WO2021000928A1 - 激活atoh1基因的寡聚核酸分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种寡聚核酸及其在听力损失治疗中的应用。一种用于治疗听力损失的小激活核酸分子。上述小激活核酸分子可以是靶向ATOH1基因启动子区的双链或单链RNA分子，包含第一核酸链和第二核酸链。靶向ATOH1基因启动子区的双链RNA分子包含两条长度为16-35个核苷酸的核酸链，并且其中一条核酸链与选自ATOH1基因启动子区的靶点存在至少75％的同源性或互补性。上述小激活核酸分子和可选的药学上可接受的载体的药物组合物；使用所述小激活核酸分子以及使用所述药物组合物可以上调ATOH1基因和蛋白在细胞中的表达及治疗与ATOH1基因表达不足或减少相关的疾病或状况的方法。

Description

激活ATOH1基因的寡聚核酸分子及其应用 技术领域
本发明属于核酸技术领域，具体来讲，涉及基因激活相关的寡聚核酸分子，例如小激活核酸分子，和小激活核酸分子在激活/上调ATOH1基因转录中的应用，以及其在与ATOH1蛋白质缺乏或不足相关的疾病或状况，如听力损失治疗中的应用。
背景技术
听力损失，是一种严重的全球性疾病，影响着全球3.6亿人。听力损失不仅影响着患者的生活质量，而且对患者和医疗系统都是一个沉重的负担。而目前仍缺乏有效的治疗办法，因此急需开发新的治疗手段(WHO，2013)。
听力损失是听觉功能障碍的表现，一般临床上把听力损失分为传导性、感音神经性和混合性听力损失三类。在传导性听力损失，病变在外耳或中耳，导致声波传入内耳受到障碍。最常见的听力损失类型是感音神经性听力损失，主要是由内耳耳蜗中毛细胞的损失引起的(Liberman 1990)。任何导致传导性听力损失和感音神经性听力损失的因素同时存在则被称为混合性听力损失。人体内耳含有约75,000个感觉毛细胞，其通过机械敏感的静纤毛束来检测声音和运动，是将运动信号转换为电信号的机械传感器。声音的传递机制为内耳通过外毛细胞对声音的适应性放大以及内毛细胞的突触化学传递，将声音的机械振动转换为听神经纤维上的电冲动。电冲动进一步被听觉脑干和听觉皮层进行处理、编码和解译，最终在认知水平上呈现出对外界声音振动的听觉物象。
听力损失的影响因素分为先天性和后天性。先天性因素主要是指新生儿出生时或出生后不久出现听力损失，包括孕妇妊娠期感染某种疾病和使用不当特殊药物，分娩期不当并发症的出现等。后天性因素在任何年龄都可能出现，包括感染某种传染病、头部和耳朵受到外伤、长期暴露于过度噪声和耳毒性药物的环境中和衰老导致耳蜗感觉毛细胞的退化等(Gurtler and Lalwani 2002)。在正常人群中，男性约从45岁开始出现听力衰退，女性则稍晚。50岁以上人群中超过40％和70岁以上人群中70％具有临床上显著的听力损失。随着人口老龄化的发展，老年人耳聋的发病率也有所增加。此外，内耳前庭上皮细胞中毛细胞的损失还导致平衡功能障碍，引起头晕和眩晕。
ATOH1基因，亦称ATH1、HATH1、MATH-1和bHLHa14，编码无调bHLH转录因子1(atonal bHLH transcription factor 1)蛋白，属于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族成员。ATOH1在哺乳类动物内耳毛细胞形态和功能再生过程中发挥正向调控作用(Zheng and Gao 2000)。ATOH1是所发现的内耳发育中第一个表达的基因(Bermingham et al.1999)，调节各种神经细胞的发育，如脊髓、内耳毛细胞、小脑神经元、本体感受系统神经元及非神经细胞。在内耳发育期间，毛细胞的再生发挥着重要的作用，而ATOH1正是 促使毛细胞分化再生的关键。因此诱导ATOH1基因的过表达进而促使毛细胞再生可能为治疗听力损失提供一种新的疗法。此外，ATOH1还有肿瘤抑制基因的功能。比如在结直肠癌，ATOH1是明确的肿瘤抑制基因，过表达ATOH1可以抑制肿瘤细胞增殖和移植瘤的生长(Kazanjian and Shroyer 2011)。
载体介导(病毒和脂质体)的ATOH1基因治疗已在动物实验中显示出促进毛细胞再生和改进听力的效果(Richardson and Atkinson 2015)。有学者也通过介导ATOH1过表达诱导毛细胞在Corti’s器细胞构架没有塌陷之前进行分化再生(Kawamoto et al.2003；Gubbels et al.2008)。美国密西根大学Rapheal研究小组报道氨基甙类抗生素导致全聋的成年豚鼠内耳过表达ATOH1后毛细胞可以再生，并伴有听功能的部分恢复(Izumikawa et al.2005)。在新生小鼠中，ATOH1过表达可以将支持细胞转化成毛细胞，其也能促进其他细胞(例如肠细胞)进入分化状态(Aragaki et al.2008)，并降低结肠癌细胞的增殖(Leow,Polakis,and Gao 2005)。
基因的输送通常需要载体来完成，目前常用的基因转染载体主要有病毒和脂质体两类。目前诺华制药公司开发的一款基因治疗产物(CGF166，为重组腺病毒介导的ATOH1基因治疗)正在I期临床试验中用于治疗听力丧失(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT02132130)。虽然这种病毒-基因治疗系统表达水平高，但存在载体安全性和免疫反应问题还不能完全克服，应用于人体还有一定的挑战。因此，开发新的治疗方法尤为重要。
发明内容
本发明的一个目标是提供基于RNA激活过程的小激活核酸分子，其通过激活/上调ATOH1基因转录，从而增加ATOH1蛋白的表达量来促进内耳毛细胞的再生，恢复听力，或者治疗与ATOH1蛋白质缺乏或不足相关的疾病或状况，肿瘤疾病。
本发明的另一目标是提供包含小激活核酸分子的组合物或制剂。
本发明的又一目标为提供小激活核酸分子或包含其的组合物或制剂在制备用于激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的药物中的应用。
本发明的又一目标为提供激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的方法。
本发明的再一目标为提供小激活核酸分子或包含其的组合物或制剂在制备用于治疗与ATOH1蛋白质缺乏或不足相关的疾病或状况如听力损失的药物中的应用或治疗与ATOH1蛋白质缺乏或不足相关的疾病或状况如听力损失的方法。
本发明的另一目标为提供分离的ATOH1基因小激活核酸分子靶位点，其中所述靶位点包括或选自SEQ ID NO：2-SEQ ID NO:5的任一条序列上的任意连续16-35个核苷酸的序列。
技术方案
