CN117630383A - 一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用，所述方法包括：构建过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞；培养所述Jurkat效应细胞，通过荧光素酶报告基因法检测待测样品中抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性。本发明基于荧光素酶报告基因法，通过对TCRγδ信号通路的分析，模拟生理状态下的γδT细胞，建立一种生物学活性检测方法，可检测抗TCRγ9链、TCRδ1链和TCRδ2链的单克隆抗体的生物活性，为靶向γδT细胞的肿瘤免疫治疗新药的筛选和评价提供了有效手段，在抗体药物的检测和筛选中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物检测领域，具体涉及一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用。
背景技术
相比于传统的抗癌治疗策略，肿瘤免疫治疗被认为拥有更宽阔的前景。其中，双特异性T细胞衔接器(bispecific T-cell engager，BiTE)是肿瘤免疫治疗一个重要发展方向。BiTE代表一类具有显著抗肿瘤效应的双特异性抗体，能够靶向性激活自身T细胞杀伤肿瘤细胞。它有两个识别不同靶点的具有特异性识别能力的结构区域，并通过各种特殊的方式连接。其中一个识别T细胞表面蛋白，例如CD3蛋白，而另一个识别特异性肿瘤细胞表面抗原。BiTE的这种结构和特异性结合蛋白的能力允许它将T细胞物理性地桥接肿瘤细胞，形成T细胞肿瘤细胞复合物，诱导免疫突触形成，刺激T细胞活化，杀伤肿瘤细胞。
BiTE中针对T细胞的特异性识别区，也就是T细胞衔接器(T-cell engager，TCE)，目前应用最广泛的就是以CD3作为识别靶点。但以CD3作为T细胞激活靶点，能激活所有的CD3阳性T细胞，因此主要激活占绝大多数比例的αβT细胞，存在功能依赖MHC限制的抗原呈递，组织浸润能力差，炎症因子释放过量风险等缺陷。因此，更加特异性的T细胞靶点成为进一步研究的方向。
γδT细胞是一群表达γδT细胞受体(TCRγδ)的T细胞亚群。区别于αβT细胞，其TCR由一条γ链和一条δ链组成。γ链和δ链通常分为V区与C区，C区十分保守，但V区差别很大，常见的人类Vγ链有Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8和Vγ9等，常见的人类Vδ链有Vδ1、Vδ2和Vδ3等。通常，人类γδT细胞可以根据其TCR链进行广泛分类，而某些γ和δ类型T细胞更普遍存在于一种或多种组织类型中。例如，大多数血液驻留的γδT细胞表达Vγ9Vδ2，而在组织中驻留的γδT细胞(例如皮肤中)主要表达Vδ1。
γδT细胞在免疫监视中发挥关键作用，它能够识别多种肿瘤抗原，从而有效的杀死肿瘤细胞。与αβT细胞相比，γδT细胞响应更快速，对肿瘤细胞的识别不依赖于任何单一肿瘤抗原，也不受MHC的限制；γδT细胞具有许多非特异性免疫细胞的特征，能够协调免疫反应；而其较强的组织浸润能力和原位驻留特性使得它们在一系列疾病适应症中具有潜力，包括血液学和实体恶性肿瘤。
近年来，基于报告基因测试的检测方法被广泛应用于各种特异性抗体药物的筛选和生物学活性的分析中。报告基因测试法具有原位检测、定量分析、高通量等优点，兼顾了大规模筛选和药物活性导向的需求。TCRγδ作为一个新兴的TCE靶点，没有专门为其设计的报告基因测试方案，因此，开发一个基于报告基因测试的检测方法能极大地提升以TCRγδ为靶点的抗体药物的筛选效率。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法及其应用。本方法基于荧光素酶报告基因法，通过对TCRγδ信号通路的分析，模拟生理状态下的γδT细胞，建立的一种生物学活性检测方法，可用于检测抗TCRγ9链、TCRδ1链和TCRδ2链的单克隆抗体的生物活性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，所述方法包括：
(1)构建过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞；
(2)培养所述Jurkat效应细胞，通过荧光素酶报告基因法检测待测样品中抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性。
本发明通过将Jurkat细胞表面的TCRαβ置换为TCRγδ，并利用原有的完整TCR下游信号通路和NFAT-RE-luc2P报告基因，在TCRγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，来指示TCRγδ的激活程度。此方案实现了天然的TCRγδ-CD3复合物组装，无需过表达CD3复合物，也无需过表达任何TCR下游信号通路蛋白，尽可能的模拟生理状态下的γδT细胞，为靶向γδT细胞的肿瘤免疫治疗新药的筛选和评价提供了有效手段。
优选地，步骤(1)中，所述过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞采用包括如下步骤的方法构建得到：
将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因导入Jurkat细胞中，进一步采用CRISPR/Cas9技术敲除Jurkat细胞中编码TCRβ链的基因，再将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列整合到Jurkat细胞染色体中，得到Jurkat效应细胞。
优选地，将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因整合在质粒上，通过质粒转染的方式导入Jurkat细胞中。
优选地，靶向所述TCRβ链的gRNA的核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
