CN116555343A - 一种新型的抗TGF-β 单克隆抗体生物学活性的检测方法 - Google Patents
一种新型的抗TGF-β 单克隆抗体生物学活性的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种新型的抗TGF‑β单克隆抗体生物学活性的检测方法，本发明构建了稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞，将该细胞用作效应细胞，用于抗TGF‑β单克隆抗体药物的生物学活性的检测，具有成本低，操作简单，试验周期短，且检测结果稳定可靠，准确度高等优点，有利于抗TGF‑β单克隆抗体药物的质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种新型的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法，更具体地，本发明涉及一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞及其在检测抗TGF-β单克隆抗体药物生物学活性中的应用。
背景技术
转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGF-β)是一种广泛存在的细胞因子，几乎每个细胞都具有分泌TGF-β、应答TGF-β的能力。在上皮细胞中，TGF-β在肿瘤的早期具有肿瘤抑制作用，而在晚期具有促进作用。TGF-β信号通路是一个包含众多成员的多功能细胞因子的大家族，包括骨形成蛋白、生长分化因子、激活素、抑制素，TGF-β配体有3个亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β作为一种广泛存在的细胞因子，在细胞的生长、黏附、运动、增殖、分化、迁移、凋亡和免疫调节等多种细胞进程中都发挥着重要的作用，参与介导组织与器官的生长和发育、机体的免疫反应等生物过程。
TGF-β在肿瘤的早期表现出对肿瘤的抑制作用，而在肿瘤的晚期则转变为对肿瘤具有促进作用。随着肿瘤的发展，肿瘤细胞常会对TGF-β调节的生长抑制功能缺失应答，但却可以充分利用TGF-β的肿瘤促进作用。首先，TGF-β信号可作用于肿瘤微环境中的免疫细胞，抑制效应性T细胞和天然杀伤细胞的细胞毒性，进而减弱了肿瘤微环境中固有免疫细胞的抗肿瘤能力，还能促进肿瘤逃逸免疫监管；其次，TGF-β信号可以通过诱导HMGA2、Snail1/2等转录因子的表达，诱发上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，进而逃逸凋亡作用；另外，TGF-β表达上调，也会促进VEGF-A等因子的分泌，刺激新生血管生成，从而促进癌细胞的生长和转移。
在肿瘤治疗中，抗TGF-β策略的研究已经进入到了临床前研究阶段。目前的主要途径是应用抗TGF-β单克隆抗体药物。抗TGF-β单克隆抗体药物的优点是其具有高度特异性，并且能够在细胞外发挥作用，利用这一特性可以扫除细胞外的配体，并且相对于静脉内的递送方式更加便捷。如诺华(Novartis)近日在中国获批临床的NIS793，礼来公司(EliLilly and Company)开发的galunisertib，目前均已进入临床中期或后期。劲方医药的GFH018片剂和璎黎药业的YL-13027目前正在开展1期临床试验。在临床应用前，对单克隆抗体类药物进行生物学活性检测是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。
目前常用的抗体类药物的生物学活性的检测方法主要有ELISA、表面等离子共振(SPR)和细胞增殖抑制法。ELISA和SPR虽然操作简单，灵敏度高，但是不能提供生物学效应的信息，且方法耐用性和重复性较差；而细胞增殖抑制方法实验周期长，变异性大。随着抗TGF-β单克隆抗体药物的快速发展，迫切需要一种高效、快速、准确、特异性强的生物学活性检测方法。鉴于此，本发明经过多种细胞株的筛选和研究开发出了一种新型的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法，该方法快速准确，专属性强，可用于抗TGF-β单克隆抗体的研制和质量控制中。
发明内容
为了解决目前本领域缺乏一种快速准确、专属性强的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法这一技术问题，本发明提供了一种新型的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞的构建方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)构建PGL4.48(SBE)质粒；
(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到4T1细胞中；
(3)对步骤(2)得到的经转染后的细胞进行筛选，获得阳性克隆4T1-SBE细胞即为稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；
优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染法。
