KR20230134574A - 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 세포, 분석용 키트, 및 분석 방법 - Google Patents

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KR20230134574A
KR20230134574A KR1020237028647A KR20237028647A KR20230134574A KR 20230134574 A KR20230134574 A KR 20230134574A KR 1020237028647 A KR1020237028647 A KR 1020237028647A KR 20237028647 A KR20237028647 A KR 20237028647A KR 20230134574 A KR20230134574 A KR 20230134574A
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chimeric
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fcεriα
fcεriα chain
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료스케 나카무라
하루요 아키야마
사토시 다도코로
겐이치 구마사카
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각코호진 데이쿄 헤이세이 다이가쿠
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Abstract

알레르기 검사감도를 향상시키기 위한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩하는 제1 염기서열과, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 코딩하는 제2 염기서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 발현산물인 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 및 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 포함하는 비인간 동물 세포도 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 세포를 포함하는 분석용 키트 및 상기 세포를 사용하는 분석 방법도 제공한다.

Description

키메라 FcεRIα쇄 유전자, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 세포, 분석용 키트, 및 분석 방법
본 발명은, 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 세포, 분석용 키트, 및 분석 방법에 관한 것이다. 보다 특별하게는, 본 발명은, 알레르기와 관련된 시험을 행하기 위해 사용되는 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 세포, 및 키트, 및 알레르기와 관련된 분석 방법에 관한 것이다.
알레르기 반응에 관여하는 IgE는 혈청 중에 극히 미량으로 존재하는 항체이다. IgE는, 예를 들면, 마스트 세포 및 호염기구 등의 세포가 발현하는 고친화성 IgE 수용체(본 명세서 내에 있어서, 고친화성 IgE 수용체를 「FcεRI」라고도 함)의 α쇄에 매우 강고하게 결합한다(Ka=1010M-1). FcεRI는, α쇄 1개, β쇄 1개, 및 γ쇄의 호모 다이머를 포함할 수 있다. 이들 서브유닛은, 많은 동물종에서는 4량체를 형성하여 비로소 세포막 표면에 발현하지만, 인간에 있어서는 β쇄를 수반하지 않는 발현 양식도 알려져 있다.
B세포가 알레르겐(항원) 특이적인 IgE를 생산하면, IgE는 혈액 순환을 타고, 말초의 면역세포, 특히 마스트 세포나 호염기구가 발현하는 FcεRI에 결합하고, 이들 세포를 감작(感作)한다. IgE로 감작된 이들 세포가 특이 항원에 폭로되면 항원과 IgE가 결합한다. 이 때, 항원 1분자에 IgE 에피토프가 복수 존재하면, 항원을 통하여 복수의 IgE 항체가 결합하게 되고, 이에 따라 복수의 FcεRI가 「가교」되게 된다.
FcεRI의 가교를 트리거로 하여, 예를 들면 수용체의 세포내 도메인에 회합하는 티로신 키나아제 등의 효소 및 어댑터 분자의 활성화를 통하여, 예를 들면, 칼슘 이온의 유입, 히스타민 등의 화학전달물질의 탈과립, 및 지질성 화학전달물질의 생산앙진(昻進)등의 세포응답이 일어나고, 즉시형의 알레르기 응답이 야기된다. 나아가서는, 일종의 전사인자의 활성화를 통하여, 예를 들면 사이토카인 및 게모카인 등의 유전자발현이 유도되며, 이것은, 보다 후기의 염증반응으로 이어진다.
알레르기에 관한 검사방법이 지금까지 몇 가지 제안되어 있다. 예를 들면, 하기 특허문헌 1은, 인간 IgE에 친화성이 있는 Fc 리셉터를 세포막 상에 가지고, 또한, 전사인자가 결합할 수 있는 인핸서의 제어 하에, 프로모터 및 리포터유전자를 이 순서로 가지는 세포를, 피험자 유래의 생체시료의 존재 하에서 인큐베이팅하는 것; 피험물질 및 상기 인큐베이팅 후의 세포를 접촉시키는 것; 및 상기 피험물질과 접촉시킨 세포에 있어서의 상기 리포터유전자의 발현의 증대를 확인하는 것을 포함하는, 상기 피험물질이 상기 피험자에 대한 알레르겐인지의 여부를 검사하는 방법이 개시되어 있다.
일본공개특허 제2011-19467호 공보
알레르기 검사감도의 더 한층의 향상이 요구되고 있다. 상기 감도를 향상시킬 수 있으면, 예를 들면 환자 IgE의 생물학적 의의에 기초한 평가, 미량 알레르겐의 검출, 및 항알레르기 물질의 하이 스루풋 스크리닝 등, 다양한 알레르기에 관한 시험을 위하여 유용할 것으로 여겨진다. 이에, 본 발명은, 알레르기 검사의 고감도화, 특히 IgE 검출 방법의 고감도화를 주목적으로 한다.
본 발명은,
인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩할 수 있는 제1 염기서열과,
비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 코딩할 수 있는 제2 염기서열
을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 제공한다.
상기 제1 염기서열은, 서열 ID No. 7의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함해도 된다.
상기 제2 염기서열은, 서열 ID No. 5의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함해도 된다.
상기 제2 염기서열은, 서열 ID No. 6의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 더욱 포함할 수 있다.
상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 상기 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄를 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열을 코딩하는 제3 염기서열을 더욱 포함할 수 있다.
상기 제3 염기서열은, 서열 ID No. 2의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 서열 ID No. 1의 염기서열과 50% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 비인간 동물은 설치류 동물일 수 있다.
또한, 본 발명은,
인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인과,
비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인
을 포함하는 키메라 FcεRIα쇄 단백질도 제공한다.
상기 세포외 도메인은, 서열 ID No. 14의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함할 수 있다.
상기 세포막 관통 도메인은, 서열 ID No. 12의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함할 수 있다.
상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포내 도메인을 더욱 포함하고,
상기 세포내 도메인은, 서열 ID No. 13의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함할 수 있다.
상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 서열 ID No. 8의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 포함하는 벡터도 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 또는 상기 벡터를 포함하는, 상기 비인간 동물의 세포도 제공한다.
상기 세포는, 상기 비인간 동물 세포의 FcεRI의 γ쇄의 유전자를 더욱 포함할 수 있다.
상기 세포는, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄와 상기 세포의 FcεRI의 γ쇄를 포함하는 회합체를 형성할 수 있다.
상기 세포는, 상기 회합체끼리의 가교에 의해 발현이 유도되는 리포터유전자를 더욱 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 세포를 포함하는 분석용 키트도 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 세포를 사용하는 분석 방법도 제공한다.
상기 분석 방법은,
상기 세포를 인큐베이팅하는 인큐베이팅 공정, 및
상기 세포의 응답을 분석하는 분석 공정
을 실행하는 것을 포함해도 된다.
상기 인큐베이팅 공정은, 상기 세포를 인큐베이팅용 재료 중에서 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다.
상기 분석 공정은, 상기 응답에 기초하여
알레르겐성의 평가,
알레르기의 유무 또는 리스크의 평가,
IgE에 관한 분석,
알레르기 억제 활성의 평가, 및
드럭스크리닝
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 행하는 것을 포함할 수 있다.
상기 분석 공정은, I형 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가를 행하는 것을 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 세포를 설명하기 위한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질을 설명하기 위한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자 및 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 구성예를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예에 있어서 사용된 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 염기서열 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산서열을 나타낸 도면이다.
도 5는 서열 ID No. 15의 염기서열이다.
도 6은 유전자 삽입을 위한 서열을 설명하는 도면이다.
도 7은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 플로우사이토미터에 의한 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 흡광도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 실시예에 있어서 사용된 키메라 FcεRIα쇄 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 구조 및 기능을 설명하기 위한 모식도이다.
도 20은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 발광강도의 측정 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태에 대하여 설명한다. 그리고, 이하에서 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태를 나타낸 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시형태만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 대하여, 이하의 순서로 설명을한다.
1. 본 발명의 설명
2. 제1 실시형태(키메라 FcεRIα쇄 유전자)
(1) 제1 염기서열
(2) 제2 염기서열
(3) 제3 염기서열
(4) 키메라 FcεRIα쇄 유전자전체
3. 제2 실시형태(키메라 FcεRIα쇄 단백질)
(1) 세포외 도메인
(2) 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인
(3) 시그널 서열
(4) 키메라 FcεRIα쇄 단백질
4. 제3 실시형태(벡터)
5. 제4 실시형태(세포)
6. 제5 실시형태(분석용 키트)
7. 제6 실시형태(분석 방법)
8. 실시예
(1) 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 합성
(2) 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 RBL-NL4세포로의 도입
(3) 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 세포에 있어서의 루시퍼라아제 발현
(4) 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 세포로의 IgE 결합능의 확인
(5) 본 발명의 세포에 적합한 시험 조건의 검토
(6) 알레르기 환자 혈청을 사용한 시험(낙화생 알레르기)
(7) 본 발명의 세포와 다른 세포의 비교(알레르기 검사, 계란 알레르기)
(8) 본 발명의 세포와 다른 세포와의 비교(알레르기 반응억제제의 유효성 평가)
(9) 안정성 및 재현 정밀도
1. 본 발명의 설명
현재 임상에서 일반적으로 사용되고 있는 알레르기 시험법은, 예를 들면, in vivo 시험법, ex vivo 시험법, in vitro 시험법의 3개로 나눌 수 있고, 각각 일장일단이 있다. in vivo 시험법은 환자 자체에 알레르겐을 투여하므로, 신뢰성은 가장 높지만, 환자에게 부담을 강요하는 문제가 있다. ex vivo 시험법에서는, 환자의 호염기구를 체외로 꺼내고, 상기 호염기구에 대하여 알레르겐이 투여될 수 있다. 상기 ex vivo 시험법은, 호염기구의 활성화(예를 들면, 히스타민의 방출 또는 세포 표면으로의 CD203c/CD63의 발현 등)를 지표로 하기 때문에, 신뢰도는 높다. 그러나, 상기 ex vivo 시험법에서는, 전혈이 사용되므로, 샘플의 보존성이 떨어지는 문제가 있다. 가장 빈번하게 이용되고 있는 in vitro 시험법의 일례로서, ImmunoCAP법을 들 수 있다. ImmunoCAP법은, 환자의 혈청 또는 혈장을 사용하여 실시할 수 있다. ImmunoCAP법은, 간편하며 또한 비교적 고감도이지만, 위양성이 매우 많다는 문제가 있다. 이 문제는, 알레르겐 상에 IgE 에피토프가 1군데밖에 존재하지 않는 경우에 일어날 수 있는 것으로 여겨진다. 또한, 이 문제는, 알레르겐과 IgE의 결합 어피니티가 낮고, FcεRI의 가교를 유지할 수 없는 것에도 기인하는 것으로 여겨진다.
전술한 ex vivo 시험법에서는, 환자의 호염기구의 활성화가 정량(定量)되는데, 이 방법을 약간 수정하면, 환자 혈청 중의 IgE 의존적인 호염기구의 활성화를 조사할 수 있다. 즉, 상기 수정된 방법에서는, 먼저, 정상인으로부터 말초혈 호염기구를 단리하고, 단리된 호염기구를 산처리하여, 결합되어 있는 IgE를 상기 호염기구로부터 괴리시킨다. 그 후, 피험자 유래의 혈청중 IgE로 상기 호염기구를 수동적으로 감작하고, 상기 감작에 의한 항원특이적인 호염기구의 활성화를 조사한다. 그러나, 이 방법은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 동일한 정상인의 말초혈이 항상 이용할 수 있는 것이 아니기 때문에, 시험의 재현성이 결여되는 문제가 있다.
이와 같은 문제를 해결하는 방법으로서, 예를 들면 래트(rat) 배양 마스트 세포주로서 알려져 있는 RBL-2H3세포에 인간 FcεRI를 안정적으로 발현시킨 배양 세포주를 사용하고, 이것을 알레르기 환자 혈청으로 감작하고, 특이항원을 첨가했을 때의 탈과립량을 측정하는 방법이, 몇 그룹에 의해 고안되었다. 이 방법은, 환자 혈청 중의 IgE에 의해 인간 FcεRI를 발현하는 배양 마스트 세포를 감작하고, 항원에 의한 FcεRI의 가교를 검출할 수 있다는 의미에 있어서 획기적이었다. 그러나, 이 방법은, 탈과립 측정의 감도가 낮고, 위음성이 생길 확률이 높다는 것이 문제가 될 수 있다.
상기 특허문헌 1에 기재된 방법에 의해, 이러한 문제에 대처할 수 있다. 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 인간 IgE에 친화성이 있는 Fc 리셉터를 세포막 상에 가지고, 또한, 전사인자가 결합할 수 있는 인핸서의 제어 하에, 프로모터 및 리포터유전자를 이 순서로 가지는 세포가 사용된다. 이 세포의 예로서, 상기 특허문헌 1에는, RBL-2H3세포에 인간 FcεRI를 안정적으로 발현시킨 배양 세포주인 RBL-SX38세포에, 전사인자 Nuclear Factor of Activated T-cells(NF-AT) 의존적으로 반딧불 루시퍼라아제 유전자의 발현이 유도되는 리포터유전자가 도입된 세포주RS-ATL8세포가 개시되어 있다. 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에서는, 상기 세포를, 예를 들면 100배 희석한 환자 혈청 등과 하룻밤 배양함으로써 IgE로 감작하고, 상기 감작 후에, 상기 세포를 특이항원과 접촉시킨다. 상기 접촉에 의해, FcεRI의 가교가 유도된다. 상기 가교에 의해, 상기 전사인자를 포함하는 세포내 시그널 전달을 경유하여 루시퍼라아제가 발현된다. 이로써, 매우 양호한 감도로 항원 또는 특이적 IgE를 검출할 수 있다. 상기 방법은, 「IgE-Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)법」으로도 불리우고 있다. 상기 방법은, 프로토콜이 매우 단순하며, 대량의 검체를 스크리닝하기에 적합하다. 또한, 상기 방법에 관해서, 예를 들면 난백 알레르기 환자를 대상으로 한 ROC 곡선해석에서는 곡선 하 면적이 0.97을 초과하는 등, 매우 우수한 성능을 가지고 있다. 전세계 연구자가 이 방법을 이미 이용하고 있고, 예를 들면 2019년 8월의 시점에서는, 구미를 중심으로 16개국에 있어서 이용되고 있다.
상기 특허문헌 1에 기재된 방법은, 항원 및 특이적 IgE를 양호한 감도로 검출할 수 있지만, 더 한층의 감도의 향상이 요구되고 있다. 더 한층의 감도의 향상은, 예를 들면, 환자 IgE의 생물학적 의의에 기초한 평가, 미량 알레르겐의 검출, 및 항알레르기 물질의 하이 스루풋 스크리닝를 위하여 유용할 것으로 여겨진다.
본 발명자들은, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩하는 제1 염기서열과 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 코딩하는 제2 염기서열을 포함하는 키메라 FcεRIα쇄 유전자가, 알레르기 검사 감도의 향상을 위하여 극히 유용한 것을 발견하였다. 예를 들면, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 상기 비인간 동물의 세포(예를 들면, 마스트 세포)는, 인간의 알레르기에 관한 시험에서의 사용에 적합하며, 예를 들면 인간의 알레르기를 극히 양호한 감도로 검사하기 위해 사용되는 재료로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 예를 들면 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에 있어서 사용되어도 되고, 특히 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에 있어서 사용되는 세포에 도입될 수 있다.
이하에서 도 1 및 2를 참조하면서, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 가지는 세포의 예, 및 상기 세포에 의한 항원 또는 IgE의 검출의 메커니즘을 설명한다.
도 1에 도시된 세포(1)는, 비인간 동물 세포이다. 세포(1)는, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자와, 리포터유전자를 포함한다. 세포(1)는, 또한 상기 비인간 동물 세포의 FcεRIγ쇄 유전자를 포함한다. 상기 비인간 동물 세포는, 또한 상기 비인간 동물 세포의 FcεRIβ쇄 유전자를 포함해도 된다.
세포(1) 중에서, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 상기 FcεRIβ쇄 유전자, 및 상기 FcεRIγ쇄 유전자가 발현하고, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, FcεRIβ쇄 단백질, 및 FcεRIγ쇄 단백질이 생성된다. 1개의 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 1개의 FcεRIβ쇄 단백질, 및 2개의 FcεRIγ쇄 단백질(호모 다이머)이 회합하여 형성된 4량체인 키메라 FcεRI는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세포(1)의 세포막 표면에 발현된다. 그리고, 수상세포에 있어서는, 키메라 FcεRI는 1개의 α쇄 및 2개의 γ쇄로 이루어지는 3량체의 콘포메이션으로 발현된다.
상기 키메라 FcεRI의 보다 상세한 모식도를 도 2의 A에 나타낸다. 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 키메라 FcεRI는, 키메라 FcεRIα쇄 단백질(동 도면에 있어서 h＋rα로 표시되어 있음), FcεRIβ쇄 단백질(동 도면에 있어서 rβ), 및 FcεRIγ쇄 단백질의 호모 다이머(동 도면에 있어서 rγ)로 이루어지는 4량체이다. 상기 α쇄 단백질은, 인간 FcεRIα쇄에 유래하는 제1 부분(동 도면에 있어서 도트로 표시되는 부분)과, 비인간 동물 FcεRIα쇄에 유래하는 제2 부분(동 도면에 있어서 그레이로 표시되는 부분)을 포함한다.
