CN104094115B - 基于细胞的传感器 - Google Patents

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Abstract

基于细胞的传感器。本发明涉及可用于药物发现的新型基于细胞的传感器，其包括这样的细胞系，所述细胞系具有分泌颗粒的专职调节的胞吐作用转染有作为报道分子多肽储存在具有专职调节的胞吐作用的细胞系的调节的分泌颗粒中的非蛋白酶水解酶并且具有作为调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的内源性或异源性分子。所述颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子至少具有：对所述颗粒内已存在的条件如低pH和通过其他蛋白酶的蛋白质分解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；高度特异性底物；在细胞解冻时无毒性；在未被刺激或基础条件下的极低水平的分泌；和对于高通量强大且灵敏的检测在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相适合的介质中的高信号/背景活性。

Description

基于细胞的传感器
发明领域
本发明包含于生物技术和药学领域。本发明涉及可用于药物发现、诊断和分析物确定的基于细胞的传感器(cell based sensor)，所述基于细胞的传感器包括这样的细胞系，所述细胞系具有分泌颗粒的专职(professional)调节的胞吐作用过表达非蛋白酶水解酶，所述非蛋白酶水解酶优选地选自包含以下各项的组：具有颗粒靶向蛋白的Gaussia萤光素酶融合蛋白，分泌型碱性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶的β链，作为可能报道分子多肽，储存在具有专职调节的胞吐作用的细胞系的调节的分泌颗粒中，并且具有作为调节的分泌颗粒胞吐作用的调质(modulator)的内源性或异源性分子，所述颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子至少具有：对在所述颗粒内部已存在的条件如低pH和通过蛋白酶的蛋白质分解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；无毒性，特别是在细胞解冻后；高度特异性底物；在未被刺激或基础条件下极低水平的分泌；和对于高通量强大且灵敏的检测的在与细胞培养物生存力和颗粒胞吐作用相适合的介质中的高信号/背景活性。
当所述基于细胞的传感器与胞吐作用调质的特异性配体温育时，报道分子多肽从颗粒释放到胞外介质中并且这样的释放的非蛋白酶水解酶报道分子多肽的酶活性用特异性底物检测。
这样的灵敏的基于细胞的传感器可用于检测至少两个分子之间的相互作用，该两个分子中的一个充当胞吐作用调质而另一个充当胞吐作用调质的特异性配体。这样的传感器的用途的实例是：测试药物发现中的分子之间的相互作用，以量化分子如蛋白质或挥发性有机化合物以用于诊断和检测例如在食品工业、在环境样品和在制药工业中的若干样品中的药物或分子。
背景技术
G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族代表在真核细胞的膜上被表达的超过 1000个表面受体的单个最大部分。
GPCR是细胞与其胞外介质通信的中心，而且还用于视觉、味觉和嗅觉。因此，用来测量和/或量化通过化合物的GPCR活性的激活或抑制的方法对于药物发现以及对于疾病诊断很重要。
通过具有专职调节的胞吐作用的造血细胞的胞吐作用在现有技术中是已知的，同样还有通过结合至GPCR的激动剂诱导的胞吐作用。但是这样的胞吐作用总是被测量为百分比，因为储存在细胞的颗粒中的酶的量，例如β-氨基己糖苷酶的量的大的可变性。为了确定胞吐作用的百分比，进行第一测量以量化在配体和受体结合后颗粒储存的酶的配体诱导释放的量，然后细胞用去垢剂溶菌，再次温育并确定细胞内部储存的总酶。未被刺激的细胞的背景从配体诱导的释放和总释放二者中减去，然后胞吐作用的百分比是在配体情况下的特异性释放和总特异性释放之间的比率。但是这种释放百分比的确定具有多个步骤，这增加测定的成本、增加测定时间并因此减少通量。而且，胞吐作用的百分比在许多情况下是极低的并因此这种测定具有低的灵敏度。
之前已由本专利申请的发明人在PCT/EP2010/004619中证实，某些蛋白酶如人粒酶B可以在具有专职胞吐作用的造血细胞的这样的颗粒内过表达，这样的测定具有提高的信号/背景比以及在所述颗粒内存在稳定的蛋白酶产生以至胞吐作用的百分比不需要比较两个实验之间的胞吐作用。如在PCT/EP2010/004619中所述，用于颗粒分泌的最广泛使用的报道分子是内源性β-氨基己糖苷酶，但这种蛋白质传统上已被认为是低灵敏度报道分子，具有低信号/背景比和由于储存在颗粒中的酶的量的随时间的巨大变化所致的实验之间的大的可变性。因此，尽管PCT/EP2010/004619公开了β-氨基己糖苷酶作为报道分子的可能用途，但是它不能被认为是本发明的充分公开内容，因为PCT/EP2010/004619的教导不能使本领域技术人员能够利用β-氨基己糖苷酶作为报道分子，因为事实上在该现有技术中进行的公开，其实际上教导背离所述用途，说明为什么β-氨基己糖苷酶不是可靠报道分子。此外，在本发明中，β-氨基己糖苷酶没有被这样地用作报道分子，而仅仅是该酶的β链并过表达。
另外，造血细胞的颗粒内部的蛋白酶如粒酶B的过表达对于细胞是有 毒的，尤其是在细胞解冻后，其中约30-40百分比的细胞在解冻后24小时死亡。
本发明聚焦于开发基于细胞的传感器，所述基于细胞的传感器包括与现有技术中已知的基于细胞的传感器中使用的报道分子不同的报道分子。
发明描述
发明简述
本发明克服了上述问题，证实不是蛋白酶的其他水解酶当在解冻的细胞的颗粒内过表达时不是有毒的，并且它们允许开发高灵敏度的传感器。特别是，某些糖苷酶如β-氨基己糖苷酶的B链和磷酸酶如分泌型碱性磷酸酶以高水平储存在具有专职调节的胞吐作用的造血细胞的颗粒内，并且通过具有高信号/背景比且具有低的测定间可变性的配体诱导的胞吐作用进行检测。另外，本发明还证实，以上发明的具体实施方案可以概括至可以借助于颗粒靶向多肽被重新引向颗粒的通常不储存在颗粒内的其他非蛋白酶水解酶。例如，Gaussia萤光素酶是通常不储存在颗粒内的非蛋白酶水解酶，其可以借助于颗粒靶向多肽如粒酶B被重新引向颗粒，过表达并储存在颗粒中，并且通过配体诱导的胞吐作用如β-氨基己糖苷酶一样释放。因此，过表达无毒性的非蛋白酶水解酶的造血细胞成为具有用于测量胞吐作用的低可变性的灵敏的基于细胞的传感器。
定义以下术语用于本发明的目的：
·传感器:是一种换能器。换能器定义为将信号从一种形式转换为另
一种的任何装置。转换生物学信号的传感器称为生物传感器。
·调节的胞吐作用：其是指其中专门的细胞分泌神经递质、激素、酶、肽或低分子量物质(例如，儿茶酚胺，谷氨酸等)的过程。通常，胞内Ca2+浓度升高触发胞吐作用，但存在同样调节或介导Ca2+触发的胞吐作用的其他胞内信号，包括cAMP、二酰甘油(DAG)、磷脂和ATP。具有专职调节的胞吐作用的细胞是指通常在其颗粒内储存代谢物或多肽并且在胞外信号后释放这样的颗粒储存的代谢物或多肽的细胞。
·分泌颗粒或分泌小泡或分泌溶酶体:它们是用作用于所选分泌产物的储存池的专门的胞内细胞器。分泌颗粒通过刺激物或调质朝向细胞周围移动，它们的膜与细胞膜融合，并且它们的内含物载荷释放。尽管在大多数细胞类型中，分泌颗粒看起来代表全新的一类细胞器，但是各种造血细胞和某些其他细胞类型中的颗粒与溶酶体共享若干性能。
·造血细胞:它们是来源于骨髓干细胞的细胞并且包括所有血细胞类型，这包括髓样(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和一些树突细胞)和淋巴系(T细胞、B细胞、NK细胞、一些树突细胞)。