在本发明的一个方面，提供了小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)分子，其激活或者上调细胞中ATOH1基因的表达，所述小激活核酸分子的一条链与ATOH1基因启动子区的任一长度为16-35个核苷酸的核酸序列具有至少75％的同源性或互补性，启动子区是指包括转录起始位点上游的637个核苷酸，从而实现所述基因表达的激活或者上调。具体地，小激 活核酸分子的一条链包括或选自与ATOH1基因启动子中距转录起始位点的-578至-386区域(热点1，SEQ ID NO:2)、-339至-291区域(热点2,SEQ ID NO:3)、-162至-86区域(热点3,SEQ ID NO:4)或-55至-34区域(热点4,SEQ ID NO:5)中的连续16-35个核苷酸具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％的同源性或互补性的核酸序列。更具体地，本发明的小激活核酸分子的一条链与选自SEQ ID NO：280-416的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性。在一个具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链包括与选自SEQ ID NO：280-416的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链由与选自SEQ ID NO：280-416的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性的核酸序列组成。在还一实施方式中，本发明的小激活核酸分子的一条链是与选自SEQ ID NO:280-416的任一核苷酸序列具有至少75％、例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性的核酸序列。
本发明的小激活核酸分子包括靶向ATOH1基因启动子区的双链小激活核酸分子，包含第一核酸链和第二核酸链，第一核酸链与ATOH1基因启动子中距转录起始位点-578至-386区域(热点1，SEQ ID NO:2)、-339至-291区域(热点2,SEQ ID NO:3)、-162至-86(热点3,SEQ ID NO:4)或-55至-34(热点4,SEQ ID NO:5)的任一连续16-35个核苷酸具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同源性或互补性，第一核酸链和第二核酸链能通过互补形成双链核酸结构，双链核酸结构能够激活ATOH1基因在细胞中的表达。
本发明的小激活核酸的第一核酸链和第二核酸链可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当第一核酸链和第二核酸链分别位于两条链上时，小激活核酸分子的至少一条链可以在5’端和/或3’端具有突出或悬垂，例如在3’端可以具有0-6个核苷酸的突出，如，0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出。优选地，本发明的小激活核酸分子的两条链都具有突出，更优选地，小激活核酸分子的两条链的3’端均可以具有0-6个核苷酸的突出，例如，具有0、1、2、3、4、5或6个核苷酸的突出，最优选地，具有2个或3个核苷酸的突出。优选地，突出端的核苷酸可以是dT。
本发明的小激活核酸分子也可以包括可形成双链区发夹结构的小激活核酸分子，例如单链小激活RNA分子。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子包括靶向ATOH1基因启动子区的单链小激活RNA分子，其中所述单链小激活核酸分子可形成双链区发夹结构。当第一核酸链和第二核酸链存在于同一条核酸链上时，优选地，本发明的小激活核酸分子可以为发夹型单链核酸分子，其中第一核酸链和第二核酸链具有能形成双链核酸结构的互补区域，所述双链核酸结构可以通过例如RNA激活机制促进ATOH1基因在细胞中的表达。
上述小激活核酸分子中，第一核酸链和第二核酸链的长度可以分别为16-35个核苷酸，例如，可以为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34或35个核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的第一核酸链与选自SEQ ID NO：6-142中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性，并且小激活核酸分子的第二核酸链与选自SEQ ID NO：143-279中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子的第一核酸链包括与选自SEQ ID NO：6-142中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的核酸序列，或者由与选自SEQ ID NO：6-142中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的核酸序列组成，并且本发明的小激活核酸分子的第二核酸链包括与选自SEQ ID NO：143-279中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的核酸序列，或者由与选自SEQ ID NO：143-279中的任一核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的同一性或同源性的核酸序列组成。在具体的实施方式中，本发明的小激活核酸分子的第一核酸链可以包括或选自SEQ ID NO：6-142的任一核苷酸序列，并且其第二链可以包括或选自SEQ ID NO：143-279的任一核苷酸序列。在一个实施方式中，本文所述的小激活核酸分子可以是合成的、体外转录的或者载体表达的。
本文所述小激活核酸分子中所有的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以包括至少一种修饰。在一个实施方式中，本文所述的小激活核酸分子中的修饰可以包括化学修饰，如在至少一个核苷酸可以具有化学修饰，本发明使用的化学修饰可以包括或选自如下修饰中的一种或多种，或其任意组合：
(1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；
(3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰；
(4)所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。
所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括但不限于，硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都能稳定saRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，包括但不限于，2’-氟代修饰、2’-氧甲基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰等。
碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，包括但不限于，5′-溴尿嘧啶修饰、5′-碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、2,6－二氨基嘌呤修饰等。
这些修饰可以增加小激活核酸分子的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。