进一步，所述PGL4.48(SBE)质粒购自于Promega公司。
进一步，步骤(3)中所述的筛选包括如下步骤：
(a)使用潮霉素B进行筛选获得稳定表达SBE的混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；
(b)通过预实验筛选得到阳性克隆细胞株；
优选地，步骤(a)中所述的潮霉素B的浓度分别为100μg/mL；
优选地，步骤(b)中所述的预实验包括：固定步骤(a)得到的单克隆细胞株的接种数目，在细胞培养板中将单克隆细胞株分别与不同浓度的TGF-β抗原混合，进行培养，荧光检测筛选得到阳性克隆细胞株；
更优选地，所述接种数目为5×104/孔；
更优选地，所述不同浓度的TGF-β抗原为50ng/mL的TGF-β抗原、0ng/mL的TGF-β抗原；
最优选地，所述TGF-β抗原为TGF-β1抗原；
更优选地，所述培养的条件为37℃、5％ CO2；
更优选地，所述培养的时间为6h。
本发明所述的抗TGF-β单克隆抗体药物生物学活性的检测方法的原理如下：本发明首先构建了一种稳定表达SBE和荧光素酶的效应细胞4T1-SBE，在TGF-β抗原的刺激下，TGF-β抗原与4T1-SBE细胞细胞膜上的TGF-β受体结合后形成复合体，进而与4T1-SBE细胞中的SBE结合，驱动荧光素酶报告基因的表达，加入抗TGF-β的单克隆抗体药物阻断TGF-β刺激激活的信号通路，加入荧光底物后产生化学发光，根据荧光素酶的表达量与抗体的浓度拟合剂量效应曲线，得到半抑制浓度IC50值，进而得到抗体药物的生物学活性。
本发明中所述的SBE，即为Smad结合元件(Smad Binding Element，SBE)，SBE可将TGF-β信号从细胞表面受体传导至主细胞核。在TGF-β诱导的信号转导中，TGF-β首先结合细胞膜上的TGF-βⅡ型受体，TGF-β发生构象变化形成复合物，继而被TGF-βⅠ型受体识别并结合形成TGF-βⅡ型受体-TGF-β-TGF-βⅠ型受体复合物，在该配体受体复合体中，TGF-βⅡ型受体通过交叉磷酸化TGF-βⅠ型受体而激活下游信号，随后，配体受体复合体持续招募受体激活Smad蛋白，即R-Smad(包括Smad2和Smad3)来激活TGF-βⅠ型受体，R-Smad结合到激活的TGF-βⅠ型受体上而被磷酸化，随后磷酸化的R-Smad与Smad4相结合，形成Smad2/3/4复合体，该复合体可进入到细胞核中，通过Smad3/4的MH1发夹样结构与靶基因启动区的特异性Smad结合元件(SBE)结合，调控下游特异基因的转录表达。
本发明的第二方面提供了一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞。
进一步，所述细胞由本发明第一方面所述的构建方法构建得到的。
本发明的第三方面提供了一种抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)构建稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；
(2)用TGF-β刺激激活步骤(1)得到的4T1细胞中报告基因的表达；
(3)将抗TGF-β单克隆抗体加入到步骤(2)得到的4T1细胞中，进行孵育；
(4)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗TGF-β单克隆抗体的生物学活性；
优选地，步骤(1)中所述的稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的。
进一步，步骤(2)中所述的TGF-β的浓度为1ng/mL；
优选地，步骤(2)中所述的TGF-β为TGF-β1；
优选地，步骤(2)中所述的步骤(1)得到的4T1细胞的接种密度为5×104/孔。
进一步，步骤(3)中所述的抗TGF-β单克隆抗体初始浓度为300μg/mL、3倍梯度稀释；
优选地，步骤(3)中所述孵育的时间为6h；
优选地，步骤(3)中所述孵育的条件为37℃、5％ CO2培养箱中孵育。
进一步，步骤(4)中所述的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，根据相对化学发光值拟合得到四参数曲线。
本发明的第四方面提供了一种用于检测抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包括稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞、TGF-β、荧光底物、稀释缓冲液；
优选地，所述稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞是采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的；
优选地，所述稀释缓冲液为含有2％ FBS的1640基础培养基。
本发明的第五方面提供了一种抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的评价体系。