·具有调节的胞吐作用的细胞系:如本文使用的，术语"具有调节的胞吐作用的细胞"、"专职分泌细胞系"和"具有专职调节的胞吐作用的细胞系"可以互换使用。对于本发明的方法，重要的细胞系是具有专职调节的胞吐作用的细胞系。
·报道分子多肽或报道分子:其是研究者附着至细胞培养物、动物或植物中关注的另一基因的基因。某些基因被选择作为报道分子，是由于它们给表达它们的有机体赋予的特性容易被鉴别和测量，或者由于它们是可选择标志。报道基因通常用来确定关注的基因是否被细胞或有机体群吸收或在它们中被表达。本文中的报道基因是储存在专职分泌细胞系如某些造血细胞的分泌颗粒内的多肽并且通过胞吐作用的刺激物或调质而释放到胞外介质中。
·颗粒靶向多肽:其是天然储存在具有调节的胞吐作用的细胞的颗粒内的多肽。这样的多肽含有将蛋白质靶向颗粒的已知或未知的序列。这样的颗粒靶向多肽的实例包括β-氨基己糖苷酶、p-选择蛋白、粒酶如A、B、M、H、K、组织蛋白酶。通常不储存在颗粒中的蛋白质可以通过与颗粒靶向多肽形成融合蛋白而储存到颗粒中。在本发明中，我们使用术语“重新引向”来描述这样的事实，即通常不 储存在颗粒中的蛋白质可以与另一个蛋白质融合并且所得蛋白质也可以储存到颗粒中。
·水解酶:其是催化化学键水解的酶。水解酶被归类在酶的EC数分类中的第3组并且可以进一步分成若干亚类(基于它们作用的键)：切割酯键的酯酶如核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、磷酸酶；切割糖类的糖苷酶和蛋白酶，包括粒酶，或切割肽键的肽酶。
·非蛋白酶水解酶:其是催化不同于肽键的化学键水解的酶。
·调节的胞吐作用的调质：其是指能够改变调节的胞吐作用过程中涉及的一个或多个下游信号转导通路的化合物、分子或组合物。这种活性的改变包括抑制(即，所述化合物、分子或组合物是胞吐作用的"抑制剂")，以及刺激、诱导或增强(即，所述化合物、分子或组合物是胞吐作用的"刺激剂"、“诱导剂”或"增强剂")。这些调质利用体外和/或体内测定鉴别。在这些测定中，使用对照以允许样品之间对比。
·药物发现:其是指发现和/或设计药物的过程。如本文使用的，药物发现包括对于亲和性、副作用、生物利用度的药物鉴别和修饰以及测试之前投放到市场上的药物在新的治疗病征中的作用，也称为重新评价的过程。
·基因:其是遗传性的基本物理和功能单位。在生物化学术语中，基因是位于编码具体功能产物(即，蛋白质或RNA分子)的特定染色体上的特定位置中的核苷酸的有序序列。如本文使用的，基因不仅由编码序列组成而且可以包含在编码序列的转录控制中涉及的相邻DNA区域(例如，启动子，增强子)和内含子。位于编码区域的5’并且在mRNA上存在的序列被称为5'未翻译的序列。位于编码区域的3’或下游并且在mRNA上存在的序列被称为3'未翻译的序列。术语"基因"涵盖cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆体含有用称为“内含子”或“插入区域”或“插入序列”的非编码序列中断的编码区域。内含子是转录入异源核RNA(hnRNA)中的 基因的区段；内含子可以含有调节元件如增强子。内含子从核或主要转录本去除或“剪接掉”；内含子因此在信使RNA(mRNA)转录本中缺乏。mRNA在翻译期间起作用以规定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
·“稳定地引入的”或“稳定地转化的”或“稳定地转导的”或“稳定地转染的”或“稳定地电穿孔的”：其是指具有整合到其基因组中的所需外来DNA的细胞的部分。取决于所使用的表达载体和转染技术，可以仅细胞的一部分将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码选择性标记(例如对抗生素的耐受性)的基因连同关注的基因一起引入到宿主细胞中。优选的选择性标记包括提供对药物(如G418、潮霉素和嘌呤霉素)的耐受性的那些。编码选择性标记的核酸可以在与编码可检测翻译产物的相同载体上被引入宿主细胞中，或者可以在单独的载体上被引入。稳定地转染有引入的核酸的细胞可以通过药物选择鉴别(例如，已结合选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
·表面受体:其是指这样的分子，该分子出现在细胞的表面上，与胞外环境相互作用并且以最终调节特定启动子的转录的方式细胞内地转送或转换关于环境的信息，导致特定基因的转录。表面受体的实例是酪氨酸激酶受体,离子通道受体,细胞因子受体,趋化因子受体或G-蛋白偶联受体(GPCR)，如化学引诱物肽受体、神经肽受体、光受体、神经递质受体或多肽激素受体。
·G蛋白偶联受体(GPCR)，也称为七次跨膜受体、7TM受体、七螺旋受体和G蛋白连接受体(GPLR)：它们是特征在于具有胞外N末端和细胞质C末端的七次膜跨结构域的跨膜受体的大的蛋白家族。结合至GPCR的配体促进构象变化，导致小的G-蛋白偶联、信号转导通路的启动，并且最终导致细胞响应。结合并激活这些受体的配体包括光敏化合物、臭味、信息素、激素和神经递质，并且大小从小分子变化至肽到大蛋白质。G蛋白偶联受体仅在高等真核细胞中 发现，包括酵母、植物，并且尤其是动物。G蛋白偶联受体涉及许多疾病，但也是所有现代医学药物的约一半的靶标。
·GPCR:它们通过类似放入分子机制操作。GPCR通过胞外刺激的激活在受体中引起构象变化，这导致GTP-结合蛋白(G蛋白)的中间偶联和激活。G蛋白在性质上是异源三聚的并且由通过不同基因编码的alpha(α)、beta(β)和gamma(γ)亚基构成。α亚基负责GDP和GTP的结合。配体与GRCP的结合导致α(α)亚基从GDP结合形式转变为GTP结合形式，并且导致该异源三聚体通过α-GTP从βγ二聚体解离的激活。α-GTP和βγ二聚体二者调控将信号通过产生第二信使分子(例如，钙，cAMP等)发送至细胞内部的各种效应子的活性。存在至少17个Galpha(Gα)基因，并且G蛋白的成员可以分为称为Gαi/0、Gαq/11、Gαs和Gα12/13的四个主类(参见例如Preininger AM和Hamm HE.Sci.STKE 2004,re3和Cabrera-Vera TM等EndocrRev.2003Dec；24(6):765-81。如本文使用的，GPCR包括偶联至任一Gαi/0、Gαq/11、Gαs和Gα12/13的受体。
·具有内在酶酪氨酸激酶活性的受体(RTK)：它们对于许多多肽生长因子、细胞因子和激素是高亲和力细胞表面受体。在人基因组中鉴别的九十个独特酪氨酸激酶基因中，58个编码受体酪氨酸激酶蛋白。大多数RTK是单个亚基受体，但是一些例如胰岛素受体作为多聚复合物存在。每个单体具有单个跨膜结构域、胞外N端区域和胞内C端区域。该胞外N端区域由结合胞外配体(例如，特定的生长因子)的极大蛋白结构域构成。胞内C端区域由调节结构域和负责这些受体的激酶活性的结构域(其特异性地磷酸化酪氨酸氨基酸)构成。
·嵌合受体:它们是基于将一个受体的部分与另一个受体的部分、蛋白质片段、标记物及其任意组合结合的人工受体，包括整个结构域及其部分。一般，嵌合蛋白质或“融合蛋白”是包含与至少另一个肽序列或另一个多肽融合的所需蛋白质产物的至少一部分。