此外，为了促进小激活核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小激活核酸分子的第一核酸链和/或第二核酸链的末端引入例如胆固醇等亲脂性基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜及核膜与细胞核内的基因启动子区发生作用。
本发明提供的小激活核酸分子在与细胞接触后可有效激活或上调细胞中ATOH1基因的表达，优选情况下表达至少上调10％。
本发明的另一方面还涉及编码本文所述的小激活核酸分子的核酸。在一个实施方式中，所述核酸可以是DNA分子。
在本发明的另一方面，提供了包含上文所述的小激活核酸分子或编码本文所述的小激活核酸分子的核酸的细胞。在一个实施方式中，本发明的小激活核酸分子可以是靶向ATOH1基因启动子区的双链小激活核酸分子，其包括第一核酸链和第二核酸链。在另一实施方式中，本发明的小激活核酸分子可以是靶向ATOH1基因启动子区的单链小激活核酸分子。
本发明的另一方面提供了组合物(例如药物组合物)，该组合物包含本发明所述的小激活核酸分子或编码本文所述的小激活核酸分子的核酸和任选地，药学上可接受的载体。在一个实施方式中，所述药学上可接受的载体可以包括或选自脂质体、高分子聚合物或多肽。
在本发明的另一方面，提供了制剂，该制剂包括：本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明所述的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物。
在本发明的另一方面，提供了试剂盒，所述试剂盒包括：本发明的小激活核酸分子、编码本文所述的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物。
本发明的另一方面涉及本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物在制备用于激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的药物或制剂中的应用。
本发明的另一方面还涉及激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物或制剂。在一个实施方式中，激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的方法包括给所述细胞施用本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物，其中所述细胞包括但不限于，癌细胞、神经细胞如脊髓细胞、内耳毛细胞、内耳支持细胞、小脑神经元、本体感受系统神经元，以及非神经细胞等。在一个实施方式中，癌细胞可以是来自实体瘤，例如肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤等的细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。
本发明的小激活核酸分子可以被直接导入细胞中，也可以是将编码本发明的小激活核酸分子的核酸序列导入细胞后在细胞内产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞系或细胞株等，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。 该人体可以是具有与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的患者。本发明所述的小激活核酸分子可以被施以足够的量以实现对与ATOH1蛋白量的缺乏或与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的治疗。具体情况下，所述与ATOH1蛋白量的缺乏或与ATOH1表达不足或减少相关的疾病或状况可以包括例如肿瘤，如实体瘤，所述实体瘤可以包括例如肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神经胶质瘤等。
本发明另一方面提供了分离的ATOH1基因小激活核酸分子作用位点，该位点具有ATOH1基因的启动子区上任意连续的16-35个核苷酸的序列，优选情况下，所述作用位点包括或选自SEQ ID NO：2-5的任一条序列上的任意连续16-35个核苷酸的序列。具体地，所述作用位点可以包括或选自SEQ ID NO：280-416中的任一核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及治疗个体中与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的本发明的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物。在一个实施方式中，本发明的治疗个体中与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的方法包括给个体施用治疗有效量的本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物和治疗有效量的小分子化合物、抗体、多肽、蛋白等。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在一个实施方案中，与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况可以包括例如听力损失,肿瘤疾病，如结直肠癌。
本发明的另一方面涉及治疗个体的听力损失的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的本发明的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物或制剂。在一个实施方式中，本发明的治疗个体中听力损失的方法包括给个体施用治疗有效量的本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物和治疗有效量的小分子化合物、抗体、多肽、蛋白等。所述个体可以是哺乳动物，例如人。听力损失或者听觉障碍是指听力的部分或者完全丧失，对日常说话有较低的敏感度。1997年，世界卫生组织(WHO)颁布标准，根据在500Hz、1000Hz、2000Hz和4000Hz四个频率点的平均听力损失，将听觉受损的严重程度分成4个等级：26～40dB为轻度，41～60dB为中度，61～80dB为重度，大于80dB为极重度。
本发明的另一方面涉及本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物在制备用于治疗与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的药物中的应用。所述个体可以是哺乳动物，例如人。在一个实施方案中，所述与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病可以包括例如听力损失，肿瘤疾病，如结直肠癌等。
在一个实施方式中，提供了本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分 子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物在制备用于治疗听力损失的药物中的应用。
