WO2011024458A1 - 宿主対移植片疾患の検査方法 - Google Patents

宿主対移植片疾患の検査方法 Download PDF

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康夫 小海
雅樹 山本
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北海道公立大学法人 札幌医科大学
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease

Definitions

  • the present invention relates to methods and reagents for testing host versus graft disease.
  • Organ transplantation is a method of treating organ damage by transplanting another person's organ, such as skin, kidney, liver, heart, lung, pancreas, and the like.
  • organ tissues are recognized as alloantigens.
  • An antigen (major histocompatibility antigen: MHC) for distinguishing between self and non-self is expressed on the cell surface of the organism, and the difference recognizes and attacks non-self cells, that is, cells with MHC different from self , Equipped with a self-defense mechanism to eliminate.
  • CD4 positive lymphocytes play a central role. When non-self cells are recognized, they activate and proliferate, and cause immune reactions such as production of various physiologically active substances (cytokines, chemokines, etc.).
  • the donor in order to prevent transplant rejection, the donor is selected so that the HLA antigen types of the donor and the host match, and the drug is administered to the host to suppress these immune responses. It is necessary to. However, there are numerous types of HLA antigens and it is very difficult to find a perfectly matched donor.
  • Identical antigen recognition requires at least two of the antigen-presenting cells and immunocompetent cells such as lymphocytes, and is established when there is an MHC mismatch between the two. Alloantigen recognition is performed when the allogeneic CD4 T cells recognize histocompatibility antigen II (MHC class II) expressed by antigen-presenting cells (dendritic cells: DC, etc.). As a result, CD4-positive T cells are activated and various physiologically active substances (cytokines and chemokines) are produced. These physiologically active substances cause inflammation in the host body, and proliferate and activate immunocompetent cells such as lymphocytes and macrophages.
  • MHC class II histocompatibility antigen II
  • DC dendritic cells
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting alloantigen recognition and a test agent used in such a method.
  • the inventors of the present invention analyzed and analyzed mixed immune cells from mice with different MHC, and found that the recognition of alloantigens was significantly related to the increase in the expression level of CCL8. completed.
  • the present invention provides a method for examining host versus graft disease (HVGD).
  • HVGD host versus graft disease
  • the amount of CCL8 protein is measured using an anti-CCL8 antibody.
  • the amount of CCL8 protein is measured using a method selected from the group consisting of a mass spectrometer, high performance liquid chromatography and two-dimensional electrophoresis.
  • the present invention provides a test agent for host versus graft disease comprising an anti-CCL8 antibody.
  • the present invention provides a method for selecting candidate substances for therapeutic agents for host versus graft disease.
  • This method Administering a test substance to a model animal of host versus graft disease; Measuring the amount of CCL8 protein in a sample obtained from said model animal; and If the amount of CCL8 protein is low compared to when the test substance is administered and not administered, the test substance is selected as a candidate for host versus graft disease treatment; Including each step.
  • the present invention provides a method for diagnosing host versus graft disease.
  • This method comprises measuring the amount of CCL8 protein in a sample obtained from a subject or test animal and comparing the obtained measurement value with a measurement value of a healthy control, wherein the obtained measurement value. Is higher than the control value, indicating that it is suffering from host versus graft disease.
  • the present invention provides a method for monitoring the progress of host versus graft disease.
  • the method includes measuring the amount of CCL8 protein in a sample obtained from a subject or test animal at multiple time points, wherein an increase in the measured value indicates disease progression. Decreasing is characterized by an improvement in the disease.
  • the present invention in organ tissue transplantation, it is possible to monitor the alloantigen recognition of the transplanted organ in the body, and to diagnose the onset and progression of host versus graft disease at an early stage.
  • FIG. 1 shows the expression of CCL8 in alloantigen recognition.
  • FIG. 2 shows the expression of various cytokines in recognition of alloantigens.
  • FIG. 3 shows the expression of CCL8 in the presence of neutralizing antibodies.
  • FIG. 4 shows the expression of CCL8 in a mixed culture of dendritic cells and CD4 positive T cells and / or macrophages.
  • FIG. 5 shows the expression of CCL8 in a mixed culture of dendritic cells and CD4 + T cells or CD8 + T cells.
  • FIG. 6 shows the dose response of the expression of CCL8.
  • FIG. 7 shows the expression of IFN ⁇ in alloantigen recognition.
  • FIG. 8 shows the results of in vivo allograft experiments.
