CN103305540B - 一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法，属于生物技术技术领域。本发明提供一种用于生物学活性测定的质粒，该质粒的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；本发明还提供该质粒的制备方法及应用。通过本发明所述方法获得的细胞株对细胞因子敏感性能更高，并且对浓度有梯度依赖性，可以广泛应用于生物学活性测定过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法，属于生物技术技术领域。
背景技术
生物学活性评价是生物制品质量最客观、有效的指标，因此建立生物制品的生物学活性检测方法也成为质量研究的重点之一。目前，已报道的生物学活性测定方法主要是利用商业化的细胞株，其特点是细胞株的专一性不好，用于生物性活性测定时常常遇到样品对细胞株的依赖性较差或样品对细胞株的依赖性缺乏梯度等问题，给样品的生物学活性测定过程带来很多限制因素。而生物学活性是评价生物制品质量最重要的指标，因此，在质量研究过程中迫切需要一种能够稳定、专一的测定生物制品生物学活性的方法。
角化细胞生长因子(Keratinocye Growth Factor，简称KGF)属于成纤维细胞生长因子家族，特异性地与上皮细胞受体结合，刺激上皮细胞的增殖、分化以及迁移，在上皮细胞的增殖与损伤修复中发挥独特的功能。目前报道的KGF生物学活性的测定主要通过Balb/MK细胞的胸苷摄入试验其生物活性，其缺点是，细胞对KGF的刺激不敏感，容易影响对产品质量的判断，因此需要探索新的生物学活性测定方法。
血小板生成素(Thrombopoietin，简称TPO)及血小板生成素模拟肽(TPO-mimetide，简称TMP)作为一个造血细胞生长因子(hematopoietic growth factor，简称HGF)，与KGF和红细胞生成素(Erythropoietin，简称EPO)一样均属于生长因子(Growth Heromne，GH)亚家族成员，其生理功能的发挥主要是通过与靶细胞表面的血小板生成素受体C-Mpl结合实现的。C-mpl多肽序列全长有633个氨基酸，成熟的C-MPL由胞外区、穿膜区和胞内区组成。胞外区有两个受体结构域，远膜结构域在传递TPO的刺激信号中起重要作用，近膜结构域含有保守的WSXWS序列；穿膜区由22个氨基酸组成且多为疏水性氨基酸；胞内区由122个氨基酸组成，其中脯氨酸和丝氨酸含量分别占12％和11.5％，无典型的蛋白激酶结构，近膜处的Boxl和Box2在信号的传导中起重要作用，它们的丢失均可失去激活JAKs(Just anotherkinase或Janus kinase的简称)途径的功能，而切除C末端20个氨基酸则将失去Shc的磷酸化功能，后者为Ras途径的起始。
TPO及其类似物的生物学活性测定主要利用Mo7e(人巨细胞白血病细胞株)，该细胞是M-07细胞系的亚系，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colonystimulating factor，简称GM-CSF)、人干扰素α抗体(IFN-α)、人干扰素(IFN-ss)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素2(Interleukin-2，简称IL-2)、白介素3(Interleukin-3，简称IL-3)，白介素4(Interleukin-4，简称IL-4)、白介素6(Interleukin-6，简称IL-6)、白介素15(Interleukin-15，简称IL-15)、神经生长因子(Nervegrowthfactor，简称NGF)、TPO可促进细胞增殖。该细胞也可不依赖细胞因子生长，但生长缓慢，可用于测定多种细胞因子的活性，因此，在生物学活性测定过程中对细胞因子的依赖性较差，并且，实验室通过实验证明该细胞株在测定TPO及其类似物生物学活性时，细胞株对TPO及其类似物的不太敏感。同时也有UT-7、TD-3等细胞是通过对细胞进行药物适应性驯化筛选获得细胞株，但是经过驯化的细胞株在长期的测定过程中性状容易改变，影响实验结果。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于生物学活性测定的质粒及其制备方法，解决了生物制品质量分析过程中建立生物学活性测定方法的难题。
一种用于生物学活性测定的质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述用于生物学活性测定的质粒的制备方法，步骤如下：
(1)用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切的表达调控元件(EASE)，构建质粒pCIneo-ease；
(2)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-ease，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体结合位点序列(IRES)，构建质粒pCIneo-ease-IRES；