그리고, 도 1 및 2는, 설명을 위한 모식도이며, 실제 상태를 반영하고 있는 것이 아님을 이해해야 한다.
상기 제1 부분은, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 포함한다. 상기 세포외 도메인은, 글자 그대로, 세포외에 노출하고 있어도 된다. 상기 세포외 도메인은, 인간 FcεRIα쇄 중 IgE 결합성 영역을 포함한다.
예를 들면 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 세포외 도메인은, 세포외에 존재하고, 상기 α쇄 단백질은, 상기 세포외 도메인에 포함되는 IgE 결합성 영역을 통하여, 인간 IgE(hIgE)와 결합할 수 있다.
상기 제2 부분은, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 포함한다. 또한, 상기 세포막 관통 도메인이, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합에 기여하고, 예를 들면 상기 결합성을 발휘하는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 제2 부분은, 상기 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포내 도메인을 더 포함해도 된다.
예를 들면, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 α쇄 단백질은, 상기 세포막 관통 도메인 중 상기 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 통하여, 상기 γ쇄 단백질과 결합할 수 있다. 또한, 동 도면에 나타낸 바와 같이, 상기 α쇄 단백질은, 상기 세포막 관통 도메인에 의해, 세포막에 머무른다.
상기 FcεRIβ쇄 단백질은, 상기 비인간 동물에 내인적(內因的)으로 존재하는 상기 FcεRIβ쇄 유전자의 발현산물이면 된다.
상기 FcεRIγ쇄 단백질도, 상기 비인간 동물에 내인적으로 존재하는 상기 FcεRIγ쇄 유전자의 발현산물이면 된다.
그리고, 상기에서 기술한 RS-ATL8세포가 발현되는 FcεRI의 모식도가 도 2의 B에 도시되어 있다. RS-ATL8세포는, RBL-2H3세포에 인간 FcεRI를 안정 발현시킨 RBL-SX38세포에, NF-AT 의존성 반딧불 루시퍼라아제 발현 벡터가 안정 도입된 세포이다. 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, RS-ATL8세포에 있어서 발현되는 FcεRI의 α쇄 및 γ쇄는 인간 FcεRI의 것이며(도트로 표시되는 부분), β쇄는, 래트 FcεRI의 것인 것으로 여겨진다(그레이로 표시되는 부분). RS-ATL8세포에 있어서 발현되는 FcεRI는, 그 α쇄가 인간 FcεRI의 것이므로, 인간 IgE와 결합할 수 있다.
RS-ATL8세포의 FcεRI의 α쇄는 그 전체가 인간 FcεRI의 것인 것에 대하여, 도 2의 A에서의 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 세포외 도메인이 인간 FcεRI의 것인 한편, 세포막 관통 도메인이 비인간 동물의 FcεRI의 것이다.
또한, 상기에서 기술한 RBL-2H3세포가 발현하는 FcεRI의 모식도가 도 2의 C에 표시되어 있다. 상기 FcεRI의 α쇄, β쇄, 및 γ쇄는 모두 래트 유래이며, α쇄는 래트 IgE에 결합한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, I형 알레르기는, (1) FcεRI와 IgE의 결합(감작), (2) IgE에 대한 항원(알레르겐)과, FcεRI에 결합한 IgE의 결합(결합), (3) 1개의 항원에 결합한 복수의 IgE 결합 FcεRI간의 가교(가교), (4) 세포로부터의 히스타민이나 세로토닌 등의 생리활성물질의 방출(탈과립), (5) 생리활성물질에 의한 전신성(全身性)의 응답에 의해 발생한다.
상기 (3)의 복수의 IgE 결합 FcεRI간의 가교에 의해 발현이 유도되는 리포터유전자의 유전자발현을 확인함으로써, 예를 들면 IgE에 결합하는 항원(특히 특이적인 항원)을 검출할 수 있다.
2. 제1 실시형태(키메라 FcεRIα쇄 유전자)
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 구성예를, 도 3의 A를 참조하면서 이하에서 설명한다. 도 3의 A는, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 구성을 설명하기 위한 모식도이다. 도 3의 A에 있어서, 지면(紙面) 좌측이 상기 유전자의 5' 말단이며, 지면 우측이 상기 유전자의 3' 말단이다.
또한, 상기 모식도의 아래에 도 3의 B가 표시되어 있고, 도 3의 B는, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 발현에 의해 생성되는 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 구성예를 나타낸다. 도 3의 B에 있어서, 지면 좌측이 상기 단백질의 N 말단이며, 지면 우측이 상기 단백질의 C 말단이다.
도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩하는 제1 염기서열과, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 코딩하는 제2 염기서열을 포함한다. 상기 제2 염기서열은, 특히 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 코딩하고, 상기 세포막 관통 도메인이, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합성을 발휘할 수 있다.
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는 또한, 상기 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄를 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열을 코딩하는 제3 염기서열을 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 발현에 의해 생성되는 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인 1과, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포막 관통 도메인 2 및 세포내 도메인 3을 포함할 수 있다. 상기 세포외 도메인 1은, IgE 결합성 영역을 포함할 수 있다. 상기 세포막 관통 도메인 2가, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합성을 발휘하고, 상기 결합성을 발휘하는 하나 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은 또한, 상기 단백질을 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열 4를 더욱 포함할 수 있다.
이상과 바와 같이, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 포함되는 상기 제1 염기서열이 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질에 포함되는 상기 세포외 도메인에 대응한다. 상기 제2 염기서열이 상기 세포막 관통 도메인 및 상기 세포내 도메인에 대응한다. 상기 제3 염기서열이, 상기 시그널 서열에 대응한다.
상기 제1∼제3 염기서열은, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 5' 말단으로부터, 상기 제3 염기서열, 상기 제1 염기서열, 및 상기 제2 염기서열의 순서대로 배열되어 있어도 된다. 상기 세포외 도메인, 상기 세포막 관통 도메인, 상기 세포내 도메인, 및 상기 시그널 서열은, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, N 말단으로부터, 상기 시그널 서열, 상기 세포외 도메인, 상기 세포막 관통 도메인, 및 상기 세포내 도메인의 순서대로 배열되어 있어도 된다. 또한, 이들 영역 사이에는, 1 이상의 아미노산 잔기가 삽입되어 있어도 되고 또는 삽입되어 있지 않아도 된다.
(1) 제1 염기서열
상기 제1 염기서열은, 상기과 같이, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩한다. 상기 세포외 도메인은, 인간 FcεRIα쇄 중 IgE 결합성 영역을 포함한다. 상기 IgE 결합성 영역은, 인간의 IgE에 결합하는 영역이면 된다.
상기 제1 염기서열은, 바람직하게는, 서열 ID No. 7의 염기서열과 70% 이상,보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함한다. 상기 염기서열에 코딩되는 아미노산서열이, IgE로의 결합성을 위하여 바람직하고, IgE 결합성 영역으로서 기능한다.
서열 ID No. 7은 이하와 같다. 서열 ID No. 7은, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 110∼183에 대응하는 염기서열이다.
보다 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 제1 염기서열은, 이하의 서열 ID No. 3의 염기서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함해도 된다. 상기 염기서열에 코딩되는 아미노산서열은, IgE로의 결합성을 위하여 바람직하고, 나아가서는 IgE 결합성을 초래하기 위한 구조의 유지를 위해서도 바람직하다. 상기 염기서열에 코딩되는 아미노산서열이, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질에서의 세포외 도메인 전체를 구성해도 된다.
서열 ID No. 3은, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 26∼205에 대응하는 염기서열이다.
또한, 상기 제1 염기서열은, 이뮤노글로불린 도메인으로서 기능하는 2개의 아미노산서열을 코딩하고 있어도 된다.
상기 2개의 아미노산서열 중 하나는, 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 44∼108의 아미노산서열이다. 상기 아미노산서열을 코딩하는 염기서열은, 예를 들면, 서열 ID No. 1 중 염기번호 130∼324에 대응한다.
상기 2개의 아미노산서열 중 또 하나는, 서열 ID No. 8의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 121∼194의 아미노산서열이다. 상기 아미노산서열을 코딩하는 염기서열은, 예를 들면, 서열 ID No. 1 중 염기번호 361∼582에 대응한다.
또한, 이뮤노글로불린 도메인으로서 기능하는 이들 2개의 아미노산서열 사이의 영역은, 링커 영역으로도 불리운다. 상기 링커 영역은, 서열 ID No. 8의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 109∼120의 아미노산서열이다. 상기 링커 영역을 코딩하는 염기서열은, 예를 들면, 서열 ID No. 1 중 염기번호 325∼360에 대응한다.
이들 염기서열에 대해서도, 상기에서 서열 ID No. 3에 대하여 기술한 바와 같은 서열 동일성이 허용된다.
그리고, 본 명세서 내에 있어서, 염기서열(또는 아미노산서열)의 「서열 동일성」이란, 비교할 2개의 염기서열(또는 아미노산서열)의 염기(또는 아미노산 잔기)가 될 수 있는 한 많이 일치하도록 양쪽 염기서열(또는 아미노산서열)을 정렬시키고, 일치한 염기수(또는 일치한 아미노산 잔기수)를 전염기수(또는 전아미노산 잔기수)로 나눈 것을 백분률로 나타낸 것이다. 상기 정렬화 및 상기 백분률의 산출은, 예를 들면 BLAST 등의 주지의 알고리즘을 사용하여 행해도 된다.
(2) 제2 염기서열
제2 염기서열은, 상기와 같이, 적어도 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포막 관통 도메인을 코딩한다. 상기 세포막 관통 도메인이, γ쇄와 결합하는 기능을 가진다. 상기 기능을 발휘하기 위하여, 상기 세포막 관통 도메인은, 비인간 동물 FcεRI의 γ쇄와의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 포함해도 된다. 예를 들면, 후술하는 세포막 관통 도메인에 포함되는 Asp가, 상기 결합에 관여할 수 있다.
상기 비인간 동물은, 예를 들면 설치류 동물이며, 바람직하게는 래트, 마우스, 또는 햄스터이며, 보다 바람직하게는 래트 또는 마우스이며, 특히 바람직하게는 래트이다.
또한, 제2 염기서열은, 상기 세포막 관통 도메인에 더하여, 상기 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 상기 세포내 도메인을 포함하는 영역을 더욱 코딩해도 된다.
특히 바람직하게는, 제2 염기서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 상기 세포막 관통 도메인 및 상기 세포내 도메인의 양쪽을 포함하는 영역을 코딩해도 된다. 그리고, 상기 세포막 관통 도메인이, 상기 비인간 동물 FcεRIγ쇄와 결합하는 기능을 가져도 되고, 상기 기능을 발휘하기 위한 상기 Asp를 포함해도 된다. 상기 Asp는, 후술하는 서열 ID No. 12에서의 아미노산번호 219의 Asp일 수 있다.
상기 제2 염기서열은, 바람직하게는,
서열 ID No. 5의 염기서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열, 및
서열 ID No. 6의 염기서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함한다. 이와 같은 염기서열에 코딩되는 아미노산서열이, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합을 위하여 바람직하다.
서열 ID No. 5의 염기서열과 상기 서열 동일성을 가지는 염기서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인에 대응한다.
서열 ID No. 6의 염기서열과 상기 서열 동일성을 가지는 염기서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포내 도메인에 대응한다.
서열 ID No. 5 및 서열 ID No. 6은 이하와 같다.
서열 ID No. 5는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 206∼224(세포막 관통 도메인)에 대응하는 염기서열이다.
서열 ID No. 6은, 상기 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 225∼246(세포내 도메인)에 대응하는 염기서열이다.
상기 제2 염기서열 중, 서열 ID No. 5의 염기서열과 상기 서열 동일성을 가지는 상기 염기서열이 5' 말단 측에 있고, 또한, 서열 ID No. 6의 염기서열과 상기 서열 동일성을 가지는 상기 염기서열은 3' 말단 측에 있다. 이들 2개의 염기서열 사이에는, 염기서열은 삽입되어 있지 않아도 되지만(즉, 전자(前者)의 염기서열의 직후의 후자의 염기서열이 있어도 되지만), 예를 들면 15염기∼75염기(5아미노산 잔기∼25아미노산 잔기에 상당), 특별하게는 21염기∼60염기(7아미노산 잔기∼20아미노산 잔기에 상당), 보다 특별하게는 30염기∼45염기(10아미노산 잔기∼15아미노산 잔기에 상당), 보다 특별하게는 36염기(12아미노산 잔기에 상당)가 삽입되어 있어도 된다.
상기 세포막 관통 도메인 및 상기 세포내 도메인의 양쪽을 포함하는 영역을 코딩하는 상기 제2 염기서열은, 서열 ID No. 4의 염기서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함한다. 이와 같은 염기서열에 코딩되는 아미노산서열이, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합을 위하여 바람직하다.
서열 ID No. 4는 이하와 같다. 서열 ID No. 4는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 206∼246(세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인)에 대응하는 염기서열이다.
(3) 제3 염기서열
제3 염기서열은, 상기와 같이, 상기 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄를 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열을 코딩한다. 예를 들면, 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 세포막 관통(특히 1회 막관통)을 초래하기 위한 시그널 서열을 코딩할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시 태양에 있어서, 상기 시그널 서열은, 예를 들면, 인간의 FcεRIα쇄 단백질에 포함되는 시그널 서열이라도 되고 또는 비인간 동물의 FcεRIα쇄 단백질에 포함되는 시그널 서열이라도 된다. 바람직하게는, 상기 시그널 서열은, 인간의 FcεRIα쇄 단백질에 포함되는 시그널 서열이다. 상기 제3 염기서열에 코딩된 상기 시그널 서열에 의해, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자로부터 생성된 키메라 FcεRIα쇄 단백질이, 세포막에 발현된다.
본 발명의 다른 실시 태양에 있어서, 상기 시그널 서열은, Igκ에 포함되는 시그널 서열이면 되고, 예를 들면 인간 Igκ 또는 비인간 동물 Igκ에 포함되는 시그널 서열이라도 된다. 상기 시그널 서열에 의해서도, 키메라 FcεRIα쇄 단백질이, 세포막에 발현될 수 있다.
상기 제3 염기서열은, 바람직하게는,
서열 ID No. 2의 염기서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함한다. 이와 같은 염기서열이, 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 세포막으로의 발현에 있어서 바람직하다.
서열 ID No. 2는 이하와 같다. 서열 ID No. 2는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 1∼25(시그널 서열)에 대응하는 염기서열이다.
(4) 키메라 FcεRIα쇄 유전자 전체
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자가, 바람직하게는, 서열 ID No. 1의 염기서열과 50% 이상, 보다 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 가진다.
서열 ID No. 1은 이하와 같다. 서열 ID No. 1은, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열이다.
서열 ID No. 1∼No. 7은, 설치류 동물의 코돈 사용 빈도, 특히 래트의 코돈 사용 빈도를 고려하여 최적화되어 있다. 이에 따라, 상기 비인간 동물은, 바람직하게는 설치류 동물이며, 보다 바람직하게는 래트, 마우스, 또는 햄스터이며, 특히 바람직하게는 래트이다.
(제조 방법)
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 예를 들면 당기술 분야에서 기지(旣知)의 인공유전자합성기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 화학합성법 또는 효소법에 의해, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 제한 효소 및/또는 PCR을 사용하여 복수의 유전자 구성 요소를 결합시킴으로써 제조되어도 되고, 또는, 비인간 동물 세포(특히 래트 세포)의 FcεRIα쇄 유전자를 게놈 편집함으로써 제조되어도 된다.
3. 제2 실시형태(키메라 FcεRIα쇄 단백질)
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 구성예가 도 3의 B에 표시되어 있다. 상기 구성예는, 상기 「2. 제1 실시형태(키메라 FcεRIα쇄 유전자)」에 있어서 설명한 바와 같다. 즉, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인과, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포막 관통 도메인을 포함한다. 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은 나아가서는 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포내 도메인을 포함해도 된다.
상기 세포외 도메인은, 인간 FcεRIα쇄 중 IgE 결합성 영역을 포함해도 된다. 또한, 상기 세포막 관통 도메인이, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합에 기여할 수 있다. 또한, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은 나아가서는, 상기 단백질을 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열을 더욱 포함할 수 있다.
(1) 세포외 도메인
상기 세포외 도메인은 상기 IgE 결합성 영역을 포함하고, 상기 영역은, 상기한 바와 같이, 인간 FcεRIα쇄 중, 인간 IgE에 결합하는 영역이면 된다. 상기 세포외 도메인은, 예를 들면, 상기에서 설명한 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 포함되는 상기 제1 염기서열에 대응하는 것이면 된다. 즉, 상기 세포외 도메인은, 상기 제1 염기서열에 코딩된 아미노산서열을 가질 수 있다.
상기 세포외 도메인은, 바람직하게는, 서열 ID No. 14의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함해도 된다. 이와 같은 아미노산서열이, 상기 IgE 결합성 영역으로서 기능한다.