  • FIG. 9 shows CD4 + T cell activation and CCL8 expression in alloantigen recognition.
  • the present invention is characterized by detecting the alloantigen recognition by measuring the expression level of CCL8 in a test sample such as blood of a subject, diagnosing host versus graft disease (HVGD), and monitoring the progress. And As specifically shown in the Examples below, it was revealed that CCL8 is expressed by alloantigen recognition. That is, it was revealed that CCL8 is useful as a biomarker for cognate antigen recognition.
  • HVGD host versus graft disease
  • CCL8 is a basic heparin-binding secreted protein belonging to the chemokine family and is also referred to as MCP-2 (GenBank Accession No. NP_005614). This protein is produced by monocytes, fibroblasts, epithelial cells and the like, and is known to bind to CCR2, CCR3, CCR5 and CCR11 as receptors. CCL8 has been shown to target CD4 positive T cells, CD8 positive T cells, monocytes, NK cells, eosinophils, basophils and the like as target cells. However, the role of CCL8 in vivo and its significance in regulating the immune system have not been fully elucidated.
  • test sample whose amount of CCL8 protein is to be measured
  • body fluid, blood, serum, plasma or the like obtained from a subject or a test animal can be used.
  • tissues or cells collected from the subject may be used.
  • the amount of CCL8 protein in a sample obtained from a subject can be measured using an immunoassay well known in the art using an anti-CCL8 antibody.
  • the anti-CCL8 antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Various anti-CCL8 polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are commercially available, and any of these antibodies can be used in the present invention.
  • antibodies may be prepared by methods well known in the art. Polyclonal antibodies that bind to CCL8 immunize animals using CCL8 or a peptide fragment thereof as a sensitizing antigen, isolate antisera containing antibodies from the immunized animals, ELISA assay, Western blot analysis, radioimmunoassay, etc. Can be obtained by confirming the presence of an antibody having a desired specificity using a method well known in the art.
  • a monoclonal antibody that binds to CCL8 immunizes an animal using CCL8 or a peptide fragment thereof as a sensitizing antigen according to methods well known in the art, and the resulting immune cells are removed and fused with myeloma cells; It can be obtained by selecting and cloning a hybridoma producing the antibody and culturing the hybridoma.
  • CCL8 protein in a sample obtained from a subject or a test animal is measured by an immunological method.
  • the measurement may be qualitative or quantitative.
  • the immunological measurement of the expression of CCL8 obtained from a subject can be performed using, for example, radioimmunoassay, ELISA, immunoprecipitation, immunoagglutination, Western blot, and the like.
  • a sandwich ELISA can be performed as follows. Peripheral blood of the subject is collected to prepare plasma, which is added to a plate or chip on which an anti-CCL8 antibody is immobilized, and incubated for an appropriate time. After washing the plate or chip to remove unbound components, another anti-CCL8 antibody is added. This antibody can be labeled so that it can be detected by an enzyme, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, biotin, a radiation compound, or the like. After incubation for an appropriate time, the plate or chip is washed, and the label is detected by measuring fluorescence, luminescence, radioactivity, and the like.
  • a secondary antibody eg, goat anti-mouse antibody
  • the secondary antibody can be labeled so as to be detectable with an enzyme, a fluorescent dye, a chemiluminescent substance, biotin, a radiation compound, or the like. In this way, the amount of CCL8 protein in plasma obtained from a subject can be measured.
  • the CCL8 protein can be detected using a detection method utilizing an agglutination reaction.
  • CCL8 can be detected using a carrier to which an anti-CCL8 antibody is bound, for example, latex particles.
  • latex particles to which an anti-CCL8 antibody is bound are mixed with a sample and incubated for a predetermined time, the particles aggregate when CCL8 is contained in the sample.
  • CCL8 in the sample can be detected by observing the degree of aggregation with the naked eye or by quantifying it using a spectrophotometer.
  • the CCL8 protein can be detected using a biosensor utilizing the surface plasmon resonance phenomenon.
  • Biosensors using the surface plasmon resonance phenomenon can monitor protein-protein interactions as surface plasmon resonance signals.
  • a biosensor such as BIAcore (manufactured by Pharmacia)
  • the binding between the CCL8 protein and the anti-CCL8 antibody can be detected.
  • a test sample is brought into contact with a sensor chip on which an anti-CCL8 antibody is immobilized, and a CCL8 protein that binds to the anti-CCL8 antibody can be detected as a change in resonance signal.