(3)用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切步骤(2)制得的质粒pCIneo-ease-IRES，插入经限制性内切酶XbaI和NotI双酶切的潮霉素(Hygromycin)基因片段，构建真核表达载体pCIneo-ease-IRES-Hygromycin，即得用于生物学活性测定的质粒。
一种生物学活性测定细胞，该细胞含有上述用于生物学活性测定的质粒。
上述生物学活性测定细胞的制备方法，步骤如下：
(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切用于生物学活性测定的质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的细胞因子受体表达基因(receptor)构建真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin；
(2)将步骤(1)制得的真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin以电击转化的方式导入到宿主细胞，得转化细胞；
(3)将步骤(2)制得的转化细胞以氨基糖苷类抗生素G418和潮霉素B进行筛选，获得细胞群体，再加入细胞因子进行筛选，获得表达受体M的细胞群体；
(4)将步骤(3)制得的细胞群体进行单克隆筛选，获得单克隆细胞株，即得。
所述步骤(1)中细胞因子受体表达基因是指细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11的受体表达基因。
所述步骤(2)中的电击转化，步骤如下：
收集处于对数生长期的宿主细胞；将生物学活性测定质粒加入到细胞悬液中，混合均匀，得细胞混合液；将细胞混合液加到电转杯中；在脉冲强度为100V-600V条件下电击7-20ms，即得。
所述步骤(2)中的生物学活性测定质粒的浓度为每百微升5-16μg。
所述步骤(2)中的宿主细胞为32D细胞株。32D细胞株为鼠骨髓细胞株，该细胞株系鼠源白介素3(Murine Interleukin-3，简称mIL-3)依赖性细胞株，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，培养方式是在含有血清的RPMI1640培养基中半贴壁半悬浮培养。
所述步骤(2)中的宿主细胞是经过预处理的宿主细胞，预处理过程如下：
将宿主细胞由液氮中取出，置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后离心，弃上清，用完全培养基重悬细胞，在体积百分比为5％CO2的培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培。
上述完全培养基，是向RPMI1640培养液中添加培养基总体积10％的FBS(灭活胎牛血清)，再加入mIL-3，使mIL-3的终浓度达到10μg/ml。
上述步骤(3)中，在加入细胞因子筛选前，还包括去除mIL-3的步骤。
所述步骤(3)中的细胞因子选自KGF、TPO、EPO或IL11。
所述步骤(4)中的单克隆筛选采用有限稀释法。
上述用于生物学活性测定的质粒、生物学活性测定细胞在检测生物制品中细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性中的应用。
生物学活性测定细胞在检测生物制品中细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性的步骤为：在加有标准品溶液和待测样品溶液的细胞培养板中加入细胞培养，然后加入MTT溶液培养；再加入裂解液混匀，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，比较结果即可。上述步骤中的条件均按本领域常规操作方法的条件。
本发明具有如下有益效果：
本发明所述用于生物学活性测定的质粒经转化宿主细胞后，可以针对不同的细胞因子制备相应的生物学活性测定细胞株，细胞专一性好，并且在后续的生物学活性测定中，细胞因子对细胞株的依赖性较好，而且对细胞因子的浓度呈现梯度依赖性，获得细胞株可用于多种生物制品的生物学活性测定过程，解决了采用常规细胞株在生物学活性测定过程中传代次数有限、实验特异性不高等缺点，能够在生物制品生产过程中用于药品的生物学活性检测。
附图说明
图1：实施例1的KGF生物学活性测定曲线；
图2：对照例1的KGF生物学活性测定曲线；
图3：实施例2的Fc-TMP生物学活性测定曲线；
图4：对照例2的Fc-TMP生物学活性测定曲线；
具体实施方式
在本下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的32D细胞株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，PCR引物合成和序列测定由博亚生物有限公司完成，T4连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶为Promaga公司产品，质粒提取试剂盒为北京博大泰克公司产品，DNA片段回收试剂盒为GE公司产品，载体pCI-neo购自Promega公司，EASE、IRES、Hygromycin基因由上海博亚公司合成，KGF受体表达基因、TPO及其类似物受体表达基因由上海生工合成。
所述重组人角质细胞生长因子(KGF)生物学活性测定标准品购自美国安进公司，血小板生成素(TPO)生物学活性测定标准品购自沈阳三生公司，Fc-TMP(中文名称：罗米斯亭)购自美国安进公司。