优选地，将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，进行慢病毒包装，采用包装后的慢病毒颗粒感染基因敲除后的Jurkat细胞。
优选地，所述慢病毒包装采用的包装质粒包括PsPAX.2质粒和PMD2.G质粒。
优选地，所述TCRγ9δ1由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ1链隔开，所述TCRγ9δ2由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ2链隔开。
优选地，所述TCRγ9δ1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述TCRγ9δ2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中，所述过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞可以用于评估抗TCRγδ抗体(包括抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体)的生物学活性，抗TCRγδ抗体通过其对TCRγδ的特异性识别与亲和力，结合于Jurkat效应细胞表面的TCRγδ-CD3复合物，激活TCR下游信号，从而激活效应细胞，最终体现为荧光素酶表达上调与荧光信号上升。其中，抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体分别特异性识别TCRγ9δ1-CD3复合物的Vγ9和Vδ1，都显示出对Jurkat效应细胞的激活作用，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
优选地，步骤(2)中，所述荧光素酶报告基因法检测的步骤包括：
(a)用包被抗体包被酶标板，所述包被抗体为抗人IgG-Fcγ片段抗体；
(b)将待测样品加入酶标板中并孵育；
(c)将Jurkat效应细胞加入酶标板中并孵育；
(d)将发光底物加入酶标板中并孵育，孵育结束，进行荧光强度的检测。
本发明中，所述包被抗体为非人源抗IgG-Fcγ片段抗体，例如山羊抗人IgG-Fcγ片段抗体、小鼠抗人IgG-Fcγ片段抗体等都可以作为包被抗体。
优选地，步骤(a)中，所述包被酶标板的具体步骤为：采用1.0-2.0μg/mL(例如可以是1.0μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL或2.0μg/mL等)的抗人IgG-Fcγ片段抗体包被酶标板，4±2℃孵育过夜。
优选地，步骤(b)中，所述待测样品孵育的条件为：于4±2℃孵育10-12小时(例如可以是10、11或12等)，或于37±2℃孵育30-90分钟(例如可以是30、40、50、60、70、80或90等)。
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞为对数生长期的细胞。
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞以细胞密度为(0.5-2)×106个/mL加入酶标板中，例如可以是个0.5×106/mL、1×106/mL、1.5×106/mL或2×106/mL等。
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞孵育的条件为：于37±2℃CO2培养箱中孵育4-24小时，例如可以是4、8、12、16、20或24等。
优选地，步骤(d)中，所述发光底物为萤火虫荧光素。
优选地，所述萤火虫荧光素包括ONE-GloTMReagent。
优选地，步骤(d)中，所述发光底物的孵育的条件为：20-25℃(例如可以是20℃、22℃、24℃或25℃等)避光孵育5-10分钟，例如可以是5、6、7、8、9或10等。
第二方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞以Jurkat细胞为出发细胞，采用质粒表达NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因，敲除编码TCRβ链的基因，再将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列整合到Jurkat细胞染色体中，得到重组细胞。
优选地，将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因整合在质粒上，通过质粒转染的方式导入Jurkat细胞中；再将靶向所述TCRβ链的gRNA的核苷酸导入Jurkat细胞中；进一步将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，进行慢病毒包装，采用包装后的慢病毒颗粒感染基因敲除后的Jurkat细胞，得到重组细胞。
优选地，所述靶向所述TCRβ链的gRNA的核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述慢病毒包装采用的包装质粒包括PsPAX.2质粒和PMD2.G质粒。
优选地，所述TCRγ9δ1由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ1链隔开，所述TCRγ9δ2由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ2链隔开。