서열 ID No. 14은 이하와 같다. 서열 ID No. 14는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 110∼183에 대응한다. 서열 ID No. 14의 아미노산서열은, 서열 ID No. 7의 염기서열에 의해 코딩된 아미노산서열이기도 하다.
보다 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 세포외 도메인은, 이하의 서열 ID No. 10의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열이면 된다. 상기 아미노산서열은, IgE로의 결합성을 위하여 바람직하고, 또한 IgE 결합성을 초래하기 위한 구조의 유지를 위해서도 바람직하다. 상기 아미노산서열이, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질에서의 세포외 도메인 전체를 구성해도 된다. 서열 ID No. 10은, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 26∼205의 아미노산서열이다.
또한, 상기 세포외 도메인은, 2개의 이뮤노글로불린 도메인을 포함해도 된다. 상기 2개의 이뮤노글로불린 도메인 중 하나는, 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 44∼108의 아미노산서열에 의해 형성될 수 있다. 상기 2개의 아미노산서열 중 또 하나는, 서열 ID No. 8의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 121∼194의 아미노산서열에 의해 형성될 수 있다.
또한, 이뮤노글로불린 도메인으로서 기능하는 이들 2개의 아미노산서열 사이의 영역은, 링커 영역으로도 불리운다. 상기 링커 영역은, 서열 ID No. 8의 아미노산서열 중, 아미노산 잔기번호 109∼120의 아미노산서열에 의해 형성될 수 있다.
이들 아미노산서열에 대해서도, 상기에서 서열 ID No. 10에 대하여 기술한 바와 같은 서열 동일성이 허용된다.
이와 같은 아미노산서열이, IgE로의 결합을 위해서 적합하다.
(2) 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인
상기 세포막 관통 도메인은, 상기 비인간 동물 FcεRIγ쇄와 결합하는 기능을 가지면 된다. 상기 기능을 발휘하기 위하여, 상기 세포막 관통 도메인은, 상기 기능을 발휘하는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 후술하는 세포막 관통 도메인에 포함되는 Asp가, 상기 결합에 관여할 수 있다.
즉, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인을 적어도 포함하면 된다. 그리고, 상기 세포막 관통 도메인이, 상기 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합에 기능을 발휘하는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 세포막 관통 도메인은, 그러한 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 상기 Asp를 포함하면 된다.
또한, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 상기 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포내 도메인을 더욱 포함하면 된다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 상기 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인의 양쪽을 포함한다.
상기 세포막 관통 도메인은, 바람직하게는, 서열 ID No. 12의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하면 된다.
서열 ID No. 12의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 아미노산서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인에 대응한다.
상기 세포내 도메인은, 바람직하게는, 서열 ID No. 13의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하면 된다. 이와 같은 아미노산서열이, 비인간 동물 FcεRIγ쇄와의 결합을 위하여 바람직하다.
서열 ID No. 13의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 아미노산서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포내 도메인에 대응한다.
서열 ID No. 12 및 서열 ID No. 13은 이하와 같다.
서열 ID No. 12는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 206∼224(세포막 관통 도메인)이다. 서열 ID No. 12의 아미노산서열은, 서열 ID No. 5의 염기서열에 의해 코딩된 아미노산서열이기도 하다.
서열 ID No. 13은, 상기 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 225∼246(세포내 도메인)에 대응하는 염기서열이다. 서열 ID No. 13의 아미노산서열은, 서열 ID No. 6의 염기서열에 의해 코딩된 아미노산서열이기도 하다.
비인간 동물 FcεRIγ쇄로의 양호한 결합성의 관점에서, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 서열 ID No. 12의 아미노산서열과 서열 ID No. 13의 아미노산서열의 양쪽을 포함하는 것이면 된다.
서열 ID No. 12의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 상기 아미노산서열이 N말단 측에 있고, 또한 서열 ID No. 13의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 상기 아미노산서열은 C말단 측에 있으면 된다. 이들 2개의 아미노산서열 사이에는, 아미노산 잔기는 삽입되어 있지 않아도 되지만(즉, 전자의 아미노산서열의 직후의 후자의 아미노산서열이 있으면 되지만), 예를 들면, 5아미노산 잔기∼25아미노산 잔기, 특별하게는 7아미노산 잔기∼20아미노산 잔기, 보다 특별하게는 10아미노산 잔기∼15아미노산 잔기, 보다 특별하게는 12아미노산 잔기가 삽입되어 있어도 된다.
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질이, 상기 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인의 양쪽을 포함하는 경우에 있어서, 상기 단백질은, 바람직하게는, 서열 ID No. 11의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하면 된다.
서열 ID No. 11의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 아미노산서열은, 비인간 동물 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인에 대응한다.
서열 ID No. 11은 이하와 같다.
서열 ID No. 11은, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 206∼246(세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인)이다. 서열 ID No. 11의 아미노산서열은, 서열 ID No. 4의 염기서열에 의해 코딩된 아미노산서열이기도 하다.
(3) 시그널 서열
상기 시그널 서열은, 상기와 같이, 키메라 FcεRIα쇄를 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열이다. 상기 시그널 서열은, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질의, 세포막으로의 이행(移行)을 촉진한다.
상기 시그널 서열은, 바람직하게는, 서열 ID No. 9의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함한다. 이와 같은 아미노산서열이, 키메라 FcεRIα쇄 단백질의 세포막으로의 발현에 있어서 바람직하다.
서열 ID No. 9는 이하와 같다. 서열 ID No. 9는, 후술하는 서열 ID No. 8(본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질)의 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 1∼25(시그널 서열)이다. 또한, 서열 ID No. 9의 아미노산서열은, 서열 ID No. 2의 염기서열에 의해 코딩된 아미노산서열이기도 하다.
(4) 키메라 FcεRIα쇄 단백질
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 바람직하게는, 서열 ID No. 8의 아미노산서열과 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 혹은 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 가진다.
서열 ID No. 8은 이하와 같다.
또한, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 비인간 동물 FcεRIγ쇄의 세포내 도메인을 더 포함해도 된다. 이로써, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질이 발현되는 세포에 있어서의 γ쇄의 역할을, 상기 α쇄 단백질이 행할 수 있고, 상기 세포에 있어서 γ쇄가 발현되지 않아도 된다.
또한, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 예를 들면 Lyn 또는 Syk 등의 티로신 키나아제의 키나아제 도메인을 더 포함해도 된다. 상기 키나아제 도메인은, 서열 ID No. 13의 아미노산서열과 상기 서열 동일성을 가지는 아미노산서열의 하류에 삽입되면 된다. 상기 키나아제 도메인에 의해, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질이 발현되는 세포에 있어서의 시그널 전달을 조절할 수 있고, 예를 들면 탈과립 등의 알레르기 응답을 제어할 수 있다.
이들 구성 요소에 의해, 숙주 세포의 γ쇄 또는 티로신 키나아제에 의존하지 않고 세포내 시그널링을 유도할 수 있게 된다. 그리고, 이들 구성 요소가 포함되는 경우에는, 상기 유도를 위하여, 바람직하게는, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 세포막 관통 도메인으로서, 예를 들면 CD8 또는 IL2Ra의 세포막 관통 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자를, 상기 유전자에 포함되는 제2 염기서열이 코딩하는 세포막 관통 도메인이 유래하는 비인간 동물의 세포에 있어서 발현시킴으로써, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질은 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자가 도입된 세포의 세포막에, 본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 단백질이 발현할 수 있다.
4. 제3 실시형태(벡터)
본 발명은, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 포함하는 벡터도 제공한다. 상기 벡터에 의해, 상기 유전자를 비인간 동물 세포에 도입할 수 있다. 상기 벡터는, 비인간 동물 세포로의 도입에 있어서, 리니얼라이즈되어도 되고, 또는, 되지 않아도 된다.
상기 벡터는, 예를 들면, 당기술분야에서 기지의 플라스미드에 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 삽입함으로써 제조되면 된다. 상기 플라스미드는, 예를 들면 적어도 하나의 클로닝 사이트를 가지고, 상기 클로닝 사이트를 이용하여, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 상기 플라스미드에 삽입될 수 있다.
플라스미드의 종류는, 비인간 동물 세포의 종류에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택되면 되고, 플라스미드의 예로서, 예를 들면 pcDNA3.1(＋)벡터(Invitrogen사)가 있다.
본 발명의 벡터는, 예를 들면, Kozak서열을 포함할 수 있다. 상기 Kozak서열에 의해, 번역 개시 효율을 높일 수 있다. 상기 Kozak서열은, 예를 들면, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 개시 코돈과, 상기 개시 코돈의 직전(5'단측)의 1염기∼6염기와, 상기 개시 코돈의 직후(3'단측)의 1염기∼6염기(특히 1염기)로 구성되어도 된다.
5. 제4 실시형태(세포)
본 발명은, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 또는 상기 벡터를 포함하는, 비인간 동물의 세포도 제공한다.
상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 예를 들면, 상기 비인간 동물의 세포의 염색체에 내장되어 있어도 되고, 또는, 상기 비인간 동물의 세포내에 도입된 벡터내에 내장되어 있어도 된다. 안정적인 발현을 위하여, 바람직하게는, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 상기 비인간 동물의 세포의 염색체에 내장되어 있다.
본 발명의 세포는, 바람직하게는, 상기 비인간 동물 세포의 FcεRI의 γ쇄의 유전자를 더 포함한다. 나아가서는, 본 발명의 세포는, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄 단백질과 상기 세포의 FcεRI의 γ쇄 단백질을 포함하는 회합체를 형성할 수 있다. 상기 회합체에는, 상기 α쇄 1개와 상기 γ쇄 2개가 포함되어 있으면 된다. 즉, 상기 γ쇄 유전자의 발현산물인 비인간 동물 FcεRIγ쇄 단백이, 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질과 회합체를 형성할 수 있다. 상기 회합체는, 인간 IgE의 Fc 리셉터로서 기능하고, 인간 IgE를 고친화성으로 결합한 복합체를 형성한다. 1개의 항원이 복수(예를 들면, 2개)의 상기 IgE와 결합함으로써 복수(예를 들면, 2개)의 상기 복합체가 가교됨으로써 알레르기 반응이 일어난다. 이와 같이, 상기 비인간 세포가 상기 γ쇄 유전자를 더 포함함으로써, 상기 비인간 세포는, 알레르기 반응을 일으킬 수 있고, 이것은 다양한 알레르기 검사를 실행하기 위하여 유용하다.
본 발명의 세포는, 보다 바람직하게는, 상기 비인간 동물 세포의 FcεRI의 β쇄의 유전자를 더 포함한다. 상기 β쇄 유전자에 기초하여 생성된 비인간 동물 FcεRI의 β쇄에 의해, 상기 가교에 의한 시그널 전달을 증강할 수 있다.
상기 γ쇄 유전자 및 상기 β쇄 유전자는, 상기 비인간 동물에 내재되어 있는 것이면 되고, 예를 들면 상기 비인간 동물 세포의 염색체 내에 천연에 존재하는 것이면 된다. 예를 들면, 래트의 γ쇄 유전자 및 β쇄 유전자의 서열 정보는, NCBI Reference Sequence 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 예를 들면, 래트의 γ쇄 유전자의 정보(서열 정보를 포함함)는, 웹페이지(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001131001)로부터 입수 가능하다. 또한, 래트의 β쇄 유전자의 정보(서열 정보를 포함함)는, 웹페이지(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22923.1)로부터 입수 가능하다. 또한, 이들 유전자로부터 발현되는 단백질의 아미노산서열 정보는, uniprot 데이터베이스(https: //www.uniprot.org/)로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 세포는, 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄와, 상기 세포의 비인간 동물 FcεRI의 β쇄와, 상기 세포의 비인간 동물 FcεRI의 γ쇄를 포함하는 회합체를 형성할 수 있다. 상기 회합체에는, 상기 α쇄 1개와, 상기 β쇄 1개와, 상기 상기 γ쇄 2개가 포함되어 있으면 된다. 즉, 상기 회합체는 4량체이며, 본 발명의 세포는, 바람직하게는, 상기 4량체를 형성하도록 구성되어 있으면 된다. 상기 4량체에 의해, 상기 알레르기 반응에 관여하는 시그널 전달이 증강될 수 있다. 이로써, 상기 세포를 사용한 알레르기 검사를, 보다 양호한 감도로 실행할 수 있다.
본 발명의 세포는, 보다 바람직하게는, 상기 회합체끼리의 가교에 의해 발현이 유도되는 리포터유전자를 더 포함한다. 상기 리포터유전자에 의해, 상기 세포를 사용한 알레르기 검사를 양호한 감도로 실행할 수 있다.
상기 리포터유전자는, 상기한 바와 같이, 상기 회합체끼리의 가교에 의해 발현이 유도되는 유전자이다. 이와 같이 유도되는 유전자는, 바람직하게는, 상기 가교에 의해 활성화한 전사인자에 의해 발현이 유도되도록 구성될 수 있다. 상기 전사인자는, NF-AT, NF-κB, AP-1, Elk-1, Egr-1, GATA-1, 및 GATA-2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나이면 되고, 바람직하게는 NF-AT이다. NF-AT의 활성화는, 피험물질 중으로부터 피험자에 대하여 I형 알레르기를 유발할 가능성이 있는 알레르겐을 검출하기 위해 적합하다.
예를 들면, 상기 리포터유전자는, 상기 활성화 전사인자가 결합할 수 있는 인핸서의 제어 하에 있어도 된다. 상기 리포터유전자의 상류에는, 프로모터가 배치되어 있어도 된다. 예를 들면, 본 발명의 세포는, 상기 인핸서와, 상기 인핸서의 제어 하에 있는 프로모터 및 리포터유전자를 포함한다. 상기 인핸서, 상기 프로모터, 및 상기 리포터유전자는, 예를 들면 이들 3개의 요소를 포함하는 영역(이하 「리포터유전자 영역」이라고도 함)을 가지는 벡터(예를 들면, 플라스미드)에 의해, 상기 세포에 도입되면 된다. 상기 리포터유전자 영역은, 상기 비인간 동물 세포의 염색체 내에 도입되어도 되고, 또는, 상기 비인간 동물 세포 중의 벡터 내에 존재하고 있어도 된다. 바람직하게는, 상기 리포터유전자 영역은, 상기 비인간 동물 세포의 염색체 내에 도입되고 있다. 이로써, 상기 리포터유전자의 안정적인 발현이 가능하게 된다. 상기 리포터유전자 영역은, 예를 들면 상동재조합에 의해, 염색체내에 도입될 수 있다.
상기 인핸서의 서열은, 상기 전사인자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택되어도 되고, 예를 들면 이하 표 1에 표시되는 서열 중 어느 하나이면 된다. 이하의 표 1의 좌측 열에는, 인핸서 서열이 기재되어 있다. 각 인핸서 서열은 괄호로 에워싸여져 있고, 상기 괄호 밖에 기재되어 있는 숫자는, 인핸서 서열의 반복 횟수의 예이다. 본 기술에 있어서, 리포터유전자에 포함되는 인핸서의 인핸서 서열 반복 횟수는, 표 1에 기재된 수로 한정되지 않고, 예를 들면 1∼15, 2∼15, 특별하게는 2∼10, 보다 특별하게는 3∼10 중 어느 하나의 수이면 된다. 표 1의 우측 열에는, 각 인핸서 서열에 결합하는 전사인자가 기재되어 있다.
[표 1]
상기 프로모터는, 세포의 RNA폴리머라제를 포함하는 복합체가 결합하는 서열을 가지는 것이면 되고, 예를 들면, TATA박스를 가지는 프로모터이면 되고, 바람직하게는 서열TATATAA를 가지는 프로모터이면 된다.
상기 리포터유전자는, 예를 들면, 효소를 코딩하는 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 및 표면항원(상기 비인간 동물에 내재하지 않는 것)을 코딩하는 유전자 중 어느 하나이면 된다.
상기 효소를 코딩하는 유전자는, 예를 들면, 루시퍼라아제, β갈락토시다아제, 알칼리포스파타아제, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제, 및 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 중 어느 1개 또는 그 이상이면 된다.
상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는, 예를 들면, 녹형광 단백질(GFP), Sirius, EBFP, ECFP, EGFP, Venus, 및 DsRed 중 어느 1개 또는 그 이상이면 된다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 동일하거나 또는 상이한 종류의 리포터유전자를 1개 또는 그 이상 가지고 있어도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 비인간 동물 세포는, 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 리포터유전자를 포함하면 된다.