  • the CCL8 protein may be detected and quantified by MS after roughly purifying (concentrating) the test sample using an affinity carrier such as a metal chelator or heparin.
  • an affinity carrier such as a metal chelator or heparin.
  • it may be detected and quantified by HPLC, or may be detected and quantified by silver staining after two-dimensional electrophoresis.
  • the present invention also provides a host versus graft disease test agent comprising an anti-CCL8 antibody.
  • the test agent for host versus graft disease of the present invention can be provided in the form of a test kit.
  • the test kit contains a reagent for detecting CCL8, for example, an anti-CCL8 antibody as an active ingredient.
  • the kit may further contain appropriate reagents necessary for the measurement, such as a buffer solution, a diluting solution, a reaction stopping solution, a washing solution, and a control sample.
  • the host versus graft disease can be examined using the amount of CCL8 protein thus measured as an index.
  • the test method of the present invention includes, for example, diagnosis before onset of host versus graft disease (early diagnosis), definitive diagnosis of onset, determination of severity, monitoring of the course of disease, determination of therapeutic effect, and prediction of prognosis. Useful for.
  • the method of the present invention for diagnosing host-versus-graft disease involves measuring the amount of CCL8 protein in a sample obtained from a subject or test animal, and comparing the resulting measurement with that of a healthy control.
  • the measured value obtained is higher than the control value, indicating that the patient is suffering from host versus graft disease.
  • a healthy control is a human or animal that has been shown not to suffer from host versus graft disease.
  • a healthy control measurement may be the average of multiple control measurements. Measurements obtained from a subject or test animal are generally about 10% higher, preferably about 20% higher, more preferably about 30% higher, and more preferably about 40% higher than that of healthy controls.
  • the method of the present invention for monitoring the progress of host versus graft disease can be performed by measuring the amount of CCL8 protein in a sample obtained from a subject or a test animal at a plurality of time points. An increase in the measured value over time indicates disease progression, and a decrease indicates disease improvement. This method is also useful for determining the effects of treatment.
  • test substance for example, an anti-CCL8 antibody can be used.
  • the test substance may be obtained from a library such as various synthetic or natural compound libraries, combinatorial libraries, oligonucleotide libraries, peptide libraries and the like.
  • test substance from natural products, such as bacteria, fungi, algae, a plant, an animal, and its partially purified product. If the amount of CCL8 protein is low compared to when the test substance is administered and not administered, the test substance can be selected as a candidate for a therapeutic drug for host versus graft disease. That is, the test method of the present invention provides a platform for developing new treatments for host versus graft disease.
  • CCL8 expression in alloantigen recognition C57BL / 6 mouse spleen cells and Balb / c mouse dendritic cells were cultured in vitro using a combination of mice (C57BL / 6 mice and Balb / c mice) with different MHC.
  • Dendritic cells were isolated from spleen cells of Balb / c mice using magnetic beads.
  • As antigen-presenting cells of Balb / c mice 1 ⁇ 10 5 dendritic cells were seeded in a 96-well culture plate and mixed with 1 ⁇ 10 6 spleen nucleated cells of C57BL / 6 mice.
  • the CCL8 concentration in the supernatant on the first, second, third, fourth, and fifth days after the start of the culture was quantified by ELISA. As a result, it was confirmed that CCL8 protein was expressed in the culture supernatant 3 to 4 days after the start of the culture (FIG. 1). When syngeneic cells were used as a control, CCL8 expression was not detected.
  • CCL8 production To clarify the cells involved in CCL8 production, spleen cells of C57BL / 6 mice were selected using the magnetic bead method, and CD4-positive T cells and macrophages (CD11b +) were isolated. And mixed culture with Balb / c mouse dendritic cells. As a result, when CD4 positive T cells were used, CCL8 expression similar to that when whole spleen cells were used was observed (FIG. 4). When equal amounts of macrophages were mixed with CD4-positive T cells, CCL8 expression was more than twice as high.
  • CCL8 is expressed when alloantigen recognition is established between antigen-presenting cells and CD4-positive T cells, and further, CCL8 expression is enhanced in the presence of macrophages. This indicates that CCL8 is initially expressed by T cell alloantigen recognition, and expression induction from CD11b + cells is caused by IFN ⁇ expressed from CD4 + T cells that have recognized alloantigens.
  • CCL8 concentration was measured when cells were cultured in the same or the same species and cultured.