本发明的另一方面涉及本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物或制剂在制备用于治疗与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的药物或药物组合中的应用。
在一个实施方式中，提供了本发明所述的小激活核酸分子、编码本发明的小激活核酸分子的核酸、包含本发明的小激活核酸分子或编码本发明的小激活核酸分子的核酸的细胞、或包含本发明的小激活核酸分子的组合物或制剂在制备用于治疗听力损失的药物或药物组合中的应用。
本发明的有益效果
本发明提供的能够激活/上调ATOH1基因表达的小激活核酸分子例如小激活RNA(saRNA)，能够持久地激活ATOH1基因，因而高效、特异地上调或恢复ATOH1基因和蛋白的表达并同时具有较低的毒副作用，可用于治疗与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或病症例如听力损失或者制备用于治疗与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或病症的药物或制剂。
附图说明
图1为saRNA介导的ATOH1 mRNA表达改变示意图。靶向ATOH1启动子的403个saRNA分别转染HEK293T细胞，72小时后用QuantiGene 2.0方法分析ATOH1 mRNA表达。图示为相对于对照处理(mock)的ATOH1 mRNA表达改变，按照saRNA在ATOH1启动子靶点位置-637到-19排序。
图2为功能性saRNA在ATOH1启动子上的热点区域示意图。靶向ATOH1启动子的403个saRNA分别转染HEK293T细胞，72小时后用QuantiGene 2.0方法分析ATOH1 mRNA表达。图示为相对于对照处理(mock)的ATOH1 mRNA表达改变，按照saRNA在ATOH1启动子上的靶点位置从-637到-19排序。图中虚线为0.5(log2)倍增加的界限，虚线条框示出4个功能性saRNA聚集的热点区(H1～H4)。
图3为在HEK293T细胞中使用二步法RT-PCR验证Quantigene筛选结果示意图。分别用所示saRNA以10 nM终浓度转染HEK293T细胞72小时，用Qiagen Rneasy试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统进行qPCR扩增。同时扩增HPRT1基因作为内参。图示为单独的saRNA处理的细胞的ATOH1相对mRNA表达值。Mock、dsCon2和RAG9-871i分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。
图4为在NKEK细胞中使用二步法RT-PCR验证Quantigene筛选结果示意图。分别用所示saRNA以10 nM终浓度转染NHEK(正常人表皮角质细胞)细胞72小时，用Qiagen Rneasy试剂盒提取RNA，反转录后用7500FAST实时PCR系统进行qPCR扩增。同时扩增HPRT1基因作为内参。图示为单独的saRNA处理的细胞的ATOH1相对mRNA表达值。Mock、dsCon2和RAG9-871i 分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。
图5为ATOH1 saRNA激活ATOH1蛋白表达结果示意图。分别用所示saRNA以10 nM终浓度转染HEK293T细胞72小时，收集细胞并提取细胞总蛋白后用蛋白质印迹法检测ATOH1蛋白表达水平，同时检测α/β-微管蛋白作为内参。图示为单独的saRNA处理的细胞的ATOH1相对蛋白表达值。Mock、dsCon2和RAG9-871i分别为空白转染、无关序列双链RNA转染及小干扰RNA对照转染。
具体实施方式
在本发明中，相关术语采用如下定义：
如本文所用的术语“互补”是指两条寡核苷酸链彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的寡核苷酸链中的核苷酸之间通过氢键形成。互补寡核苷酸链可以沃森-克里克(Watson-Crick)方式碱基配对(例如，A-T，A-U，C-G)，或以允许形成双链体的任何其他方式(例如Hoogsteen型或者反向Hoogsteen型碱基配对)进行碱基配对。
互补包括完全互补和不完全互补两种情况。完全互补或100％互补是指双链寡核苷酸分子的双链区中来自第一条寡核苷酸链的每个核苷酸可以与第二条寡核苷酸链相应位置的核苷酸形成氢键而没有“错配”的情况。不完全互补是指两条链的核苷酸单元不能全部互相氢键结合的情况。例如，对于两条双链区为20个核苷酸长度的寡核苷酸链，如果每条链上只有两个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出10％的互补性。在同一实例中，如果每条链上的18个碱基对可以彼此氢键结合，则寡核苷酸链展现出90％的互补性。实质互补是指至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约100％的互补。
如本文所用的术语“寡核苷酸”是指核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA，RNA或DNA/RNA杂交体的单链或双链分子，包括规则地和不规则地交替的脱氧核糖基部分和核糖基部分的寡核苷酸链，以及这些种类的寡核苷酸的修饰和以及天然存在的或非天然存在的骨架。本发明中所述的用于激活靶基因转录的寡核苷酸为小激活核酸分子。
如本文所用的术语“寡核苷酸链”和“寡核苷酸序列”可互换地使用，是指35个以下碱基的短链核苷酸的总称(包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸)。在本发明中，寡核苷酸链的长度可以是16至35个核苷酸的任一长度。
如本文所用，术语“第一核酸链”可以是正义链也可以是反义链，小激活RNA的正义链是指小激活RNA双链体中含与靶基因的启动子DNA序列的编码链具有同一性的核酸链，反义链是指小激活RNA双链体中与正义链互补的核酸链。
如本文所用，术语“第二核酸链”也可以是正义链或者反义链。当第一寡核酸链为正义链时，第二寡核酸链为反义链，当第一寡核酸链为反义链时，第二寡核酸链为正义链。
如本文所用的术语“基因”是指编码一条多肽链或转录一条功能RNA所需的全部核苷酸序列。“基因”可以是对于宿主细胞而言内源的或完全或部分重组的基因(例如，由于引入编码启动子的外源寡核苷酸和编码序列或将邻近内源编码序列的异源启动子导入宿主细胞)。例如，术语“基因”包括可以由外显子和内含子组成的核酸序列。编码蛋白质的序列是，例如， 包含在起始密码子和终止密码子之间的开放阅读框中的外显子内的序列，如本文所用，“基因”可以指包括例如基因调控序列例如启动子，增强子和本领域已知的控制另一基因的转录，表达或活性的所有其他序列，无论另一基因是否包含编码序列或非编码序列。在一种情况下，例如，“基因”可以用于描述包含调控序列例如启动子或增强子的功能性核酸。重组基因的表达可以通过一种或多种异源调节序列来控制。