优选地，所述编码TCRγ9δ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述编码TCRγ9δ2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中，所述重组细胞可以用于评估抗TCRγδ抗体(包括抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体)的生物学活性，抗TCRγδ抗体通过其对TCRγδ的特异性识别与亲和力，结合于Jurkat效应细胞(重组细胞)表面的TCRγδ-CD3复合物，激活TCR下游信号，从而激活效应细胞，最终体现为荧光素酶表达上调与荧光信号上升。其中，抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体分别特异性识别TCRγ9δ1-CD3复合物的Vγ9和Vδ1，都显示出对Jurkat效应细胞(重组细胞)的激活作用，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
第三方面，本发明提供一种检测抗TCRγδ特异性抗体的试剂盒，所述试剂盒中包括第二方面所述的重组细胞。
优选地，所述试剂盒中还包括包被缓冲液、稀释液或发光底物中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述包被缓冲液选自PBS缓冲液。
优选地，所述稀释液选自RPMI-1640完全培养基。
优选地，所述发光底物选自ONE-GloTMReagent。
本发明中所述试剂盒用于检测抗TCRγδ抗体的生物学活性，抗TCRγδ抗体激活重组细胞上的TCRγδ，在TCRγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，来指示TCRγδ的激活程度。
第四方面，本发明提供一种筛选以TCRγδ为靶点的抗体药物的方法，所述方法包括：采用第二方面所述的重组细胞为指示细胞，将待筛选抗体药物与指示细胞结合，根据指示细胞的荧光强度的变化筛选抗体药物。
本发明中，所述重组细胞在体外可以被抗TCRγδ抗体激活，在TCRγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，荧光素酶蛋白作用于发光底物，根据发光底物的荧光强度，来指示TCRγδ的激活程度，从而反应抗TCRγδ抗体的生物活性。
本发明所述筛选方法具有原位检测、定量分析、特异性强、高通量等优点，极大地提升以TCRγδ为靶点的抗体药物的筛选效率。
第五方面，本发明提供第一方面所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法、第二方面所述的重组细胞或第三方面所述的检测抗TCRγδ特异性抗体的试剂盒在抗TCRγδ特异性抗体检测或筛选中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过将Jurkat细胞表面的TCRαβ置换为TCRγδ，并利用原有的完整TCR下游信号通路和NFAT-RE-luc2P报告基因，在TCRγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，来指示TCRγδ的激活程度。此方案实现了天然的TCRγδ-CD3复合物组装，无需过表达CD3复合物，也无需过表达任何TCR下游信号通路蛋白，从而尽可能的模拟生理状态下γδT细胞的激活状态。
(2)本发明基于荧光素酶报告基因的方法，通过对TCRγδ信号通路的分析，建立了一种抗TCRγδ抗体生物学活性的检测方法，可以用于体外证明激活剂对于γδT细胞的激活作用。本方法具有原位检测、定量分析、特异性强、高通量等优点，能够帮助我们探索TCRγδ这一靶点的生物学机制，并极大地提升以TCRγδ为靶点的抗体药物的筛选效率。
附图说明
图1为Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRγ9的水平。
图2为Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRδ1的水平。
图3为Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达CD3的水平。
图4为Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRαβ的水平。
图5为Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRγ9的水平。
图6为Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRδ2的水平。
图7为Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达CD3的水平。
图8为Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRαβ的水平。
图9为TCRγδ活性检测系统的示意图。
图10为抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体激活Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞的活性检测(相对光单位)结果。
图11为抗Vγ9抗体、抗Vδ2抗体激活Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞的活性检测(相对光单位)结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1工程细胞的构建
(1)构建表达NFAT-RE-luc2P的Jurkat.NFAT.RE细胞
用含有NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因的质粒(Promega，货号E8481)转染Jurkat细胞(ATCC，货号TIB-152)，培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞密度不超过2×106个/mL。待细胞生长稳定之后挑取荧光素酶信号阳性的单克隆细胞系扩大培养，命名为Jurkat.NFAT.RE细胞。
(2)构建敲除TCRβ链的Jurkat.NFAT.TCR-KO细胞