所述试剂如无特别说明，均为市售产品。实施例中采用的方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。
生物学活性测定采用常规的MTT比色法。
生物学活性按照以下公式计算：
式中Pr为标准品生物学活性，Unit/ml
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释度；
Er为标准品半效量的稀释度；
实施例1
试剂
1)RPMI1640培养液
取RPMI 1640培养基粉末一袋(规格为1L)，加超纯水溶解并稀释至1000ml，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后混匀，除菌过滤，4℃保存。
2)基础培养液 RPMI1640培养液，添加基础培养基总体积10％的FBS，再加入Heparin溶液使最终浓度为500ng/ml。
3)完全培养基 RPMI1640培养液，添加完全培养基总体积10％的FBS，再加入mIL-3，使mIL-3的终浓度为10μg/ml。
4)完全培养液 基础培养液中加入KGF因子，使KGF因子终浓度为100ng/ml。
5)筛选培养基 完全培养液中加入抗生素G418，使抗生素G418的终浓度为200ng/ml，再加入潮霉素B，使潮霉素B的终浓度为450ng/ml。
6)5.0mg/ml 噻唑蓝(MTT)溶液。
7)裂解液 国产AR级别DMSO。
8)生物学活性测定对照品及国际标准品和工作标准品：
KGF标准品溶液的制备
取重组人角质细胞生长因子(KGF)生物学活性测定标准品，按照说明书复溶后，用基础培养液将对照品稀释至每ml含KGF 1ug。
在96孔细胞培养板中，进行4倍系列稀释(首孔不稀释)，共做8个稀释度，每个稀释度做2个复孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
KGF供试品溶液的制备
将供试品复溶后，用基础培养液将对照品稀释至每ml含KGF 1μg。在96孔细胞培养板中，进行4倍系列稀释(首孔不稀释)，共做8个稀释度，每个稀释度做2个复孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。
1、KGF活性测定细胞的制备
用于生物学活性测定的质粒的制备方法，步骤如下：
(1)用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切的表达调控元件(EASE)，构建质粒pCIneo-ease；
(2)用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤(1)制得的质粒pCIneo-ease，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体结合位点序列(IRES)，构建质粒pCIneo-ease-IRES；
(3)用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切步骤(2)制得的质粒pCIneo-ease-IRES，插入经限制性内切酶XbaI和NotI双酶切的潮霉素(Hygromycin)基因片段，构建真核表达载体pCIneo-ease-IRES-Hygromycin，即得用于生物学活性测定的质粒。
上述用于生物学活性测定的质粒经测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
KGF测定细胞的制备方法，步骤如下：
(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切上述用于生物学活性测定的质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的KGF受体表达基因(KGFR)构建真核表达载体pCIneo-ease-KGFR-IRES-Hygromycin；经检测，序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)从液氮罐中取一支32D细胞株，迅速置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后1000rpm，5min离心，弃上清，用新鲜的完全培养基(RPMI1640培养基，含10％FBS，mIL-3)重悬细胞，并转到细胞培养瓶内培养，置于37℃，5％CO2培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培；然后，将获得的真核表达载体pCIneo-ease-KGFR-IRES-Hygromycin以电转化的方式导入到宿主细胞32D细胞株，具体方法如下：收集处于对数生长期的32D细胞株，调整细胞密度107cell/ml；将40μg质粒与400μl细胞悬液中，充分混合；将细胞混合液加到电转杯(4mm)中；电转杯在常温(或冰浴)10min；在电转仪上设置相关参数：电压400V，脉冲强度17ms，将电转杯放入电转池中，启动电穿孔装置；电击后，将电转杯在常温放置10min，然后，向电转杯中加入5ml预热的完全培养基，将细胞悬液以6×105cell的密度在T25培养瓶中，放入37度培养箱中；48小时后，加入G418进行筛选。