如本文所用的术语“靶基因”可以是天然存在于生物体中的核酸序列、转基因、病毒或细菌序列、染色体或染色体外和/或瞬时或稳定转染或掺入细胞和/或其染色质。靶基因可以为蛋白质编码基因，也可为非蛋白质编码基因(例如微小RNA基因、长链非编码RNA基因)。靶基因通常含有启动子序列，设计与启动子序列具有同一性(也称同源性)的小激活核酸分子可以实现对靶基因的正向调控，表现为靶基因表达的上调。“靶基因启动子序列”是指靶基因的非编码序列，在本发明中涉及“与靶基因启动子序列互补”中靶基因启动子序列是指该序列的编码链，亦称非模板链，即为与该基因编码序列为同一序列的核酸序列。“靶点”或“靶点序列”是指靶基因启动子序列中小激活核酸分子的正义寡核苷酸链或反义寡核苷酸与之同源或互补的序列片段。
如本文所用，术语“正义链”、“正义核酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的正义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中含与靶基因的启动子序列的编码链具有同一性的第一核酸链。
如本文所用，术语“反义链”、“反义核酸链”可互换地使用，小激活核酸分子的反义寡核苷酸链是指小激活核酸分子双链体中与正义寡核苷酸链互补的第二核酸链。
如本文所用的术语“编码链”是指靶基因中不能进行转录的那一条DNA链，该链的核苷酸序列与转录生成的RNA的序列一致(在RNA中是以U取代了DNA中的T)。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的编码链是指与靶基因DNA编码链在同一条DNA链上的启动子序列。
如本文所用的术语“模板链”是指靶基因的双链DNA中与编码链互补的另一条链，可作为模板转录为RNA的那条链，该链与转录的RNA碱基互补(A-U，G-C)。在转录过程中，RNA聚合酶与模板链结合，并沿着模板链的3'→5'方向移动，按照5'→3'方向催化RNA的合成。本发明中所述的靶基因启动子双链DNA序列的模板链是指与靶基因DNA模板链在同一条DNA链上的启动子序列。
如本文所用的术语“启动子”是指通过与蛋白质编码或RNA编码核酸序列在位置上关联而对它们的转录发挥调控作用的序列。通常，真核基因启动子包含100～5,000个碱基对，尽管此长度范围并不意味着限制本文所用的术语“启动子”。虽然启动子序列一般位于蛋白质编码或者RNA编码序列的5'端，但启动子序列也可存在于外显子及内含子序列中。
如本文所用的术语“转录起始位点”是指在基因的模板链上标志转录起始的核苷酸。转录起始位点可出现于启动子区的模板链上。一个基因可以有多于一个的转录起始位点。
如本文所用的术语“同一性”或“同源性”是指小激活RNA的其中一条寡核苷酸链(正义链或者反义链)与靶基因的启动子序列的某一区域的编码链或者模板链存在的相似性。在 本文中，所述“同一性”或“同源性”可以是至少约75％、约79％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。
如本文所用的术语“突出”、“overhang”、“悬垂”可互换地使用，是指寡核苷酸链末端(5'或3')非碱基配对核苷酸，其是由延伸超出双链寡核苷酸内的其中一条链的另一条链产生的。延伸超出双链体3'和/或5'端的单链区域被称为突出。
如本文所用，术语“基因激活”或“激活基因”或“基因上调”或“上调基因”可互换地使用，是指通过测量基因转录水平、mRNA水平、蛋白水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平、或其在细胞或生物系统中的活性或状态来测定某一核酸转录、翻译或表达或活性的增加。这些活动或状态可以直接或间接的测定。此外，“基因激活”、“激活基因”、“基因上调”、“上调基因”是指与核酸序列相关的活性增加，而不管发生这种激活的机制如何，例如其作为调节序列发挥调控作用、被转录成RNA，被翻译为蛋白质并增加蛋白质的表达。
如本文所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”、“小激活核酸分子”可互换地使用，是指能够促进基因表达的核酸分子，并且可以由包含与靶基因的非编码核酸序列(例如启动子、增强子等)具有序列同一性或同源性的核苷酸序列的第一核酸片段(反义核酸链，也称反义寡核苷酸链)和包含与第一核酸片段互补的核苷酸序列的第二核酸片段(正义核酸链，也称有义链或正义寡核苷酸链)组成，其中所述第一核酸片段和第二核酸片段形成双链体。小激活核酸分子也可以由合成的或者载体表达的可形成双链区发夹结构的单链RNA分子组成，其中第一区域包含与基因的启动子靶序列具有序列同一性的核苷酸序列，第二区域包含的核苷酸序列与第一区域互补。小激活核酸分子的双链体区域长度通常为约10至约50个碱基对、约12个至约48个碱基对、约14个至约46个碱基对、约16个至约44个碱基对、约18个至约42个碱基对、约20个至约40个碱基对、约22个至约38个碱基对、约24个至约36个碱基对、约26个至约34个碱基对、约28个至约32个碱基对、通常约10个、约15个、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，术语“saRNA”、“小激活RNA”和“小激活核酸分子”还含有除核糖核苷酸部分之外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。
如本文所用，术语“热点”是指长度至少为30 bp的基因启动子区域，在这些区域，呈现出功能性小激活核酸分子靶点的聚集，即靶向这些热点区域的小激活核酸分子至少40％能够诱导靶基因mRNA表达达到1.1倍或以上。
如本文所用，术语“合成”是指寡核苷酸的合成方式，包括任何能够合成RNA的方式，例如化学合成、体外转录、载体表达等。
本发明通过RNA激活方式上调ATOH1基因的表达，通过增加全长ATOH1蛋白的表达量来治疗相关疾病，尤其是听力损失。本发明中ATOH1基因有时也称为靶基因。
本发明提供的小激活核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。
本发明的小激活核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成。
一般来说，化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐及退火。
例如，本发明所述saRNA化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成
在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定合成1微摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第n次(19≥n≥2)循环中，在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护
将连接有saRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/氨水溶液(体积比为1：3)，然后密封，置于25-70℃温箱中，孵育2-30小时，过滤含有saRNA的固相支持物的溶液并收集滤液，用双蒸水淋洗固相支持物2次(每次1毫升)并收集滤液，合并收集洗脱液，在真空条件下干燥1-12小时。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升正丁醇，高速离心收集沉淀即得到saRNA单链的粗产物。