  • Dendritic cells were isolated from spleens of Balb / c mice. B6 spleen cells were isolated using an Auto MACS system. 1 ⁇ 10 5 Balb / c dendritic cells are cultured for 4 days with 1 ⁇ 10 6 B6 mouse spleen, whole spleen cells, CD4 + T cells, CD8 + T cells or spleen cells of Balb / c (syngeneic) mice as controls , CCL8 in the culture supernatant was quantified.
  • the expression of CCL8 is clearly observed in the mixed culture of Balb / c dendritic cells and B6 CD4 + T cells, and the concentration of CCL8 is the same as that of B6 CD8 + T cells or Balb / c spleen cells (syngeneic). Significantly higher than in mixed culture (white bar).
  • anti-mouse MHC class II antibody was added at the start of mixed culture, the expression level of CCL8 was significantly reduced, and this effect was significant in Balb / c dendritic cells and B6 CD4 + T cells (black bars). This shows that the induction of CCL8 is mediated by class II recognition by CD4 + T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of B6 mice and allogeneic dendritic cells were isolated from the spleen of Balb / c mice. 1 ⁇ 10 6 B6 CD4 + T cells were cultured in culture plates in the presence of buffer (control), anti-CD3 ⁇ antibody and anti-CD28 antibody, or Balb / c mouse dendritic cells. When the concentration of CCL8 in the supernatant was measured, production of CCL8 was observed only for allogeneic dendritic cell stimulation (FIG. 9A). These results indicate that cross-linking of CD3 ⁇ and CD28 to CD4 + T cells did not induce CCL8 expression in vitro.
  • CD4 + T cells stimulated with anti-CD3 ⁇ antibody and anti-CD28 antibody or allogeneic dendritic cells (FIG. 9B).
  • the white bar represents cell proliferation measured using a dye reflecting mitochondrial activity (graph left value), and the gray bar represents IFN- ⁇ secretion amount (graph right value). It can be seen that activation of CD4 + T cells occurs both in alloantigen presentation and in TCR cross-linking.
  • CCL8 as a molecular marker for alloantigen recognition is 1.
  • the present invention is useful for diagnosis and progress monitoring and treatment of host versus graft disease.

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Abstract

　同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することが見いだされた。宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法が開示される。また，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬も提供される。

Description

宿主対移植片疾患の検査方法
関連する出願
　本出願は，日本特許出願２００９－１９５９５１（２００９年８月２６日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
　本発明は，宿主対移植片疾患を検査するための方法および試薬に関する。
