隆细胞
A31、将步骤A22挑选出的细胞克隆以50万个细胞/孔的密度植入24孔的transwell板中，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基；
A32、在缓冲液HBSS中配制20nmol/L人乳腺癌耐药蛋白的特异性放射性配体[3H]-雌酮磺胺；
A33、在transwell板底部加入600微升HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升含20nmol/L[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板底部的HBSS缓冲液；
A34、在transwell板底部加入600微升含20nmol/L[3H]-雌酮磺胺的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板顶部的HBSS缓冲液；
A35、分别测定步骤A33、A34所收集HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率，流出比率大于6的细胞克隆为阳性克隆细胞；
B、人乳腺癌耐药蛋白药物代谢水平评价平台的建立
B1、在24孔transwell板里，每孔植入50万个步骤A35所得阳性克隆细胞，在37℃、5％二氧化碳培养箱里培养三天，每天更换培养基，并测定跨上皮膜电阻值，及荧光黄的渗透率，达标的transwell板将用于人乳腺癌耐药蛋白药物筛选；
B2、在transwell板底部加入600微升含10微摩尔待筛选药物的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升含20nmol/L特异性放射性配体[3H]-雌酮磺胺及10微摩尔待筛选药物的HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板底部的HBSS缓冲液；
B3、在transwell板底部加入600微升含20nmol/L特异性放射性配体[3H]-雌酮磺胺及10微摩尔待筛选药物的HBSS缓冲液，在transwell板顶部加入300微升含10微摩尔待筛选药物HBSS缓冲液，在37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育一小时，然后收集30微升transwell板顶部的HBSS缓冲液；
B4、分别测定步骤B2，B3所收集的HBSS缓冲液中的[3H]-雌酮磺胺的放射强度，并计算流出比率，流出比率＜2的药物为能够被人乳腺癌耐药蛋白代谢的药物。
2.根据权利要求1所述的人乳腺癌耐药蛋白介导的药物代谢水平评价方法，其特征在于：步骤B1中所述达标的transwell板是指跨上皮膜电阻值大于300Ohms/cm2，荧光黄的渗透率小于0.4％/小时。
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