(3)纯化分离
将得到的saRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/升的三乙胺乙酸盐溶液中，然后通过高压液相色谱反相C18柱进行分离，得到纯化的saRNA单链产物。
(4)脱盐及退火
用体积排阻凝胶过滤法去除盐份，将正义链和反义链的寡聚核糖核酸单链按相同摩尔比混合在1-2毫升的缓冲液中(10 mM Tris，pH＝7.5-8.0，50 mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，得到含有saRNA的溶液。
本研究发现，将上述saRNA导入细胞后，能够有效增加全长ATOH1 mRNA和蛋白质的表达。
下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1靶向ATOH1启动子的小激活核酸分子的设计与合成
以ATOH1启动子从-637bp到-1 bp的637bp的序列(SEQ ID No:1)为靶序列,以19个核苷酸为saRNA靶点，每次移动一个碱基得到下一个靶点。对所有靶点序列进行过滤处理，保留靶点序列的标准为：：1)GC含量在30％～80％之间；2)不含有5个或者多于5个的连续同一核苷酸；3)不含多于3个的二核苷酸重复序列；4)不含多于3个的三核苷酸重复序列。过滤后，剩余402个靶点序列作为候选进入筛选过程。另外选取ATOH1启动子-1407bp位置的一 个靶点作为候选靶点序列，总共有403个靶点序列作为候选进入筛选过程。
其中，实验中使用的双链小激活RNA的正义链和反义链的长度均为21个核苷酸，所述双链saRNA的第一核酸链(正义链)的5’区域的19个核苷酸与启动子靶点序列具有100％的同一性，其3’末端含有TT序列；第二核酸链的5’区域的19个核苷酸与第一核糖核酸链序列完全互补，其3’末端含有TT序列。将前述双链saRNA的两条链以同等量的摩尔数混合，退火后形成双链saRNA。
ATOH1启动子序列如下所示，其对应于序列表中SEQ ID No:1从5’至3’的位置1至位置637：
Figure PCTCN2020100093-appb-000001
实施例2靶向ATOH1启动子的saRNA的高通量筛选
(1)细胞培养和转染
正常人表皮角质细胞(NHEK)、人肾胚胎细胞(HEK293T)培养在DMEM培养基(Gibco)中。所有培养基含有10％小牛血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素/链霉素(Gibco)。细胞在5％CO 2，37℃条件下培养。依照制造商的说明，使用RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad,CA)以10 nM(除非另有说明)浓度转染小激活RNA。
(2)QuantiGene 2.0分析
将细胞以4000个细胞/孔铺板于96孔板中并转染寡核苷酸双链体，转染72小时后，使用QuantiGene 2.0试剂盒(AffyMetrix产品号为QGS-1000，ATOH1 Assay ID：SA-6000952；HPRT Assay ID：SA-10030)定量检测目的基因mRNA水平。QuantiGene 2.0 试剂盒是基于杂交技术的方法，使用基因特异性探针直接定量mRNA水平。实验步骤简述如下：添加裂解液以裂解转染后的细胞，细胞裂解物加样至包被有ATOH1和HPRT1(管家基因)探针的捕获孔板中，55℃杂交过夜。为了增强杂交信号，在100μL相应的缓冲液(Quantigene 2.0试剂盒提供)中顺次与2.0 PreAMP，2.0 AMP和2.0标记探针(Lable Probe，Quantigene 2.0试剂盒提供)杂交。所有杂交均在50–55℃震荡1小时。最后一步洗涤后，加入2.0底物并在室温下孵育5分钟。然后使用Infinite 200 PRO读板仪(Tecan，瑞士)检测光信号。
(3)功能性saRNA筛选
为了获得能够激活ATOH1转录的功能性saRNA，用上述403个saRNA分别转染HEK293T细胞，转染浓度为10 nM，72小时后以QuantiGene所述的方法分析光信号。如表1所示，分别有32(7.9％)和105(26.1％)个saRNA显示出高度激活和轻度激活活性，266(66.0％)的saRNA对ATOH1的表达不产生影响。激活的最大幅度为5.88倍。这些具有激活活性的saRNA被称为功能性saRNA。
表1.ATOH1高通量筛选结果统计
saRNA活性分类 ATOH1改变幅度的log2值(倍数) saRNA数量 百分比
高度激活 ≥1.00(2.00)～≤2.557(5.883) 32 7.9％
轻度激活 ≥0.14(1.10)～<1.00(2.00) 105 26.1％
无激活作用 <0.14(1.10) 266 66.0％
总计   403 100％
图1进一步显示了ATOH1 saRNA从高度激活到高度抑制的活性分布。
Figure PCTCN2020100093-appb-000002
Figure PCTCN2020100093-appb-000003
Figure PCTCN2020100093-appb-000004
Figure PCTCN2020100093-appb-000005
Figure PCTCN2020100093-appb-000006
Figure PCTCN2020100093-appb-000007
Figure PCTCN2020100093-appb-000008
Figure PCTCN2020100093-appb-000009
Figure PCTCN2020100093-appb-000010
Figure PCTCN2020100093-appb-000011
Figure PCTCN2020100093-appb-000012
Figure PCTCN2020100093-appb-000013
Figure PCTCN2020100093-appb-000014
Figure PCTCN2020100093-appb-000015
对403个saRNA的活性按照其在ATOH1启动子上的位置排列，很明确地看到功能性saRNA的分布呈现聚集现象，即在某些启动子区域，激活性saRNA聚集在特定的“热点(hot spot)”区域(图2)。如图2所示，在启动子的-578/-386区域(H1)、-339/-291区域(H2)、-162/-86(H3)和-55/-34(H4)分别出现4个热点区域，表现为激活性saRNA的高度聚集，功能性saRNA的比例分别为41.0％、51.6％、45.6％和100％。该分析结果表明，功能性saRNA在启动子上并非随机分布，而是存在特定的热点区域。
热点H1(5’至3’：-578至-386)序列，其对应于序列表中SEQ ID NO:2所示序列：
Figure PCTCN2020100093-appb-000016
热点H2(5’至3’：-339至-291)序列，其对应于序列表中SEQ ID NO:3所示序列：
Figure PCTCN2020100093-appb-000017
