CN106480028A - TPO基因的saRNA分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学医药领域，合成了TPO基因的saRNA分子，所述saRNA分子序列与TPO基因转录起始位点上游6000bp和下游1000bp区域的序列SEQ ID NO:1互补，其能有效地激活肿瘤细胞内低表达或不表达的TPO基因，具有促进肿瘤细胞滞留放射性核素131I的生物学功效，为基因技术与放射性核素疗法相结合以靶向治疗肿瘤提供了新方法和新分子靶点。

Description

TPO基因的saRNA分子及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是TPO基因的saRNA分子及其应用。
背景技术
基因治疗是将正常基因或治疗基因导入靶细胞从而达到疾病治疗目的的一种新型治疗手段。近年来全世界范围内开展了许多针对肿瘤的基因治疗方法研究，其中RNA激活(RNA activation，RNAa)是近年来发现和发展起来的一门新兴基因技术，为一种采用短双链RNA调控基因表达的技术，可激活细胞的内源性基因，从而实现目的基因表达上调的新技术。RNA激活技术的开发为将基因技术与放射性核素疗法相结合以靶向治疗肿瘤提供了极其有前景的选择。
钠碘同向转运体(Human sodium iodide symporter,hNIS)和人甲状腺过氧化物酶(Human thyroidperoxidase，hTPO)主要在甲状腺组织表达，在甲状腺疾病的诊断和治疗中发挥了至关重要的作用。许多学者报道了用不同方法转导hNIS基因介导非甲状腺肿瘤细胞碘摄取的体内外研究，证实了转导hNIS基因的瘤细胞可以提高摄取放射性核素碘(131I、123I、124I、125I)的能力，从而实现放射性核素治疗目的。
影响放射性碘疗效的另一个重要因素是碘在胞内的滞留时间，如果放射性碘在细胞内停留时间短，其临床应用价值就会受到一定的限制。hTPO是甲状腺激素合成酶系的关键酶，可有效延缓碘从胞内流出，它催化碘的氧化、甲状腺球蛋白(TG)上酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸的偶联以生成三碘甲腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4)。细胞内的碘经hTPO催化后以有机化碘的形式存在，有效地延缓碘的外流，提高了131I的抑瘤效果。
通过RNA激活技术，让肿瘤细胞摄取碘使碘在肿瘤细胞内滞留，利用大剂量放射性核素的辐射生物效应杀伤肿瘤细胞，有望成为放射性核素靶向治疗甲状腺和非甲状腺肿瘤的新途径。
发明内容
本发明的目的在于提供TPO基因的saRNA分子，能有效激活肿瘤细胞内低表达或不表达的TPO基因，具有促进肿瘤细胞滞留放射性核素131I的生物学功效。
本发明具体的技术方案如下：
本发明公开了TPO基因的saRNA分子，其序列与TPO基因转录起始位点上游6000bp和下游1000bp区域的序列SEQ ID NO:1互补，增加TPO基因的表达。其中，序列SEQ ID NO:1中第6001到6010个碱基为转录起始点TSS。
优选的，所述saRNA分子序列与TPO基因转录起始位点上游5500bp和下游800bp区域的序列SEQ ID NO:2互补。
所述saRNA分子序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。优选为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
上述saRNA分子用于针对TPO基因的启动子序列区域，激活肿瘤细胞内TPO基因，增加TPO基因的表达。
本发明还包括一种用于激活TPO基因的组合物，该组合物包括至少第一条核糖核酸链，所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中之一，其与TPO基因转录起始位点上游6000bp和下游1000bp区域的序列SEQ ID NO:1互补，增加TPO基因的表达。
优选的，所述组合物还包括第二条核糖核酸链，当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:3所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:4；当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:5所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:6；当第一核糖核酸链为一个序列由SEQ ID NO:7，第二个核糖核酸链为SEQ ID NO:8的序列。