(3)将细胞用200ng/ml浓度G418和450ng/ml的潮霉素筛选，细胞经过2周时间恢复，获得细胞群体；细胞群体在T25瓶以1×106cell细胞密度接种，在培养基中去掉mIL-3，同时添加100ng/ml浓度的KGF和浓度为500ng/ml Heparin进行筛选，细胞经过10天恢复，可以在含有KGF而不含mIL-3的培养基中生长，最终获得表达KGF受体的细胞群体32D/KGFR；
(4)32D/KGFR细胞群体在96孔板内进行亚克隆筛选，所用方法为有限稀释法，采用筛选培养基进行亚克隆，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用培养基稀释100倍；第二步用培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200ul细胞液；四周的孔加入无菌水。期间观察96孔板内细胞数，将孔内只有一个细胞的孔标出，当孔中的细胞平铺满孔时，换入200μl新鲜的筛选培养基，24h后取样测定表达量。根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增，制得KGF活性测定细胞。
2、利用KGF活性测定细胞测定KGF生物学活性
将本实施例构建的KGF活性测定细胞用完全培养液于37℃、5％CO2(体积百分比)培养，传代后48～72小时用于生物学活性测定。取足量细胞培养液，离心收集细胞，洗涤3次后，重悬于基础培养液配成每1ml含2.0～3.0×105个细胞的细胞悬液，置37℃备用。
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％CO2培养40～48小时；每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO2培养5小时。以上操作在无菌条件下进行；每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，活性测定图谱见图1。通过活性测定图谱可以看出构建的活性测定细胞株对KGF呈现依赖性，且随着KGF浓度的提高呈现梯度依赖性，因此，该细胞株可以用来测定KGF的生物学活性。
对照例1
试剂同实施例1。
1、KGF活性测定对照细胞的制备
(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的KGF受体表达基因(KGFR)构建真核表达载体pCIneo-KGFR；
(2)从液氮罐中取一支32D细胞株，迅速置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后1000rpm，5min离心，弃上清，用新鲜的完全培养基(含RPMI1640，10％FBS，mIL-3)重悬细胞，并转到细胞培养瓶内培养，置于37℃，5％CO2培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培；然后，将获得的真核表达载体pCIneo-KGFR以电转化的方式导入到宿主细胞32D，具体方法如下：收集处于对数生长期的细胞，调整细胞密度107cell/ml；将40ug质粒与400ul细胞悬液中，充分混合；将细胞混合液加到电转杯(4mm)中；电转杯在常温(或冰浴)10min；在电转仪上设置相关参数：电压400V，脉冲强度17ms，将电转杯放入电转池中，启动电穿孔装置；电击后，将电转杯在常温放置10min；然后，向电转杯中加入5ml预热的完全培养基，将细胞悬液以6×105cell的密度在T25培养瓶中，放入37度培养箱中；48小时后，加入G418进行筛选。
(3)将细胞以200ng/ml浓度G418和450ng/ml的潮霉素筛选，细胞经过2周时间恢复，获得细胞群体；细胞群体在T25瓶以1×106cell细胞密度接种，同时在培养基中去掉mIL-3，同时添加100ng/ml浓度的KGF和浓度为500ng/ml Heparin进行筛选，细胞经过10天恢复，可以在含有KGF而不含mIL-3的培养基中生长，最终获得表达KGF受体的细胞群体32D/KGFR；
(4)32D/KGFR细胞群体在96孔板内进行亚克隆筛选，所用方法为有限稀释法法，采用筛选培养基进行亚克隆，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用培养基稀释100倍；第二步用培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200ul细胞液；四周的孔加入无菌水。期间观察96孔板内细胞数，将孔内只有一个细胞的孔标出，当孔中的细胞平铺满孔时，换入200μl新鲜培养基，24h后取样测定表达量。根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增，最终获得KGF活性测定对照细胞。
2、利用KGF活性测定对照细胞测定KGF生物学活性
将对照例构建的KGF活性测定对照细胞用完全培养液于37℃、5％CO2培养，传代后48～72小时用于生物学活性测定。取足量32D/KGFR细胞培养液，离心收集细胞，洗涤3次后，重悬于基础培养液配成每1ml含2.0～3.0×105个细胞的细胞悬液，置37℃备用。
