CN110045131A - 用于测定人il-33/st2通路抑制剂的生物学活性的方法 - Google Patents

用于测定人il-33/st2通路抑制剂的生物学活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于快速测定IL‑33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法，所述方法包括：构建得到稳定表达NF‑κB或IL‑8报告基因的细胞株，用IL‑33刺激激活报告基因表达，并用IL‑33/ST2抗体药物阻断IL‑33信号通路，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。本发明针对IL‑33/ST2抗体药物的生物学活性测定建立了更加快速、准确的定量检测方法，实验周期短，操作简便，并且避免了长时间孵育和多步骤操作所带来的细胞污染和误差。

Description

用于测定人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法
技术领域
本发明涉及生物药物的生物学活性检测领域，具体而言，本发明涉及一种用于快速、准确、定量地测定IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，目前已经成为全球医药市场的重要组成部分。单克隆抗体在细胞水平上的生物学活性的测定在单克隆抗体药物的发现与开发中起着重要的作用，目前生物学活性检测方法多采用基于细胞的生物活性测定方法，包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、补体依赖的细胞毒法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、细胞ELISA法和报告基因法。
白介素33（IL-33）是一种与IL-1和IL-18相关的细胞因子，又被称为NF-HEV或IL-1F11。ST2（ST2L、IL-1RL1、T1、Fit-1、DER-4、IL-1R4或ST2α）是白介素33的一种结合受体，它是Toll/IL-1受体家族成员，在多种免疫细胞的细胞表面上表达，这些细胞包括淋巴细胞，尤其是表达IL-5和IL-13的辅助性T细胞、天然杀伤（NK）和天然杀伤-T（NKT）细胞，以及很多所谓的先天免疫细胞，例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和先天辅助性细胞（又名新免疫细胞（nuocyte）（Neill,Wong等人2010））。ST2能够下调Toll样受体TLR2、TLR4和TLR9的响应性，但也能经由被其配体IL-33活化及与辅助蛋白IL-1RAcP缔合而诱导2型细胞因子释放。相关文献已提出了ST2、IL-33和IL-1RAcP相互作用以及IL-1R1与IL-1RAcP之间相互作用的模型（Lingel等人，Cell 17：1398-1410，2009；Wang等人，NatImmunol，11：905-11，2010）。
IL-33已被描述为“警报素”，因为在内稳态过程中其以全长形式存在于上皮细胞和内皮细胞的细胞核中，但在细胞坏死过程中可被裂解并释放。IL-33诱导的细胞反应的实例包括诸如IL-5、IL-6、IL-13、TNF、IFN-γ和GM-CSF的炎性细胞因子的产生，以及诸如CXCL8、CCL17和CCL24的趋化因子的产生。IL-33还展示通过加强由IgE受体信号转导或其它肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化剂引发的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化而增强急性过敏反应。IL-33还会增强表达ST2的免疫细胞的募集、存活和粘附特性，因此在激发和维持局部组织中的细胞炎症方面具有重要意义。
IL-33/ST2途径失调已表明与多种免疫介导的疾病有关，包括哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、鼻息肉以及全身性硬化症（综述于Palmer和Gabay，Nat Rev Rheumatol 7：321-9，2011和Lloyd，Curr Opin Immunol 22：800-6，2010；Shimizu等人，Hum Molec Gen 14：2919-27，2005；Kamekura等人，Clin Exp Allergy 42：218-28，2012；Manetti 等人，Ann Rheum Dis 69：598-605，2010）。因此，治疗性阻断IL-33/ST2途径可有助于克服过免疫反应。为了开发更多的IL-33/ST2通路抑制剂以及为了IL-33/ST2通路抑制剂（例如单克隆抗体）生产中的质量控制，有必要开发对IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性进行测定的方法。
目前通用的IL-33/ST2通路抑制剂（例如IL-33单克隆抗体和ST2单克隆抗体）的生物学活性的测定方法为：（1）人嗜碱性粒细胞（KU812）的细胞因子释放实验；（2）人肥大细胞细胞因子释放实验和PGD2释放实验。这些方法均需要进行细胞培养和细胞因子ELISA测定，步骤繁琐，变异性大，成本高，时间长，方法耐用性和重复性较差。具体为：
(1)人嗜碱性粒细胞（KU812）的细胞因子释放实验：将KU812细胞（ATCC，CRL-2099）以25,000或50,000个细胞/孔接种于无菌96孔U形底组织培养板中总共40μl的补充有10% FBS和青霉素/链霉素的RPMI 1640生长培养基（Invitrogen）中。以各种浓度（50μl/孔）添加抗-人ST2单克隆抗体或抗-人IL33单克隆抗体和对照，并在37℃下温育。在温育1小时后，将重组“成熟”IL-33（SEQ ID NO: 1的第111-270位氨基酸）以10ng/ml的终浓度添加到10μlRPMI生长培养基中。然后将细胞在37℃下温育40-48小时，以允许IL-33介导的IL-5和IL-6诱导。温育之后，收获细胞并收集细胞上清液以用于使用ELISA（R&D systems）或基于小珠的多重分析（Millipore）进行IL-33诱导的IL-5和IL-6的后续检测。