作为一种优选的可实施方式，所述组合物可包含至少一种saRNA分子，其含有一个核糖核酸的序列，选自序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8，其中优选为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或为与序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中之一具有至少99％，95％，90％，85％，或更少序列同一性的序列。
作为一种优选的可实施方式，所述组合物包括两个或多个的saRNA分子，所述saRNA分子的序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8，与靶基因TPO的启动子区域内的不同位置互补。
优选的，本发明中的组合物可以为重组质粒，用于在特定组织或在特定的细胞内环境的所述saRNA分子的表达，诱导型或调节启动子，增加TPO基因的表达。
进一步优选的，所述组合物还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。
另外，本发明还包括一种增强细胞中TPO基因表达的方法，即将所述saRNA分子引入到动物细胞的细胞核中。
另外，本发明还公开了上述saRNA在制备放射性核素靶向治疗药物中的应用。
本发明设计合成的TPO基因的saRNA分子，其能有效地激活肿瘤细胞内低表达或不表达的TPO基因，具有促进肿瘤细胞滞留放射性核素131I的生物学功效，为基因技术与放射性核素疗法相结合以靶向治疗肿瘤提供了新方法和新分子靶点，对开发肿瘤的靶向治疗新策略具有重要意义，具有潜在临床应用价值。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1：saRNA设计示意图；
图2：RT-PCR量化hTPO-saRNA介导的HepG2细胞系hTPO mRNA上调水平分析图；
图3：Western blot显示hTPO-saRNA介导的Hep肝癌细胞系hTPO蛋白升高水平图，其中，图3-A为Western blot成像图，图3-B为Western Blot量化分析图；
图4：hNIS-saRNA与hTPO-saRNA转染组与hNIS-saRNA组的肝癌细胞的摄碘能力。
具体实施方式
本文所用的术语“基因”包括，在适当的宿主细胞中存在时，有利于生产的基因产物的核酸序列。“基因”可以包含核酸序列编码的蛋白质，不编码蛋白质的序列，包括基因的宿主细胞是内源性的，或者是完全或部分重组(例如，由于启动子的外源多核苷酸，其编码的引入和编码序列，或相邻的内源性的编码序列，导入宿主细胞)的异源启动子的介绍。例如，术语“基因”包括核酸，可以由外显子和内含子组成。编码蛋白质的序列，例如，包含于外显子的序列，该序列在起始密码子和终止密码子的开放阅读框之间。“基因”在本文中是指一种核酸，包括，例如调节序列如启动子、增强子，和本领域中已知的所有其他序列可操作地连接或可操作地相关联的调节核酸序列的转录、表达，或活化的核酸序列，包括编码序列或非编码序列。在本文中，例如，“基因”被用于描述包括调节序列，如启动子或增强子和编码非编码序列的核酸。由一个或多个异源调节序列的重组基因的表达可被控制。“异源”指的是两个要素，一般都不会在本质上相关联。
术语“细胞”是指任何哺乳动物的细胞，包括人类的哺乳动物细胞，是指在体内的细胞，例如，在生物体中，或在一个生物体的器官；或指在体外的细胞，如，在细胞培养中的细胞保持。
saRNA可采取使用化学合成的方法获得，如采用Dharmacon公司，Inc。的专有的ACE(R)技术的方法。
另外，人们也可以使用依赖于模板的合成方法。合成方法也可以进行使用改性或非改性的，如本文所公开的天然或非天然的碱基。此外，合成有或没有本文所公开的改性或非改性的核酸骨架。
另外，saRNA分子可能在宿主细胞中合成，由现在已知的或涉及到已知的合成saRNA分子在宿主细胞中的任何方法进行。例如，可以表示saRNA分子使用任何合适的启动子的DNA载体。本发明的重组质粒也可包括在特定组织或在特定的细胞内环境的saRNA分子的表达，诱导型或调节的启动子。选择合适的载体，用于表达本发明的saRNA，插入saRNA到载体表达的核酸序列的方法，提供感兴趣的细胞的重组载体的方法是在本领域的技术范围内。
本发明saRNA分子在表达的重组核酸载体中，可作为两个独立互补的RNA分子，或作为一个与两个互补区的单个RNA分子。
一旦合成，本发明的多核苷酸可能会立即被使用，或者被存储以备将来使用。在一些实施例中，本发明的多核苷酸被存储在适当的缓冲液中。多种缓冲液是已知在本领域适合用于存储saRNA的。例如，缓冲液可以由100mM的氯化钾和30mM HEPES，pH值7.5，和1mM氯化镁。