·载体或质粒载体或质粒:术语"载体"用来指这样的载体核酸分子，其中核酸序列可以插入其内以引入到其可以被复制的细胞中。核酸序列可以是"异源的"，这意指它对于其中引入载体的细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列是同源的但在宿主细胞核酸的其中通常没有发现该序列的位置中。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体，动物病毒和植物病毒)、以及人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员将良好装备以通过标准重组技术构建载体(参见，例如，Maniatis等，Molecular Cloning(分子克隆),A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,1990)和Ausubel等，1994,Current Protocols In MolecularBiology(分子生物学中的当前方案)(John Wiley&Sons,1996)，这二者通过引用结合于此)。
·表达载体:术语"表达载体"是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。表达载体通常至少包含启动子和poly-A信号。启动子是作为控制转录的启动和速率的核酸序列的区域的控制序列。poly-A信号或终止信号包含在RNA转录通过RNA聚合酶的特定终止中涉及的DNA序列。在体内终止子可以是必需的以实现理想的信息水平。
·启动子:启动子是含有涉及相邻编码序列的转录的控制的区域的DNA的序列。远离启动子的转录开始位点定位的特定调控DNA序列被称为增强子。启动子的其他序列包含TATA盒序列，该TATA盒序列结合至有助于RNA聚合酶转录复合体形成的TATA结合蛋白。但是相关序列在不同启动子之间具有大的可变性。通过比较不同启动子，已经确定了共有序列。给定启动子符合所述共有序列的程度决定了该启动子的强度。序列与共有序列越接近，则启动子将越强大，并且在该启动子处更频繁地发生转录。启动子强度由于其决定给定mRNA序列转录的频率而是重要的，有效地相对于其他基因给一些基因提供转录的更高优先级。可以预期编码例如大量需要的蛋白的基因具有相对强的启动子。因此，启动子分类为强或弱是相对的分类，其中强启动子比弱启动子更频繁地被转录。因此，如 本文中使用的，强启动子是比其他启动子更频繁地被转录且比弱启动子产生更高蛋白质水平的启动子。强启动子的实例是CMV启动子、延伸因子1-α启动子和CMV与MoMLV5′LTR启动子之间的嵌合启动子。
·过表达:通过利用表达载体，蛋白质可以在细胞系中过表达以增加这样的细胞系中之前存在的蛋白质水平或者在这样的细胞系中产生大量的蛋白质。通常用于蛋白质过表达的表达载体是强组成型或强诱导型启动子。
·信号肽或信号序列：信号肽是指导蛋白质的翻译后转运的短(3-60个氨基酸长)肽链。信号肽也可以被称为靶向信号、信号序列、运输肽或定位信号。信号肽的氨基酸序列将蛋白质(其在细胞溶胶中被合成)引向某些细胞器如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体、质外体(apoplast)和过氧化物酶体(peroxisome)。一些信号肽在蛋白质被转运后通过信号肽酶从该蛋白质切割。
·肽标记物：肽标记物是短肽，其可以用于检测蛋白质，例如在蛋白质的特异性抗体不可用时利用抗体或用于蛋白质纯化。可以用于细胞表面检测和分离的已知肽标记物的实例是c-myc标记物、HA标记物和FLAG sup.TM标记物。一般地，可获得其特异性结合蛋白的任何肽标记物都可以用于表面检测和或分离，假定这样的特异性结合蛋白被用荧光团或例如用用于表面分离的小珠直接或间接标记。
·基础分泌：基础分泌是指在没有细胞胞吐作用的调质下通过细胞分泌的蛋白质的相对量。在几乎所有的分泌细胞类型中，可以检测基础分泌的水平。还不知晓基础分泌是由于储存在颗粒中的蛋白质的释放所致还是来自远离分泌颗粒储存的新合成的蛋白质的一部分。(参见例如Burgoyne RD和Morgan A.Physiol Rev(2003)83:581–632)。
·重组DNA(rDNA)分子：其是指通过可操作地将核酸序列如基因连接至DNA分子序列产生的DNA分子。
·转化或转染：如本文使用的，其是指将外来DNA引入到细胞(例如原核或真核细胞)中。转化可以通过本领域已知的各种方式完成，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、聚凝胺-介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂转染、原生质融合、逆转录病毒感染和生物射弹(biolistics)。特别地，当合适的抗生素没有被包含在细胞培养基中以用于选择带有DNA稳定整合到染色体中的细胞时，转入到真核细胞中可以瞬间的。用于稳定选择的质粒载体必须具有在要利用抗生素进行选择的细胞中表达的选择性标记。
·包含:该术语，在全部本专利说明书中，包括，具体地，术语“组成”，当特别地指生物学序列作为氨基酸或核苷酸序列时。其意指该序列可以包含视为生物活性或技术效果的本发明主要依赖的片段，任选地结合至其他序列片段或序列部分；或简单地，被精确地限制为片段本身。
附图简述
图1.其显示本发明的总体构思，使用非蛋白酶水解酶作为颗粒储存的报道分子，IgE受体作为介导颗粒胞吐作用的细胞表面受体和通过分泌的颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子切割的底物用于检测。细胞用结合至高亲和性受体结合的IgE的多聚抗原(例如，变应原)处理诱导颗粒储存的非蛋白酶水解酶的释放，并且这样的非蛋白酶水解酶切割底物以产生荧光终产物。利用分泌的报道分子酶的这种特异性底物，可以确定配体受体相互作用(ligand-to-receptor-interation)。
图2.本发明的总体构思的图示，使用非蛋白酶水解酶作为颗粒储存的报道分子，GPCR作为介导颗粒胞吐作用的细胞表面受体和通过分泌的颗粒储存的水解酶报道分子切割的荧光底物用于检测。细胞用GPCR的激动剂处理诱导颗粒储存的水解酶的释放并且这样的水解酶切割底物以产生荧光终产物。使用分泌的报道分子酶的特异性底物，可以确定配体受体 相互作用。
图3.本方面的代表性质粒载体的总体结构。具有潮霉素抗性、用来在嵌合hCMV-MoMLV5′-LTR强组成型启动子(A)或四环素诱导型启动子(B)控制下稳定地表达HEXBβ链、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)或作为粒酶B与Gaussia萤光素酶的融合体形成的嵌合蛋白的质粒载体的图谱。
发明详述
如上所述，本发明涉及可用于药物发现、诊断和分析物确定的基于细胞的传感器，所述基于细胞的传感器包含细胞系，所述细胞系具有分泌颗粒的专职调节的胞吐作用，过表达非蛋白酶水解酶，所述非蛋白酶水解酶优选地选自包含以下各项的组：具有颗粒靶向蛋白的Gaussia萤光素酶融合蛋白；分泌型碱性磷酸酶和β-氨基己糖苷酶的β链，作为可能的报道分子多肽，储存在具有专职调节的胞吐作用的细胞系的调节的分泌颗粒中，并且具有作为调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的内源性或异源性分子。所述颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子至少具有：对颗粒内已存在的条件，如低pH和通过蛋白酶的蛋白质水解的高耐受性；胞吐作用后的酶活性；高度特异性底物；无毒性，尤其是在细胞解冻后；在未被刺激或基础条件下的极低水平的分泌；和对于高通量强大且灵敏的检测的在与细胞培养物存活力和颗粒胞吐作用相适合的介质中的高信号/背景活性。
当基于细胞的传感器与胞吐作用调质的特异性配体温育时，报道分子多肽从颗粒释放到胞外介质中并且这样释放的报道分子多肽的酶活性用特异性底物检测。