(2)人肥大细胞细胞因子释放实验和PGD2释放实验：肥大细胞来源于CD34+人脐带血细胞（Lonza）。将>1.0×106个CD34+脐带血细胞的冷冻小瓶快速解冻并转移至50ml锥形管。将数滴温热或室温Stem-Pro 34培养基+补充物（总共25ml；Invitrogen）缓慢添加到细胞。将细胞在1,000rpm下离心15分钟，并重悬于培养基（10ml的StemPro-34，含如下补充物：30ng/ml IL-3、100ng/ml IL-6和100ng/ml SCF）。将细胞接种于6孔板的2个孔中，并培养1周。在第4天，使细胞以1:3在补充的Stem Pro-34培养基中扩增。在第7天，移除非贴壁细胞，并以0.5×106/ml接种于包含10ng/ml IL-6和100ng/ml SCF的StemPro-34培养基中。细胞每周扩增以保持0.5×106/ml的细胞密度直到肥大细胞在6-10周成熟（通过FcεR1、cKit和类胰蛋白酶的表达来评估）。将成熟肥大细胞以0.5×106/ml培养于StemPro-34中，并每天在IL-4（10ng/ml；Peprotech）、IL-6（10ng/ml；R&D Systems）和SCF（100ng/ml；Invitrogen）中刺激，持续4天。在测定之前，将细胞收获，在1,000rpm下离心10分钟，并重悬于新鲜StemPro-34培养基或包含10% FCS的RPMI(不含抗生素，含有100ng/ml人重组SCF）中。将细胞以65,000至75,000个细/0.16ml/孔的密度接种于平底的组织培养处理的96孔板中。在添加IL-33之前30分钟，将抗-ST2单克隆抗体或抗-IL33单克隆抗体添加到平板至终浓度为50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032μg/ml。还在培养基+100ng/ml SCF中制备10X（10或30ng/ml）的重组人“成熟”IL-33（SEQ ID NO: 1的第111-270位残基）。将20μl的10× IL-33添加到孔中至终浓度为1或3ng/ml，并将平板在37℃、5% CO2 下温育过夜。在刺激后18-24小时，收获培养上层清液。将平板在1,000rpm下离心10分钟。去除上清液，置于U形底96孔板中，并在测定之前保存在-20℃下。使用得自Millipore的人细胞因子试剂盒，利用LuminexTM技术分析细胞因子水平。使用得自Cayman Chemical Company的前列腺素D2-MOX EIA试剂盒，根据制造商说明书测量PGD2的水平。为了增强ELISA的灵敏度，将肥大细胞培养上层清液中的PGD2通过用甲氧胺盐酸盐（MOX-HCl）处理，转化为不可降解的MOX-PGD2（甲氧胺-PGD2）。
上述两种传统的IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性测定方法均需要长时间的细胞培养和ELISA检测，这些传统的方法步骤繁琐，变异性大，成本高，时间长，方法耐用性和重复性较差。
因此，针对IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性测定，本领域仍然存在对新型测定方法的需要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种IL-33/ST2通路抑制剂、特别是IL-33或ST2单克隆抗体的生物学活性测定方法，该方法基于荧光素酶报告基因检测方式，不采用任何人血液来源细胞或其他成分，体外评价药物的生物学活性，满足专属性和准确性的要求且具有操作简便、试验周期短、检测结果稳定和可靠等优点。
本发明的技术方案如下。
一方面，本发明提供一种用于测定人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法，所述方法包括：使用表达NF-κB或IL-8报告基因的细胞作为效应细胞，与IL-33和人IL-33/ST2通路抑制剂混合后孵育，根据测得的所述报告基因的信号值来测定所述人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性，所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体，所述细胞天然表达人ST2的悬浮生长细胞。
例如，所述细胞为人外周血嗜碱性白血病细胞KU812、人脐静脉血管内皮细胞HUVEC、人肥大细胞HMC-1等。
优选地，本发明采用的细胞为人外周血嗜碱性白血病细胞KU812。根据本发明的具体实施方式，所述效应细胞为本发明提供的人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#。该细胞于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCCNo. 17414。
具体地，本发明的方法可包括以下步骤：
(1) 使用培养基将IL-33稀释为100pg/mL-20μg/mL，使用所述培养基将IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体稀释为1pg/mL-1mg/mL作为起始浓度，再向下以2-5倍的体积比稀释8-12个稀释度，然后将得到的系列稀释液分别与IL-33的稀释液以1:1的体积比混合；
(2) 使所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#在所述培养基中以10×104-160×104个细胞/mL的密度稀释，然后以1:1的体积比分别加入到步骤(1)得到的混合液中，混合后孵育12-24 h；
(3) 向步骤(2)得到的混合液中加入所述报告基因的化学发光底物，根据得到的相对化学发光单位值(RLU)拟合四参数曲线来确定所述抗体的生物学活性。
优选地，所述IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体为选自CNTO7160、GSK3772847、ANB020、AMG-282、RG-6149、MEDI 3506、REGN3500、LY-3375880、PF-06817024、MT-2990的一种或多种。
根据本发明的具体实施方式，本发明采用的IL-33（近岸蛋白质科技有限公司，货号C091）的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的第111-270位。