　臓器移植は，他人の臓器，例えば，皮膚，腎臓，肝臓，心臓，肺，膵臓などを移植することにより，臓器の障害を治療する方法である。移植医療において，他人の臓器組織はすべて同種抗原（アロ抗原）として認識される。生物の細胞表面には自己と非自己を区別するための抗原（主要組織適合抗原：ＭＨＣ）が発現しており，その違いによって非自己の細胞，すなわち自己と異なるＭＨＣをもつ細胞を認識，攻撃，排除する自己防衛機構が備わっている。その中心的な役割を担っているのはＣＤ４陽性リンパ球であり，非自己の細胞を認識すると活性化，増殖し，種々の生理活性物質（サイトカイン，ケモカインなど）の産生といった免疫反応を引き起こす。このため，移植医療においては，移植拒絶を防止するために，ドナーと宿主とのＨＬＡ抗原のタイプが一致するようにドナーを選択し，かつ，宿主に薬剤を投与してこれらの免疫反応を抑制することが必要である。しかしながら，ＨＬＡ抗原にはきわめて多くのタイプがあり，完全に一致するドナーを見いだすことは非常に困難である。
　同種抗原認識には抗原提示細胞とリンパ球などの免疫担当細胞の二者が少なくとも必要であり，両者の間にＭＨＣの不一致が存在することにより成立する。抗原提示細胞（樹状細胞：ＤＣなど）が発現する組織適合抗原ＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）を同種ＣＤ４Ｔ細胞が認識することにより同種抗原認識が行われる。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞が活性化し，様々な生理活性物質（サイトカイン，ケモカイン）が産生される。それらの生理活性物質は宿主体内での炎症を惹起し，リンパ球，マクロファージなどの免疫担当細胞を増殖，活性化させる。
　体内で起こっている同種抗原認識を血清などでモニターできれば，臓器拒絶などの移植免疫状態を客観的に観察可能となり，診断治療に大きな貢献ができると考えられる。過去の研究では，同種抗原認識の際に腫瘍崩壊因子アルファ（ＴＮＦ－α）やインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）といったサイトカインが産生されることがわかっている。しかし，ＩＦＮ－γは同種抗原認識の有無に関わらず，活性化されたリンパ球からも産生されるため，同種抗原認識の分子マーカーとしては不十分である。したがって，宿主対移植片疾患を早期に診断し，早期に治療を開始し，治療効果を客観的にモニターするために，同種抗原認識に特異的な分子マーカーを発見することが求められている。
　本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。
WO2009/001545
　本発明は，同種抗原認識を検出する方法およびかかる方法に用いる検査薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは，ＭＨＣの異なるマウスからの免疫細胞を混合培養して解析したところ，同種抗原認識の成立とＣＣＬ８の発現量の増加とが有意に関連することを発見して，本発明を完成した。
　すなわち，本発明は，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を検査するための方法を提供する。この方法は，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする。
　好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される。また好ましくは，ＣＣＬ８蛋白質の量は，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される。
　別の観点においては，本発明は，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬を提供する。
　さらに別の観点においては，本発明は，宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法を提供する。この方法は，
宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
の各工程を含む。
　さらに別の観点においては，本発明は，宿主対移植片疾患を診断する方法を提供する。この方法は，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を健常な対照の測定値と比較することを含み，ここで，得られた測定値が対照の測定値より高いことは宿主対移植片疾患に罹患していることを示すことを特徴とする。
　さらに別の観点においては，本発明は，宿主対移植片疾患の経過をモニタリングする方法を提供する。この方法は，被験者または被検動物から複数の時点で得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することを含み，ここで，得られた測定値が上昇していることは疾患の進行を示し，低下していることは疾患の改善を示すことを特徴とする。
　本発明にしたがえば，臓器組織移植において，体内での移植臓器の同種抗原認識をモニターすることができ，宿主対移植片疾患の発症および進行を早期に診断することが可能となる。
図１は，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現を示す。 図２は，同種抗原認識における各種サイトカインの発現を示す。 図３は，中和抗体の存在下におけるＣＣＬ８の発現を示す。 図４は，樹状細胞と，ＣＤ４陽性Ｔ細胞および／またはマクロファージとの混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。 図５は，樹状細胞と，ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞との混合培養におけるＣＣＬ８の発現を示す。 図６は，ＣＣＬ８の発現の用量応答性を示す。 図７は，同種抗原認識におけるＩＦＮγの発現を示す。 図８は，インビボ同種移植実験の結果を示す。 図９は，同種抗原認識におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化およびＣＣＬ８発現を示す。
　本発明は，被験者の血液などの被検試料におけるＣＣＬ８の発現量を測定することにより，同種抗原認識を検出して，宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）を診断し，経過をモニタリングする方法を特徴とする。下記の実施例に具体的に示されるように，同種アロ抗原認識によってＣＣＬ８が発現することが明らかとなった。すなわち，ＣＣＬ８は同種抗原認識のバイオマーカーとして有用であることが明らかとなった。