进一步，所述评价体系包括如下组分：抗TGF-β单克隆抗体样品、稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞、TGF-β、荧光底物、稀释缓冲液；
优选地，所述评价体系包括如下步骤：
(1)用TGF-β刺激激活稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞中报告基因的表达；
(2)将抗TGF-β单克隆抗体加入到步骤(a)得到的4T1细胞中，进行孵育；
(3)加入荧光底物，根据测定的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定抗TGF-β单克隆抗体的生物学活性，得出样品的相对生物学效价；
优选地，步骤(a)中所述的TGF-β为TGF-β1；
优选地，所述评价体系的评价指标包括抗TGF-β单克隆抗体样品的相对生物学效价；
更优选地，若得到的抗TGF-β单克隆抗体样品相对生物学效价的数值为70％-130％，则表明所述抗TGF-β单克隆抗体样品的生物学活性良好；
优选地，所述稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞是采用本发明第一方面所述的构建方法构建得到的；
优选地，所述稀释缓冲液为含有2％ FBS的1640基础培养基。
进一步，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(Relative lightunit，RLU)，通过数据处理拟合倒S型四参数曲线。倒S型四参数曲线，可反映出上下渐近线、IC50值和斜率等指标；
优选地，使用SoftMax Pro 5.4进行相对化学发光单位值数据处理拟合倒S型四参数曲线，以所述抗TGF-β单克隆抗体样品或参比品浓度的对数值(Log[M])(ng/mL)为横坐标，以相对化学发光单位值(RLU)为纵坐标，对剂量效应曲线进行四参数拟合。
在本发明的具体实施方案中，通过比较抗TGF-β单克隆抗体样品与参比品四参数曲线的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)值，得出样品的相对生物学效价。计算公式为：相对生物学效价＝参比品IC50/样品IC50×100％。
本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的构建方法在制备稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞中的应用；
(2)本发明第二方面所述的稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞在制备检测抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的产品中的应用；
(3)本发明第三方面所述的检测方法在抗TGF-β单克隆抗体的质量控制中的应用；
(4)本发明第四方面所述的试剂盒在抗TGF-β单克隆抗体生物学活性检测中的应用；
(5)本发明第五方面所述的评价体系在抗TGF-β单克隆抗体生物学活性评价中的应用。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
传统的抗体类药物生物学活性的检测方法主要有ELISA、表面等离子共振(SPR)和细胞增殖抑制法；ELISA和SPR虽然操作简单，灵敏度高，但是不能提供生物学效应的信息，且方法耐用性和重复性较差；而细胞增殖抑制方法实验周期长，变异性大；
本发明提供了一种新型的抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法，所述方法无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，成本低，操作简单，试验周期短，且检测结果稳定可靠，准确度高，有利于抗TGF-β单克隆抗体药物的质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示的是本发明构建得到的4T1-SBE细胞在不同的TGF-β1抗原刺激浓度下的剂量效应曲线结果图；
图2显示的是抗原刺激浓度的优化的结果图；
图3显示的是细胞铺板密度的优化的结果图；
图4显示的是孵育时间的优化的结果图；
图5显示的是对TGF-β单克隆抗体药物的生物学活性进行检测得到的剂量效应曲线结果图；
图6显示的是报告基因生物学活性检测法针对不同靶点特异性的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1构建稳定表达SBE-Luc报告基因的效应细胞4T1-SBE
1、实验材料
4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)购自于ATCC；One-Glo荧光素酶试剂盒购自于Promega公司；PGL4.48(SBE)购自于Promega公司；抗TGF-β单克隆抗体为JS201，购自于苏州君盟生物科技有限公司。
2、载体构建
质粒PGL4.48(SBE)的构建：PGL4.48(SBE)质粒购自于Promega公司。所述质粒的信息如下：
3、4T1-SBE细胞株的构建