본 발명의 세포는, 비인간 동물의 세포이면 된다. 상기 비인간 동물은, 예를 들면 설치류 동물이면 되고, 바람직하게는 래트, 마우스, 또는 햄스터이면 되고, 보다 바람직하게는 래트이다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 바람직하게는 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질과 상기 비인간 동물 세포에 유래하는 FcεRIγ쇄 단백질이 회합체를 형성하도록 구성되어 있는 세포이며, 보다 바람직하게는 상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질과 상기 비인간 동물 세포에 유래하는 FcεRIβ쇄 단백질 및 FcεRIγ쇄 단백질이 회합체를 형성하도록 구성되어 있는 세포이다. 이와 같은 세포로서, 예를 들면, 마스트 세포(비만 세포), 호염기구, 수상세포, 호산구, 단구, 마크로파지, 및 랑게르한스세포가 있다. 즉, 본 발명의 세포는, 이들 열거된 세포 중 어느 하나이면 되고, 보다 바람직하게는 마스트 세포, 호염기구, 또는 수상세포이며, 더욱 바람직하게는 마스트 세포이다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 바람직하게는, 래트의 마스트 세포, 호염기구, 혹은 수상세포, 또는, 마우스의 마스트 세포, 호염기구, 혹은 수상세포이며, 보다 바람직하게는, 래트 또는 마우스의 마스트 세포이다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 예를 들면, 동물체내로부터 단리된 세포 또는 주화(株化)한 세포에 상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 도입함으로써 얻어져도 된다. 본 발명에 있어서 사용될 수 있는 상기 주화한 세포의 예로서, 래트 마스트 세포주인 RBL-2H3세포(세포번호: JCRB0023, 국립연구개발법인 의약기반·건강·영양 연구소 JCRB 세포 뱅크로부터 입수 가능, 또는, 세포번호: CRL-2256, ATCC(상표)로부터 입수 가능) 및 마우스 마스트 세포주인 MC/9세포(ATCC(상표)로부터 입수 가능)를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 예를 들면, 수탁번호: NITE BP-03230로 기탁된 세포이면 된다. 상기 세포는, 기탁일을 레와 2년(2020년) 6월 17일로 하고, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)에 국제기탁되었다.
본 발명의 비인간 동물 세포는, 예를 들면, 분석 방법에 있어서 사용되면 되고, 예를 들면 이하 「7. 제6 실시형태(분석 방법)」에 있어서 설명하는 분석 방법에 있어서 사용되면 된다.
또한, 본 발명의 비인간 동물 세포는, 예를 들면, 상기 특허문헌 1에 기재된 방법에서의 세포로서 사용하기에 적합하다. 즉, 본 발명의 비인간 동물 세포는, 상기에서 설명한 EXiLE법에 있어서 사용되면 된다.
6. 제5 실시형태(분석용 키트)
본 발명은, 본 발명의 세포를 포함하는 분석용 키트를 제공한다. 상기 키트는, 예를 들면 알레르기에 관한 분석 또는 진단을 위하여 사용될 수 있다. 상기 키트는, 예를 들면 알레르겐성의 평가, 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가, IgE에 관한 분석, 알레르기 억제 활성의 평가, 및 드럭스크리닝으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 시험을 실행하기 위해 사용되는 키트이면 된다.
본 발명의 키트는, 리포터유전자의 발현검출용 재료를 포함할 수 있다. 상기 검출용 재료는, 예를 들면 리포터유전자가 효소를 발현하는 경우, 상기 효소의 기질을 포함해도 되며, 예를 들면 루시퍼라아제의 기질을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는, 예를 들면, 본 발명의 세포를 인큐베이팅하기 위해 사용되는 인큐베이팅 재료를 포함할 수 있다. 상기 인큐베이팅용 재료는, 상기 세포를 인큐베이팅하기 위해 사용되는 재료를 의미하면 되고, 예를 들면 상기 세포가 인큐베이팅되는 배지 또는 버퍼이면 된다. 상기 인큐베이팅 재료는, 예를 들면 감작용인큐베이팅을 위한 인큐베이팅 재료, 세포응답유도용 인큐베이팅을 위한 인큐베이팅 재료라도 된다. 또한, 상기 인큐베이팅 재료는, 감작 및 세포응답유도의 양쪽의 인큐베이팅 재료라도 된다.
상기 배지로서, 예를 들면 MEM배지가 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 상기 배지는, 예를 들면 우태아혈청 등의 보조 성분을 포함해도 된다.
상기 버퍼로서, 예를 들면 PBS가 있지만 이것으로 한정되지 않는다. 상기 PBS는, 예를 들면 세포세정액으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는, 세포감작성분을 포함할 수 있다. 상기 성분은, 상기에서 기술한 감작용인큐베이팅을 위한 인큐베이팅 재료에 포함되어 있어도 되고, 예를 들면 배지 또는 버퍼 중에 포함되어 있어도 된다. 또는, 상기 성분은, 배지 또는 버퍼에 포함되어 있지 않은 상태로, 상기 키트에 포함되어 있어도 된다.
상기 세포감작성분은, 본 발명의 세포를 감작시킬 수 있는 성분이면 된다. 세포감작성분은, 예를 들면 IgE 또는 키메라 IgE이다. 상기 IgE는, 영장류의 IgE이면 되고, 예를 들면 인간 또는 비인간 영장류(특히 원숭이)의 IgE이면 되고, 바람직하게는 인간의 IgE이다. 상기 IgE는, 정제 또는 단리된 IgE이면 되고, 또는, 정제 또는 단리되어 있지 않은 IgE라도 된다. 또한, 상기 키메라 IgE, 예를 들면 Fc부가 인간화된 키메라 IgE이면 된다.
상기 세포감작성분은, 생체재료라도 되고, 예를 들면 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액에 포함되는 성분(예를 들면, 혈액세포) 등이라도 된다.
본 발명의 키트는, 세포응답 유도성분을 포함할 수 있다. 상기 성분은, 상기에서 설명한 세포응답유도용 인큐베이팅을 위한 인큐베이팅 재료에 포함되어 있어도 되고, 예를 들면 배지 또는 버퍼 중에 포함되어 있으면 된다. 또는, 상기 성분은, 배지 또는 버퍼에 포함되어 있지 않은 상태로, 상기 키트에 포함되어 있어도 된다.
상기 세포응답 유도성분은, 예를 들면, 상기 세포감작성분에 결합하여 본 발명의 세포의 응답을 유도하는 성분이면 되고, 예를 들면, 상기 IgE 또는 키메라 IgE에 결합하는 성분이면 된다. 세포응답 유도성분은, 예를 들면 항IgE 항체이면 되고, 또는, IgE 또는 키메라 IgE와 결합하는(예를 들면, 특이적으로 결합하는) 항원 또는 항원후보물질이면 된다.
상기 세포응답 유도성분은, 상기 항원 또는 항원후보물질은, 예를 들면 피험자에 대하여 알레르기 반응(특히 I형 알레르기 반응)을 일으킬 수 있는 물질(즉 알레르겐이 될 가능성이 있는 물질)이면 된다. 상기 물질로서, 예를 들면, 티끌; 먼지; 비듬 등의 피부 가루; 삼나무 꽃가루, 사방오리 꽃가루, 벼과 꽃가루, 국화과 꽃가루 등의 꽃가루; 곰팡이 등의 진균; 깔따구나 바퀴벌레 등의 곤충; 곤충이나 어개류(魚介類) 등이 가지는 자극성 또는 독성의 물질; 대두, 계란, 밀, 우유, 메밀, 낙화생, 새우, 게 등에 포함되는 물질; 페니실린 등의 약제에 포함되는 물질; 배설물 등에 포함되는 동물의 몸에 유래하는 물질; 밀가루나 목재 가공 시에 생기는 분진 등의 식물성 물질; 그 외의 천연 또는 화학합성물질이 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 예를 들면, 피험자가 난백을 알레르겐으로 할 것인지의 여부를 검출하고 싶을 경우에는, 예를 들면, 피험물질로서 오브알부민, 오봄코이드, 리소자임 등의 난백 중에 존재하는 물질의 정제품이나 난백추출물을 사용할 수 있다. IgE로서 키메라 IgE를 사용하는 경우에는, 항원으로서 예를 들면 니트로페닐기와 같은 저분자 합텐(hapten)을 사용할 수도 있다.
본 발명의 키트는 나아가서는, 시험에 있어서 사용되는 양성대조 재료 및/또는 음성대조 재료를 포함할 수 있다. 양성대조 재료는, 예를 들면 칼슘이오노포어(예를 들면, 이오노마이신 등)를 포함할 수 있다. 음성대조 재료는, 예를 들면, 배지이면 된다.
또한, 본 발명의 키트는, 전사인자의 활성을 억제하는 물질을 포함해도 되고, 예를 들면 NF-AT의 활성을 억제하는 물질을 포함해도 된다. 상기 물질은, 예를 들면, 시클로스포린 A 또는 타크로리무스일 수 있다. 그리고, 본 발명의 키트가, 항알레르기 활성물질의 스크리닝용 키트인 경우에는, 상기 물질은, 항알레르기 활성물질의 양성대조로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키트는 약제를 더 포함할 수 있다.
상기 약제는, 감작저해제이면 되고, 또는, 감작을 저해하는 것이 기대되는 약제라도 된다. 상기 약제는, 예를 들면, IgE 또는 키메라 IgE에 결합하는 성분이면 되고, 예를 들면, 항IgE 항체 또는 항키메라 IgE 항체일 수 있다.
상기 약제는, 세포응답 저해제이면 되고, 또는, 세포응답을 저해하는 것이 기대되는 약제라도 된다. 상기 약제는, 예를 들면 FcεRI의 가교에 의한 시그널 전달을 저해하는 시그널 전달 저해제이면 된다.
본 발명의 키트는 나아가서는, 시험을 위한 반응이 행해지는 용기, 특히 본 발명의 세포가 유지되는 공간을 가지는 용기를 포함할 수 있다. 상기 용기의 예로서, 예를 들면 웰 플레이트(96웰 플레이트 등)가 있다.
7. 제6 실시형태(분석 방법)
본 발명은, 본 발명에 따른 세포를 사용하는 분석 방법도 제공한다. 상기 방법은, 알레르기에 관한 분석 또는 진단을 위하여 행해질 수 있다. 상기 방법은, 상기 세포를 사용하여, 예를 들면 알레르겐성의 평가, 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가, IgE에 관한 분석, 알레르기 억제 활성의 평가, 또는 드럭스크리닝을 행하는 것을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 분석 방법은, 알레르겐성의 평가 방법, 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가 방법, IgE의 분석 방법, 알레르기 억제 활성의 평가 방법, 또는 드럭스크리닝 방법으로서 구성되면 된다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 상기 특허문헌 1에 기재된 방법을 실행하도록 행해지면 되며, 즉 EXiLE법을 실행하도록 행해지면 된다.
또한, 본 발명의 방법은, 항원특이적인 IgE의 세컨드 스크리닝을 위하여 행해질 수 있다. 예를 들면, 생물학적으로 의의가 있는 IgE인지 아닌지의 평가, 중화항체의 어세이, 또는 교차 반응성의 어세이를 위하여, 본 발명의 방법이 실행되면 된다.
또한, 본 발명의 방법은, 드럭스크리닝, 특히 하이 스루풋한 드럭스크리닝을 위하여 행해질 수 있다. 예를 들면, IgE와 FcεRI의 결합을 저해하는 물질의 선택 또는 평가를 위하여, 또는, 세포(특히 마스트 세포 또는 호염기구 등)의 세포내 시그널 전달 저해 물질의 선택 또는 평가를 위하여, 본 발명의 방법이 행해지면 된다.
또한, 본 발명의 방법은, 기초과학연구를 위하여 행해지면 된다. 예를 들면, 메커니즘 해석 또는 바이오마커 탐색을 위하여, 본 발명의 방법이 행해지면 된다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 본 발명에 따른 세포를 인큐베이팅하는 인큐베이팅 공정 및/또는 상기 세포의 응답을 분석하는 분석 공정을 포함할 수 있다.
상기 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅될 수 있다. 상기 인큐베이팅 공정은, 후술하는 바와 같이, 2 또는 그 이상의 인큐베이팅 공정으로부터 구성되면 된다.
상기 인큐베이팅 공정은, 예를 들면, 본 발명에 따른 세포를 인큐베이팅용 재료 중에서 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서 내에 있어서, 「인큐베이팅용 재료」는, 상기 세포를 인큐베이팅하기 위해 사용되는 재료를 의미하고, 예를 들면 상기 세포가 인큐베이팅되는 배지 또는 버퍼이면 된다.
상기 분석 공정에 있어서, 본 발명에 따른 세포의 응답이 분석될 수 있다. 상기 분석은, 예를 들면, 상기에서 설명한 리포터유전자의 발현의 분석이면 된다. 상기 리포터유전자의 발현은, 상기 「5. 제4 실시형태(세포)」에 있어서 설명한 상기 회합체끼리의 가교에 의해 유도되는 발현이면 된다. 리포터유전자의 발현분석의 구체적인 방법은, 리포터유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택면 된다. 예를 들면, 리포터유전자가, 효소 단백질을 발현하는 경우에는, 분석 공정에 있어서, 상기 효소 단백질에 의한 효소반응의 분석이 행해질 수 있다. 예를 들면, 효소 단백질이 루시퍼라아제인 경우, 루시퍼라아제에 의한 기질분해에 의해 생기는 발광이 분석될 수 있다. 예를 들면, 리포터유전자가 형광 단백질을 발현하는 경우에는, 분석 공정에 있어서, 상기 형광 단백질로부터 생긴 형광의 분석이 행해질 수 있다.
또한, 상기 분석은, 상기 세포에 있어서의 알레르기 응답의 분석이면 되고, 특히 I형 알레르기 응답의 분석이라도 된다. 상기 분석에 있어서, 예를 들면, 탈과립 등의 알레르기 응답이 분석될 수 있다.
상기 분석 공정은, 상기 인큐베이팅 공정 후에 실행되면 되고, 또는, 상기 인큐베이팅 공정이 행해지고 있는 동안에 실행되어도 된다. 예를 들면, 상기 분석 공정은, 2 이상의 인큐베이팅 공정 중 어느 하나의 인큐베이팅 공정이 행해지고 있는 동안(특히 최후의 인큐베이팅 공정이 행해지고 있는 동안)에 실행되어도 된다.
본 발명의 하나의 실시 태양에 있어서, 상기 인큐베이팅 공정은, 2개의 인큐베이팅 공정을 포함한다. 이하 이들 2개의 인큐베이팅 공정을, 「제1 인큐베이팅 공정」 및 「제2 인큐베이팅 공정」이라고도 한다. 제1 인큐베이팅 공정은, 본 발명에 따른 세포에 감작을 초래하기 위한 처리를 행하는 감작용 인큐베이팅 공정이면 된다. 제2 인큐베이팅 공정은, 상기 처리가 행해진 세포에 있어서의 응답을 유도하는 세포응답유도용 인큐베이팅 공정이면 된다.
이 실시 태양에 있어서, 상기 분석 공정은, 예를 들면 제1 인큐베이팅 공정이 행해지고 있는 동안에 실행되면 되고, 제1 인큐베이팅 공정과 상기 제2 인큐베이팅 공정 사이에 실행되면 되고, 상기 제2 인큐베이팅 공정이 행해지고 있는 동안에 실행되면 되고, 또는, 상기 제2 인큐베이팅 공정 후에 실행되면 된다.
이하, 이들 공정에 대하여 각각 설명한다.
(1-1) 제1 인큐베이팅 공정
상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서 사용되는 인큐베이팅용 재료는, 감작용 재료 또는 감작분석용 재료이면 된다. 즉, 상기 제1 인큐베이팅 공정은, 상기 세포를, 감작용 재료 또는 감작분석용 재료 중에서 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 상기 재료는, 예를 들면 배지 또는 버퍼일 수 있다. 상기 배지 또는 상기 버퍼의 종류는, 예를 들면 분석의 목적 등에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택되면 된다. 예를 들면, 상기 배지는, MEM배지이면 된다. 상기 재료는, 보조 성분을 포함하면 되며, 예를 들면 우태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 상기 재료는, 보조 성분으로서, 예를 들면 1 또는 2 이상의 항생 물질을 포함해도 된다.
본 명세서 내에 있어서, 「감작용 재료」는, 상기 세포를 감작시키기 위해 사용되는 재료를 일컫는다. 상기 감작용 재료는, 상기 세포를 감작시킬 수 있는 성분(본 명세서 내에 있어서 「세포감작성분」이라고도 함)을 포함하는 재료를 의미하면 된다.
상기 「세포감작성분」은, 예를 들면 IgE 또는 키메라 IgE이다. 상기 IgE 또는 키메라 IgE는, 영장류의 IgE 또는 키메라 IgE이면 되고, 예를 들면 인간 또는 비인간 영장류(특히 원숭이)의 IgE 또는 키메라 IgE이면 되고, 바람직하게는 인간의 IgE 또는 키메라 IgE이다. 상기 IgE 또는 키메라 IgE는, 정제 또는 단리된 IgE 또는 키메라 IgE이면 되고, 또는, 정제 또는 단리되어 있지 않은 IgE 또는 키메라 IgE라도 된다.
상기 「세포를 감작시킬 수 있는 성분을 포함하는 재료」는, 예를 들면 세포감작성분을 포함하는 배지 또는 버퍼이면 되고, 특히 상기 성분을 포함하는 배지이다.
본 발명의 하나의 실시 태양에 있어서, 상기 감작용 재료는, 예를 들면 정제 또는 단리된 IgE를 포함하는 재료(특히 배지 또는 버퍼)이면 된다.