因此本发明的基于细胞的传感器包含：具有专职调节的胞吐作用的造血细胞系；颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子，所述颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子被转染到所述造血细胞系中并且所述颗粒储存的报道分子在合适启动子的控制下在所述造血细胞系中过表达；在合适启动子控 制下的胞吐作用调质例如表面受体，如GPCR，以及用于检测分泌的颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子的特异性底物。
这样灵敏的基于细胞的传感器可用于检测至少两种分子(一个充当胞吐作用调质而另一个充当该胞吐作用调质的特异性配体)之间的相互作用。这样的传感器的用途的实例为：检测药物发现中分子之间的相互作用，量化分子如蛋白质以用于诊断和用于检测若干样品中的药物或分子，例如在食品工业中、在环境样品中和在制药工业中。
本发明的传感器是高度灵敏的并因此使用比当前可用的传感器更低量的细胞，其响应比基于诱导型启动子的传感器更快，报道分子的释放不需要细胞溶解，信号可以在端点模式或动态模式中测量，所有试剂可以混合，然后读数，不需要洗涤或终止步骤，从而增加通量，对于在测定间实验之间具有低可变性的强大测定来说获得稳定且高的信号/背景，并且其显示无毒性，特别是在细胞解冻后。
本发明证实，当细胞解冻时，与蛋白酶不同的其他水解酶在颗粒内被过表达时是无毒的，并且他们允许开发高度灵敏的传感器。特别地，某些糖苷酶如β-氨基己糖苷酶的β链和磷酸酶如分泌型碱性磷酸酶以高水平储存在具有专职调节的胞吐作用的造血细胞的颗粒内并通过配体诱导的胞吐作用以高信号/背景比和以低测定间可变性进行检测。另外，本发明还证实，上述发明的特定实施方案可以概括至可以借助于颗粒靶向多肽再引向颗粒的通常不储存在颗粒内的其他非蛋白酶水解酶。例如，Gaussia萤光素酶是通常不储存在颗粒内的非蛋白酶水解酶，其可以借助于颗粒靶向多肽如非活性粒酶B再引向颗粒、过表达并且储存在颗粒中并且通过配体诱导的胞吐作用如β-氨基己糖苷酶一样释放。因此，过表达无毒的非蛋白酶水解酶的造血细胞成为对于测量胞吐作用具有低可变性的灵敏的基于细胞的传感器。
因此，本发明基于这样的发现，即非蛋白酶水解酶可以在无毒性的情况下在具有专职调节的胞吐作用的哺乳动物细胞的颗粒中过表达，从而产生可用于以低可变性测量胞吐作用的高度灵敏的基于细胞的传感器。
本发明获益于之前的专利申请PCT/EP2010/004619并且涉及细胞、启动子、胞吐作用调质的所有教导通过引用结合于此。
用于本发明中的细胞
本发明涉及可用于药物发现、诊断和分析物的确定的基于细胞的传感器，所述基于细胞的传感器包括细胞系，所述细胞系具有分泌颗粒的专职调节的胞吐作用转染有非蛋白酶水解酶，所述非蛋白酶水解酶作为报道分子多肽储存在具有专职调节的胞吐作用的细胞系的调节的分泌颗粒中，并且具有作为调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的内源性或异源性分子，所述颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子至少具有：对颗粒内已存在的条件如低pH和通过其他蛋白酶的蛋白质水解的高耐受性；在胞吐作用后的酶活性；无毒性，特别是在细胞解冻后；高度特异性底物；在未被刺激或基础条件下的极低水平的分泌；和对于高通量的强大且灵敏的检测的在与细胞培养物存活力和颗粒胞吐作用相适合的介质中的高信号/背景活性。
分泌颗粒及其调节的胞吐作用在现有技术中是已知的，并且在由于某些实验优点或由于其重要生理学或病理生理学重要性而被选作模型系统的几种细胞类型中被最广泛地研究(参见例如，Burgoyne,RD和Morgan,A.Physiological Reviews,Vol.83,No.2,April2003,pp.581-632)。大概被最多研究的细胞类型是肾上腺嗜铬细胞(adrenal chromaffincell)(及其肿瘤对应物，PC12细胞系)、胰腺β-细胞和造血细胞如肥大细胞、血小板和嗜中性粒细胞，但是然而，分泌颗粒胞吐作用也发生在用于分泌肽和其他激素的许多不同神经内分泌和内分泌细胞类型中以及在用于分泌消化酶的外分泌细胞中。此外，已经证实，即使在非专职分泌细胞系如成纤维样细胞系(CHO细胞)中，也存在用于胞吐作用的Ca2+调节的通路，并且这或许所有的细胞类型可能具有调节的胞吐通路，即常规的溶酶体可以通过Ca2+触发而进行胞吐作用。但是分泌型溶酶体是不同的一类调节的分泌细胞器，并且这种胞吐能力明显地使它们从常规溶酶体中凸显出来。尽管常规溶酶体也可以与质膜融合并在刺激后释放它们的可溶内容物(1)，溶酶体酶自细胞如成纤维细胞和表皮细胞的Ca2+触发的分泌的程度趋于仅为10–20％(2)。对比地，多至80％的溶酶体标志在生理触发后从具有分泌型溶酶体的细胞(在本文中称为具有专职调节的胞吐作用的细胞)释放。因此，优选的用于本发明方法的细胞选自包含具有专职调节的胞吐作用的细胞 的组。具有专职调节的胞吐作用的细胞的最多样的组中之一是包含以下的组：造血细胞，如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T细胞如细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。所有上述细胞的正常功能的关键在于大量的储存的组分如水解酶诸如蛋白酶、糖苷酶和磷酸酶的调节的胞吐作用。因此，具有专职的调节的胞吐作用的造血细胞是用于本发明方法的高度相关的细胞。
在本发明的一个实施方案中，细胞选自具有专职调节的胞吐作用的造血细胞系的组，其选自利用它们的分泌型溶酶体来储存专门的组分如水解酶例如糖苷酶和磷酸酶的细胞如细胞毒性T淋巴细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
在本发明的另一个实施方案中，优选的细胞选自RBL-2H3、大鼠嗜碱性白血病细胞系、小鼠32D细胞系、小鼠骨髓造血细胞、人NK92细胞系、自然杀伤细胞系和人YT细胞系、自然杀伤细胞系和小鼠MC/9细胞系、小鼠肥大细胞。特别优选的用于本发明方法的细胞系是RBL-2H3，因为这种细胞系具有本发明的优选的非蛋白酶水解酶报道分子如β-氨基己糖苷酶的β链、分泌的碱性磷酸酶或gaussia萤光素酶和使传感器具有高信号/背景的颗粒靶向蛋白之间的融合蛋白的极低的组成型分泌水平和高度诱导的分泌。
用于本发明中的胞吐作用调质
本发明还包括胞吐作用调质。在本发明的一个实施方案中，胞吐作用调质选自诱导胞内钙水平变化的化合物或多肽。在本发明的另一个实施方案中，胞吐作用调质选自诱导cAMP、二酰甘油(DAG)、磷脂或ATP水平变化(这又调节或介导钙触发的胞吐作用)的化合物或多肽。
用于本发明中的颗粒储存的报道分子
最广泛使用的用于颗粒分泌的报道分子是内源性β-氨基己糖苷酶，但这种蛋白质，如现有技术中使用、表达和公开的，其在传统上被认为是低灵敏度报道分子，具有低的信号/背景比和由于颗粒中储存的酶的量随时间的巨大变化所致的实验之间的强可变性(参见PCT/EP2010/004619)。然而， 本发明惊人地证实，β-氨基己糖苷酶的β链的过表达产生具有低可变性和高信号/背景的传感器。此外，如以上解释的，在解冻时这种糖苷酶的过表达对于细胞是无毒的。
组成型和调节的通路之间的可溶蛋白质的分选明显复杂，并且在可溶性蛋白质至储存颗粒的路线选择中存在细胞类型特异性的实质证据，与表达水平无关。例如，淀粉酶是外分泌胰腺细胞中的正常颗粒组分，并且在转染入外分泌胰腺细胞系中时被运输至颗粒，但在转染的内分泌细胞系中被组成型地分泌(参见例如，El Meskini,R等Endocrinology(2001)Vol.142,No.2864-873)。细胞类型特异性可以解释使用POMC分子的氨基末端的部分来研究各种内分泌和神经细胞系中的路线选择的一些矛盾的结果(参见例如，Tam WWH等Eur J Cell Biol(1993),62:294–306；Roy P等Mol Cell Endocrinol(1991),82:237–250和Cool DR等J Biol Chem(1995)270:8723–8729。蛋白质分选的细胞特异性延伸超出细胞系至原代培养，因为相同的构建体在原代内分泌和神经细胞中可能是相当不同地进行处理。因此，对于本领域技术人员来说，不同于具有调节的胞吐作用的造血细胞的其他细胞可以用于本发明的方法中，但其他细胞类型的选择需要与以高浓度储存在所选细胞系的分泌颗粒中并且具有低水平的基础分泌的特定报道分子平行地进行。