在代表性的实施方案中，本发明的双链多核苷酸在这样的缓冲液中4℃存储一年，保留其活性的30％至100％。更优选地，存储在这样的缓冲液4℃，一年，它们保留其生物活性的80％至100％。为了确保saRNA的稳定性，在使用前，它们可能会以干的形式(如冻干形式)被保留在-20℃，直到他们准备使用。
在使用前，它们应该被重新悬浮，然而，即使是一次再悬浮，例如，在上述的缓冲液，它们应保持在-20℃下直至使用。上述缓冲液，在使用前，可被存储在约4℃下或室温下进行。进行转染的有效温度在本领域中的技术人员公知的，例如室温。
方法什么方法？
本发明提供了增加hTPO基因的表达，包括引入saRNA分子到哺乳动物细胞的细胞核中，其中saRNA分子中有一个的hTPO基因的启动子序列的区域互补的链，导致hTPO基因表达增加的结果。hTPO基因的表达或活性的测量可采用本领域中公知的各种方法中的任何一个，包括测量靶基因的核酸的转录水平，靶基因的mRNA表达水平，靶基因的蛋白质水平。
本发明是适用于整个范围广泛的哺乳动物，包括但不限于人类。哺乳动物如牛，马，山羊，猪，羊，犬科动物，啮齿动物，如仓鼠，小鼠和大鼠，和灵长类动物，大猩猩，黑猩猩和人。
转基因哺乳动物中也可以使用，例如，哺乳动物的嵌合基因序列。
本发明可以有利地使用具有不同类型的细胞，包括生殖细胞系、体细胞、干细胞或分化后的细胞。例如，细胞类型可以是胚细胞，卵母细胞，精子细胞，脂肪细胞，成纤维细胞，肌细胞，心肌细胞，血管内皮细胞，神经细胞，神经胶质细胞，血细胞，巨核细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，肥大细胞，白细胞，粒细胞，角质形成细胞，软骨细胞，成骨细胞，破骨细胞，肝细胞和内分泌或外分泌腺细胞。
从阅读了本文中，本领域的技术人员在本领域中可以得出结论，本发明的分子和方法可应用的现在已知的任何方法使saRNA穿过细胞膜和/或核膜，将是有益于本发明。
这些方法包括但不限于任何方式如转染，例如，采用DEAE-葡聚糖，磷酸钙，阳离子脂质/脂质体，胶束，操纵压力，显微注射，电穿孔，免疫穿孔，或使用载体，如病毒(如RNA病毒)、质粒，细胞融合，和耦合的多核苷酸的特定共轭物或配体，如抗体、抗原、受体，被动引进saRNA，促进其吸收。
本发明的saRNA可以用在一组不同的应用程序的激活的靶基因，包括但不限于基础研究，药物发现和开发，诊断和治疗。本申请中的靶核酸序列的确定和激活(例如，增加表达)用于验证基因产物是否是药物发现或开发的一个目标。例如，细胞接触一个针对特定的目标的调节序列的saRNA，该信元被保持的条件下，使甲基化的目标DNA和/或甲基化的核蛋白质，例如一个或多个组蛋白，导致活性下降或一个基因的转录活动增加的程度，例如转录或翻译的基因以及与这样的活动增加的效果，然后进行评估，并判断。如果活性增加，则核酸序列将是一种药物发现或发展目标。以这种方式，相关表型理想的saRNA在适当的情况下可以进行毒性和药代动力学研究和开发治疗制剂。
另外，本发明可以被用于在应用活动中，例如，预防，诊断和治疗。对于这些应用，一个体具有一个特定的靶核酸通过操纵调制疾病或病症，经saRNA处理的结果可能是改善，缓和，预防，和/或诊断的一个特定的疾病或紊乱。在代表性的实施例中，saRNA带或不带稀释剂的药学上可接受的载体与药学上可接受的方式给药。
适于治疗用本发明的方法的涉及saRNAs的适应症包括但不限于，甲状腺低分化和未分化肿瘤，非甲状腺肿瘤。
本发明不应该被解释为仅限于具有上述疾病的患者的治疗。相反，本发明应被理解为包括或hTPO基因的表达增加的状况或疾病的患者的治疗，将受益于本发明的方法。
在一个或多个参数的显着改善疗效的指标，以及本领域技术人员的普通医护人员(例如，临床医生)根据各种因素来调整给药方案和剂量，例如，依赖于病人的严重程度等因素，以对患者疾病提供最佳的给药的化合物等。
药物制剂
本发明提供的是上述的saRNA分子的药物制剂。
通过本领域常见各种方法，saRNA化合物可制备出用于治疗给药的各种剂型。
更具体地，本发明的化合物可配制成药物组合物与适当的药学上可接受的载体，稀释剂，赋形剂和/或佐剂组合，并且可以配制成固体，半固体，液体或气体形式的制剂，如片剂，胶囊，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，注射剂，吸入剂和气溶胶，在无菌小瓶或注射器。
用于透皮给药制剂，该化合物优选配制没有检测到DMSO中，或与载体除了DMSO。
该制剂可被设计用于施用于受试者或患者需要其通过许多不同的给药方式，包括口服，口腔，直肠，肠胃外，腹膜内，皮内，气管内等；给药可以是全身性或局部性的配方治疗，例如，局部输送到肿瘤中的内部。
此外，药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，等渗调节剂，稳定剂，润湿剂和类似物，均为本领域技术人员所公知。