在表达NFAT-RE-luc2P的Jurkat.NFAT.RE细胞中，使用CRISPR/Cas9技术敲除编码TCRβ链的基因。将敲除TCRβ链的gRNA(SEQ ID NO:1：5′-GGAGAATGACGAGTGGACCC-3′)插入到PX459-AAVS1表达载体中，将PX459-AAVS1质粒电转Jurkat.NFAT.RE细胞，然后用含15％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养，细胞密度不超过2×106个/mL。
待细胞生长稳定后，利用TCRαβ-CD3复合物共表达的特性，对细胞进行TCRαβ与CD3的双色流式染色，然后使用流式细胞分选仪富集双阴性细胞(敲除TCRβ链的细胞)，并进行扩大培养，细胞命名为Jurkat.NFAT.TCR-KO细胞。
Jurkat.NFAT.TCR-KO细胞的CD3、TCRαβ表达的流式检测方法包括如下步骤：
步骤1：待测细胞与FITC-anti-human-CD3抗体(eBioscience-11-0038-42)或APC-anti-human-TCRαβ抗体(BioLegend-306718)在4℃孵育30分钟。
步骤2：洗涤细胞后使用流式细胞仪检测细胞的平均荧光强度。
步骤3：数据处理：细胞的平均荧光强度用FlowJo软件进行分析。
(3)构建CD3/TCRγ9双阳性的细胞
利用慢病毒感染敲入外源基因γ9δ1或γ9δ2：将人全长基因TCRγ9链与TCRδ1链的组合，或TCRγ9链与TCRδ2链的组合，分别制作成慢病毒，TCRγ链与TCRδ链以多肽P2A(GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO:4)相隔，分别被克隆到含有杀稻瘟菌素抗性基因的慢病毒表达载体的多克隆酶切位点中，其中，TCRγ9δ1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，TCRγ9δ2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。将这两个慢病毒表达载体，分别与PsPAX.2和PMD2.G两个质粒(Vigene Bioscience，货号LTMP8006)混合转染293FT细胞，从而培养收集得到包含γ9δ1基因或γ9δ2基因的两种慢病毒颗粒。
SEQ ID NO:2
MLSLLHTSTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWDRYYKKLFGSGTTLVVTDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLFSSLLCVFVAFSYSGSSVAQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGVRAFLRDWGIRVLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL。
SEQ ID NO:3
MLSLLHTSTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMQRISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL。
使用包装好的两种慢病毒颗粒分别感染Jurkat.NFAT.TCR-KO细胞，之后将细胞培养于含10μg/mL杀稻瘟菌素和15％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养，细胞密度不超过2×106个/mL。
待细胞生长稳定后，利用TCRγδ-CD3复合物共表达的特性，对细胞进行TCRγ9与CD3的双色流式染色，通过流式细胞分选仪的方法挑选出CD3/TCRγ9双阳性的单克隆细胞，对单克隆细胞进行扩大培养，其中表达TCRγ9δ1的细胞被命名为Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞；表达TCRγ9δ2的细胞被命名为Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞。
Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞和Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞的TCRγ9、TCRδ1、TCRδ2表达的流式检测方法包括如下步骤：
步骤1：待测细胞与抗Vγ9抗体或抗Vδ1抗体或抗Vδ2抗体在4℃孵育1小时。
步骤2：洗涤细胞后，加入荧光标记的山羊抗人抗体(Jackson ImmunoResearch，货号109-605-098)检测抗Vγ9抗体或抗Vδ1抗体或抗Vδ2抗体与待测细胞的结合。
步骤3：荧光强度测定：细胞的平均荧光强度用流式细胞仪检测。
步骤4：数据处理：细胞的平均荧光强度用FlowJo软件进行分析。
Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRγ9的情况如图1所示，灰色的阳性峰代表TCRγ9有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRδ1的情况如图2所示，灰色的阳性峰代表TCRδ1有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达CD3的情况如图3所示，灰色的阳性峰代表CD3有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞表达TCRαβ的情况如图4所示，灰色的阴性峰代表TCRαβ完全没有表达；以上结果表明，Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞不再表达TCRαβ，不存在TCRαβ-CD3复合物，而表达TCRγ9δ1-CD3复合物。
Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRγ9的情况如图5所示，灰色的阳性峰代表TCRγ9有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRδ2的情况如图6所示，灰色的阳性峰代表TCRδ2有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达CD3的情况如图7所示，灰色的阳性峰代表CD3有正常的表达；Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞表达TCRαβ的情况如图8所示，灰色的阴性峰代表TCRαβ完全没有表达；以上结果表明，Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞不再表达TCRαβ，不存在TCRαβ-CD3复合物，而表达TCRγ9δ2-CD3复合物。
图中黑色曲线代表无细胞染色或只孵育荧光标记二抗的细胞，灰色区域代表荧光标记的相应抗体或通过荧光标记二抗检测相应抗体与对应细胞共孵育后的染色结果。
本实施例中的Jurkat.NFAT.RE细胞、Jurkat.NFAT.TCR-KO细胞、包含γ9δ1基因或γ9δ2基因的两种慢病毒颗粒、Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞和Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞，均由上海药明生物医药有限公司生物新药研发服务业务部构建。
实施例2细胞系稳定性测试
上述步骤构建得到的Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞与Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞还需经过细胞系稳定性测试，具体步骤如下所示：
构建得到的单克隆细胞系在第一次离心传代之前被认定为P1代，每次离心传代后的细胞系代数加一，分别在P4代、P6代与P8代取样，利用流式抗体，对CD3、TCRγ9、TCRδ1、TCRδ2和TCRαβ的表达进行检测。
结果显示：构建的Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞能够在P8代以内稳定表达CD3-TCRγ9δ1复合物，并保持TCRαβ流式信号为阴性；构建的Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞能够在P8代以内稳定表达CD3-TCRγ9δ2复合物，并保持TCRαβ流式信号为阴性。
实施例3制备抗体
本实施例中使用的抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体、抗Vδ2抗体由上海药明生物医药有限公司生物新药研发服务业务部构建、表达并纯化。
抗Vγ9抗体的全长序列根据Janssen Biotech公司专利US20210284731A1中已经披露的克隆号为7A5_var17的序列合成。抗Vδ1抗体的全长序列根据GammaDeltaTherapeutics公司专利WO2022/175413A1和WO2022/175414A1中已经披露的克隆号为ADT1-4-2的序列合成。抗Vδ2抗体的全长序列根据Lava Therapeutics公司专利WO2022122973A1中已经披露的克隆号为5C8的序列合成。
人IgG1同型对照抗体Human IgG1的可变区序列由上海药明生物医药有限公司生物新药研发服务业务部杂交瘤部发现，全长抗体由蛋白科学部进行构建、表达并纯化。
实施例4抗体激活效应细胞的活性检测
步骤1：使用PBS稀释山羊抗人IgG-Fcγ片段抗体(Jackson ImmunoResearch-109-005-098)至2.0μg/mL，将稀释液每孔100μL加入96孔板(NEST-701111)，于4℃冰箱中孵育过夜。
步骤2：第二天，使用RPMI-1640完全培养基配制不同浓度的待测抗体，从0.2nM开始，3倍稀释至0.00003nM；取出孵育过夜的96孔板，弃去孔内溶液，并用PBS洗涤两遍；将稀释好的待测抗体溶液每孔100μL加入96孔板，于4℃冰箱中孵育过夜或37℃孵育1小时。
步骤3：孵育结束，弃去孔内溶液，并用PBS洗涤一遍；取对数生长期的Jurkat效应细胞(Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞或Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞)，离心，使用RPMI-1640完全培养基重悬至细胞密度为1×106个/mL；将Jurkat效应细胞悬液每孔100μL加入孵育好的96孔板中，于37℃CO2培养箱中培养孵育4～24小时。
步骤4：提前将发光底物(ONE-GloTMReagent(Promega-E6120))取出避光置于室温，待样品孵育结束后，将96孔板取出置于室温放置3～5分钟，每孔加入50μL发光底物并混匀，室温避光孵育5分钟；孵育结束，从96孔板中转移100μL混合液至白壁或黑壁平底96孔板中，使用Envision多功能酶标仪进行荧光强度的检测，以相对光单位表示。
应用报告基因方法评估抗TCRγδ抗体的生物学活性的示意图如图9所示。抗TCRγδ抗体通过捕获抗体包被于平板上，通过其对TCRγδ的特异性识别与亲和力，结合于Jurkat效应细胞表面的TCRγδ-CD3复合物，激活TCR下游信号，从而激活效应细胞，最终体现为荧光素酶表达上调与荧光信号上升。
抗Vγ9抗体、抗Vδ1抗体激活Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞的活性检测结果如图10所示，它们分别特异性识别TCRγ9δ1-CD3复合物的Vγ9和Vδ1，都显示出对Jurkat.NFAT.TCRg9d1细胞的激活作用，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
抗Vγ9抗体、抗Vδ2抗体激活Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞的活性检测结果如图11所示，它们分别特异性识别TCRγ9δ2-CD3复合物的Vγ9和Vδ2，都显示出对Jurkat.NFAT.TCRg9d2细胞的激活作用，而且这种作用具有剂量依赖性，而同型对照抗体则没有任何作用。