优选地，本发明采用的NF-κB报告基因或IL-8报告基因为NF-κB-荧光素酶或IL-8-荧光素酶。
优选地，在本发明的方法中，用包含NF-κB-荧光素酶核酸序列的载体转染KU812细胞，来构建所述效应细胞即人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#。
根据本发明的具体实施方式，该构建包括，取1×106个KU812细胞，1µg所述载体，以电压1000v、电击时间30ms、电击次数1次的条件来转染所述KU812细胞；其中所述载体可以为pGL4.32。
优选地，在本发明的方法中，例如在步骤(1)中，使用培养基将IL-33稀释为1μg/mL；优选地，使用培养基将IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体稀释为50μg/mL作为起始浓度，再向下以3倍的体积比稀释11个稀释度。
优选地，在本发明的方法中，例如在步骤(2)中，使所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#在培养基中以20×104-160×104个细胞/mL、优选40×104个细胞/mL的密度稀释，然后以1:1的体积比加入到步骤(1)得到的混合液中；优选地，混合后孵育16-24 h、优选16 h，优选在37℃下、5% CO2中孵育。
根据本发明的具体实施方式，在本发明的方法中，例如在步骤(1)和(2)中，培养基为IMDM+10% FBS。
优选地，在本发明的方法中，例如在步骤(3)中，使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，根据得到的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述抗体的生物学活性。
其中，所述荧光素酶试剂盒可以是Promega公司的Bio-Glo荧光素酶试剂盒、Biovision公司的Luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒、碧云天公司的荧光素酶报告基因检测试剂盒以及其他基于荧光素酶发光检测的试剂盒，按照说明书所述，进行所述报告基因的检测。
优选地，在96孔板中进行步骤(2)中所述混合后孵育，然后在酶标仪上进行步骤(3)中的读取相对化学发光单位值。
根据本发明的具体实施方式，本发明的方法包括以下步骤：
(1) 使用培养基IMDM+10% FBS将IL-33稀释为1μg/mL，使用培养基IMDM+10% FBS将IL-33单克隆抗体或ST2单克隆抗体稀释为50μg/mL作为起始浓度，再向下以3倍的体积比稀释11个稀释度，然后将得到的系列稀释液分别与IL-33的稀释液以1:1的体积比混合，并以50μL/孔铺到96孔板中；
(2) 使本发明提供的人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#在所述培养基中以40×104个细胞/mL的密度稀释，然后以50μL/孔加入到步骤(1)的96孔板中，在37℃下、5%CO2中孵育16 h；
(3) 向步骤(2)的96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶化学发光底物，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值，根据测得的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述抗体的生物学活性。
另一方面，本发明提供构建的人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#，所述细胞于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 17414。
还一方面，本发明提供表达NF-κB或IL-8报告基因的细胞作为效应细胞在检测人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性中的应用，其中所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体，所述细胞为天然表达人ST2的悬浮生长细胞。
优选地，所述细胞为KU812细胞。根据本发明的具体实施方式，所述效应细胞为本发明提供的人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#。
优选地，所述IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体为选自CNTO7160、GSK3772847、ANB020、AMG-282、RG-6149、MEDI 3506、REGN3500、LY-3375880、PF-06817024、MT-2990的一种或多种。
又一方面，本发明还提供上述方法在人IL-33/ST2通路抑制剂生产的质量控制中的应用，所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体。
优选地，所述IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体为选自CNTO7160、GSK3772847、ANB020、AMG-282、RG-6149、MEDI 3506、REGN3500、LY-3375880、PF-06817024、MT-2990的一种或多种。
除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“效应细胞”是指天然地或者人工地（例如通过将含有目的蛋白编码核酸序列的载体转染进细胞）表达NF-κB或IL-8报告基因的细胞。本发明的效应细胞起到IL-33/ST2通路中效应细胞的作用，或者模拟IL-33/ST2通路中的效应细胞。
本文中使用的术语“KU812/NF-κB细胞”是指天然地或者人工地（例如通过将含有目的蛋白编码核酸序列的载体转染进细胞）表达NF-κB-萤光素酶的KU812细胞。
本文中使用的术语“HEK293/ST2/IL-8细胞”是指天然地或者人工地（例如通过将含有目的蛋白编码核酸序列的载体转染进细胞）表达ST2和IL-8-萤光素酶的HEK293细胞。