　ＣＣＬ８とは，ケモカイン・ファミリーに属する塩基性ヘパリン結合性分泌蛋白質であり，ＭＣＰ－２とも称される（GenBank　Accession　No.　NP＿005614)。この蛋白質は，単球，線維芽細胞，上皮細胞などで産生され，レセプターとして，ＣＣＲ２，ＣＣＲ３，ＣＣＲ５およびＣＣＲ１１に結合することが知られている。ＣＣＬ８は，ＣＤ４陽性Ｔ細胞，ＣＤ８陽性Ｔ細胞，単球，ＮＫ細胞，好酸球，好塩基球などを標的細胞とすることが明らかにされている。しかしながら，生体内におけるＣＣＬ８の役割や免疫系の調節におけるその意義は十分に解明されていない。
　本発明者らは先に，ＣＣＬ８を指標として造血幹細胞移植により生ずる移植片対宿主疾患の発症および経過を診断することができることを見いだした（WO/2009/001545：特許文献１）。しかし，このＣＣＬ８の発現と移植片対宿主疾患との相関のメカニズムは不明であった。また，骨髄移植における拒絶反応（移植片対宿主疾患；ＧＶＨＤ）と，臓器移植における拒絶反応（宿主対移植片疾患；ＨＶＧＤ）とは，免疫学的には大きく異なることが知られているが，その免疫反応の詳細は明らかになっていない。本発明にしたがって，ＣＣＬ８を同種抗原認識のバイオマーカーとして利用することにより，今後これらの免疫反応のメカニズムに関する研究が進むことが期待される。
　ＣＣＬ８蛋白質の量を測定すべき被検試料としては，被験者または被検動物から得た体液，血液，血清，血漿などを用いることができる。また，被験者から採取された組織や細胞を用いてもよい。
　被験者から得た試料におけるＣＣＬ８蛋白質の量は，抗ＣＣＬ８抗体を用いて，当該技術分野においてよく知られる免疫学的測定法を用いて測定することができる。抗ＣＣＬ８抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。各種の抗ＣＣＬ８ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が市販されており，それらのいずれの抗体も本発明において用いることができる。
　あるいは，抗体は当該技術分野においてよく知られる方法により作成してもよい。ＣＣＬ８に結合するポリクローナル抗体は，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し，ＥＬＩＳＡアッセイ，ウエスタンブロット分析，またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて，所望の特異性を有する抗体の存在を確認することにより得ることができる。
　ＣＣＬ８に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，ＣＣＬ８またはそのペプチド断片を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマを選択してクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
　このようにして得られた抗体を用いて，免疫学的方法により，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質を測定する。測定は，定性的であっても定量的であってもよい。被験者から得たＣＣＬ８の発現の免疫学的測定は，例えば，ラジオイムノアッセイ，ＥＬＩＳＡ，免疫沈降法，免疫凝集法，ウエスタンブロット等を用いて行うことができる。
　例えば，典型的な例として，以下のようにしてサンドイッチＥＬＩＳＡを行うことができる。被験者の末梢血を採血して血漿を調製し，これを抗ＣＣＬ８抗体を固定化したプレートまたはチップに加え，適当な時間インキュベートする。プレートまたはチップを洗浄して未結合成分を除去した後，別の抗ＣＣＬ８抗体を加える。この抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。適当な時間インキュベートした後，プレートまたはチップを洗浄し，蛍光，発光，放射活性等を測定することにより，標識を検出する。あるいは，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた後，二次抗体（例えばヤギ抗マウス抗体）を加えてシグナルを増強してもよい。二次抗体は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等により検出可能なように標識することができる。このようにして，被験者から得た血漿におけるＣＣＬ８蛋白質の量を測定することができる。
　別の態様においては，凝集反応を利用した検出方法を用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。この方法においては，抗ＣＣＬ８抗体を結合させた担体，例えばラテックス粒子を用いてＣＣＬ８を検出することができる。抗ＣＣＬ８抗体を結合させたラテックス粒子を試料と混合して一定時間インキュベートすると，試料中にＣＣＬ８が含まれる場合には粒子が凝集する。この凝集の程度を肉眼で観察するか，または分光光度計を用いて定量することにより，試料中のＣＣＬ８を検出することができる。
　別の態様においては，表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いてＣＣＬ８蛋白質を検出することができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは，蛋白質－蛋白質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてモニターすることが可能である。例えば，ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることにより，ＣＣＬ８蛋白質と抗ＣＣＬ８抗体の結合を検出することができる。具体的には，抗ＣＣＬ８抗体を固定化したセンサーチップに，被検試料を接触させ，抗ＣＣＬ８抗体に結合するＣＣＬ８蛋白質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