就本技术领域的技术人员而言，制备各种剂型的实际方法是已知的，或将是显而易见的，参见，Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania,17th edition,1985；Remington:The Science and PracticeofPharmacy,A.R.Gennaro,(2000)Lippincott,Williams&Wilkins。在任何情况下，给药含有一定量的组合物或制剂，足以使受治疗者达到理想效果状态。在说明书中关于方案的解释说明，不仅仅是要求一个最大的保护范围，还要考虑的是在创造性的答复中，哪些特征会提高创造性，就要适当的进行设置，如果都是常规的助剂和方法，一旦RNA分子本身没有创造性，药剂也没有创造性了
在药物剂型中，本发明的主题saRNA分子可能被它们的药学上可接受的盐的形式给药，或者它们也可以单独使用，或在适当的关联，以及组合，与其它药用活性化合物。
下列方法和赋形剂是仅仅是示例性的，决不是限制性的。
常规药学上可接受的给药途径，包括鼻内，肺内肌内，气管内，瘤内，皮下，皮内，外敷，静脉注射，直肠，鼻腔，口腔及其他肠外给药途径。给药途径可能被合并，如果需要的话可调整，这取决于治疗程序和/或所需的效果。该组合物可以以单一剂量或多次剂量给药。
根据主体和治疗条件和给药途径，saRNA分子可采用合适的剂量范围给药，1μg至10000μg或10000μg/公斤体重每天。在某些实施例中，反复进行给药，直至达到所期望的效果的治疗给药。
使用本发明的化合物的组合疗法
在本发明方法中使用，本发明所述saRNA分子与其他药物如化疗药物联合给药，以实现治疗目的。或本发明化合物可用于增加另一种化学品的有效性，如一种药物，或在另一种化学物质的量的减少。
在联合治疗中使用的化学治疗剂包括，但不限于，柔红霉素，放线菌素D，多柔比星，表柔比星，伊达比星，依索比星，博来霉素，马磷酰胺，异环磷酰胺，阿糖胞苷，卡莫司汀，白消安，丝裂霉素C，放线菌素D，光辉霉素，强的松，羟孕酮，睾酮，他莫昔芬(tamoxifen)，达卡巴嗪，丙卡巴肼，六甲基蜜胺，五甲密胺，米托蒽醌，安吖啶，苯丁酸氮芥，氮芥，苯丙氨酸氮芥，环磷酰胺，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氮胞苷，脱氧柯福霉素，羟基脲，5-氟尿嘧啶(5-FU)，5-氟脱氧尿苷(5-FUDR)，甲氨蝶呤(MTX)，秋水仙素，紫杉醇，长春新碱，长春碱，鬼臼乙叉甙(VP-16)，三甲曲，伊立替康，拓扑替康，吉西他滨，替尼泊苷，顺铂和己烯雌酚(DES)。
以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
实施例1：saRNA的制备
根据Li等总结的RNAa原则及提供的设计软件，针对hTPO mRNA设计合成saRNA，具体设计步骤如下：
1.NCBI检索hTPO基因特征如下：
(1)human TPO位于染色体的位置：Chromosome 2：1413461..1542727，
(2)Accession number:NG_011581
(3)Length：129267bp
(4)UCSC检索TSS上游6000bp下游1000基因序列如SEQ ID NO:1所示，其中，序列SEQ ID NO:1中第6001到6010个碱基为转录起始点TSS。
根据saRNA设计原则，在TSS上游6000bp，下游1000bp范围内共设计合成了6个saRNA序列[saRNA-758(sa-758),saRNA-3073(sa-3073),saRNA-3860(sa-3860),saRNA-4576(sa-4576),saRNA-5198(sa-5198),saRNA-5640(sa-5640)]。并进行BLAST同源性分析，确认与hTPO以外的人已知基因序列无同源性。此外，另外设计合成了2个与目的基因无同源性的阴性对照dsRNA。合成各dsRNA序列见表1。每个saRNA在无菌无RNA酶的水中重悬，稀释到合适的工作浓度(μumol/L)，并储存于-80℃备用。
表1靶向hTPO的saRNA oligomer序列
实施例2 saRNA对hTPO表达的影响
肝癌细胞HepG2用含10％胎牛血清DMEM，5％CO2、37℃培养箱培养。处于对数生长期的细胞，2×105接种于六孔板培养过夜。次日以上dsRNAs和dscontrol以50nM的终浓度，通过脂质体Lipofectamine2000转染肝癌细胞HepG2，转染后72h，以RT-PCR技术半定量分析各组hTPO mRNA的表达量，分析RNAa对HTPO表达上调程度。
免疫印迹分析