本文中使用的术语“IL-33/ST2通路抑制剂”是指能够抑制IL-33/ST2通路信号转导的抑制剂，其通过与IL-33或者ST2结合从而阻断IL-33与ST2之间的相互作用，使得IL-33/ST2通路的信号转导被抑制。本发明中所用的IL-33/ST2通路抑制剂包括但不限于：IL-33单克隆抗体、ST2单克隆抗体、小分子抑制剂等。
本文中使用的术语“IL-33”是指白细胞介素33，也被称为NF-HEV或IL-1F11，在人中由IL-33基因所编码。
本文中使用的术语“ST2”是指生长刺激表达基因2蛋白（growth stimulationexpressed gene 2），也被称为ST2L、IL-1RL1、T1、Fit-1、DER-4、IL-1R4或ST2α，在人中由ST2基因所编码。
本文中使用的术语“NF-κB”是指核因子κB（nuclear factor-kappa B），其为IL-33介导的信号转导通路中非常关键的转录因子。
本文中使用的术语“IL-8”是指白细胞介素8（interleukin-8），其为IL-33所刺激细胞产生的细胞因子。
本文中使用的术语“NF-κB反应元件”是指NF-κB作为转录因子在细胞核内结合的碱基序列。
本文中使用的术语“NF-κB报告基因”是指与可检测部分（例如GFP、eGFP、萤光素酶、FITC、量子点等）有效连接从而使得可以对其表达进行定量的NF-κB反应元件基因。
本文中使用的术语“IL-8报告基因”是指与可检测部分（例如GFP、eGFP、萤光素酶、FITC、量子点等）有效连接从而使得可以对其表达进行定量的IL-8生成相关的反应元件基因。
本文中使用的术语“生物学活性”是指基于生物制品实现确定的生物学效应的特定能力或潜力，可采用特定细胞株（靶细胞）的生物学效应来评估生物制品相应的活性。
本文中使用的术语“四参数曲线”是指按照四参数方程Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))进行拟合的曲线，拟合曲线可以给出Top、Bottom、EC50、HillSlope等四个参数。
本发明人出人意料地发现，表达NF-κB或IL-8报告基因的细胞（例如，KU812细胞、HEK293细胞、HEK 293T17细胞、CHO细胞、293T/17 SF细胞、Hela细胞、HUVEC细胞、HMEC细胞、HMC-1细胞、LAD细胞等）可以代替上文所述的传统的细胞因子释放实验。通过在表达ST2的细胞系中转染NF-κB或IL-8报告基因，使得IL-33刺激ST2的信号通过报告基因的方式输出，进而再通过加入IL-33/ST2通路抑制剂来抑制报告基因的输出，可实现对该IL-33/ST2通路抑制剂生物学活性的测定。
在对细胞进行筛选中，本发明人发现，部分细胞由于ST2的天然表达量低，需要通过额外转染ST2表达质粒的方式人为提高ST2的表达量，才能产生较高的信号，由此具有无法良好模拟药物在体内起效情况、不贴合临床使用目的的缺陷。同时，在使用贴壁细胞进行实验时发现，构建得到的效应细胞需要胰酶消化才可在培养基中接种制成细胞悬浮液，而使用胰酶消化本身即是对细胞的一种外界刺激，IL33作为典型的应急响应蛋白，会随着这一外界刺激升高，结果反而刺激效应细胞内的信号通路，导致整体响应背景信号增高，信噪比降低；另外，贴壁细胞在消化铺板后还需要额外的静置贴壁时间，导致检测过程不够快速。
基于上述情况，本发明的发明人经过大量筛选工作，选择了天然过表达ST2的KU812细胞，用于构建本发明检测方法的效应细胞。针对KU812细胞这一悬浮生长细胞，选择了在特定电击条件下进行电击转染的方式，成功地构建了高表达NF-κB-荧光素酶报告基因的效应细胞。通过比较不同株的效应细胞在萤光素酶表达量、抗体生物学活性的测定信背比、传代稳定性等方面的性能，获得了一株具有更高萤光素酶表达量、更高信背比、更优传代稳定性的细胞株，即KU812/NF-κB-1#。并基于此，通过比较不同IL33浓度下的信背比以及四参数曲线拟合效果，建立了适于检测的合适的效应细胞浓度以及该效应细胞与IL33、IL-33/ST2通路抑制剂的孵育时间。
由此，本发明针对IL-33/ST2通路抑制剂、特别是单克隆抗体药物的生物学活性测定建立了更加快速、准确的定量检测方法。与现有技术相比，本发明提供的检测方法不需要任何人血液来源的细胞或其他成分，加入检测液后可以在不同的时间检测结果，实验周期短，操作简便，并且避免了长时间孵育和多步骤操作所带来的细胞污染和误差，显色结果稳定，质量更加可控；并且测定的生物学活性与临床疗效相关，符合CFDA相关的技术要求。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是KU812细胞在不同电击转染条件下的转染效率，图中的1A至1D分别为电击转染条件1至4的结果；
图2是KU812/NF-κB不同克隆的效应细胞萤光素酶活性测定结果；
图3是KU812/NF-κB细胞在不同IL-33浓度下的四参数曲线图；
图4是KU812/NF-κB细胞在不同抗体浓度下的四参数曲线图；
图5是HEK293/ST2/IL-8不同克隆的效应细胞萤光素酶活性测定结果；
图6是KU812/NF-κB细胞在不同细胞密度下的四参数曲线图；
图7是采用本发明方法测定三种单抗药物的活性结果；
图8是KU812/NF-κB-1#细胞和KU812/NF-κB-2#细胞测定ST2单克隆抗体生物学活性结果；
图9是KU812/NF-κB-1#细胞和KU812/NF-κB-2#细胞的稳定性结果；
图10是本发明检测方法和细胞因子生成法比较图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和材料的来源或购买情况如下：
KU812细胞，中国科学院细胞库，TCHu189；
HEK293细胞，ATCC，CRL-1573；
质粒pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro]，普洛麦格（北京）生物技术有限公司，E8491；
pDSRed质粒，Clontech，632406；
pcDNA3.1(+)/hST2，如下自制：
在苏州金唯智生物科技有限公司合成引物hST2-F（SEQ ID NO: 2：5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGGGTTTTGGATCTTAGCA-3’）和hST2-R1（SEQ ID NO: 3：5’-GGAATTCTCAGAAACACTCCTTACTTGGATT-3’），然后以hST2基因（购自义翘神州，货号HG10105-M）为模板，使用下面的PCR条件扩增hST2基因：