热点H3(5’至3’：-162至-86)序列，其对应于序列表中SEQ ID NO:4所示序列：
Figure PCTCN2020100093-appb-000018
热点H4(5’至3’：-55至-34)序列，其对应于序列表中SEQ ID NO:5所示序列：
Figure PCTCN2020100093-appb-000019
实施例3高通量筛选结果验证
正常人表皮角质细胞(NHEK)和人肾胚胎细胞(HEK293T)分别以2×10 5至3×10 5个细胞/孔接种在6孔板中，反向转染寡核苷酸双链体。使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)，按照其说明书提取细胞总RNA。使用含有gDNA Eraser(Takara，Shlga，日本)的PrimeScript RT试剂盒将RNA(1μg)反转录为cDNA。qPCR采用ABI 7500 Fast实时PCR系统(Applied Biosystems)和SYBR Premix Ex Taq II(Takara，Shlga，日本)试剂，反应条件为：95℃3秒，60℃30秒，扩增40个循环。以HPRT1为内参，RAG9-871i为抑制性dsRNA，作为对照。用2 -ΔΔCT方法计算获得ATOH1基因的相表达值。所用引物序列列于表3中。
为了计算某个saRNA转染样本的ATOH1(目的基因)的相对于对照处理(mock)的表达值(E rel)，用公式1代入目的基因及内参基因的Ct值计算。
E rel＝2 (CtTm-CtTs)/2 (CtRm-CtRs)     (公式1)
其中，CtTm为来自mock样本的目的基因的Ct值，CtTs为来自saRNA处理样本的目的基因的Ct值，CtRm为来自mock处理样本的内参基因的Ct值，CtRs为来自saRNA处理样本的内参基因的Ct值。
表3.二步法qRT-PCR分析的引物序列
Figure PCTCN2020100093-appb-000020
Figure PCTCN2020100093-appb-000021
如图3和图4所示，随机选取功能性saRNA在HEK293T细胞和NHEK细胞中进行验证，结果表明它们均对ATOH1的mRNA表达有上调作用。
表4.作为实验对照的双链RNA序列
Figure PCTCN2020100093-appb-000022
实施例4 saRNA促进ATOH1蛋白表达
将HEK293T细胞以3×10 3至5×10 3个细胞/孔铺板于96孔板中，培养过夜，转染7个随机选择的功能性saRNA。转染72小时后收集细胞，使用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(1×RIPA缓冲液,CST)裂解。BCA法(Thermo)进行蛋白质定量，随后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转至0.45μm的PVDF膜所用一抗为：兔单克隆抗ATOH1(Abcam)和抗α/β-微管蛋白抗体(Cell Signaling Technology)对印迹进行检测；二抗用抗兔IgG,HRP-连接的抗体(Cell Signaling Technology)。采用Image Lab(BIO-RAD,Chemistry Doctm MP成像系统)收集信号。
采用Image Lab(BIO-RAD,Chemistry Doctm MP成像系统)扫描检测信号。
如图5所示，这7个随机选择的激活性saRNA能够促进或增加ATOH1蛋白表达。
综合上述结果，申请人通过高通量筛选靶向ATOH1基因启动子的saRNA，发现了多个能够显著激活ATOH1基因表达的saRNA。这些saRNA能够在mRNA和蛋白表达层面上调ATOH1基因的表达，可用于ATOH1蛋白表达下降或者不足引发的疾病或病症，或用于制备治疗上述疾病或病症的方法或药物。
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Claims (46)

  1. 小激活核酸分子，包含第一核酸链和第二核酸链，其中第一核酸链与ATOH1基因启动子中距转录起始位点-578至-386区域(SEQ ID NO:2)、-339至-291区域(SEQ ID NO:3)、-162至-86区域(SEQ ID NO:4)或-55至-34区域(SEQ ID NO:5)中的任一连续16-35个核苷酸具有至少75％的同源性或互补性，所述第一核酸链和所述第二核酸链能通过互补形成双链核酸结构，所述双链核酸结构能够激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达。
  2. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链存在于两条不同的核酸链上。
  3. 根据权利要求1所述的小激活核酸分子，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链存在于同一条核酸链上，优选地，所述小激活核酸分子为发夹型单链核酸分子，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链包含形成双链核酸结构的互补区域。
  4. 根据权利要求2所述的小激活核酸分子，其特征在于所述小激活核酸分子的至少一条链在3’端具有0至6个核苷酸的突出。
  5. 根据权利要求4所述的小激活核酸分子，其特征在于所述小激活核酸分子的两条链在3’端都具有0至6个核苷酸的突出，优选地具有2个或3个核苷酸的突出。
  6. 根据权利要求1-5任一项所述的小激活核酸分子，其特征在于所述第一核酸链和所述第二核酸链的长度分别为16至35个核苷酸。
  7. 根据权利要求1-6任一项所述的小激活核酸分子，其特征在于所述小激活核酸分子的一条链包括与选自SEQ ID NO:280-416中的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性或互补性的核酸序列，或由与选自SEQ ID NO:SEQ ID NO:280-416中的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性或互补性的核酸序列组成。
  8. 根据权利要求1-7所述的小激活核酸分子，其特征在于所述第一核酸链与选自SEQ ID NO:6-142的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性，并且所述第二核酸链与选自SEQ ID NO:143-279的任一核苷酸序列具有至少75％的同源性。
  9. 权利要求1-8所述的小激活核酸分子，其特征在于所述第一核酸链包括选自SEQ ID NO:6-142的任一核苷酸序列或由选自SEQ ID NO:6-142的任一核苷酸序列组成，并且所述第二核酸链包括选自SEQ ID NO:143-279的任一核苷酸序列或由选自SEQ ID NO:143-279的任一核苷酸序列组成。
  10. 根据权利要求1-9任一项所述的小激活核酸分子，其中所述小激活核酸分子包括至少一个修饰，优选地，所述修饰为化学修饰。
  11. 根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰包括或选自如下修饰中的 一种或多种：