본 발명의 다른 실시 태양에 있어서, 상기 감작용 재료는, IgE를 포함하는 것이 기지의 생체성분(특히 영장류 유래 생체성분, 인간 또는 비인간 영장류(원숭이)에 유래하는 생체성분)을 포함하는 재료(배지 또는 버퍼)이면 되고, 보다 구체적으로는 전혈, 혈청, 혹은 혈장, 또는 혈액 구성성분(예를 들면, 혈액세포)을 포함하는 재료(배지 또는 버퍼) 등이면 된다.
본 명세서 내에 있어서, 상기 「감작분석용 재료」는, 상기 세포를 감작시킬 수 있는지에 관한 분석의 대상이 되는 재료를 일컫는다. 상기 감작분석용 재료는, 상기 세포감작성분을 포함할 수 있는 재료를 의미하면 된다.
상기 「세포감작성분」은, 상기에서 기술한 바와 같으면 된다.
상기 「세포감작성분을 포함할 수 있는 재료」, 상기 성분을 포함하는지 아닌지가 불분명한 재료(배지 또는 버퍼)이면 되고, 또는, 상기 성분을 포함하는 것이 기지이지만 상기 성분의 종류 또는 함유량이 불분명한 재료이면 된다. 예를 들면, 상기 재료는, 본 발명의 방법을 실시한 결과, 상기 성분을 포함하는 것 또는 포함하지 않는 것이 판명되는 재료, 또는, 상기 성분의 함유량 및/혹은 종류가 판명되는 재료라도 된다.
(1-2) 제2 인큐베이팅 공정
상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서 사용되는 인큐베이팅용 재료는, 세포응답유도용 재료 또는 세포응답유도분석용 재료이면 된다. 즉, 상기 제2 인큐베이팅 공정은, 상기 세포를, 세포응답유도용 재료 또는 세포응답유도분석용 재료 중에서 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 상기 재료는, 예를 들면 배지 또는 버퍼일 수 있다. 상기 배지 또는 상기 버퍼의 종류는, 예를 들면 분석의 목적 등에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택되면 된다. 예를 들면, 상기 배지는, MEM배지이면 된다. 상기 재료는, 보조 성분을 포함해도 되며, 예를 들면 우태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 상기 재료는, 보조 성분으로서, 예를 들면 1 또는 2 이상의 항생 물질을 포함해도 된다.
본 명세서 내에 있어서, 「상기 세포응답유도용 재료」는, 세포의 응답을 유도하는 성분(이하 「세포응답 유도성분」이라고도 함), 특히 감작된 세포의 응답을 유도하는 성분을 포함하는 재료이면 된다.
「상기 세포응답유도용 재료」는, 상기 세포응답 유도성분에 더하여, 상기에서 설명한 세포감작성분을 포함하면 되고 또는 포함하지 않아도 된다.
상기 세포응답 유도성분은, 예를 들면, 상기 세포감작성분에 결합하여 본 발명의 세포의 응답을 유도하는 성분이면 되고, 예를 들면, 상기 IgE 또는 키메라 IgE에 결합하는 성분이면 된다. 세포응답 유도성분은, 예를 들면 항IgE 항체이면 되고, 또는, IgE 또는 키메라 IgE와 결합하는(예를 들면, 특이적으로 결합하는) 항원 또는 항원후보물질이면 된다.
상기 세포응답 유도성분에 의해 유도되는 세포응답은, 예를 들면, 상기에서 설명한 리포터유전자의 발현이면 된다. 특히, 상기 발현은, 상기 회합체끼리의 가교에 의해 유도되는 발현이면 된다.
또한, 상기 세포응답은, 상기 세포의 알레르기 응답이라도 되고, 특히 I형 알레르기에 관한 세포응답이면 된다. 상기 세포응답은, 예를 들면 탈과립 등의 알레르기 응답이면 된다.
본 명세서 내에 있어서, 상기 「세포응답유도분석용 재료」는, 세포응답을 유도할 수 있는지의 분석 대상이 되는 재료를 일컫는다. 상기 「세포응답유도분석용 재료」는, 예를 들면, 세포응답 유도성분을 포함할 수 있는 재료를 의미하면 되고, 특히 감작된 세포의 응답을 유도하는 성분을 포함할 수 있는 재료를 의미하면 된다.
상기 「세포응답 유도성분」은, 상기에서 기술한 바와 같으면 된다.
상기 「세포응답 유도성분을 포함할 수 있는 재료」는, 상기 성분을 포함하는지 아닌지가 불분명한 재료(배지 또는 버퍼)이면 되고, 또는, 상기 성분을 포함하는 것은 기지이지만 상기 성분의 종류 및/또는 함유량이 불분명한 재료이면 된다. 예를 들면, 상기 재료는, 본 발명의 방법을 실시한 결과, 상기 성분을 포함하는 것 또는 포함하지 않는 것이 판명되는 재료, 또는, 상기 성분의 함유량 및/혹은 종류가 판명되는 재료라도 된다.
(1-3) 분석 공정
상기 분석 공정에 있어서, 상기 세포의 응답이 분석된다. 상기 응답은, 예를 들면, 상기에서 설명한 리포터유전자의 발현이면 된다. 특히, 상기 발현은, 상기 회합체끼리의 가교에 의해 유도되는 발현이면 된다. 리포터유전자의 발현분석의 구체적인 방법은, 리포터유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택되면 된다. 예를 들면, 리포터유전자가, 효소 단백질을 발현하는 경우에는, 분석 공정에 있어서 효소반응의 분석이 행해질 수 있다. 예를 들면, 효소 단백질이 루시퍼라아제인 경우, 루시퍼라아제에 의한 기질분해에 의해 생기는 발광이 분석될 수 있다. 예를 들면, 리포터유전자가 형광 단백질을 발현하는 경우에는, 분석 공정에 있어서 형광분석이 행해질 수 있다.
또한, 상기 응답은, 상기 세포의 알레르기 응답이라도 되고, 특히 I형 알레르기에 관한 세포응답이면 되고, 예를 들면, 세포내 칼슘 이온 농도 상승이나 탈과립 등의 알레르기 응답이면 된다. 이 알레르기 응답은, 형광지시약을 사용하여 측정되면 된다.
또한, 상기 응답을 분석하기 위하여, 에바네센트파를 사용하여, 알레르기 응답에 따르는 세포막의 굴절율 변화 등이 측정되어도 된다.
(1-4) 약제의 사용
본 발명의 분석 방법에 있어서, 본 발명의 세포에 있어서의 응답에 영향을 미칠 수 있는 약제가 사용되면 된다. 상기 약제는, 예를 들면 알레르기 반응을 저해 또는 억제하기 위해 사용되는 제이면 되고, 예를 들면 감작저해제 또는 세포응답 저해제이면 된다. 상기 약제는, 예를 들면,
상기 제1 인큐베이션 공정 전,
상기 제1 인큐베이션 공정이 실행되고 있는 동안,
상기 제1 인큐베이션 공정과 상기 제2 인큐베이션 공정 사이,
상기 제2 인큐베이션 공정이 실행되고 있는 동안, 또는,
상기 제2 인큐베이션 공정 후
중 어느 1개 또는 2개 이상의 단계에 있어서 사용되면 된다.
상기 약제를 사용하여 본 발명의 방법을 실행함으로써, 예를 들면 상기 약제의 알레르기 반응 억제 활성의 평가가 가능하게 된다. 또한, 다양한 약제를 사용하여 본 발명의 방법을 실행함으로써, 드럭스크리닝을 행할 수도 있다.
상기 약제는, 예를 들면, 상기에서 기술한 인큐베이션 재료에 포함된 상태로 사용될 수 있다. 상기 약제의 각 공정에서의 사용예는 이하와 같다.
예를 들면, 상기 (1-1)에 있어서 기술한 상기 제1 인큐베이션 공정에 있어서, 상기 약제가, 감작용 재료 또는 감작분석용 재료에 포함될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기 약제는, 감작저해제이면 되고, 또는, 감작을 저해하는 것이 기대되는 약제라도 된다. 상기 약제는, 예를 들면, IgE 또는 키메라 IgE에 결합하는 성분이면 되고, 예를 들면 항IgE 항체 또는 항키메라 IgE 항체일 수 있다. 대체적(代替的)으로는, 상기 약제는, 수용체의 다운 레귤레이션을 유도하는 약물이라도 된다. 이와 같이 약제를 사용함으로써, 알레르기 반응(특히 I형 알레르기 반응)을 억제하는 작용을 가지는 약제를 스크리닝할 수 있고, 또는 알레르기 반응억제제(특히 I형 알레르기 반응억제제)의 억제 작용의 평가를 행할 수도 있다.
대체적으로는, 상기 제1 인큐베이션 공정 전에, 상기 약제와, 상기 감작용 재료 또는 상기 감작분석용 재료에 포함되는 세포감작성분의 접촉이 행해져도 된다. 상기 접촉 후에, 상기 감작용 재료 또는 상기 감작분석용 재료 중에서 상기 세포를 인큐베이팅하는 것에 의해서도, 상기 스크리닝 또는 상기 평가를 행할 수 있다.
또한, 상기 (1-2)에 있어서 기술한 상기 제2 인큐베이션 공정에 있어서, 상기 약제가, 세포응답유도용 재료 또는 세포응답 유도 분석용 재료에 상기 약제가 포함될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기 약제는, 세포응답 저해제이면 되고, 또는, 세포응답을 저해하는 것이 기대되는 약제라도 된다. 상기 약제는, 예를 들면 FcεRI의 가교에 의한 시그널 전달을 저해하는 시그널 전달 저해제이면 된다. 상기 약제의 예로서, 예를 들면 시클로스포린 및 타크로리무스 등의 칼시뉴린저해제; 예를 들면, Genistein, Herbimycin A, 및 Piceatannol 등의 티로신 키나아제 저해제; 예를 들면 U73122 등의 PLC저해제; 예를 들면 Wortmannin 등의 PI3-kinase저해제; 및 예를 들면 BAPTA-AM 등의 세포내 칼슘이온 킬레이터가 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
이와 같이 약제를 사용하는 것에 의해서도, 알레르기 반응(특히 I형 알레르기 반응)을 억제하는 작용을 가지는 약제를 스크리닝할 수 있고, 또는 알레르기 반응억제제(특히 I형 알레르기 반응억제제)의 억제 작용의 평가를 행할 수도 있다.
대체적으로는, 상기 제1 인큐베이션 공정과 상기 제2 인큐베이션 공정 사이에, 상기 약제와, 상기 세포응답유도용 재료 또는 상기 세포응답 유도 분석용 재료에 포함되는 세포응답 유도성분의 접촉이 행해져도 된다. 상기 접촉 후에, 상기 세포응답유도용 재료 또는 상기 세포응답 유도 분석용 재료 중에서 상기 세포를 인큐베이팅하는 것에 의해서도, 상기 스크리닝 또는 상기 평가를 행할 수 있다.
(1-5) 알레르겐성 평가의 예
이 예에 있어서, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서 사용되는 세포응답 유도성분(특히 항원 또는 항원 후보물질)이, 피험시료로서 취급되어, 상기 세포응답 유도성분의 알레르겐성이 평가될 수 있다.
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 대상(인간)으로부터 얻어진 IgE 또는 IgE 함유 혈청을 포함하는 감작용 재료 중에서, 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 대상의 IgE에 의해, 상기 세포가 감작된다.
다음으로, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서, 피험시료인 항원을 포함하는 세포응답유도용 재료 중에서, 상기 감작된 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 항원에 의해, 본 발명에 따른 세포의 세포막에 있어서, 상기에서 기술한 바와 같은 회합체가 형성되고, 그리고, 상기 회합체의 형성에 의해, 예를 들면 리포터유전자가 발현할 수 있다.
다음으로, 상기 분석 공정에 있어서, 세포응답이 분석된다. 예를 들면, 분석 공정에 있어서, 상기 리포터유전자의 발현이 분석될 수 있다. 상기 발현의 분석에 의해, 상기 항원의, 상기 대상에 대한 알레르겐성을 평가할 수 있다.
(1-6) 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서 사용되는 세포감작성분(특히 IgE 또는 IgE 함유 생체성분)이, 피험시료로서 취급되어, 상기 세포감작성분이 유래하는 대상의, 소정의 항원에 대한 알레르기(특히 I형 알레르기)의 유무 또는 리스크가 평가될 수 있다.
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 대상(인간)으로부터 얻어진 IgE 또는 IgE 함유 생체성분(특히 IgE 함유 혈청)을 포함하는 감작용 재료 중에서, 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 대상의 IgE에 의해, 상기 세포가 감작된다.
다음으로, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서, 소정의 항원을 포함하는 세포응답유도용 재료 중에서, 상기 감작된 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 항원에 의해, 본 발명에 따른 세포의 세포막에 있어서, 상기에서 기술한 바와 같은 회합체가 형성되고, 그리고, 상기 회합체의 형성에 의해, 예를 들면 리포터유전자가 발현할 수 있다.
다음으로, 상기 분석 공정에 있어서, 상기 리포터유전자의 발현이 분석된다. 상기 발현의 분석에 의해, 상기 대상의, 상기 소정의 항원에 대한 알레르기의 유무 또는 리스크를 평가할 수 있다.
(1-7) IgE에 대한 분석
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서 사용되는 세포감작성분(특히 IgE 또는 IgE 함유 생체성분)이, 피험시료로서 취급되어, 상기 세포감작성분자체의 분석이 행해질 수 있다.
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 대상(인간)으로부터 얻어진 IgE 또는 IgE 함유 생체성분(특히 IgE 함유 혈청)을 포함하는 감작용 재료 중에서, 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 대상의 IgE에 의해, 상기 세포가 감작된다.
다음으로, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서, 소정의 항원을 포함하는 세포응답유도용 재료 중에서, 상기 감작된 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 항원에 의해, 본 발명에 따른 세포의 세포막에 있어서, 상기에서 기술한 바와 같은 회합체가 형성되고, 그리고, 상기 회합체의 형성에 의해, 예를 들면 리포터유전자가 발현할 수 있다.
다음으로, 상기 분석 공정에 있어서, 상기 리포터유전자의 발현이 분석된다. 상기 발현의 분석에 의해, IgE의 평가를 행할 수 있다.
(1-8) 알레르기 억제 활성의 평가 방법
이 예에 있어서, 약제가 피험시료로서 취급되어, 상기 약제에 의한 알레르기 반응억제 활성이 평가될 수 있다.
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 IgE 또는 IgE 함유 생체성분(특히 IgE 함유 혈청)을 포함하는 감작용 재료 중에서, 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 대상의 IgE에 의해, 상기 세포가 감작된다.
다음으로, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서, 소정의 세포응답유도용 재료 중에서, 상기 감작된 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 항원에 의해, 본 발명에 따른 세포의 세포막에 있어서, 상기에서 기술한 바와 같은 회합체가 형성되고, 그리고, 상기 회합체의 형성에 의해, 예를 들면 리포터유전자가 발현할 수 있다.
여기서, 알레르기 억제 활성을 가지는 물질 또는 알레르기 억제 활성을 가지는 것으로 여겨지는 물질(약제)이, 상기 감작용 재료 또는 상기 세포응답유도용 재료에 포함되어 있다. 상기 물질이 상기 감작용 재료에 포함되는 경우, 상기 물질은 감작저해제로서 작용할 수 있다. 상기 물질이 상기 세포응답유도용 재료에 포함되는 경우, 상기 물질은 세포응답 저해제로서 작용할 수 있다.
다음으로, 상기 분석 공정에 있어서, 상기 리포터유전자의 발현이 분석된다. 상기 발현의 분석에 의해, 상기 물질의 알레르기 억제 활성을 평가할 수 있다.
(1-9) 드럭스크리닝
이 예에 있어서, 다양한 약제가 피험시료로서 취급되어, 상기 각종 약제에 의한 알레르기 반응억제 활성이 평가된다. 그리고, 보다 양호한 알레르기 반응억제 활성을 가지는 약제가 선택될 수 있다.
이 예에 있어서, 상기 제1 인큐베이팅 공정에 있어서, 예를 들면 IgE 또는 IgE 함유 생체성분(특히 IgE 함유 혈청)을 포함하는 감작용 재료 중에서, 본 발명에 따른 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 대상의 IgE에 의해, 상기 세포가 감작된다.
다음으로, 상기 제2 인큐베이팅 공정에 있어서, 소정의 세포응답유도용 재료 중에서, 상기 감작된 세포가 인큐베이팅된다. 이로써, 상기 항원에 의해, 본 발명에 따른 세포의 세포막에 있어서, 상기에서 기술한 바와 같은 회합체가 형성되고, 그리고, 상기 회합체의 형성에 의해, 예를 들면 리포터유전자가 발현할 수 있다.
여기서, 알레르기 억제 활성을 가지는 것으로 여겨지는 다양한 물질의 각각 이, 상기 감작용 재료 또는 상기 세포응답유도용 재료에 포함되어 있다. 상기 다양한 물질이 상기 감작용 재료에 포함되는 경우, 상기 다양한 물질은 감작저해제로서 작용하는 것이 기대된다. 상기 다양한 물질이 상기 세포응답유도용 재료에 포함되는 경우, 상기 다양한 물질은 세포응답 저해제로서 작용하는 것이 기대된다.