储存在分泌颗粒中，尤其是在造血起源的细胞的分泌颗粒中的可用于本发明的方法中的报道分子的一个重要性质，是对该报道分子在颗粒内最多承受的苛刻环境的耐受性。造血细胞的分泌颗粒与溶酶体(在极酸性pH在内部储存大量水解酶如组织蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶(chymase)的细胞器，并且这种环境对于不是天然储存在这样的细胞器中的蛋白质不是理想的)相关，因此对蛋白酶不稳定的报道分子或pH不稳定的报道分子将可能在分泌颗粒内降解，由此降低这样的不稳定的报道分子蛋白质的灵敏度。例如，蛋白酶是从活化的肥大细胞胞外分泌的主要蛋白质组分(参见例如Huang等,J ClinImmunol.18:169-183,1998)。类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和羧肽酶是储存在肥大细胞的分泌颗粒中的蛋白酶的三个主要家族。因此，本发明的优选报道分子是对本发明的造血细胞的颗粒内的蛋白质水解和低pH具有高耐受性的多肽。尽管分泌型溶酶体中溶酶 体酶和造血丝氨酸蛋白酶与若干抗生素蛋白质的共存表明，在没有降解下共储存是可能的，不是人工引向分泌颗粒的每一种多肽都将耐受这种苛刻环境。例如，Kaur J和Cutler DF(参见Kaur,J和Cutler DF.J.Biol.Chem.,(2002)Vol.277,Issue 12,10498-10505)已发现，嵌合HRP-P选择蛋白可以靶向分泌型和传统溶酶体二者，但多至70％的被靶向的蛋白被蛋白水解降解。
本发明方法中使用的造血细胞的分泌颗粒与溶酶体(其是在极酸性pH环境下在内部储存大量水解酶如组织蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的细胞器)共享性质，并且因此本方面的方法的可用的报道分子必需是对合适的造血细胞的颗粒内的环境耐受的多肽。
在本发明的一个实施方案中，有用的报道分子选自对造血细胞的颗粒内的环境，如蛋白质水解和低pH耐受的多肽。
用于报道分子表达的启动子
本发明还包括用于报道分子的表达的合适启动子。用于本发明的颗粒储存的报道分子的表达的有用启动子是适用于造血细胞中的蛋白质表达的启动子，特别是适用于中至高蛋白质表达的启动子。合适启动子的另一相关性质在于，蛋白质表达在培养期间必须是稳定的。某些异源性启动子在培养期间，尤其是在造血细胞中被下调，并且这个过程被称为“启动子沉默”。用于本发明方法的优选启动子因此是非可沉默启动子。
检测技术和底物
除了对分泌颗粒内的环境的耐受性、要用于本发明方法的报道分子的高水平表达、低基础分泌和高诱导的分泌之外，用于本发明的灵敏检测方法的调节的胞吐作用的报道分子的其他重要性质是用来测量分泌的报道分子的检测技术的类型和对于用于检测的特异性底物的这样的报道分子的催化效率。高度灵敏的检测技术和对特异性底物具有高催化效率的报道分子二者对于本发明的方法都是有益的。
在本发明的一个实施方案中，用于检测分泌的非蛋白酶水解酶的底物可以选自比色、荧光底物或化学发光底物。用于HEXB的底物的一个实例 是4-甲基伞形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(4MU-NGlc)，但用于糖苷酶的其他底物可以被合成和测试。用于磷酸酶的底物的实例是4-甲基伞形酮磷酸酯和荧光素二磷酸酯，但用于磷酸酶的其他底物也可以是有用的。用于gaussia萤光素酶的底物可以选自腔肠素(coelenterazine)及其衍生物。
本发明的基于细胞的传感器的应用
本发明的基于细胞的传感器通常可用于检测至少两种分子(一个充当胞吐作用调质而另一个充当该胞吐作用调质的特异性配体)之间的相互作用。例如，在药物发现中，针对靶标测试成千或甚至成百万的小分子以寻找改变这样的靶标的活性的小分子。在特别的实例中，筛选化合物用于G-蛋白偶联受体(高度可药用的一类受体)的激动剂或拮抗剂。但是相同的传感器可用于检测和量化调节颗粒胞吐作用的化合物，例如，若干样品中滥用的药物，例如在食品工业、环境样品中并且用于诊断。所述传感器的用途不限于细胞表面受体或表面受体的小调质。例如，通过利用本发明的传感器，利用一对结合至待测蛋白质的两个分子，可以进行快速、特异性且灵敏的检测，前提是结合至待测蛋白的分子中的一个是特异性免疫球蛋白E而结合至待测蛋白的另一种分子诱导待测蛋白的寡聚化。上述传感器的其他用途是用于测试抗变应性化合物和用于检测变应原。
用于测试化合物是否介导胞吐作用的试剂盒
本发明还包括用于测试化合物是否调节胞吐作用的试剂盒。这样的试剂盒至少包括：造血细胞系，所述造血细胞系具有专职调节的胞吐作用转染有在合适启动子控制下的至少一种异源性非蛋白酶水解酶报道分子；和用于检测分泌的异源性蛋白酶报道分子的特异性底物。另外，具有专职调节的胞吐作用的造血细胞系可以转染有在合适启动子控制下的异源性胞吐作用调质，如GPCR、异源性FcγI受体或异源性FcεI受体转染，或者可以使用内源性胞吐作用调质如内源性Fcε受体I(IgE受体)。使用IgE受体作为胞吐作用调质的试剂盒可以含有对于要确定的分析物特异的IgE和用来诱导结合于IgE的分析物的寡聚化的第二分子。
因此，本发明的第一实施方案涉及基于细胞的传感器，所述基于细胞 的传感器包含：
a.具有分泌颗粒的调节的胞吐作用的造血细胞系；
b.在强组成型启动子或强诱导型启动子控制下转染入(a)的细胞系中并且过表达的颗粒储存的非蛋白酶水解酶报道分子；
c.(a)的细胞系的分泌颗粒的调节的胞吐作用的内源性调质或转染的异源性调质；
d.不能透过细胞的底物，其选自包含以下各项的组：对检测分泌的非蛋白酶水解酶活性特异的嵌合、荧光或发光底物；
所述基于细胞的传感器允许测量特异性配体对调节的胞吐作用的调质的作用。
在一个优选实施方案中，非蛋白酶水解酶选自SEQ ID NO:1的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、β-氨基己糖苷酶(HEXB)(Gene Bank BC017378.2，日期为26.01.2012)的β链或Gaussia萤光素酶(GLuc)和颗粒靶向蛋白(SEQ ID NO:2)之间的融合蛋白；细胞选自包含以下各项的组：大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL2H3，小鼠骨髓造血细胞系32D，自然杀伤细胞系人NK92细胞系，自然杀伤细胞系人YT细胞系和小鼠肥大细胞小鼠MC/9细胞系；并且调节的分泌颗粒胞吐作用的调质是选自包含以下各项的组的内源性表面受体或转染的异源性表面受体：G-蛋白偶联受体(GPCR)，带有ITAM基序的受体，带有ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。
本发明的第二实施方案涉及一种获得上述生物传感器的方法，所述方法包括用编码在合适启动子控制下的颗粒储存的报道分子的载体转化带有调节的分泌颗粒胞吐作用的内源性调质或带有在合适启动子控制下的转染的异源性表面受体的造血细胞系。在一个优选实施方案中，编码调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的载体还包含可用于在细胞表面处的受体过表达的信号肽，和/或用于阳性细胞的表面检测和/或分离的标记物。