　あるいは，ＣＣＬ８蛋白質は，被検試料を金属キレート剤やヘパリン等のアフィニティー担体を用いて粗精製（濃縮）した後に，ＭＳにより検出および定量してもよい。また，HPLCにより検出および定量してもよく，２次元電気泳動をした後に銀染色により検出および定量してもよい。
　本発明はまた，抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患検査薬を提供する。本発明の宿主対移植片疾患検査薬は，検査キットの形で提供することができる。検査キットは，ＣＣＬ８の検出のための試薬，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を有効成分として含む。また，このキットは，測定に必要な適当な試薬類，例えば緩衝液，希釈液，反応停止液，洗浄液，コントロール標品などをさらに含んでいてもよい。
　本発明においては，このようにして測定されたＣＣＬ８蛋白質の量を指標として，宿主対移植片疾患の検査を行うことができる。本発明の方法にしたがえば，臨床症状の観察ではなく，ＣＣＬ８蛋白質をマーカーとして，宿主対移植片疾患を客観的に診断することができ，宿主対移植片疾患の発症および経過をモニタリングすることができる。本発明の検査方法は，例えば，宿主対移植片疾患の発症前の診断（早期診断），発症の確定診断，重篤度の判定，疾患の経過のモニタリング，治療効果の判定，および予後の予測に有用である。
　宿主対移植片疾患を診断する本発明の方法は，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を健常な対照の測定値と比較することにより実施することができ，ここで，得られた測定値が対照の測定値より高いことは宿主対移植片疾患に罹患していることを示す。健常な対照とは，宿主対移植片疾患に罹患していないことが示されているヒトまたは動物をいう。健常な対照の測定値は，複数の対照の測定値の平均であってもよい。被験者または被検動物から得られる測定値は，一般に，健常な対照の測定値より約１０％高く，好ましくは約２０％高く，より好ましくは約３０％高く，さらに好ましくは約４０％以上高い。
　宿主対移植片疾患の経過をモニタリングする本発明の方法は，被験者または被検動物から複数の時点で得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することにより実施することができる。得られた測定値が時間の経過とともに上昇していることは疾患の進行を示し，低下していることは疾患の改善を示す。この方法は，治療の効果の判定にも有用である。
　さらに，本発明にしたがって，ＣＣＬ８の発現量を指標として，宿主対移植片疾患の治療薬の有力な候補物質をスクリーニングすることが可能である。スクリーニングは，宿主対移植片疾患のモデル動物，例えば同種臓器移植を受けた動物に試験物質を投与し，モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することにより行う。試験物質としては，例えば，抗ＣＣＬ８抗体を用いることができる。あるいは，試験物質は，種々の合成又は天然の化合物ライブラリー，コンビナトリアルライブラリー，オリゴヌクレオチドライブラリー，ペプチドライブラリー等のライブラリーから取得してもよい。また，細菌，真菌類，藻類，植物，動物等の天然物からの抽出物やその部分精製物を試験物質として用いてもよい。試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合には，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択することができる。すなわち，本発明の検査方法は，宿主対移植片疾患の新規治療法開発におけるプラットフォームを提供するものである。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現
　ＭＨＣの異なるマウスの組み合わせ（Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＢａｌｂ／ｃマウス）を用いて，Ｃ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞とＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とを生体外混合培養した。樹状細胞は，Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞から磁気ビーズを用いて分離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として，１ｘ１０５個の樹状細胞を９６ウエルの培養プレートに播種し，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞１ｘ１０６個とともに混合培養した。培養開始後１，２，３，４，５日目の上清のＣＣＬ８濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。その結果，培養開始後３～４日目には培養上清中にＣＣＬ８蛋白質が発現していることが確認された（図１）。対照として同系（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）の細胞を用いた場合にはＣＣＬ８の発現は検出されなかった。
同種抗原認識における各種サイトカインの発現
　同種抗原認識状態におけるＣＣＬ８発現機構を解析するために，Ｂａｌｂ／ｃマウスの抗原提示細胞として樹状細胞を１ｘ１０５個と，種々の個数のＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓有核細胞とを丸底９６穴プレートで，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ），２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン，１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μ／ｍＬのストレプトマイシンとを補充したＲＰＭＩ１６４０中，３７℃，５％ＣＯ２下で混合培養した。培養開始後６時間で細胞からｍＲＮＡを抽出し，リアルタイムＰＣＲ法にて各種サイトカインの発現を定量した。結果を図２に示す。図２のグラフでは，ＧＡＰＤＨに対して標準化した値を，同系抗原における発現のレベルを１とした相対値で表されている。ＩＬ－２，ＴＮＦ－α，およびＩＦＮγがＣＣＬ８に先立って発現することが見いだされた。