다음으로, 상기 분석 공정에 있어서, 상기 다양한 물질의 각각을 사용한 경우에 있어서의, 상기 리포터유전자의 발현이 분석된다. 상기 발현의 분석에 의해, 상기 다양한 물질 중에서, 보다 양호한 알레르기 억제 활성을 가지는 물질이 선택될 수 있다.
8. 실시예
(1) 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 합성
인간 FcεRIα쇄의 세포외 도메인에, 래트 FcεRIα쇄의 세포막 관통 도메인 및 세포내 도메인을 연결시킨 키메라 수용체(인간-래트 키메라 FcεRIα쇄, Human-Rat chimeric FcεRI α chain) 유전자를 인공유전자합성에 의해 작성했다. 상기 유전자의 염기서열 및 상기 유전자에 의해 코딩되는 아미노산서열을 도 4에 나타낸다. 도 4에 있어서, 상단이 염기서열이며, 하단이 번역 후의 아미노산서열을 나타낸다. 도 4에 표시되는 염기서열 및 아미노산서열은, 각각 서열 ID No. 1의 염기서열 및 서열 ID No. 8의 아미노산서열과 동일하다. 또한, 도 4에 표시되는 염기서열 및 아미노산서열과, 상기 키메라 수용체 단백질의 구조 및 기능의 관계를, 도 19에 나타낸다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 도 4에 표시되는 아미노산서열 중 아미노산 잔기번호 1∼25가 시그널 서열이며, 아미노산 잔기번호 26∼205가 세포외 도메인이며, 아미노산 잔기번호 206∼224가 세포막 관통 도메인이며, 또한 아미노산 잔기번호 225∼246이 세포내 도메인이다.
상기 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 잔기번호 26∼205의 아미노산서열은, 서열 ID No. 10에 표시된 서열과 동일하다. 상기 세포외 도메인은 IgE 결합성 영역을 포함하고, 상기 IgE 결합성 영역은, 아미노산 잔기번호 110∼183이다. 아미노산 잔기번호 110∼183의 아미노산서열은, 서열 ID No. 14에 표시된 서열과 동일하다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 상기 IgE 결합성 영역에 포함되는 아미노산 잔기 중, 특히 S110, D111, W112, W135, W138, K142, I144, A151, Y154, W155, Y156, E157, W181, Q182, 및 L183이, IgE와의 결합성에 관여하는 아미노산이다. 이들 아미노산 중, K142, I144, A151, Y154, W155, Y156, 및 E157이 첫번째의 IgE 결합성 부위를 형성하고, S110, D111, W112, W135, W138, W181, Q182, 및 L183이 두 번째의 IgE 결합성 부위를 형성한다.
또한, 아미노산 잔기번호 44∼108 및 121∼194가 이뮤노글로불린 도메인이다.
상기 세포막 관통 도메인의 아미노산서열은, 래트의 FcεRIα쇄에 포함되는 세포막 관통 도메인의 아미노산서열이다. 아미노산 잔기번호 206∼224의 서열은, 서열 ID No. 12에 표시된 서열과 동일하다. 또한, 상기 세포막 관통 도메인의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열의 예는, 서열 ID No. 5에 표시된 서열이다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 상기 세포막 관통 도메인은, γ쇄와의 결합성을 발휘하고, 하전(荷電) 아미노산인 D219가, γ쇄결합성에 특히 관여하는 아미노산이다.
상기 세포내 도메인의 아미노산서열은, 래트의 FcεRIα쇄에 포함되는 세포내 도메인의 아미노산서열이다. 아미노산 잔기번호 225∼246의 서열은, 서열 ID No. 13에 표시된 서열과 동일하다. 또한, 상기 세포내 도메인의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열의 예는, 서열 ID No. 6에 표시된 서열이다.
상기 시그널 서열은, 인간의 FcεRIα쇄에 포함되는 시그널 서열이다. 아미노산 잔기번호 1∼25의 서열은, 서열 ID No. 9에 표시된 서열과 동일하다. 또한, 상기 시그널 서열의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열의 예는, 서열 ID No. 2에 표시된 서열이다.
서열 ID No. 1의 염기서열은, 래트의 배양 세포에 있어서의 양호한 효율의 유전자발현을 위하여, 래트의 코돈 사용 빈도를 고려하여 최적화되어 있다. 또한, 최적화되기 전의 염기서열은, 도 5에 표시되는 서열 ID No. 15의 염기서열이다. 이들 2개의 염기서열을 비교하여, 이하에, 서열 ID No. 1의 염기서열이 가지는 특징을 설명한다.
서열 ID No. 15의 염기서열의 코돈 적응 지표(Codon Adaptation Index, CAI)는, 0.72이다. 한편, 서열 ID No. 1의 염기서열의 래트에 대한 상기 코돈 적응 지표는, 0.83이다. 코돈 적응 지표는 높을수록 바람직하며, 최고로 1이며, 바람직하게는 0.8 이상, 보다 바람직하게는 0.8을 초과하면, 세포 중에서의 높은 유전자발현 레벨을 위하여 바람직할 것으로 여겨진다.
서열 ID No. 1의 염기서열은, 서열 ID No. 15의 염기서열보다 코돈 적응 지표가 보다 높으므로, 래트 세포에 있어서의 발현을 위하여 보다 적합하다.
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 염기서열의 코돈 적응 지표는, 예를 들면 0.7 이상이며, 바람직하게는 0.8 이상이며, 보다 바람직하게는 0.8초이며, 더욱 바람직하게는 0.81 이상, 0.82 이상일 수 있다. 상기 코돈 적응 지표는, 예를 들면 1.0 이하, 0.99 이하, 또는 0.95 이하라도 된다.
코돈 적응 지표는, 리보솜 관련 유전자 등의 고발현유전자의 동의(同義) 코돈 사용 빈도의 치우침을 바탕으로, 이들 고발현유전자의 코돈 바이어스와 관찰 대상유전자의 코돈 바이어스의 상관관계로부터, 상대적인 발현량을 추정하기 위한 척도로서 사용될 수 있다. 코돈 적응 지표는, 예를 들면, P. M. Sharp and W. H. Li(Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11;15(3): 1281-1295)에 기재된 방법에 따라 산출될 수 있다.
서열 ID No. 15의 염기서열은, 사용 빈도(가장 높은 코돈을 100으로 한 경우에 있어서의 코돈 사용 빈도)가 91∼100인 코돈의 비율이 47%이다. 한편, 서열 ID No. 1의 염기서열은, 사용 빈도가 91∼100인 코돈의 비율이 59%이다.
사용 빈도가 높은 코돈의 비율이 높을수록, 세포 중에서의 높은 유전자발현 레벨을 위하여 바람직할 것으로 여겨진다.
서열 ID No. 1의 염기서열은, 사용 빈도가 91∼100인 코돈의 비율이, 서열 ID No. 15의 염기서열보다 높으므로, 래트 세포에 있어서의 발현을 위하여 보다 적합하다.
본 발명의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 상기 유전자가 발현되는 세포(특히 비인간 동물의 세포)에 있어서의 사용 빈도가 91∼100인 코돈의 비율이, 예를 들면 40% 이상, 바람직하게는 50% 이상이며, 보다 바람직하게는 53% 이상이며, 더욱 바람직하게는 55% 이상일 수 있다. 상기 비율은, 예를 들면 100% 이하, 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 또는 60% 이하일 수 있다.
서열 ID No. 15의 염기서열의 GC 함량은 45.53%인 것에 대하여, 서열 ID No. 1의 염기서열의 GC 함량은 51.05%이다. GC 함량이 보다 높을수록, 전사산물 mRNA의 반감기가 길어지는 경향이 있어, 높은 유전자발현 레벨을 위하여 바람직하다. 이 때문에, 서열 ID No. 1의 염기서열은, 서열 ID No. 15보다, 보다 높은 유전자발현 레벨을 달성할 수 있을 것으로 여겨진다.
본 기술의 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 GC 함량은, 예를 들면 40% 이상이며, 바람직하게는 47% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상이면 된다. 상기 GC 함량은, 예를 들면 80% 이하, 70% 이하, 또는 60% 이하일 수 있다.
서열 ID No. 15의 염기서열은 제한 효소 ScaI가 인식하는 서열(AGTACT)을 2개 포함한다. 한편, 서열 ID No. 1의 염기서열은 상기 서열을 포함하지 않는다.
본 기술의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 제한 효소서열을 포함해도 되지만, 바람직하게는 제한 효소서열을 포함하지 않는다.
서열 ID No. 15의 염기서열은, 스플라이싱에 관한 시스 작용 엘리먼트(GGTGAT)를 3개 포함하고, 폴리 A 시그널인 시스 작용 엘리먼트(AATAAA)를 1개 포함하고, mRNA의 불안정화에 관한 시스 작용 엘리먼트(ATTTA)를 1개 포함하고, 또한 폴리 A 시그널인 시스 엘리먼트(AAAAAAA)를 1개 포함한다. 한편, 서열 ID No. 1의 염기서열은 이들 시스 엘리먼트를 포함하지 않는다. 이 때문에, 서열 ID No. 1의 염기서열은, 예를 들면 스플라이스 부위로서 오인될 수 있는 서열, 잘못하여 폴리 A가 부가될 수 있는 서열, 및 mRNA의 불안정화를 초래하는 서열이 삭제되어 있다.
본 기술의 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 1 또는 복수의 이들 시스 작용 엘리먼트를 포함해도 되지만, 바람직하게는 이들 시스 작용 엘리먼트를 포함하지 않는다.
서열 ID No. 15의 염기서열은, 한 쌍의 역방향 반복 서열을 가지지만, 서열 ID No. 1의 염기서열은 서열을 가지지 않는다. 이 때문에, 후자에서는, 불필요한 고차(高次)구조의 형성이 억제될 수 있다.
(2) 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 RBL-NL4세포로의 도입
도 6에 나타낸 바와 같이, 서열 ID No. 1의 5' 말단에 「제한 효소 BamHI의 인식 부위(GGATCC)」와 「KOZAK서열을 형성하기 위한 서열(CACC)」이 추가되고 또한 그 3' 말단에 「제한 효소 EcoRI의 인식 부위(GAATTC)」가 추가된 염기서열을 가지는 핵산(DNA)을 인공적으로 합성했다. 상기 핵산은, 상기 2개의 제한 효소 인식 부위를 멀티클로닝사이트 내에 가지는 pcDNA3.1(＋)벡터(Invitrogen사)에, 상기 2개의 부위를 이용하여, 상기 핵산은 삽입되었다. 상기 핵산이 삽입된 벡터가, 당기술분야에서 기지의 방법에 의해, 대량 조제되었다. 그 후, 상기 핵산이 삽입된 벡터가, BamHI 및 EcoRI를 사용하여 리니얼라이즈되었다.
RBL-2H3세포(세포번호: JCRB0023, 국립연구개발법인 의약기반·건강·영양 연구소 JCRB 세포 뱅크)에, NF-AT(Nuclear factor activated T-cell) 의존성 반딧불 루시퍼라아제 발현 벡터(pHTS- NFAT, Biomyx사)를 안정 도입한 세포(이하 「RBL-NL4세포」라고도 함)를 얻었다. 상기 RBL-NL4세포에, Lipofectamine3000을 사용하여, 상기 리니얼라이즈된 벡터를 도입하고, Hygromycin에 의한 약제 선택을 행하였다. 그 후, 한계희석법으로 클로닝을 행하여, 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 7개의 클론을 얻었다.
RBL-NL4세포는, 래트의 내재성 FcεRI의 α쇄 유전자, β쇄 유전자, 및 γ쇄 유전자를 발현한다. 이 때문에, 상기 도입된 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 발현하는 것에 의해, 상기 유전자의 발현에 의해 생성한 키메라 FcεRIα쇄 단백질이, β쇄 및 γ쇄와 회합한 FcεRI가, 상기 세포의 세포막 상에 기능적으로 발현한다.
(3) 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 세포에 있어서의 루시퍼라아제 발현
상기 (2)에 있어서 얻어진 7개의 클론 및 RBL-NL4세포를 배양하여 얻어진 배양물에 대하여 이오노마이신, 항인간 IgE 항체, 또는 특이항원에 의해 자극을 준 경우의 루시퍼라아제 발현을 확인했다. 상기 확인은 구체적으로는 이하와 같이 행해졌다.
각 클론 및 RBL-NL4세포가, 10%의 비동화 우태아혈청을 첨가한 MEM배지에 있어서 배양되었다. 상기 배지의 조성은 이하와 같다.
MEM배지(Earle's salts(＋), L-Glutamine(-); Gibco 11090)
우태아혈청(Gibco 10437-028, 56℃에서 30분 비동화, 사용 시 농도 10%)
GlutaMAX-I(Gibco 35050)
페니실린-스트렙토마이신(Sigma P4333)
제네티신(Geneticin, Gibco 10131, 사용 시 농도 500μg/mL)
하이그로마이신 B(Hygromycin B, Invirtogen 10687-10, 사용 시 농도 200μg/mL)
페니실린 및 스트렙토마이신은 세균에 의한 감염을 방지하기 위해 상기 배지에 가해졌다. 제네티신 및 하이그로마이신 B는 선택 마커이다.
상기 배양은, 플라스틱제 세포배양 플라스크(T25)에서, 37℃, 5% 이산화탄소 존재 하의 인큐베이터 중에서 행해졌다.
세포의 계대는 이하와 같이 행해졌다. 즉, 상기 플라스크 중의 배양상청액(부유하고 있는 세포를 포함함)을 디캔트로 버린 후, 새로운 배지를 5mL 가하였다. 셀스크레이퍼를 사용하여 세포를 소프트하게 박리하고, 피펫팅한 후, 미리 배지 5mL를 넣은 계대용의 플라스크에 1/40량(0.125mL) 가하고, 37℃, 5% CO2 하에서 5일간 배양했다.
그리고, 후술하는 각종 시험에 있어서 사용하기 위하여 대량배양할 때는, T75 플라스크 및 배량의 배지(10mL)를 사용했다.
상기 자극을 준 경우의 루시퍼라아제 발현을 확인하기 위한 시험의 전날에, 이하의 조작을 행하였다. 즉, 정제 인간 IgE(ab65866, Abcam)(최종농도 50ng/mL)를 상기 MEM배지에 첨가했다. 상기 배지를, 바닥면이 투명한 플라스틱제의 백색 96웰 플레이트(제품번호: 165306, Thremo사)의 각 웰에 넣었다. 그리고, 각 클론의 세포를, 1웰당 5×104세포/50μL가 되도록 파종하고, 인큐베이터 중에서 하룻밤 정치(靜置)하여 감작했다.
또한, 정제 인간 IgE가 첨가되어 있지 않은 것 이외에는 동일하게, 각 클론의 세포를 상기 96웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 그리고, 상기 인큐베이터 내에서 하룻밤 정치하였다(즉 감작되어 있지 않은 세포도 준비했다).
다음날, PBS에 의해 세포를 복수 회 세정했다. 감작된 세포를 포함하는 웰에, 상기 배지에서 조제된 100ng/mL의 항인간 IgE 항체(제품번호 A80-108A, BETHYL사, 최종농도 100ng/mL)를 첨가하고, 그리고, 상기 세포에, 37℃에서 3시간 자극을 주었다. 마찬가지로, 감작되어 있지 않은 세포를 포함하는 웰에도, 100ng/mL의 항인간 IgE 항체를 첨가하고, 그리고, 상기 세포에, 37℃에서 3시간 자극을 주었다.
또한, 감작되어 있지 않은 세포를 포함하는 별도의 웰에 250μM의 이오노마이신을 첨가하고, 그리고, 상기 세포에, 37℃에서 3시간 자극을 주었다.
상기 자극 부여 후에 각 웰 내에, 기질액(One-Glo Luciferase Assay System, Promega사)을 50μL/웰씩 가하여 5분간 반응시킨 후, 루미노미터(GloMax, Promega사)를 사용하여 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 7에 표시되어 있다.
도 7에 있어서, 7개의 클론에 대한 측정 결과는, 「HuRa-11」, 「HuRa-19」, 「HuRa-21」, 「HuRa-29」, 「HuRa-37」, 「HuRa-38」, 및 「HuRa-40」에 각각 표시되어 있다. 또한, RBL-NL4세포에 대한 측정 결과는, 「NL4」에 표시되어 있다.
도 7에 있어서, 흑색 도트는 측정된 루시퍼라아제 출발광강도(단위: CPS)를 나타낸다(우측의 축: LUMINESCENCE(CPS)). 또한, 도 7에 있어서, 각 막대는, 인간 IgE로 감작되어 있지 않은 세포에 항인간 IgE 항체를 가한 경우(no IgE), 감작된 세포에 항인간 IgE 항체를 가하여 자극을 준 경우(aIgE), 및 감작되어 있지 않은 세포에 이오노마이신 자극을 준 경우(Iono)에 있어서의 상대출발광강도를 각각 나타낸다(좌측의 축: Luciferase activity (fold change)). 상대출발광강도는, 각 클론의 무자극 시의 발광강도를 1로 한 경우에 있어서의 상대적출발광강도이며, 로그 스케일로 표시되어 있다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 감작된 경우(aIgE) 및 감작되어 있지 않은 경우(no IgE)의 비교로부터, 어느 클론에 대해서도, 항인간 IgE 항체자극에 의해, 루시퍼라아제 발현량이 몇십배∼100배 증가했다. 한편, 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 발현하지 않고 있는 RBL-NL4세포에 대해서는, 항인간 IgE 항체자극에는 거의 응답하지 않았다. 따라서, 키메라 FcεRIα쇄 유전자의 도입에 의해, 인간 IgE의 검출능력이 부여된 것을 알 수 있다.