通过电转染的方法(NEONTM电穿孔转染系统，Invitrogen)将质粒PGL4.48(SBE)转染入4T1细胞中，然后在细胞生长培养基(1640培养基+10％FBS+1％ NEAA+1％ P/S)中加入100μg/mL的Hygromycin B筛选得到稳定表达SBE的细胞pool，进一步通过有限稀释法得到单克隆稳转细胞株。
通过报告基因法对挑选出的单克隆细胞株进行细胞株检测，固定单克隆细胞株接种数目为5×104/孔，在96孔板中将细胞分别与50ng/mL和0ng/mL的TGF-β1抗原混合，之后放入二氧化碳培养箱中孵育6h，然后加入One-Glo进行荧光检测，筛选得到阳性克隆4T1-SBE细胞株。
4、对筛选得到的阳性克隆进行验证
TGF-β1抗原以50ng/mL(工作浓度)浓度起始，5倍稀释，设置9个浓度梯度，第十个浓度为0ng/mL，固定细胞4T1-SBE接种为5×104/孔，assay buffer为1640基础培养基+2％FBS。
5、实验结果
结果显示，筛选得到的阳性克隆4T1-SBE细胞株对TGF-β1抗原的刺激具有较好的荧光素酶表达反应性(见图1)。
实施例2抗TGF-β单克隆抗体药物生物学活性检测方法的优化
1、TGF-β1刺激浓度的优化
将TGF-β浓度稀释到较高的浓度50ng/mL(终浓度)，1:4稀释，10个浓度点，在不同的细胞密度以及孵育时间下根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线(图1)确定TGF-β的作用范围。
实验方法：选取曲线上EC50和EC80对应的值分别为0.5ng/mL和1.5ng/mL。然后设置了两个条件。在条件I中，TGF-β1的工作浓度为0.5ng/mL，抗TGF-β1mAb-A的工作浓度和系列稀释比分别为150ng/mL和3倍。在条件II中，TGF-β1的工作浓度为1.0ng/mL，抗TGF-βmAb-A的工作浓度和系列稀释率分别为200ng/mL和3倍。
实验结果：结果显示，条件II的信噪比更高(见图2)，因此，TGF-β1的工作浓度设定为1.0ng/mL。此外，将抗TGF-βmAb-A的初始工作浓度调整为300ng/mL，连续稀释比仍为3倍。
2、4T1-SBE细胞接种密度的优化
实验方法：细胞密度分别调整至5×104cells/孔、7.5×104cells/孔和10×104cells/孔，进行实验。
实验结果，结果显示，三种细胞密度之间所得到曲线无明显区别，都满足实验要求(见图3)。为了节省细胞用量，因此，本发明确定细胞的铺板密度设定为5×104cells/孔。
3、孵育时间的优化
实验方法：将抗原、抗体和细胞共同孵育，分别在4、5、6h后进行读数。
结果显示：三种孵育时间所得到的曲线之间无明差别，都满足实验要求(见图4)，因此，本发明将孵育时间设定为4-6h。
实施例3抗TGF-β单克隆抗体药物生物学活性检测方法的建立
1、实验方法
使用实施例2中所构建的4T1-SBE细胞，固定TGF-β1浓度为1ng/mL，完成方法优化后，基于报告基因法检测抗TGF-β单抗(初始浓度为300μg/mL，3倍梯度稀释)的生物学活性。
2、实验结果
所得的抗TGF-β单克隆抗体的剂量效应曲线见图5，结果显示，所得数据在半对数坐标纸上呈典型的S型曲线，为一个完整的S型量效反应曲线，表明了本发明建立的抗TGF-β单克隆抗体药物生物学活性检测方法具有较好的应用效果。
实施例4检验方法的验证
1、实验方法
选择靶向TGF-β、PCSK9和IL-17A的抗体，以及分析培养基(1650+2％FBS)，进行平行实验。
2、实验结果
结果显示，只有抗TGF-βmAb-A抑制荧光素酶活化(见图6)。此外，靶向PCSK9或IL-17A的抗体以及用于配制抗TGF-β的分析缓冲液均不能抑制荧光素酶的激活。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建PGL4.48(SBE)质粒；
(2)将步骤(1)中所述的质粒转染到4T1细胞中；
(3)对步骤(2)得到的经转染后的细胞进行筛选，获得阳性克隆4T1-SBE细胞即为稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；
优选地，步骤(2)中所述转染的方式为电转染法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的筛选包括如下步骤：
(a)使用潮霉素B进行筛选获得稳定表达SBE的混合克隆细胞株，进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株；
(b)通过预实验筛选得到阳性克隆细胞株；
优选地，步骤(a)中所述的潮霉素B的浓度分别为100μg/mL；
优选地，步骤(b)中所述的预实验包括：固定步骤(a)得到的单克隆细胞株的接种数目，在细胞培养板中将单克隆细胞株分别与不同浓度的TGF-β抗原混合，进行培养，荧光筛选得到阳性克隆细胞株；
更优选地，所述接种数目为5×104/孔；
更优选地，所述不同浓度的TGF-β抗原为50ng/mL的TGF-β抗原、0ng/mL的TGF-β抗原；
最优选地，所述TGF-β抗原为TGF-β1抗原；
更优选地，所述培养的条件为37℃、5％CO2；
更优选地，所述培养的时间为6h。