在加有标准品溶液和供试品溶液的96孔细胞培养板中每孔加入细胞悬液50μl，于37℃、5％CO2培养40～48小时；每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO2培养5小时。以上操作在无菌条件下进行；每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，活性测定图谱见图2。通过活性测定图谱可以看出构建的活性测定细胞株虽然对KGF呈现依赖性，但是随着KGF浓度的提高不呈现梯度依赖性。
实施例2
试剂
(1)RPMI1640培养液
取RPMI 1640培养基粉末一袋(规格为1L)，加超纯水溶解并稀释至1000ml，再加碳酸氢钠2.1g，溶解后混匀，除菌过滤，4℃保存。
(2)基础培养液 取FBS(灭活胎牛血清)100ml，加入RPMI 1640培养液900ml中，4℃保存。
(3)完全培养基 向基础培养液中加入mIL-3使终浓度为10μg/ml。
(3)完全培养液 基础培养液中加入TPO至最终浓度为每1ml含50ng。
(4)筛选培养基 完全培养液中加入抗生素G418，使抗生素G418的终浓度为200ng/ml，再加入潮霉素B，使潮霉素B的终浓度为450ng/ml。
(4)噻唑蓝(MTT)溶液 取MTT粉末0.10g，加PBS 20ml中，配制成每1ml含5.0mg的溶液，经0.22um滤膜过滤除菌。4℃避光保存。
(5)裂解液 国产AR级别DMSO。
TPO标准品和TPO供试品溶液的制备：将标准品和供试品用基础培养液稀释至2000ng/ml。在96孔细胞培养板中，进行4倍系列稀释(首孔不稀释)，共做10个稀释度，每个稀释度至少2个复孔。
1、TPO及其类似物活性测定细胞的制备
用于生物学活性测定的质粒的制备方法同实施例1。
TPO及其类似物活性测定细胞的制备方法，步骤如下：
(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切实施例1制得的用于生物学活性测定的质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的TPO及其类似物受体表达基因(mpl)，构建真核表达载体pCIneo-ease-mpl-IRES-Hygromycin；经检测，序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)从液氮罐中取一支32D细胞株，迅速置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后1000rpm，5min离心，弃上清，用新鲜的完全培养基重悬细胞，并转到细胞培养瓶内培养，置于37℃，5％CO2培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培；然后，将获得的真核表达载体pCIneo-ease-mpl-IRES-Hygromycin以电转化的方式导入到宿主细胞32D，具体方法如下：收集处于对数生长期的细胞，调整细胞密度107cell/ml；将40ug质粒与400ul细胞悬液中，充分混合；将细胞混合液加到电转杯(4mm)中；电转杯在常温(或冰浴)10min；在电转仪上设置电转参数：电压400V，脉冲强度17ms，将电转杯放入电转池中，启动电穿孔装置；电击后，将电转杯在常温放置10min；然后，向电转杯中加入5ml预热的完全培养基，将细胞悬液以6×105cell的密度在T25培养瓶中，放入37度培养箱中；48小时后，加入G418进行筛选。
(3)将细胞以200ng/ml浓度G418和450ng/ml的潮霉素B筛选，细胞经过2周时间恢复，获得细胞群体；细胞群体在T25瓶以1×106cell细胞密度接种，在培养基中去掉mIL-3，同时添加100ng/ml浓度的Fc-TMP进行筛选，细胞经过10天恢复，可以在含有Fc-TMP而不含mIL-3的培养基中生长，最终获得表达Fc-TMP受体的细胞群体32D/mpl；
(4)32D/mpl细胞群体在96孔板内进行亚克隆筛选，所用方法为有限稀释法法，采用筛选培养基进行亚克隆，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用培养基稀释100倍；第二步用培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200μl细胞液；四周的孔加入无菌水。期间观察96孔板内细胞数，将孔内只有一个细胞的孔标出，当孔中的细胞平铺满孔时，换入200ul新鲜的筛选培养基，24h后取样测定表达量。根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增，制得TPO及其类似物生物学活性测定细胞。
2、利用TPO及其类似物活性测定细胞测定TPO类似物的生物学活性
TPO及其类似物活性测定细胞用完全培养液于37℃、5％CO2培养，传代后48～72小时用于生物学活性测定。取足量TPO及其类似物活性测定细胞培养液，离心收集细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液，96孔板中每孔加入细胞悬液100μl。
在上述加有细胞悬液的96孔细胞培养板中加入稀释好的标准品和供试品，每孔100μl，于37℃、5％CO2培养40～48小时；每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO2培养5小时。以上操作在无菌条件下进行；染色结束后小心吸出每孔中的上清液，每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。活性测定结果如图2所示，通过图3结果可知，该细胞株对TPO类似物浓度呈现梯度的依赖性，可以用来TPO类似物的生物学活性测定。