그리고, 도 7에 나타낸 바와 같이, RBL-NL4세포를 이오노마이신에 의해 자극한 경우(Iono)에 있어서의 루시퍼라아제 발현량은, RBL-NL4세포를 항인간 IgE 항체에 의해 자극한 2개의 경우(no IgE 및 aIgE)보다 큰 폭으로 증가했다. 이오노마이신은, FcεRI를 경유하지 않고, NFAT를 활성화하는 물질이다. 이 때문에, RBL-NL4세포에 있어서, NFAT의 활성화에 의해 루시퍼라아제 발현계는 정상적으로 기능하고 있는 것이 확인되었다.
또한, 상기 7개의 클론 중, HuRa-40이 특히, 항체자극에 대한 응답성, FcεRI 발현량, 및 증식 능력의 점에서 우수하였다. HuRa-40은, 기탁일을 레와 2년(2020년) 6월 17일로 하고, 수탁번호: NITE BP-03230이며, 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(NPMD)에 국제기탁되었다.
(4) 키메라 FcεRIα쇄 유전자가 도입된 세포로의 IgE 결합능의 확인
각 클론에 대하여, 세포 표면으로의 인간 IgE의 결합성을 플로우사이토메트리에 의해, 이하와 같이 측정했다.
먼저, 각 클론에 대하여, 50ng/mL의 인간 IgE로 하룻밤 감작한 세포 샘플과 감작하지 않은 세포 샘플을 준비했다. 다음으로, 이들 2종의 세포 샘플 각각을, 빙상에서 30분간 1μg/mL의 인간 IgE에 접촉시키고, 모든 FcεRI를 IgE에 의해 점유시켰다. 또한, 감작하지 않은 세포 샘플의 일부에 대해서는, 빙상에서의 인간 IgE로의 접촉 처리를 행하지 않았다. 그 후, 각 샘플을, FITC 표지 항인간 IgE 항체로 염색했다. 이와 같이 하여, 각 클론에 대하여, 이하의 3개의 샘플을 준비했다.
샘플 1: 감작없음, 빙상에서의 인간 IgE 접촉없음, FITC 염색있음
샘플 2: 감작없음, 빙상에서의 인간 IgE 접촉있음, FITC 염색있음
샘플 3: 감작있음, 빙상에서의 인간 IgE 접촉있음, FITC 염색있음
또한, RBL-NL4세포(음성대조) 및 RS-ATL8세포(양성대조)에 대해서도, 상기 3개의 샘플을 준비했다.
전술한 바와 같이 준비된 샘플에 대하여, FITC의 형광강도를 플로우사이토미터에 의해 측정했다. 측정 결과가 도 8에 표시되어 있다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 샘플 1, 2, 및 3의 순으로, FITC의 형광이 확인된 세포의 수가 증가하고, 특히, 샘플 3에 관하여, FITC의 형광이 확인된 세포의 수가, 샘플 1 및 2보다 큰 폭으로 증가했다. 또한, 양성대조인 RS-ATL8세포에 대해서도, 동일한 결과가 얻어졌다. 한편, 음성대조인 RBL-NL4세포에 대해서는, 이와 같은 결과는 얻어지지 않았다. 이러한 결과로부터, 각 클론의 세포에 IgE가 특이적으로 결합하는 것이 확인되었다.
(5) 본 발명의 세포에 적합한 시험 조건의 검토
(5-1) 자극 시간
100배 희석한 정상인 혈청(코스모바이오사)을 포함하는 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁한 HuRa-40세포를, 96혈(穴)의 마이크로플레이트(ISOPLATE-96TC, PerkinElmer사)에 5.0×104세포/50μL/웰로 파종하고, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작시켰다.
상기 감작된 세포를 세정한 후에, 10% FBS 함유 MEM배지로 희석된 항인간 IgE 항체(0.1μg/mL)를, 50μL/웰의 양으로 첨가하고, 1시간, 3시간, 6시간, 또는 8시간 자극했다.
또한, 자극을 행하지 않은 세포에 대해서는, 배지를 첨가했다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega사)의 기질액을 50μL/웰의 양으로 각 웰에 가하고, 5분간, 실온에서 차광하면서 반응시켰다. 그 후, 마이클로플레이트리더(GloMax, Promega사)에서 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 9에 표시되어 있다.
도 9에 표시되는 상대출발광강도(Luciferase activity (fold change))는, 하기 식에 따라서 산출했다.
Luciferase activity (fold change) = (항체자극한 HuRa-40세포의 각 시간에서의 출발광강도-배지의 발광강도)/(배지를 첨가한 HuRa-40세포의 0시간에서의 출발광강도-배지의 발광강도)
도 9에 표시되는 결과로부터, 자극 시간은, 바람직하게는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 1.5시간 이상, 더욱 바람직하게는 2시간 이상이다. 또한, 자극 시간은, 바람직하게는 8시간 이하, 보다 바람직하게는 7시간 이하, 더욱 바람직하게는 6시간 이하, 5시간 이하, 또는 4시간 이하라도 된다. 자극 시간은, 예를 들면 1시간∼8시간이면 되고, 보다 바람직하게는 2시간∼8시간, 더욱 바람직하게는 1.5시간∼7시간, 2시간∼6시간, 2시간∼5시간, 또는 2시간∼4시간, 특히 바람직하게는 3시간∼4시간이면 된다.
(5-2) 혈청농도
각종 농도로 정상인 혈청(코스모바이오사)을 포함하는 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁한 HuRa-40세포를, 96혈의 마이크로 플레이트(ISOPLATE-96TC, PerkinElmer사)에 5.0×104세포/50μL/웰로 파종하고, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작시켰다. 사용된 혈청농도는, 0체적%, 0.01체적%, 0.1체적%, 1체적%, 또는 10체적%의 5종류였다.
상기 감작된 세포를 세정한 후에, 10% FBS 함유 MEM배지로 희석된 항인간 IgE 항체(0.1μg/mL)를, 50μL/웰의 양으로 첨가하고, 3시간 자극했다.
또한, 자극을 행하지 않은 세포에 대해서는, 배지를 첨가했다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, 상기 (5-1)에서 기술한 바와 같이, 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 10에 표시되어 있다. 도 10에 표시되는 상대출발광강도(Luciferase activity (fold change))는, 하기 식에 따라서 산출했다.
Luciferase activity (fold change) = (각종 혈청농도에서의 HuRa-40세포의 발광강도-배지의 발광강도)/(혈청농도가 0체적%에서의 HuRa-40세포의 발광강도-배지의 발광강도)
도 10에 표시되는 결과로부터, 감작을 위한 혈청농도는, 바람직하게는 0.01체적% 이상, 보다 바람직하게는 0.1체적% 이상, 더욱 바람직하게는 0.5체적% 이상, 0.6체적% 이상, 0.7체적% 이상, 0.8체적% 이상, 또는 0.9체적% 이상이다. 또한, 감작을 위한 혈청농도는, 예를 들면 10체적% 이하, 바람직하게는 8체적% 이하, 보다 바람직하게는 7체적% 이하, 더욱 바람직하게는 6체적% 이하, 5체적% 이하, 4체적% 이하, 3체적% 이하, 또는 2체적% 이하라도 된다. 혈청농도는, 예를 들면 0.1체적%∼10체적%이면 되고, 보다 바람직하게는 0.5체적%∼5체적%, 더욱 바람직하게는 0.7체적%∼3체적%, 특히 바람직하게는 1체적%이면 된다.
(5-3) 세포장애성
인간 혈청에 의한 HuRa-40세포로의 세포장애성을, CytotoxicityLDH Assay Kit-WST(도진화학연구소사)를 사용하여, 세포 외에 방출된 LDH를 지표로 평가했다. 각 농도(0체적%, 0.01체적%, 0.1체적%, 1체적%, 또는 10체적%)의 인간 혈청을 포함하는 MEM배지로 상기 세포를 하룻밤 배양하여 얻어진 배양물의 세포상청액를, 96혈 마이크로 플레이트에 50μL/웰로 파종하고, 상기 키트에 포함되는 Working Solution을 50μL/웰로 각 웰에 가하고, 차광하면서 실온에서 30분간 정색(呈色) 반응을 행하였다. 마지막으로 상기 키트에 포함되는 Stop Solution을 25μL/웰로 각 웰에 가하고, 마이클로플레이트리더(iMark, Bio Rad사)를 사용하여 490nm의 흡광도를 측정했다. 측정 결과가 도 11에 표시되어 있다.
도 11로부터, 혈청농도 1%에서는 장애성이 없는 것, 및 10%에서는 장애성이 있는 것을 알 수 있다.
(5-4) 동결보존
HuRa-40세포의 표현형의 안정성으로의 -80℃ 보존의 영향을 검토했다. -80℃에서의 동결 전, 동결 2개월 후, 또는 동결 4개월 후의 HuRa-40세포를 준비했다. 이들 3종의 세포를, 인간 IgE(ab65866, Abcam, 최종농도 50ng/mL)를 포함하는 MEM배지에 있어서 하룻밤 감작했다. 상기 감작 후, PBS로 3회 세정했다. 상기 세정 후, 항인간 IgE 항체로 3시간 자극했다. 양성대조로서는, 이오노마이신(250nM)을 사용했다. 상기 자극 후, 기질액(One-Glo Luciferase Assay System, Promega사)을 첨가하고, 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 12에 표시되어 있다.
도 12에 표시되는 결과로부터, 적어도 4개월간의 동결에서의 수용체 특이적인 반응의 안정성이 확인되었다. 그리고, 8개월간의 -80℃ 보존 후에도, 세포의 수용체 특이적인 응답이 일어나는 것도 확인할 수 있었다.
(5-5) 계대수
계대수 4(P4) 또는 계대수 50(P50)의 HuRa-40세포에, 삼나무 꽃가루 알레르기 환자 혈청(특이적 IgE 항체가 100 이상)을 가하고 하룻밤 감작했다. 상기 감작 후, 각 세포는, PBS로 세정되고, 그리고, 삼나무 꽃가루 알레르겐 엑기스로 자극되었다. 상기 자극 후, 기질액(Bright-Glo, Promega사)을 가하고 발광을 측정했다. 측정 결과가 도 13에 표시되어 있다.
도 13에 표시되는 결과로부터, 삼나무 꽃가루 엑기스에 대한 응답은 P4 및 P50에서 큰 차이는 인정되지 않았다.
(6) 알레르기 환자 혈청을 사용한 시험(낙화생 알레르기)
(6-1) 각종 RAST 스코어의 환자 혈청을 사용한 항원특이적 응답
100배 희석한 정상인 혈청 또는 각종 RAST 스코어를 가지는 낙화생 알레르기 환자 혈청을 포함하는 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁한 HuRa-40세포를, 96혈의 마이크로 플레이트(ISOPLATE-96TC, PerkinElmer사)에 5.0×104세포/50μL/웰로 파종하고, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작시켰다.
상기 감작된 세포를 세정한 후에, 10% FBS 함유 MEM배지로 희석된 알레르겐 스크래치 엑기스(낙화생)를, 각종 농도로 첨가하고, 37℃에서 3시간 자극했다.
또한, 상기 감작이 행해지고 있지 않은 세포에 대해서도, 동일한 자극 처리를 행하였다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega사)의 기질액을 50μL/웰의 양으로 각 웰에 가하고, 5분간, 실온에서 차광하면서 반응시켰다. 그 후, 마이클로플레이트리더(GloMax, Promega사)에서 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 14에 표시되어 있다.
도 14에 표시되는 결과로부터, HuRa-40세포는, 항원특이적으로 응답하는 것을 알 수 있다.
(6-2) 본 발명의 세포와 다른 세포의 비교
HuRa-40세포에 의한 항원특이적 응답을, RS-ATL8세포와 비교했다. 또한, 상기 비교에 있어서, 음성대조로서, RBL-NL4세포를 사용했다.
RS-ATL8세포는, RBL-2H3세포에 인간 FcεRI를 안정 발현시킨 RBL-SX38세포에, NF-AT 의존성 반딧불 루시퍼라아제 발현 벡터(Biomyx사)를 안정 도입한 세포이다.
RBL-NL4세포는, 상기한 바와 같이, HuRa-40세포의 호스트 세포이며, RBL-2H3세포에 NF-AT 의존성 반딧불 루시퍼라아제 발현 벡터(Biomyx사)를 안정 도입한 세포이다.
상기 3종의 세포를 각각, RAST 스코어 6(>100UA/mL)의 낙화생 알레르기 환자 혈청(100배 희석)을 포함하는 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁하고, 96혈의 마이크로 플레이트(ISOPLATE-96TC, PerkinElmer사)에 5.0×104세포/50μL/웰로 파종하고, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작시켰다.
상기 감작된 세포를 세정한 후에, 10% FBS 함유 MEM배지로 희석된 알레르겐 스크래치 엑기스(낙화생)를, 각종 농도(0, 0.1, 1, 10, 100, 또는 1000 ng/mL)로 첨가하고, 37℃에서 3시간 자극했다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega사)의 기질액을 50μL/웰의 양으로 각 웰에 가하고, 5분간, 실온에서 차광하면서 반응시켰다. 그 후, 마이클로플레이트리더(GloMax, Promega사)에서 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 15에 표시되어 있다.
도 15에 표시되는 결과로부터, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 우수한 항원응답을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한, 폭 넓은 항원농도에 걸쳐, HuRa-40세포의 응답성은, RS-ATL8세포보다 우수했다.
(7) 본 발명의 세포와 다른 세포의 비교(알레르기 검사, 계란 알레르기)
HuRa-40세포에 의한 항원특이적 응답을, RS-ATL8세포와 비교했다. 또한, 상기 비교에 있어서, 음성대조로서, RBL-NL4세포를 사용했다.
상기 3종의 세포를 각각, 계란 알레르기 환자 혈청(특이적 IgE 항체가 100 이상) 또는 정상인의 풀 혈청을 포함하는 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁하고, 96혈의 마이크로 플레이트(ISOPLATE-96TC, PerkinElmer사)에 5.0×104세포/50μL/웰로 파종하고, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작시켰다.
상기 감작된 세포를 PBS로 세정한 후에, 10% FBS 함유 MEM배지로 희석된 난백 알레르겐 엑기스를, 각종 농도(0.1, 1, 10, 100, 또는 1000 ng/mL)로 첨가하고, 37℃에서 3시간 자극했다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega사)의 기질액을 50μL/웰의 양으로 각 웰에 가하고, 5분간, 실온에서 차광하면서 반응시켰다. 그 후, 마이클로플레이트리더(GloMax, Promega사)에서 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 16에 표시되어 있다.
도 16에 표시되는 결과로부터, 계란 알레르기 환자 혈청을 사용한 경우에는, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 우수한 응답성을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한, 정상인 풀 혈청을 사용한 경우에는, 난백 알레르겐 엑기스에 대한 응답은 인정되지 않았다. 이들 결과로부터, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포보다, 우수한 항원특이적 응답성을 나타내는 것을 알 수 있다.
(8) 본 발명의 세포와 다른 세포의 비교(알레르기 반응억제제의 유효성 평가)
오말리주맙은, 기관지천식, 계절성 알레르기성 비염, 및 만성 두드러기의 치료약이다. 오말리주맙은, 인간화 항인간 IgE 모노클로널 항체이며, IgE와 고친화성 수용체(FcεRI)의 결합을 저해함으로써, 호염기구, 비만세포 등의 염증세포의 활성화를 억제한다. 인간 IgE와 FcεRI의 결합을 경합적으로 저해하고, 혈청 중 유리 IgE 농도를 감소시킨다. 그리고, 이미 FcεRI와 결합한 IgE에는 결합하지 않는다. 본 발명의 세포는, 예를 들면 오말리주맙 등의 알레르기 반응억제제의 유효성 평가를 위하여 사용할 수 있다. 이하에서, 상기 유효성 평가를 위하여 사용할 수 있는 것을 나타내는 실험 및 그 결과를 설명한다.
HuRa-40세포 및 RS-ATL8세포를 준비했다. 10% FBS 함유 MEM배지에 현탁된 이들 세포의 각각에, 각종 최종농도(0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 또는 100 μg/mL)의 오말리주맙을 첨가하고, 첨가의 30분 후에, 인간 IgE를 50ng/mL 가하고 하룻밤 감작했다.
상기 감작된 세포를 PBS로 3회 세정한 후에, 인간 IgE 항체를 첨가하고, 37℃에서 3시간 자극했다.