将扩增获得的hST2基因和pcDNA3.1(+)质粒使用EcoR I（Takara，货号1040A）和HindIII（Takara，货号1060A）进行双酶切，酶切获得的hST2 基因和pcDNA3.1(+)质粒进行酶连，然后转化到DH5α获得pcDNA3.1(+)/hST2质粒；
pGL4 [luc2P/hIL-8/Hygro]，普洛麦格（北京）生物技术有限公司，CS179401；
Bright-GloTM试剂盒，普洛麦格（北京）生物技术有限公司，E2620；
重组人白介素-33（rhIL33），自制或近岸蛋白质科技有限公司，C091，示于SEQ ID NO:1第111-270位的氨基酸序列；
ST2单克隆抗体CNTO7160、AMG-282，自制；
IL33单克隆抗体ANB020，自制。
生物材料的保藏：
人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#，按照实施例1所述过程构建，于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No. 17414。
实施例1 采用悬浮生长的KU812细胞构建效应细胞KU812/NF-κB
KU812是悬浮的人外周血嗜碱性白血病细胞，转染难度很大，化学转染法很难将质粒转染进细胞中，所以选择通过电击转染法实现。
比较了多个电击转染条件：
(1) 电击转染条件1：取1×106个KU812细胞，1µg pDSRed质粒（红色荧光质粒用于鉴定转染效率），电击电压1000v，电击时间50ms，电击次数1次；
(2) 电击转染条件2：取1×106个KU812细胞，1µg pDSRed质粒，电击电压1200v，电击时间40ms，电击次数1次；
(3) 电击转染条件3：取1×106个KU812细胞，1µg pDSRed质粒，电击电压1000v，电击时间30ms，电击次数1次；
(4) 电击转染条件4：取1×106个KU812细胞，1µg pDSRed质粒，电击电压1400v，电击时间10ms，电击次数1次。
四个转染条件对应的红色荧光蛋白表达对比结果可见图1。由图1可知电击转染条件3同时可以获得15%左右的转染效率及较高的活力，相比其他条件更适合用作pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]质粒转染。
采用电击转染条件3将质粒pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro]转染到KU812细胞中，然后在含有0.1 mg/ml潮霉素B的培养基IMDM+10% FBS中培养经转染的细胞，得到多个克隆。向96孔板中每孔加入50µL的培养基IMDM+10% FBS，部分孔中另外加入重组人IL-33，终浓度为1000ng/mL（加药组），部分孔中不加入作为对照（空白组）。将得到的不同克隆的细胞分别使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述对照孔或含IL-33孔中，37℃ 5% CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，萤光素酶活性测定结果见图2。
从图2可知，克隆1和克隆2表达萤光素酶较高，由其获得稳定细胞株KU812/NF-κB-1#和KU812/NF-κB-2#。
测定了KU812/NF-κB-1#细胞在不同IL-33浓度下的四参数曲线图。具体过程如下：将IL-33按照5000 ng/mL、1428.5714 ng/mL、408.1632 ng/mL、116.6180 ng/mL、33.3194ng/mL、9.5198 ng/mL、2.7199 ng/mL、0.7771 ng/mL、0.2220 ng/mL、0.0634 ng/mL、0.0181ng/mL、0.0051 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，50µL/孔加到96孔板中，然后将KU812/NF-κB-1#细胞使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述IL-33孔中，37℃ 5% CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，萤光素酶活性测定结果见图3。
测定了KU812/NF-κB-1#细胞在不同抗体浓度下的四参数曲线图。具体过程如下：将CNTO7160按照50000 ng/mL、16666.668 ng/mL、5555.556 ng/mL、1851.852 ng/mL、617.284 ng/mL、205.761 ng/mL、68.587 ng/mL、22.862 ng/mL、7.620 ng/mL、2.540 ng/mL、0.846 ng/mL、0.282 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，然后与1µg/mL IL-33进行1:1 稀释，稀释后按照50µL/孔加到96孔板中，然后将KU812/NF-κB-1#细胞使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述IL-33孔中，37℃ 5%CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，萤光素酶活性测定结果见图4。
实施例2 采用贴壁生长的HEK293细胞构建效应细胞HEK293/ST2/IL-8
使用化学转染的方法将pcDNA3.1(+)/hST2和pGL4 [luc2P/hIL-8/Hygro]共转染到HEK293细胞中，然后在含有0.5 mg/ml新霉素和0.1 mg/ml潮霉素B的培养基1640+10% FBS中培养经转染的细胞，得到多个克隆。将得到的不同克隆的细胞分别使用培养基1640+10%FBS稀释到40×104个/mL，在96孔板中按照50µL/孔，37℃ 5% CO2孵育过夜。第二天，向部分孔中加入重组人IL-33，终浓度为1000n g/mL（加药组），部分孔中不加入作为对照（空白组），37℃ 5%CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，萤光素酶活性测定结果见图5。