在另一个优选实施方案中，用于调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的组成型过表达的启动子选自包含以下各项的组：哺乳动物延伸因子1-α启动子(hEF1α)(SEQ ID NO:3)，和来自莫洛尼鼠白血病毒的5′LTR启动子MoMLV-5′LTR(SEQ ID NO:4)。在另一个优选实施方案中，可用于调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的过表达的启动子是选自包含以下各项的组的 诱导型启动子：四环素诱导型启动子，蜕皮素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
在进一步优选的实施方案中，用于调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的过表达的载体包含用于表面过表达的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的病毒GPCR来源的序列(VGS)。
在进一步优选的实施方案中，用于调节的分泌颗粒胞吐作用的调质的组成型过表达的载体是P-MoMLV-5′LTR-SP-cmyc-tag-VGS-MCS-polyA(SEQ ID NO:7)。
在另一个优选实施方案中，用于颗粒储存的报道分子的强组成型过表达的启动子选自包含以下各项的组：hCMV和MoMLV-5′-LTR启动子(SEQ ID NO:4)的嵌合启动子；MoMLV-5′LTR启动子(SEQ ID NO:4)和延伸因子1-α启动子(SEQ ID NO:3)。
在进一步优选的实施方案中，颗粒储存的报道分子在选自包含以下各项的组的诱导型启动子控制下过表达：四环素诱导型启动子，蜕皮素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
本发明的第三实施方案涉及一种测试或量化至少两种分子(一个充当胞吐作用调质而另一个充当该胞吐作用调质的特异性配体)之间的相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在与细胞生存力、胞吐作用和分泌的颗粒储存的报道分子的酶活性相适合的介质中温育上述基于细胞的传感器，
b)加入胞吐作用调质的特异性配体，
c)加入颗粒储存的报道分子的特异性底物，和
d)检测从颗粒释放到胞外介质中的报道分子多肽非蛋白酶水解酶酶活性，利用所述释放的报道分子的特异性底物。
本发明的第四实施方案涉及上述基于细胞的传感器在检测与一对的两种分子结合的蛋白质中的用途，其中与待检测的蛋白质结合的分子中的一个是特异性免疫球蛋白G、或特异性免疫球蛋白E、或特异性免疫球蛋白A，并且与待检测的蛋白质结合的第二分子在结合后诱导所述待检测的蛋白质的寡聚化。
本发明的第五实施方案涉及上述基于细胞的传感器的用途，所述基于 细胞的传感器用于测试药物发现中分子之间的相互作用或量化分子如蛋白质以用于诊断或用于检测食品工业的样品中的、环境样品中的以及制药工业中的药物或分子，用于测试IgE-变应原相互作用，用于测试抗变应性化合物和/或用于检测变应原。
本方面的第六实施方案涉及包含上述基于细胞的传感器的试剂盒，其用于测试化合物是否介导胞吐作用或量化这样的胞吐作用的程度。在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含至少一种用于检测分泌的异源性报道分子的特异性底物。
实施例
实施例1.在hCMV-MoLV5′LTR嵌合启动子控制下表达人HEXB的β链的稳定细胞系的开发。
开发载体用于在hCMV-MoLV5′LTR嵌合启动子控制下稳定表达人HEXB的β链。潮霉素抗性盒被包括在载体主链中用于选择细胞的稳定种群。载体还包括在人HEXB下游克隆的IRES-NGFR盒，并且因此在相同启动子控制下，用于表达HEXB的稳定细胞的流式细胞术和/或选择。
各个载体使用微造孔器(Digital Bio Technology,South Korea)单个地电穿孔到RBL-2H3中并在48小时后，以1500ug/mL向培养物加入潮霉素以用于选择。在约2周的选择后，通过具有针对偶联至FITC的NGFR的抗体的流式细胞术(Guava Technologies,USA)分析细胞。其中通过使用抗NGFR-MACS sup.R(Miltenyi Biotec,Germany)的MACS磁分离的阳性种群。分析的种群通过流式细胞术再次分析以检查分选效率。阳性细胞通过有限稀释克隆，0,3个细胞/96孔微板的孔。具有生长的克隆的孔通过流式细胞术分析NGFR表达。具有对NGFR的阳性表达的三种克隆体(命名为1B7-HEXB、1C4-HEXB和1F10-HEXB)连同非转化的RBL2H3和稳定转染的整个细胞种群(RBL2H3-HEXB)扩增至6孔板。
用移液管收获细胞，离心，重悬在HBSS缓冲液中，使用Neubauer室计数并调整至500.000个细胞/mL。用于确定HEXB活性的底物是4-甲基伞形酮N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(4MU-NGlc)(Sigma-Aldrich,M2133)并在测定孔中将其在HBSS中稀释至1mM终浓度。
针对三硝基苯基半抗原的小鼠IgE单克隆抗体从购自ATCC(TIB-141)的IgELb4杂交瘤纯化并且通过结合于与BSA缀合的TNP的IgE的IgE受体的交联而诱导胞吐作用。TNP-N-羟基琥珀酰亚胺esther购自Biosearch Technologies Inc并且使用标准方案缀合至牛血清白蛋白(BSA)。使用15400单位/mol/10mm光传送长度作为TNP的消光系数，通过测量在348nm的TNP吸光度确定在pH 7.0的缀合。TNP-BSA缀合物中的TNP与BSA的摩尔比为18:1并且是在假定BSA的分子量为60000的情况下下计算的。
将384黑壁微板用于测定。在2微克/mL的IgELb4IgE抗体和2微克/mL的TNP-BSA连同2mM的4MU-NGlc的在HBSS中的第一混合物用来测量胞吐作用。第二混合物用作对照并且其仅为2mM的4MU-NGlc而没有IgE并且没有TNP-BSA。离子霉素(ionomycin)以10uM用作对照。没有细胞的孔用作空白。10微升的细胞(任一1B7-HEXB、1C4-HEXB和1F10-HEXB，未转化的RBL2H3和RBL2H3-HEXB)各自加入到12个孔中。向六个孔中加入10微升的含有IgE+TNP-BSA加4MU-NGlc的混合物，而对于另外的六个孔，仅加入4MU-NGlc。将板在37℃温育并且在BMG-Labtech Optima荧光读数器中在360nm激发和470nm作为发射波长下读出荧光。在0、15、30、45和60分钟进行读数。将30分钟选择作为最佳结果的时间。在30min的结果显示在下表1中：
表1