3.一种稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞，其特征在于，所述细胞由权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。
4.一种抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞；
(2)用TGF-β刺激激活步骤(1)得到的4T1细胞中报告基因的表达；
(3)将抗TGF-β单克隆抗体加入到步骤(2)得到的4T1细胞中，进行孵育；
(4)加入荧光底物，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线确定抗TGF-β单克隆抗体的生物学活性；
优选地，步骤(1)中所述的稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞采用权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的TGF-β的浓度为1ng/mL；
优选地，步骤(2)中所述的步骤(1)得到的4T1细胞的接种密度为5×104/孔。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的抗TGF-β单克隆抗体初始浓度为300μg/mL、3倍梯度稀释；
优选地，步骤(3)中所述孵育的时间为6h；
优选地，步骤(3)中所述孵育的条件为37℃、5％CO2培养箱中孵育。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的四参数曲线是在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，根据相对化学发光值拟合得到四参数曲线。
8.一种用于检测抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞、TGF-β、荧光底物、稀释缓冲液；
优选地，所述稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞是采用权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。
9.一种抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的评价体系，其特征在于，所述评价体系包括如下组分：抗TGF-β单克隆抗体样品、稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞、TGF-β、荧光底物、稀释缓冲液；
优选地，所述评价体系包括如下步骤：
(1)用TGF-β刺激激活稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞中报告基因的表达；
(2)将抗TGF-β单克隆抗体加入到步骤(a)得到的4T1细胞中，进行孵育；
(3)加入荧光底物，根据测定的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定抗TGF-β单克隆抗体的生物学活性，得出样品的相对生物学效价；
优选地，步骤(a)中所述的TGF-β为TGF-β1；
优选地，所述评价体系的评价指标包括抗TGF-β单克隆抗体样品的相对生物学效价；
更优选地，若得到的抗TGF-β单克隆抗体样品相对生物学效价的数值为70％-130％，则表明所述抗TGF-β单克隆抗体样品的生物学活性良好；
优选地，所述稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞是采用权利要求1或2所述的构建方法构建得到的。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1或2所述的构建方法在制备稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞中的应用；
(2)权利要求3所述的稳定表达SBE和Luc报告基因的4T1细胞在制备检测抗TGF-β单克隆抗体生物学活性的产品中的应用；
(3)权利要求4-7任一项所述的检测方法在抗TGF-β单克隆抗体的质量控制中的应用；
(4)权利要求8所述的试剂盒在抗TGF-β单克隆抗体生物学活性检测中的应用；
(5)权利要求9所述的评价体系在抗TGF-β单克隆抗体生物学活性评价中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202310556145.9A CN116555343A (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 一种新型的抗TGF-β 单克隆抗体生物学活性的检测方法 |
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2023
- 2023-05-17 CN CN202310556145.9A patent/CN116555343A/zh active Pending
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