从图5可知，克隆110表达萤光素酶较高，由其获得稳定细胞株HEK293/ST2/IL-8-110#。
实施例3 效应细胞KU812/NF-κB与HEK293/ST2/IL-8的比较
HEK293/ST2/IL-8作为一种贴壁细胞，在进行传代使用过程中需要采用胰酶进行消化传代。使用胰酶消化本身是对细胞的一种外界刺激，而IL33作为典型的应急响应蛋白，会随着这一外界刺激升高，结果反而刺激HEK293细胞内的信号通路，导致整体响应背景信号增高，信噪比降低。另外，HEK293/ST2/IL-8在消化铺板后需要一天的静置贴壁时间。KU812/NF-κB是悬浮细胞就不存在上述问题。
KU812/NF-κB与HEK293/ST2/IL-8两种效应细胞的比较总结可见表1。
表1 KU812/NF-κB与HEK293/ST2/IL-8两种方法比较
实施例4：基于KU812/NF-κB效应细胞的方法优化
（一）细胞密度优化：
将实施例1中构建的KU812/NF-κB-1#细胞按照5000个/孔、10000个/孔、20000个/孔、40000个/孔、80000个/孔铺板，50µl/孔；rhIL33稀释到5000ng/ml，然后按照2倍倍比稀释到2500 ng/ml、714.2857 ng/ml、204.0816 ng/ml、58.3090 ng/ml、16.6597 ng/ml、4.7599ng/ml、1.3599 ng/ml、0.3885 ng/ml、0.1110 ng/ml、0.0317 ng/ml、0.0090 ng/ml，50µl/孔；37℃，5% CO2孵育16-24h。然后每孔加入100μL Bright-GloTM试剂盒中的发光底物，检测化学发光值，采用Graphpad拟合四参数曲线（图6），计算各浓度下的信背比（S/B），具体见表2。
表2 不同细胞密度下信背比比较
（二）孵育时间优化：
将KU812/NF-κB-1#细胞按照20000个/孔铺板，50µl/孔；rhIL33稀释到5000ng/ml，然后按照2倍倍比稀释到2500 ng/ml、714.2857 ng/ml、204.0816 ng/ml、58.3090 ng/ml、16.6597 ng/ml、4.7599 ng/ml、1.3599 ng/ml、0.3885 ng/ml、0.1110 ng/ml、0.0317 ng/ml、0.0090 ng/ml，50µl/孔；37℃，5% CO2分别孵育6h、16h、24h。结果发现，在6 h孵育条件下并不能拟合出四参数曲线，而在孵育16 h和24 h条件下，则可以拟合出四参数曲线，且信背比接近。所以选择16 h作为最佳孵育时间。
实施例5：根据本发明的方法测定IL-33单克隆抗体和ST2单克隆抗体的生物学活性
IL-33配制：使用培养基IMDM+10% FBS将0.5mg/mL的IL-33稀释到1000 ng/mL；
药物配制：使用培养基IMDM+10% FBS将IL-33单克隆抗体或ST2单克隆抗体稀释到50000 ng/mL；
药物稀释：使用培养基IMDM+10% FBS将IL-33单克隆抗体或ST2单克隆抗体以50000ng/mL作为起始浓度，再向下进行3倍的体积比稀释11个稀释度；将稀释好的药物与配制好的IL-33稀释液进行1:1的体积比混合，并铺到96孔板中，50µL/孔。
效应细胞加入：将效应细胞采用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述96孔板中，37℃ 5% CO2孵育16 h。
检测：使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，1:1 (100µL:100µL)加入Bright-GloTM试剂盒中的发光底物测定萤光素酶的表达。
三种不同的IL-33单克隆抗体和ST2单克隆抗体的药物活性测定结果见图7。
实施例6 KU812/NF-κB-1#和KU812/NF-κB-2#两株细胞在测定抗体生物学活性中的比较
（1）两株细胞的信背比差异比较：
将CNTO7160按照50000 ng/mL、16666.668 ng/mL、5555.556 ng/mL、1851.852 ng/mL、617.284 ng/mL、205.761 ng/mL、68.587 ng/mL、22.862 ng/mL、7.620 ng/mL、2.540 ng/mL、0.846 ng/mL、0.282 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，然后与1000ng/mL IL-33进行1:1体积比混合，混合后按照50µL/孔加到96孔板中，然后将KU812/NF-κB-1#细胞或KU812/NF-κB-2#细胞使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述含IL-33孔中，37℃ 5% CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，比较两株细胞在测定ST2单克隆抗体生物学活性中的信背比差异，具体结果见图8和表3。
由表3可知，KU812/NF-κB-1#细胞在测定ST2单克隆抗体生物学中的信背比上明显高于KU812/NF-κB-2#。
表3 KU812/NF-κB-1#细胞和KU812/NF-κB-2#细胞测定ST2单克隆抗体生物学活性比较
（2）两株细胞的稳定性比较：
将KU812/NF-κB-1#细胞和KU812/NF-κB-2#细胞连续传代30个代次后形成KU812/NF-κB-1#细胞（高代次）和KU812/NF-κB-2#细胞（高代次），然后分别与传代3个代次的低代次KU812/NF-κB-1#细胞（低代次）和KU812/NF-κB-2#细胞（低代次）进行稳定性比较。具体过程如下：将CNTO7160按照50000 ng/mL、16666.668 ng/mL、5555.556 ng/mL、1851.852 ng/mL、617.284 ng/mL、205.761 ng/mL、68.587 ng/mL、22.862 ng/mL、7.620 ng/mL、2.540 ng/mL、0.846 ng/mL、0.282 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，然后与1000ng/mL IL-33进行1:1体积比混合，混合后按照50µL/孔加到96孔板中；然后将上述KU812/NF-κB-1#细胞（高代次）、KU812/NF-κB-2#细胞（高代次）、KU812/NF-κB-1#细胞（低代次）、KU812/NF-κB-2#细胞（低代次）使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述含IL-33孔中，37℃ 5%CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达，比较两株细胞在低代次和高代次之间稳定性。具体结果见图9。