对照例2
试剂同实施例2。
1、TPO及其类似物活性测定对照细胞的制备
(1)用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的TPO及其类似物受体表达基因(mpl)，构建真核表达载体pCIneo-mpl；
(2)从液氮罐中取一支32D细胞株，迅速置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后1000rpm，5min离心，弃上清，用新鲜的完全培养基(含RPMI1640，10％FBS，mIL-3)重悬细胞，并转到细胞培养瓶内培养，置于37℃，5％CO2培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培。
(3)将获得的真核表达载体pCIneo-mpl以电转化的方式导入到宿主细胞32D，具体方法如下：收集处于对数生长期的细胞，调整细胞密度107cell/ml；将40μg质粒与400μl细胞悬液中，充分混合；将细胞混合液加到电转杯(4mm)中；电转杯在常温(或冰浴)10min；在电转仪上设置电转参数：电压400V，脉冲强度17ms，将电转杯放入电转池中，启动电穿孔装置；电击后，将电转杯在常温放置10min；电击后，向电转杯中加入5ml预热的完全培养基，将细胞悬液以6×105cell的密度在T25培养瓶中，放入37度培养箱中；48小时后，加入G418进行筛选。
(4)将细胞以200ng/ml浓度G418和450ng/ml的潮霉素筛选，细胞经过2周时间恢复，获得细胞群体；细胞群体在T25瓶以1×106cell细胞密度接种，同时在培养基中去掉mIL-3，同时添加100ng/ml浓度的Fc-TMP进行筛选，细胞经过10天恢复，可以在含有Fc-TMP而不含mIL-3的培养基中生长，最终获得表达Fc-TMP受体的细胞群体32D/mpl；
(5)32D/mpl细胞群体在96孔板内进行亚克隆筛选，所用方法为有限稀释法法，采用筛选培养基进行亚克隆，每块96孔板上接种60个孔，每孔1个细胞；计数后，第一步用培养基稀释100倍；第二步用培养基稀释到5cells/ml，混匀后每个孔接种200μl细胞液；四周的孔加入无菌水。期间观察96孔板内细胞数，将孔内只有一个细胞的孔标出，当孔中的细胞平铺满孔时，换入200μl新鲜培养基，24h后取样测定表达量。根据定量结果，从中挑选高表达克隆细胞株转入6孔板进行扩增，最终获得TPO类似物活性测定对照细胞。
2、利用对照细胞株测定TPO类似物生物学活性
TPO类似物生物学活性测定对照细胞株用完全培养液于37℃、5％CO2培养，传代后48～72小时用于生物学活性测定。取足量TPO类似物活性测定对照细胞培养液，离心收集细胞，用RPMI1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液配成每1ml含2.0×105个细胞的细胞悬液，96孔板中每孔加入细胞悬液100μl。
在上述加有细胞悬液的96孔细胞培养板中加入稀释好的标准品和供试品，每孔100μl，于37℃、5％CO2培养40～48小时；每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％CO2培养5小时。以上操作在无菌条件下进行；染色结束后小心吸出每孔中的上清液，，每孔加入裂解液100μl，混匀后，放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。活性测定结果如图2所示，通过图4结果可知，该细胞株对TPO类似物浓度的依赖性不好，不能用于其生物学活性的测定。
Claims (2)
1.一种用于生物学活性测定的质粒，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒的制备方法，步骤如下：
（1）用限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切pCI-neo质粒，插入经限制性内切酶NheI和EcoRI双酶切的表达调控元件EASE，构建质粒pCIneo-ease；
（2）用限制性内切酶MluI和XbaI双酶切步骤（1）制得的质粒pCIneo-ease，插入经限制性内切酶MluI和XbaI双酶切的核糖体结合位点序列，构建质粒pCIneo-ease-IRES；
（3）用限制性内切酶XbaI和NotI双酶切步骤（2）制得的质粒pCIneo-ease-IRES，插入经限制性内切酶XbaI和NotI双酶切的潮霉素基因片段，构建真核表达载体pCIneo-ease-IRES-Hygromycin，即得用于生物学活性测定的质粒。
3. 一种生物学活性测定细胞，该细胞含有权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒。
4. 权利要求3所述生物学活性测定细胞的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）用限制性内切酶XhoI和MluI双酶切用于生物学活性测定的质粒，插入经限制性内切酶XhoI和MluI双酶切的细胞因子受体表达基因构建真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin；