以上结果表明，HEXB的β链在RBL2H3细胞中的过表达产生功能酶，如用储存在颗粒内并且特异性地通过胞吐作用释放的4MU-NGlc测量的。从以上数据，特异性和背景释放通过减去没有细胞情况下孔的荧光进行计算。在全部稳定转染的群中，相对于亲本RBL2H3细胞，特异性信号增加2,48倍，而背景增加1,97倍，即特异性信号比背景释放增加更多，并且这表明转染的细胞作为传感器的用途比使用亲本细胞更好。在这个实验中，RBL2H3细胞的特异性信号/背景(S/B)为5,9倍，而RBL2H3-HEXB细胞的S/B为8,2倍。通过从RBL2H3-HEXB全种群的有限稀释选择的克隆具有增加的特异性释放，而且有时具有增加的背景释放，如例如克隆1C4-HEXB，其中特异性信号相对于RBL2H3增加7,40倍，但背景相对于RBL2H3增加5,82倍。因此，1C4-HEXB克隆具有7,53倍的S/B。但是克隆体如1B7-HEXB具有比RBL2H3高1,63倍的背景，而特异性释放比RBL2H3的高5,24倍。因此，1B7-HEXB克隆的S/B为19。甚至更重要的是这样的事实，即1B7-HEXB产生和HEXB的释放极规则而RBL2H3的随时间具有极强的可变性。利用如上所述的相同条件，将RBL2H3和1B7-HEXB二者培养2个月并且每1个月如上所述测量胞吐作用。RBL2H3的信号/背景(S/B)为5,9(第0月)、2,8(第1月)和4,3(第2月)，而1B7-HEXB的信号/背景为19(第0月)、17(第1月)和22(第2月)。以上结果确认了为什么RBL2H3细胞的胞吐作用总是作为对于在RBL2H3细胞中观察到的强天然可变性的归一化的百分比(在以上结果中，在第0月和第1月之间有63％的S/B的降低)。但是1B7-HEXB细胞表现显著更好并且S/B虽然对于活细胞仍然是变化的，但更稳定(在上述结果中，最大可变性第2月和第3月之间的22％)。
因此，以上结果确认了过表达HEXB的β链的细胞可用作传感器以测量胞吐作用，并且过表达HEXB的那些传感器比包含天然非转染的RBL2H3细胞的现有技术的传感器更好。
实施例2.在hCMV-MoLV5′LTR嵌合启动子控制下表达其他非蛋白酶水解酶的稳定细胞系的开发。
为了证实非蛋白酶水解酶的过表达是不受限于HEXB的总体构思，而 且其他蛋白质可以再引向颗粒并用来测量胞吐作用，开发载体用于人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)在hCMV-MoLV5′LTR嵌合启动子控制下的稳定表达并且还开发载体用于Gaussia princeps萤光素酶(克隆在框中作为在粒酶B下游的融合蛋白，其中193位的丝氨酸被突变为丙氨酸以失活活性)的稳定表达。潮霉素抗性盒包括在载体主链中用于选择细胞的稳定种群。载体还包括在人SEAP或GZB-Luc下游克隆的IRES-NGFR盒，并且因此在相同启动子控制下，用于表达SEAP和/或GZB-GLuc的稳定细胞的流式细胞术和/或选择。
各个载体使用微造孔器(Digital Bio Technology,South Korea)单个地电穿孔入RBL-2H3中并在48小时后，将潮霉素以1500ug/mL加入培养物用于选择。在约2周的选择后，通过流式细胞术(Guava Technologies,USA)利用针对偶联至FITC的NGFR的抗体分析细胞。阳性种群通过MACS磁分离，使用抗-NGFR-MACS sup.R(Miltenyi Biotec,Germany)。分选的种群通过流式细胞术再次分析以检查分选效率。
对于SEAP，阳性细胞通过以0,3个细胞/96孔微板的孔的有限稀释克隆。通过流式细胞术分析具有生长克隆的孔的NGFR表达。通过流式细胞术和SEAP活性(使用磷酸酶底物4-MUP(Sigma-Aldrich,M3168))二者选择了一个克隆体2D1-SEAP。由胞吐作用所致的SEAP活性如实施例1中那样测量，即将在悬浮液中的10微升细胞(5.000个细胞)与含有IgELb4和TNP-BSA二者的10微升荧光素二磷酸酯(Marker Gene Technologies,M1034)混合。RBL2H3细胞用作对照并且没有细胞的孔也用作空白。离子霉素(ionomycin)用作阳性对照。
将板在37℃温育并在BMG-Labtech Optima荧光读数器中在485nm激发和535nm作为发射波长读出荧光。在0、15、30、45和60分钟进行读数。选择30分钟作为最佳结果的时间。在30min的结果为如下表2：
表2
以上结果表明，通常RBL2H3细胞产生高水平的磷酸酶并且过表达增加这样的水平，因为在30分钟的特异性荧光在2D1克隆中比在RBL2H3细胞中高2,38倍。同样背景增加并且在2D1中比在RBL2H3细胞中高3,18倍。事实上，在上述实验中，S/B在RBL2H3细胞(S/B＝32,3)中比在2D1细胞(S/B＝24,2)中更好。但是，当在60天的期间测量S/B时，2D1的S/B几乎恒定(在第1月S/B＝25,1并且在第2月为24,9)，而RBL2H3的S/B是高度变化的(在第1月S/B＝17,9并且在第2月为5,34)。以上结果说明这样的事实，即蛋白质过表达的作用不仅增加储存在颗粒中的酶的量而且降低RBL2H3中通常与胞吐作用相关的可变性，并且因此，通过在具有专职胞吐作用的颗粒中过表达非蛋白酶水解酶而可以开发更好的传感器。这个实施例还表明，在其他细胞系如HEK293、Jurkat和CHO-K1细胞中分泌的通常不储存在颗粒中的酶如分泌型碱性磷酸酶可以在转染到具有专职胞吐作用的细胞中时自然地储存到颗粒内。
为了进一步扩展非蛋白酶水解酶的过表达产生更好的传感器的总构思，用于表达克隆在人粒酶B下游的读框中的Gaussia萤光素酶(通过将193位的丝氨酸突变为丙氨酸而失活)的载体，被转染入RBL2H3中并且利用潮霉素选择细胞。通常，Gaussia萤光素酶是分泌型酶，即使在被单独转染入RBL2H3细胞中时(数据未显示)。但是当融合至粒酶B时，Gaussia萤光素酶储存到颗粒中。类似的载体(但使用融合在粒酶B下游的firefly萤光素酶)在来自胞吐作用的上清液或介质中没有产生萤光素酶活性(数据未显示)，表明可以储存在颗粒中的酶必须是耐受具有低pH和存在于这样的颗粒内的若干蛋白酶的胞内介质的酶。GZB-GLuc转染的细胞的整个种群对于NGFR为56％阳性。因为Gaussia萤光素酶的信号是闪光(不是稳定的信号)，所以使用IgELb4和TNP-BSA或单独的BSS进行胞吐作用达30分钟，并且将对应于100.000、50.000、25.000和12.500个细胞的上清液与作为底物的终浓度为16,6微摩尔的天然腔肠素(coelenterazine native)(Biosynth AG,C-7000)在384黑壁板中温育。测定缓冲液为10mM Tris-HCl pH＝7,8、1mM EDTA和600mM NaCl。结果利用来自Thermo Labsystems的Fluoroskan Ascent FL测量。参见表3。
表3
以上结果证实，通常不储存在具有专职调节的胞吐作用的细胞的颗粒中的非蛋白酶水解酶可以通过使用颗粒靶向多肽如粒酶B人工地重新引向颗粒，并且这样的颗粒储存的非蛋白酶水解酶产生有用的传感器从而测量胞吐作用。利用12.500个细胞，信号/背景为22,94。因此，颗粒内的非蛋白酶水解酶的过表达产生比当前可用的传感器更好的测量胞吐作用的传感器。
实施例3.过表达颗粒内的非蛋白酶水解酶的细胞系的冷冻和解冻。
这个实施例设计用来证实带有不同非蛋白酶水解酶的传感器的稳定性。将1B7-HEXB克隆、2D1-SEAP克隆、RBL2H3亲本细胞和RBL2H3-GRZB以4百万个细胞/冷冻管冷冻在1mL冷冻介质(细胞培养基+10％DMSO)中。细胞冷冻在具有异丙醇的低温冷冻容器“MrFrosty”(Nalgene,now Thermo,5100-0001)和-80℃冷冻器中达24小时，然后储存在液氮的蒸汽相中。解冻进行如下：将冷冻管置于37℃的水浴中直至细胞解冻，并将9mL培养基加入到细胞的各个小瓶中。然后将细胞离心并通过台盼蓝排除(trypan exclusion)确定存活力。培养细胞并且再次评估在培养24小时后的存活力，此时健康存活的细胞是粘附的而脱离的细胞是不健康的。结果如下：对于1B7-HEXB、2D1-SEAP和RBL2H3，刚解冻 后的存活力超过95％，并且细胞是明亮的而膜是规则和圆形的。RBL2H3-GRZB的存活力超过90％，但约30-40百分比的细胞在质膜中呈现不规则凸起(指示早期凋亡)。事实上，超过90％的1B7-HEXB、2D1-SEAP和RBL2H3的细胞附着至塑料培养烧瓶的底部(细胞死亡的量度)并且是活着的，而约30-40％的RBL2H3-GZB细胞死亡并悬浮着。事实上，细胞附着至烧瓶的水平指示细胞存活(生存力)率。这个实施例说明了这样事实，即非蛋白酶水解酶在细胞解冻时具有比蛋白酶水解酶更低的毒性，并且它们对于开发灵敏且稳定的传感器相对于蛋白酶具有优势。