상기 자극 시간이 경과한 후에, Bright-Glo(Promega사)의 기질액을 50μL/웰의 양으로 각 웰에 가하고, 5분간, 실온에서 차광하면서 반응시켰다. 그 후, 마이클로플레이트리더(GloMax, Promega사)에서 발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 17에 표시되어 있다.
도 17에 표시되는 결과로부터, RS-ATL8세포에 관해서는, 오말리주맙 농도가 0.1μg/mL로부터 1μg/mL로 증가하는 것에 따라 출발광강도가 약간 저하하고, 그리고 1μg/mL로부터 10μg/mL로 증가하는 것에 따라 출발광강도가 더욱 저하했다. 또한, 동 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, RS-ATL8세포에 관해서는, 오말리주맙의 50% 저해 농도(IC50)는 1μg/mL 초과이다. 한편, 동 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, HuRa-40세포에 관해서는, 오말리주맙 농도가 0.1μg/mL로부터 1μg/mL로 증가한 단계에서 이미, 발광강도의 큰 폭의 저하가 관찰되었다. 동 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, HuRa-40세포에 관해서는, 오말리주맙의 IC50은 1μg/mL 미만이다. 즉, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 보다 낮은 농도에서 오말리주맙의 작용을 검출할 수 있다. 이 때문에, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 항알레르기 활성물질의 스크리닝에 보다 적합한 것을 알 수 있고, HuRa-40세포에 의해, 항알레르기 활성물질을, 보다 예리하게 스크리닝할 수 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도 17에 표시되는 결과로부터, RS-ATL8세포에 관해서는, 오말리주맙 농도가 최대(100μg/mL)일 때, 0μg/mL의 경우와 비교하여, 발광강도는 1/4 정도로 저하한 것뿐이었다. 한편, HuRa-40세포에 관해서는, 오말리주맙 농도 100μg/mL에서의 출발광강도는, 0μg/mL의 경우의 1/30 이하로 현저하게 저하하였다. 즉, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 백그라운드가 거의 남지 않는다. 이 결과로부터도, HuRa-40세포는, RS-ATL8세포와 비교하여, 항알레르기 활성물질의 스크리닝에 보다 적합한 것을 알수 있고, HuRa-40세포에 의해, 항알레르기 활성물질을, 보다 예리하게 스크리닝할 수 있는 것을 알 수 있다.
이상에서 설명한 시험과 동일한 시험을, 오말리주맙의 대신에 시클로스포린 A를 사용하여 행하였다. 구체적으로는, 최종농도 0∼1 μg/mL의 시클로스포린 A를 RS-ATL8세포 또는 HuRa-40세포에 첨가하여 30분 후, 인간 IgE를 50ng/mL 가하고 하룻밤 감작했다. PBS로 3회 세정 후, 항인간 IgE 항체로 3시간 자극하고, Bright-Glo를 가하여 발광을 측정했다. 측정 결과가 도 18에 표시되어 있다.
도 18에 표시되는 결과로부터, HuRa-40세포에서는, 0.1μg/mL의 시클로스포린 A 첨가로 억제 경향이 인정되며, RS-ATL8세포와 마찬가지로, 0.5μg/mL의 시클로스포린 A 첨가에 의해 응답이 현저하게 억제되었다.
(9) 안정성 및 재현 정밀도
HuRa-40세포의 동결보존에서의 표현형의 안정성 평가 시험 및 재현 정밀도 평가 시험을 이하와 같이 행하였다.
이들 시험에 있어서 사용된 루시페라제 어세이는 이하와 같이 행해졌다.
즉, HuRa-40세포 현탁배지에 1/100vol.의 환자 혈청 또는 Human IgE(ab65866, Abcam)(최종농도 50ng/mL)를 가하고, 5.0×104세포/50μL/웰이 되도록 96혈 플레이트(165306, Thermo사)에 파종하고, 37℃, CO2인큐베이터 내에서 하룻밤 감작했다. 상기 감작 후, 세포를 PBS로 3회 세정하고, 상기 세정 후, 배지에서 조제한 난백 알레르겐 엑기스 또는 항인간 IgE 항체(A80-108A, BETHYL사)(최종농도100ng/mL)를 50μL/웰씩 가하고, 37℃, CO2 하에서 3시간 자극했다. 이하의 기질액을 50μL/well씩 가하여 5분간 반응시킨 후, 루미노미터(GloMax, Promega사)로 발광강도를 측정했다.
<기질액>
One-Glo Luciferase Assay System(Promega사)
One-Glo EX Luciferase Assay System(Promega사)
Bright-Glo(Promega사)
(HuRa-40의 표현형의 안정성의 평가 1)
동결 전, 동결 2개월 후, 동결 4개월 후, 동결 6개월 후, 또는 동결 2년 5개월 후의 HuRa-40세포에 Human IgE를 가하고 하룻밤 감작했다. PBS로 3회 세정 후, 항인간 IgE 항체로 3시간 자극했다. One-Glo Luciferase Assay System을 가하고 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 20에 표시되어 있다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, HuRa-40세포의, 적어도 2년 5개월간의 수용체 특이적인 반응의 안정성이 확인되었다.
(HuRa-40의 표현형의 안정성의 평가 2)
동결 2개월 후 또는 동결 2년 5개월 후의 HuRa-40세포에 계란 알레르기 환자 혈청(특이적 IgE 항체가 100 이상) 또는 정상인의 풀 혈청을 첨가하고 하룻밤 감작 후, PBS로 세정하고, 난백 알레르겐 엑기스로 자극하고 One-Glo EX Luciferase Assay System을 가하고 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 21에 표시되어 있다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, HuRa-40세포의, 적어도 2년 5개월간의 수용체 특이적인 반응의 안정성이 확인되었다.
(룸간 재현 정밀도 평가)
이하의 검토를 시설수 2(도 22의 A 및 B에 대응함) 및 시행 횟수 3(동 도면의 EXP1, 2, 3에 대응함)에서 실시한(룸간 공동시험). HuRa-40세포에 Human IgE를 가하고 하룻밤 감작했다. 상기 감작 후, PBS로 3회 세정하고, 상기 세정 후, 항인간 IgE 항체로 3시간 자극했다. 호모지니어스계 루시퍼라아제 기질액(Bright-Glo)을 가하고 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 22에 표시되어 있다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, HuRa-40세포를 사용한 시험의 재현 정밀도는 매우 높았다.
(실내 재현 정밀도 평가)
단일시험실에 의한 재현 정밀도 확인을 행하였다. HuRa-40세포에 Lot가 상이한 Human IgE(도 23의 OLD 및 NEW에 대응함)를 가하고 하룻밤 감작했다. 상기 감작 후에 PBS로 3회 세정하고, 상기 세정 후, 항인간 IgE 항체로 3시간 자극했다. 호모지니어스계 루시퍼라아제 기질액(Bright-Glo)을 가하고 출발광강도를 측정했다. 측정 결과가 도 23에 표시되어 있다.
동 도면에 나타낸 바와 같이, HuRa-40세포를 사용한 시험의 재현 정밀도는 매우 높았다.
독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁 센터 NPMDNITEBP-03230 20200617
SEQUENCE LISTING <110> KANAGAWA PREFECTURE JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH SCIENCES TEIKYO HEISEI UNIVERSITY <120> Chimeric FceRI a Gene, Chimeric FceRI a Protein, Cell, Kit, and Method <130> P3423 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric FceRI a chain gene <400> 1 atggcacccg caatggagtc ccccaccctg ctgtgtgtcg cactgctctt tttcgccccc 60 gatggagtcc tcgccgtccc ccagaagccc aaggtgtctc tcaacccccc ttggaataga 120 atctttaaag gggagaacgt gaccctgaca tgcaatggta acaatttctt tgaagtcagc 180 tccactaagt ggtttcacaa cgggtcactc agcgaggaaa caaattctag tctgaacatt 240 gtgaatgcca agttcgagga cagcggtgaa tacaaatgcc agcatcagca ggtgaacgag 300 tccgaacctg tgtatctgga ggtcttttcc gattggctgc tcctgcaggc ctctgctgag 360 gtggtcatgg aaggccagcc actcttcctg aggtgtcacg gatggcggaa ctgggacgtg 420 tacaaggtca tctactataa agatggggag gccctgaagt attggtacga aaaccataac 480 atcagtatca ctaacgcaac cgtggaggac tcaggcacat actattgtac tggaaaagtc 540 tggcagctcg attacgagag cgaaccactg aatatcaccg tgattaaggc tcccagggag 600 aaatattggc tccagctgat cttcccttct ctcgcagtga ttctgtttgc cgtcgacacc 660 ggactgtggt tcagtacaca caagcagttc gagtccatcc tcaaaatcca gaagacaggg 720 aaaggcaaga agaaggggtg a 741 <210> 2 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal sequence of chimeric FceRI a chain gene <400> 2 atggcacccg caatggagtc ccccaccctg ctgtgtgtcg cactgctctt tttcgccccc 60 gatggagtcc tcgcc 75 <210> 3 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Extracellular domain of chimeric FceRI a chain gene <400> 3 gtcccccaga agcccaaggt gtctctcaac cccccttgga atagaatctt taaaggggag 60 aacgtgaccc tgacatgcaa tggtaacaat ttctttgaag tcagctccac taagtggttt 120 cacaacgggt cactcagcga ggaaacaaat tctagtctga acattgtgaa tgccaagttc 180 gaggacagcg gtgaatacaa atgccagcat cagcaggtga acgagtccga acctgtgtat 240 ctggaggtct tttccgattg gctgctcctg caggcctctg ctgaggtggt catggaaggc 300 cagccactct tcctgaggtg tcacggatgg cggaactggg acgtgtacaa ggtcatctac 360 tataaagatg gggaggccct gaagtattgg tacgaaaacc ataacatcag tatcactaac 420 gcaaccgtgg aggactcagg cacatactat tgtactggaa aagtctggca gctcgattac 480 gagagcgaac cactgaatat caccgtgatt aaggctccca gggagaaata ttggctccag 540 <210> 4 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transmembrane and Intracellular domains of chimeric RceRI a chain gene <400> 4 ctgatcttcc cttctctcgc agtgattctg tttgccgtcg acaccggact gtggttcagt 60 acacacaagc agttcgagtc catcctcaaa atccagaaga cagggaaagg caagaagaag 120 ggg 123 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transmembrane domain of chimeric FceRI a chain gene <400> 5 ctgatcttcc cttctctcgc agtgattctg tttgccgtcg acaccggact gtggttc 57 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Intracellular domain of chimeric FceRI a chain gene <400> 6 agtacacaca agcagttcga gtccatcctc aaaatccaga agacagggaa aggcaagaag 60 aagggg 66 <210> 7 <211> 222 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE binding region of chimeric FceRI a chain gene <400> 7 tccgattggc tgctcctgca ggcctctgct gaggtggtca tggaaggcca gccactcttc 60 ctgaggtgtc acggatggcg gaactgggac gtgtacaagg tcatctacta taaagatggg 120 gaggccctga agtattggta cgaaaaccat aacatcagta tcactaacgc aaccgtggag 180 gactcaggca catactattg tactggaaaa gtctggcagc tc 222 <210> 8 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric FceRI a chain protein <400> 8 Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val 20 25 30 Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr 35 40 45 Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp 50 55 60 Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile 65 70 75 80 Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln 85 90 95 Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp 100 105 110 Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu 115 120 125 Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile 130 135 140 Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn 145 150 155 160 Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys 165 170 175 Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile 180 185 190 Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Leu Ile Phe 195 200 205 Pro Ser Leu Ala Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Trp Phe 210 215 220 Ser Thr His Lys Gln Phe Glu Ser Ile Leu Lys Ile Gln Lys Thr Gly 225 230 235 240 Lys Gly Lys Lys Lys Gly 245 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Pro Ala Met Glu Ser Pro Thr Leu Leu Cys Val Ala Leu Leu 1 5 10 15 Phe Phe Ala Pro Asp Gly Val Leu Ala 20 25 <210> 10 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile 1 5 10 15 Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe 20 25 30 Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu 35 40 45 Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val 85 90 95 Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn 100 105 110 Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys 115 120 125 Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu 130 135 140 Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr 145 150 155 160 Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys 165 170 175 Tyr Trp Leu Gln 180 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11 Leu Ile Phe Pro Ser Leu Ala Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 1 5 10 15 Leu Trp Phe Ser Thr His Lys Gln Phe Glu Ser Ile Leu Lys Ile Gln 20 25 30 Lys Thr Gly Lys Gly Lys Lys Lys Gly 35 40 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Leu Ile Phe Pro Ser Leu Ala Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 1 5 10 15 Leu Trp Phe <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Ser Thr His Lys Gln Phe Glu Ser Ile Leu Lys Ile Gln Lys Thr Gly 1 5 10 15 Lys Gly Lys Lys Lys Gly 20 <210> 14 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr 20 25 30 Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu 35 40 45 Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr 50 55 60 Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu 65 70 <210> 15 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preoptimized sequence of chimeric FceRI a chain gene <400> 15 atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60 gatggcgtgt tagcagtccc tcagaaacct aaggtctcct tgaaccctcc atggaataga 120 atatttaaag gagagaatgt gactcttaca tgtaatggga acaatttctt tgaagtcagt 180 tccaccaaat ggttccacaa tggcagcctt tcagaagaga caaattcaag tttgaatatt 240 gtgaatgcca aatttgaaga cagtggagaa tacaaatgtc agcaccaaca agttaatgag 300 agtgaacctg tgtacctgga agtcttcagt gactggctgc tccttcaggc ctctgctgag 360 gtggtgatgg agggccagcc cctcttcctc aggtgccatg gttggaggaa ctgggatgtg 420 tacaaggtga tctattataa ggatggtgaa gctctcaagt actggtatga gaaccacaac 480 atctccatta caaatgccac agttgaagac agtggaacct actactgtac gggcaaagtg 540 tggcagctgg actatgagtc tgagcccctc aacattactg taataaaagc tccgcgtgag 600 aagtactggc tacaactcat tttcccatca ttggcggtga ttctgtttgc tgtggacact 660 gggttatggt tctcaaccca caaacagttc gaatccatct tgaagattca gaagactgga 720 aaaggcaaaa aaaaaggttg a 741

Claims (24)

  1. 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인을 코딩하는 제1 염기서열과,
    비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 코딩하는 제2 염기서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 염기서열은, 서열 ID No. 7의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2 염기서열은, 적어도 서열 ID No. 5의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 염기서열은, 서열 ID No. 6의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 더 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자는, 상기 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄를 세포막에 발현시키기 위한 시그널 서열을 코딩하는 제3 염기서열을 더 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제3 염기서열이, 서열 ID No. 2의 염기서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자가, 서열 ID No. 1의 염기서열과 50% 이상의 서열 동일성을 가지는 염기서열을 가지는, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비인간 동물이 설치류 동물인, 키메라 FcεRIα쇄 유전자.
  9. 인간 FcεRIα쇄 중 세포외 도메인과,
    비인간 동물 FcεRIα쇄 중 적어도 세포막 관통 도메인을 포함하는 키메라 FcεRIα쇄 단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포외 도메인은, 서열 ID No. 14의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 단백질.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 세포막 관통 도메인은, 서열 ID No. 12의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 단백질.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질은, 비인간 동물 FcεRIα쇄 중 세포내 도메인을 더 포함하고,
    상기 세포내 도메인은, 서열 ID No. 13의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 포함하는, 키메라 FcεRIα쇄 단백질.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 키메라 FcεRIα쇄 단백질이, 서열 ID No. 8의 아미노산서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산서열을 가지는, 키메라 FcεRIα쇄 단백질.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 FcεRIα쇄 유전자를 포함하는 벡터.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 FcεRIα쇄 유전자,
    제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 또는
    제14항에 기재된 벡터를 포함하는, 상기 비인간 동물의 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 비인간 동물 세포의 FcεRI의 γ쇄의 유전자를 더 포함하는, 세포.
  17. 제6항에 있어서,
    상기 키메라 FcεRIα쇄 유전자에 기초하여 생성된 키메라 FcεRIα쇄와 상기 세포의 FcεRI의 γ쇄를 포함하는 회합체를 형성하는, 세포.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 회합체끼리의 가교에 의해 발현이 유도되는 리포터유전자를 더 포함하는, 세포.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 포함하는 분석용 키트.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 사용하는 분석 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 분석 방법은,
    상기 세포를 인큐베이팅하는 인큐베이팅 공정, 및
    상기 세포의 응답을 분석하는 분석 공정
    을 실행하는 것을 포함하는, 분석 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 인큐베이팅 공정이, 상기 세포를 인큐베이팅용 재료 중에서 인큐베이팅하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 분석 공정이, 상기 응답에 기초하여
    알레르겐성의 평가,
    알레르기의 유무 또는 리스크의 평가,
    IgE에 대한 분석,
    알레르기 억제 활성의 평가, 및
    드럭스크리닝
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 행하는 것을 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석 공정이, I형 알레르기의 유무 또는 리스크의 평가를 행하는 것을 포함하는, 방법.
KR1020237028647A 2021-03-01 2022-02-24 키메라 FcεRIα쇄 유전자, 키메라 FcεRIα쇄 단백질, 세포, 분석용 키트, 및 분석 방법 KR20230134574A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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