（2）将步骤（1）制得的真核表达载体pCIneo-ease-receptor-IRES-Hygromycin以电击转化的方式导入到宿主细胞，得转化细胞；
（3）将步骤（2）制得的转化细胞以氨基糖苷类抗生素G418和潮霉素B进行筛选，获得细胞群体，再加入细胞因子进行筛选，获得表达细胞因子受体的细胞群体；
（4）将步骤（3）制得的细胞群体进行单克隆筛选，获得单克隆细胞株，即得生物学活性测定细胞。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中细胞因子受体表达基因是指细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11的受体表达基因。
6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的电击转化步骤如下：
收集处于对数生长期的宿主细胞；将生物学活性测定质粒加入到细胞悬液中，混合均匀，得细胞混合液；将细胞混合液加到电转杯中；在脉冲强度为100V-600V条件下电击7-20ms，即得。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的生物学活性测定质粒的浓度为每百微升5-16μg；所述步骤（2）中的宿主细胞为32D细胞株；
所述步骤（2）中的宿主细胞是经过预处理的宿主细胞，预处理过程如下：
将宿主细胞由液氮中取出，置于37℃水浴锅中，使冻存的细胞在1分钟内解冻，然后离心，弃上清，用完全培养基重悬细胞，在体积百分比为5%CO2的培养箱内静置培养，每三天进行传代、扩培。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，上述完全培养基，是向RPMI1640培养液中添加培养基总体积10%的灭活胎牛血清，再加入mIL-3，使mIL-3的终浓度达到10μg/ml。
9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，在加入细胞因子筛选前，还包括去除mIL-3的步骤；所述步骤（3）中的细胞因子选自KGF、TPO、EPO或IL11。
10. 权利要求1所述用于生物学活性测定的质粒在检测生物制品中细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性中的应用。
11. 权利要求3所述生物学活性测定细胞在检测生物制品中细胞因子KGF、TPO、EPO或IL11活性中的应用。
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| CN102250952A (zh) * | 2011-06-17 | 2011-11-23 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的载体及其应用 |
| CN102277380A (zh) * | 2010-06-08 | 2011-12-14 | 齐鲁制药有限公司 | 一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体及其制备方法与应用 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101233238A (zh) * | 2005-06-30 | 2008-07-30 | 奥克塔法马股份有限公司 | 人细胞系中重组人蛋白质的无血清稳定转染和生产 |
| CN102277380A (zh) * | 2010-06-08 | 2011-12-14 | 齐鲁制药有限公司 | 一种dhfr互补表达的共转染真核表达载体及其制备方法与应用 |
| CN102250952A (zh) * | 2011-06-17 | 2011-11-23 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的载体及其应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| "GenBank Accession NO：AF309825.2";Zuo,J.等;《GenBank》;20001202;第2页的"CDS"部分 * |
| "GenBank Accession No：U47120.2";Brondyk,W.H.;《GenBank》;19960220;第1-4页 * |
| "重组人KGF制备工艺和活性检测方法的建立";王希菊 等;《生物技术》;20110331;第21卷(第3期);第48页左栏第1.2.2节，第49页左栏第2.5节 * |
| Brondyk,W.H.."GenBank Accession No：U47120.2".《GenBank》.1996,第1-4页. * |
| Zuo,J.等."GenBank Accession NO：AF309825.2".《GenBank》.2000,第2页的"CDS"部分. * |
| 王希菊 等."重组人KGF制备工艺和活性检测方法的建立".《生物技术》.2011,第21卷(第3期),第48页左栏第1.2.2节，第49页左栏第2.5节. * |
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