采用PBS缓冲液清洗细胞，RIPA蛋白裂解液冰上裂解数分钟后12,000rpm/min离心15min收集上清；BCA法检测蛋白浓度。10％SDS-PAGE凝胶电泳约2h后将蛋白转移至PVDF膜(polyvinylidene difluoride membranes)。4℃封闭过夜后，于含hTPO一抗(SantaCruzBiotechnology，INC)的PBS中4℃孵育过夜。然后将含hTPO蛋白的滤纸与辣根过氧化物酶连接的驴抗兔IgG(Immunology Consultants Laboraory，Inc)孵育1h后，荧光检测试剂增强发光，Odyssey图像分析系统(Gene Company Limited)下显影和拍照。
上述操作发现，3个saRNA序列均可上调hTPO mRNA表达水平(P＜0.05)，其中saRNA3073对HepG2细胞系hTPO mRNA表达水平上调最明显。对RNAa效果进行量化分析，显示saRNA3073转染后72h HepG2细胞系hTPO mRNA表达水平上调了2.12±0.88倍(图2)。在HepG2细胞系6个saRNA序列转染72h后，Western blot结果显示，hTPO蛋白表达水平均不同程度升高，其中saRNA3073组升高最明显，通过与内参基因GAPDH蛋白比较的光密度量化分析，结果显示，saRNA3073介导的细胞系显示hTPO蛋白表达水平较对照组分别升高了2.27±0.35倍(图3)。
实施例3放射性核素摄取实验
用hNIS-saRNA和/或hTPO-saRNA(saRNA-3073)序列分别转染两个HepG2细胞后，加入含有Na125I溶液，继续培养2h后，测量不同时间点的各组细胞内的放射性计数。结果显示(图4)，联合转染组细胞内放射性计数高于单独hNIS-saRNA转染细胞(P＜0.01)，在30min时，联合转染组细胞内放射性计数是hNIS-saRNA转染组的3.03倍。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.TPO基因的saRNA分子，其特征在于，所述saRNA分子序列与TPO基因转录起始位点上游6000bp和下游1000bp区域的序列SEQ ID NO:1互补，增加TPO基因的表达。
2.如权利要求1所述saRNA分子，其特征在于，所述saRNA分子序列与TPO基因转录起始位点上游5500bp和下游800bp区域的序列SEQ ID NO:2互补。
3.如权利要求1所述saRNA分子，其特征在于，所述saRNA分子序列为SEQ ID NO:3和SEQID NO:4，或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
4.如权利要求1所述saRNA分子，其特征在于，所述saRNA分子其序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
5.一种用于激活TPO基因的组合物，其特征在于，包括至少第一条核糖核酸链，所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8中之一，所述第一条核糖核酸链序列与TPO基因转录起始位点上游6000bp和下游1000bp区域的序列SEQ ID NO:1互补。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第二条核糖核酸链，当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:3所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ IDNO:4；当所述第一条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:5所示，所述第二条核糖核酸链序列为SEQ ID NO:6；当第一核糖核酸链为一个序列由SEQ ID NO:7，第二个核糖核酸链为SEQ IDNO:8的序列。
7.如权利要求5-7任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为重组质粒。
8.如权利要求5-7任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体，药学上可接受的稀释剂，药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的佐剂中的至少一种。
9.一种增强细胞中TPO基因表达的方法，其特征在于，将权利要求1所述saRNA分子引入到动物细胞的细胞核中。
10.如权利要求1所述saRNA分子在制备放射性核素靶向治疗药物中的应用。
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