由图9可知KU812/NF-κB-2#细胞在传了30代后，用于ST2单克隆抗体生物学活性的最大信号值明显下降，而KU812/NF-κB-1#细胞在传了30代后并未发生信号值下降的问题，这表明KU812/NF-κB-1#细胞的稳定性明显优于KU812/NF-κB-2#细胞。
实施例7：本发明的检测方法和细胞因子生成法的比较
（1）本发明的检测方法：
将CNTO7160按照50000 ng/mL、16666.668 ng/mL、5555.556 ng/mL、1851.852 ng/mL、617.284 ng/mL、205.761 ng/mL、68.587 ng/mL、22.862 ng/mL、7.620 ng/mL、2.540 ng/mL、0.846 ng/mL、0.282 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，然后与1000ng/mL IL-33进行1:1体积比混合，混合后按照50µL/孔加到96孔板中，然后将KU812/NF-κB-1#细胞使用培养基IMDM+10% FBS稀释到40×104个/mL，按照50µL/孔加入到上述含IL-33孔中，37℃ 5% CO2孵育16 h。然后采用Bright-GloTM试剂盒，按照说明书，1:1 (100µL:100µL)加入发光底物，测定萤光素酶的表达。
（2）细胞因子生成法：
将CNTO7160按照100000 ng/mL、25000 ng/mL、6250 ng/mL、1562.5 ng/mL、390.625ng/mL、97.656 ng/mL、24.414 ng/mL、6.103 ng/mL等浓度采用培养基IMDM+10% FBS进行梯度稀释，然后与80 ng/mL IL-33进行1:1体积比混合，混合后按照50µL/孔加到96孔板中，然后将KU812细胞采用培养基IMDM+10% FBS稀释到2×106个/mL，37℃ 5% CO2孵育48 h。48h后采用R&D Human IL-5 DuoSet ELISA试剂盒（货号DY205-05）测定上清中IL-5水平。
比较结果见图10。
进行多次重复测定，发现本发明的生物学活性测定方法稳定性较高，加入检测液后可以在不同的时间检测结果，显色结果稳定，质量更加可控，相较于传统的细胞因子检测方法具有更快更准的优势，同时，本方法不需要任何人血液来源细胞或其他成分。并且，本方法测定的生物学活性与临床疗效相关，符合CFDA相关的技术要求。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
序列表
<110> 迈威（上海）生物科技有限公司
南京诺艾新生物技术有限公司
<120> 用于测定人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法
<130> LC19110004
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 270
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<221> PEPTIDE
<222> ()..()
<223> IL-33
<400> 1
Met Lys Pro Lys Met Lys Tyr Ser Thr Asn Lys Ile Ser Thr Ala Lys
1 5 10 15
Trp Lys Asn Thr Ala Ser Lys Ala Leu Cys Phe Lys Leu Gly Lys Ser
20 25 30
Gln Gln Lys Ala Lys Glu Val Cys Pro Met Tyr Phe Met Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Gly Leu Met Ile Lys Lys Glu Ala Cys Tyr Phe Arg Arg Glu Thr
50 55 60
Thr Lys Arg Pro Ser Leu Lys Thr Gly Arg Lys His Lys Arg His Leu
65 70 75 80
Val Leu Ala Ala Cys Gln Gln Gln Ser Thr Val Glu Cys Phe Ala Phe
85 90 95
Gly Ile Ser Gly Val Gln Lys Tyr Thr Arg Ala Leu His Asp Ser Ser
100 105 110
Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Thr
115 120 125
Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr Glu
130 135 140
Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val Leu
145 150 155 160
Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp Gly
165 170 175
Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp Phe
180 185 190
Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys Cys
195 200 205
Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met His
210 215 220
Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe Ile
225 230 235 240
Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
260 265 270
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 引物
<400> 2
cccaagcttg ccgccaccat ggggttttgg atcttagca 39
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<221> gene
<222> ()..()
<223> 引物
<400> 3
ggaattctca gaaacactcc ttacttggat t 31

Claims (14)

1.一种用于测定人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性的方法，所述方法包括：使用人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#作为效应细胞，与IL-33和人IL-33/ST2通路抑制剂混合后孵育，根据测得的所述报告基因的信号值来测定所述人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性，所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体，所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 17414。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 使用培养基将IL-33稀释为100pg/mL-20μg/mL，使用所述培养基将IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体稀释为1pg/mL-1mg/mL作为起始浓度，再向下以2-5倍的体积比稀释8-12个稀释度，然后将得到的系列稀释液分别与IL-33的稀释液以1:1的体积比混合；
(2) 使所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#在所述培养基中以10×104-160×104个细胞/mL的密度稀释，然后以1:1的体积比分别加入到步骤(1)得到的混合液中，混合后孵育12-24 h；
(3) 向步骤(2)得到的混合液中加入所述报告基因的化学发光底物，根据得到的相对化学发光单位值(RLU)拟合四参数曲线来确定所述抗体的生物学活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体为选自CNTO7160、GSK3772847、ANB020、AMG-282、RG-6149、MEDI 3506、REGN3500、LY-3375880、PF-06817024、MT-2990的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述IL-33的氨基酸序列示于SEQ IDNO: 1所示氨基酸序列的第111-270位。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用培养基将IL-33稀释为1μg/mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，使用培养基将IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体稀释为50μg/mL作为起始浓度，再向下以3倍的体积比稀释11个稀释度。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，使所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#在培养基中以40×104个细胞/mL的密度稀释，然后以1:1的体积比分别加入到步骤(1)得到的混合液中。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，混合后孵育16 h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中的培养基为IMDM+10%FBS。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，根据得到的相对化学发光单位值拟合四参数曲线确定所述抗体的生物学活性。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在96孔板中进行步骤(2)中所述混合后孵育，然后在酶标仪上进行步骤(3)中的读取相对化学发光单位值。
12.人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#，所述细胞于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 17414。
13.人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#作为效应细胞在检测人IL-33/ST2通路抑制剂的生物学活性中的应用，其中所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体，所述人外周血嗜碱性白血病细胞KU812/NF-κB-1#于2019年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 17414。
14.权利要求1至11中任一项所述的方法在人IL-33/ST2通路抑制剂生产的质量控制中的应用，所述人IL-33/ST2通路抑制剂为IL-33单克隆抗体和/或ST2单克隆抗体。
CN201910512938.4A 2019-06-14 2019-06-14 用于测定人il-33/st2通路抑制剂的生物学活性的方法 Active CN110045131B (zh)

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