Claims (22)

1.基于细胞的传感器，所述基于细胞的传感器包括：
(a).具有分泌颗粒的调节的胞吐作用的造血细胞系；
(b).颗粒储存的报道分子，其选自非蛋白酶水解酶或与颗粒靶向多肽融合的Gaussia萤光素酶蛋白，所述颗粒储存的报道分子被转染入(a)的细胞系中，在强组成型启动子或强诱导型启动子的控制下过表达；
(c).(a)的细胞系的分泌颗粒的调节的胞吐作用的内源性调质或转染的异源性调质；
(d).选自包含以下各项的组的细胞不可渗透底物：对(b)的颗粒储存报道分子活性的检测特异的荧光或比色底物；
所述基于细胞的传感器允许测量特异性配体对调节的胞吐作用的调质的作用。
2.根据权利要求1所述的基于细胞的传感器，其中所述荧光底物是发光底物。
3.根据权利要求1所述的基于细胞的传感器，其中所述颗粒储存的报道分子是选自下述的非蛋白酶水解酶：SEQ ID NO:1的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，或Gene Bank BC017378.2的β-氨基己糖苷酶(HEXB)的β链，或所述颗粒储存的报道分子是与SEQ ID NO:2的颗粒靶向蛋白融合的Gaussia萤光素酶(GLuc)蛋白。
4.根据权利要求1所述的基于细胞的传感器，其中所述细胞选自包含以下各项的组：大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL2H3，小鼠骨髓造血细胞系32D，自然杀伤细胞系人NK92细胞系，自然杀伤细胞系人YT细胞系和小鼠肥大细胞小鼠MC/9细胞系。
5.根据权利要求1所述的基于细胞的传感器，其中分泌颗粒的调节的胞吐作用的所述调质是选自包含以下各项的组的内源性表面受体或转染的异源性表面受体：G-蛋白偶联受体(GPCR)，带有ITAM基序的受体，带有ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。
6.用于获得根据权利要求1所述的基于细胞的传感器的方法，其中所述方法包括将造血细胞系用编码在合适强启动子控制下的选自非蛋白酶水解酶或与颗粒靶向多肽融合的Gaussia萤光素酶蛋白的颗粒储存的报道分子的载体转化，其中所述造血细胞系带有在合适启动子控制下的分泌颗粒的调节的胞吐作用的内源性调质，其中所述内源性调质选自包含以下各项的组：G-蛋白偶联受体(GPCR)，带有ITAM基序的受体，带有ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。
7.用于获得根据权利要求1所述的基于细胞的传感器的方法，其中所述方法包括将造血细胞系用编码在合适强启动子控制下的选自非蛋白酶水解酶或与颗粒靶向多肽融合的Gaussia萤光素酶蛋白的颗粒储存的报道分子的载体转化，其中所述造血细胞系带有在合适启动子控制下的分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源性调质，其中所述转染的异源性调质选自包含以下各项的组：G-蛋白偶联受体(GPCR)，带有ITAM基序的受体，带有ITIM基序的受体和蛋白酪氨酸激酶受体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质利用载体获得，所述载体还包含用于在细胞表面处过表达所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质的信号肽，和/或用于阳性细胞的表面检测和/或分离的标记物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中用于过表达所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质的启动子是组成型启动子，其选自包含以下各项的组：哺乳动物延伸因子1-α启动子，和SEQ ID NO:4的来自莫洛尼鼠白血病毒的5′LTR启动子MoMLV-5′LTR。
10.根据权利要求9的方法，其中哺乳动物延伸因子1-α启动子是SEQ ID NO:3的人哺乳动物延伸因子1-α启动子。
11.根据权利要求7所述的方法，其中用于过表达所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质的启动子是选自包含以下各项的组的诱导型启动子：四环素诱导型启动子，蜕皮素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
12.根据权利要求7至10任一项所述的方法，其中用于所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质的过表达的载体包含用于表面过表达的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的病毒GPCR来源的序列。
13.根据权利要求7至10任一项所述的方法，其中用于过表达所述分泌颗粒的调节的胞吐作用的转染的异源调质的载体处于以下载体中：SEQ ID NO:7的P-MoMLV-5′LTR-SP-cmyc-tag-VGS-MCS-polyA。
14.根据权利要求6或7任一项所述的方法，其中用于颗粒储存的报道分子的过表达的合适强组成型启动子选自包含以下各项的组：hCMV和SEQ ID NO:4的MoMLV-5′-LTR启动子的嵌合启动子；SEQ ID NO:4的MoMLV-5′LTR启动子和SEQ ID NO:3的延伸因子1-α启动子。
15.根据权利要求6或7任一项所述的方法，其中用于颗粒储存的报道分子的过表达的合适强诱导型启动子选自包含以下各项的组：四环素诱导型启动子，蜕皮素诱导型启动子，cumate诱导型启动子和孕酮诱导型启动子。
16.测试至少两种分子之间的相互作用的方法，所述至少两种分子中的一个充当胞吐作用调质而另一个充当所述胞吐作用调质的特异性配体，所述方法包括以下步骤：
a.在与细胞生存力、胞吐作用和分泌的颗粒储存的报道分子的酶活性相适合的介质中温育根据权利要求1至5任一项所述的基于细胞的传感器，
b.添加胞吐作用调质的特异性配体，
c.利用从颗粒释放到所述介质中的所述颗粒储存的报道分子的特异性底物检测所述颗粒储存的报道分子的酶活性，所述颗粒储存报道分子选自非蛋白酶水解酶或与颗粒靶向多肽融合的Gaussia萤光素酶蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述方法是至少两种分子之间的量化。
18.根据权利要求1至5任一项所述的基于细胞的传感器在检测结合有一对的两个分子的蛋白质中的用途，其中结合待检测的蛋白质的分子中的一个是特异性免疫球蛋白G，或特异性免疫球蛋白E，或特异性免疫球蛋白A，并且结合待检测的蛋白质的第二分子在结合后诱导所述待检测的蛋白质的寡聚化。
19.根据权利要求1至5任一项所述的基于细胞的传感器的用途，所述基于细胞的传感器用于测试药物发现中分子之间的相互作用，或用于检测食品工业的样品中的、环境样品中的和制药工业中的药物或分子，用于测试IgE-变应原相互作用，用于测试抗变应性化合物和/或用于检测变应原。
20.根据权利要求1至5任一项所述的基于细胞的传感器在制备用于量化分子以用于诊断的诊断剂中的用途。
21.根据权利要求19或20所述的用途，其中所述分子是蛋白质。
22.包含根据权利要求1至5任一项所述的基于细胞的传感器的试剂盒，所述试剂盒用于测试化合物是否介导胞吐作用或用于量化这样的胞吐作用的程度。
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