综上，本发明基于荧光素酶报告基因法，通过对TCRγδ信号通路的分析，模拟生理状态下的γδT细胞，建立了一种生物学活性检测筛选方法；具体的，本发明通过将Jurkat细胞表面的TCRαβ置换为TCRγδ，并利用原有的完整TCR下游信号通路和NFAT-RE-luc2P报告基因，在TCRγδ激活的情况下，刺激大量荧光素酶蛋白表达，来指示TCRγδ的激活程度。所述方法实现了天然的TCRγδ-CD3复合物组装，无需过表达CD3复合物，也无需过表达任何TCR下游信号通路蛋白，尽可能的模拟生理状态下的γδT细胞，为靶向γδT细胞的肿瘤免疫治疗新药的筛选和评价提供了有效手段，在抗体药物的检测和筛选中具有重要的应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)构建过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞；
(2)培养所述Jurkat效应细胞，通过荧光素酶报告基因法检测待测样品中抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性。
2.根据权利要求1所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述过表达人TCRγ9δ1或TCRγ9δ2以及NFAT反应元件荧光素酶报告基因的Jurkat效应细胞采用包括如下步骤的方法构建得到：
将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因导入Jurkat细胞中，进一步采用CRISPR/Cas9技术敲除Jurkat细胞中编码TCRβ链的基因，再将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列整合到Jurkat细胞染色体中，得到Jurkat效应细胞。
3.根据权利要求2所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，将NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因整合在质粒上，通过质粒转染的方式导入Jurkat细胞中；
优选地，靶向所述TCRβ链的gRNA的核苷酸如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求2或3所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，进行慢病毒包装，采用包装后的慢病毒颗粒感染基因敲除后的Jurkat细胞；
优选地，所述慢病毒包装采用的包装质粒包括PsPAX.2质粒和PMD2.G质粒；
优选地，所述TCRγ9δ1由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ1链隔开，所述TCRγ9δ2由多肽P2A将TCRγ9链与TCRδ2链隔开；
优选地，所述TCRγ9δ1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述TCRγ9δ2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述荧光素酶报告基因法检测的步骤包括：
(a)用包被抗体包被酶标板，所述包被抗体为抗人IgG-Fcγ片段抗体；
(b)将待测样品加入酶标板中并孵育；
(c)将Jurkat效应细胞加入酶标板中并孵育；
(d)将发光底物加入酶标板中并孵育，孵育结束，进行荧光强度的检测。
6.根据权利要求5所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述包被酶标板的具体步骤为：采用1.0-2.0μg/mL的抗人IgG-Fcγ片段抗体包被酶标板，4±2℃孵育过夜；
优选地，步骤(b)中，所述待测样品孵育的条件为：于4±2℃孵育10-12小时，或于37±2℃孵育30-90分钟；
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞为对数生长期的细胞；
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞以细胞密度为(0.5-2)×106个/mL加入酶标板中；
优选地，步骤(c)中，所述Jurkat效应细胞孵育的条件为：于37±2℃ CO2培养箱中孵育4-24小时；
优选地，步骤(d)中，所述发光底物为萤火虫荧光素；
优选地，所述萤火虫荧光素包括ONE-GloTMReagent；
优选地，步骤(d)中，所述发光底物的孵育的条件为：20-25℃避光孵育5-10分钟。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以Jurkat细胞为出发细胞，采用质粒表达NFAT-RE-luc2P荧光素酶报告基因，敲除编码TCRβ链的基因，再将编码TCRγ9δ1或TCRγ9δ2的核苷酸序列整合到Jurkat细胞染色体中，得到重组细胞。
8.一种检测抗TCRγδ特异性抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求7所述的重组细胞；
优选地，所述试剂盒中还包括包被缓冲液、稀释液或发光底物中任意一种或至少两种的组合。
9.一种筛选以TCRγδ为靶点的抗体药物的方法，其特征在于，所述方法包括：采用权利要求7所述的重组细胞为指示细胞，将待筛选抗体药物与指示细胞结合，根据指示细胞的荧光强度的变化筛选抗体药物。
10.权利要求1-6中任一项所述的基于报告基因检测抗TCRγδ特异性抗体的生物学活性的方法、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的检测抗TCRγδ特异性抗体的试剂盒在抗TCRγδ特异性抗体检测或筛选中的应用。
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