    (1)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
    (2)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；
    (3)对所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰；
    (4)所述小激活核酸分子的核苷酸序列中的至少一个核苷酸为锁核酸。
  12. 根据权利要求10所述的小激活核酸分子，其中所述化学修饰包括或选自如下修饰中的一种或多种：2’-氟代修饰、2’-氧甲基修饰、2’-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4’-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2’-氨基修饰、2’-脱氧修饰、5′-溴尿嘧啶修饰、5′-碘尿嘧啶修饰、N-甲基脲嘧啶修饰、2,6－二氨基嘌呤修饰、硫代磷酸修饰和硼烷化磷酸盐修饰。
  13. 权利要求1-12任一项所述的小激活核酸分子，其激活/上调ATOH1基因表达至少10％。
  14. 编码权利要求1-9任一项所述的小激活核酸分子的核酸。
  15. 权利要求14所述的核酸，其中所述核酸是DNA分子。
  16. 包含权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子或权利要求14或15所述的核酸的细胞。
  17. 包含权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸或权利要求16所述的细胞，和任选地药学上可接受的载体的组合物。
  18. 权利要求17所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体包括或选自脂质体、高分子聚合物或多肽。
  19. 试剂盒，其包含权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16所述的细胞或权利要求17-18中任一项所述的组合物。
  20. 权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸或权利要求17-18任一项所述的组合物在制备用于在细胞中激活/上调ATOH1基因表达的制剂中的应用。
  21. 根据权利要求20所述的应用，其中所述小激活核酸分子被直接导入所述细胞中。
  22. 根据权利要求20所述的应用，其中所述小激活核酸分子是在编码该小激活核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内产生的。
  23. 根据权利要求20-22的任一项所述的应用，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
  24. 根据权利要求20所述的应用，其中所述细胞是人类细胞。
  25. 根据权利要求24所述的应用，其中所述细胞存在于人体中。
  26. 根据权利要求25所述的应用，其中所述人体是患有与ATOH1蛋白表达不足或减少相关 的疾病或状况的患者，并且所述小激活核酸分子被施用足够的量以实现对所述疾病或状况的治疗。
  27. 根据权利要求26所述的应用，其中所述与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况包括听力损失和肿瘤。
  28. 分离的ATOH1基因小激活核酸分子靶位点，其中所述靶位点包括或选自SEQ ID NO:2-5的任一条序列上的任意连续16-35个核苷酸序列。
  29. 根据权利要求28所述的小激活核酸分子靶位点，其中所述靶位点包括或选自SEQ ID NO:280-416中所示的任一核苷酸序列。
  30. 激活/上调ATOH1基因在细胞中的表达的方法，该方法包括给所述细胞施用权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸或权利要求17-18中任一项所述的组合物。
  31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述小激活核酸分子被直接导入所述细胞中。
  32. 根据权利要求30所述的方法，其中所述小激活核酸分子是在编码所述小激活核酸分子的所述核酸导入所述细胞后在细胞内产生的。
  33. 根据权利要求30-32任一项所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
  34. 根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞是人类细胞。
  35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述细胞存在于人体中。
  36. 根据权利要求35所述的方法，其中所述人体是患有与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的患者，并且所述小激活核酸分子被施用足够的量以实现对所述疾病或状况的治疗。
  37. 根据权利要求35所述的方法，其中所述与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况包括听力损失和肿瘤。
  38. 治疗个体中与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的方法，包括给所述个体施用治疗有效量的权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16所述的细胞或权利要求17-18任一项所述的组合物。
  39. 权利要求38的方法，其中所述与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况包括听力损失和肿瘤。
  40. 权利要求38或39所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。
  41. 权利要求38所述的方法，其中所述个体是人。
  42. 权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸、权利要 求16所述的细胞或权利要求17-18任一项所述的组合物在制备用于治疗与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况的药物中的应用。
  43. 权利要求42所述的应用，其中所述与ATOH1蛋白表达不足或减少相关的疾病或状况包括听力损失和肿瘤。
  44. 权利要求1-13任一项所述的小激活核酸分子、权利要求14或15所述的核酸、权利要求16所述的细胞或权利要求17-18任一项所述的组合物在制备用于治疗由ATOH1蛋白表达不足引发的疾病的药物中的应用，所述疾病包括听力损失。
  45. 权利要求43-44任一项所述的应用，其中所述个体是哺乳动物。
  46. 权利要求43-44任一项所述的应用，其中所述个体是人。
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