　次に，これらのサイトカインに対する中和抗体の存在下で，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞とＣ５７ＢＬ／６マウス脾臓細胞を４日間混合培養し，培養上清におけるＣＣＬ８の濃度を定量した。抗ＩＬ－２抗体および抗ＩＦＮγ抗体の添加によりＣＣＬ８発現は低下し，抗ＴＮＦα抗体でもＣＣＬ８発現の減少が見られた（図３）。このことから，同種抗原認識におけるＣＣＬ８の発現には，ＭＨＣクラスＩＩ，ＩＮＦγ，ＩＬ２，およびＴＮＦαが関与していることがわかる。
ＣＣＬ８産生に関与する細胞の同定
　ＣＣＬ８産生に関与する細胞を明らかにする目的で，Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を磁気ビーズ法を用いて選別し，ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）を単離して，Ｂａｌｂ／ｃマウス樹状細胞と混合培養した。その結果，ＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いたときに，脾細胞全体を用いた場合と同様のＣＣＬ８発現が見られた（図４）。またＣＤ４陽性Ｔ細胞にマクロファージを等量混合した場合では，ＣＣＬ８発現は２倍以上の高値を認めた。これらの結果より，抗原提示細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞の間で同種抗原認識が成立するとＣＣＬ８が発現し，更にマクロファージの存在下ではＣＣＬ８の発現が増強することが明らかになった。このことから，ＣＣＬ８はＴ細胞の同種抗原認識により初期発現し，同種抗原認識したＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されたＩＦＮγによりＣＤ１１ｂ＋細胞からの発現誘導が起こることがわかる。
　次に，ＣＣＬ８産生のメカニズムを調べるために，細胞を同系または同種で混合して培養したときのＣＣＬ８濃度を測定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓から樹状細胞を単離した。Ｂ６脾臓細胞はＡｕｔｏ　ＭＡＣＳ　ｓｙｓｔｅｍを用いて単離した。１ｘ１０５個のＢａｌｂ／ｃの樹状細胞を，１ｘ１０６個のＢ６マウス脾臓由来の，全脾臓細胞，ＣＤ４＋Ｔ細胞，ＣＤ８＋Ｔ細胞または対照としてＢａｌｂ／ｃ（同系）マウスの脾臓細胞とともに４日間培養し，培養上清中のＣＣＬ８を定量した。
　図５に示されるように，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞とＢ６　ＣＤ４＋Ｔ細胞との混合培養において明らかなＣＣＬ８の発現が見られ，ＣＣＬ８の濃度はＢ６　ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＢａｌｂ／ｃ脾臓細胞（同系）との混合培養の場合より有意に高かった（白色バー）。一方，混合培養開始時に抗マウスＭＨＣクラスＩＩ抗体を添加すると，ＣＣＬ８の発現レベルは顕著に低下し，この効果は，Ｂａｌｂ／ｃ樹状細胞およびＢ６　ＣＤ４＋Ｔ細胞において有意であった（黒色バー）。このことから，ＣＣＬ８の誘導はＣＤ４＋Ｔ細胞によるクラスＩＩ認識を介していることがわかる。
　さらに，上記と同じ系で，脾臓細胞／ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を変えて実験したところ，ＣＣＬ８の発現は用量応答性を示し，ＣＣＬ８の誘導が生物学的な反応であることが確認された（図６）。
ＩＦＮγの発現の分析
　培養プレートでＢａｌｂ／ｃ由来樹状細胞（ＤＣ）とＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を混合培養し，継時的に培養上清のＩＦＮγ値を測定した。結果を図７に示す。ＩＦＮγのレベルは第２日より上昇したが，第５日には，同種抗原認識反応が続いているにも関わらず低下していた。このことは，ＩＦＮγの発現レベルは同種抗原認識の指標としては不適当であることを示す。
インビボ同種移植実験
　４グレイの放射線を照射した拒絶モデルマウスの背部皮下に，同種脾臓由来Ｂ６　ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植し，血中ＣＣＬ８濃度を測定した（図８）。白バーは０．１ｘ１０７個のＢ６　ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植したときの，黒バーは１．０ｘ１０７個を移植したときの，５日および７日後の平均ＣＣＬ８濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。＊および＊＊は，それぞれｐ値＜０．０５および＜０．０１を示す（ｎ＝４）。血漿ＣＣＬ８濃度は１．０ｘ１０７個の同種ＣＤ４＋Ｔ細胞を移植した群において，０．１ｘ１０７個の群より有意に高かった。移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞の数とＣＣＬ８産生との間に明らかな用量依存性がみられた。一方，血漿ＣＣＬ８濃度は第５日に上昇したが，移植されたＣＤ４＋Ｔ細胞数が拒絶反応によって減少する第７日までに急速に低下した。これらの結果は，血漿ＣＣＬ８濃度が同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を忠実に反映していることを示す。
ＴＣＲの関与の解析
　ＣＤ４＋Ｔ細胞はＢ６マウスの脾臓から単離し，同種樹状細胞はＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離した。１ｘ１０６個のＢ６　ＣＤ４＋Ｔ細胞を，培養プレートで，バッファー（対照），抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体，またはＢａｌｂ／ｃマウス樹状細胞の存在下で培養した。上清中のＣＣＬ８濃度を測定したところ，同種樹状細胞刺激についてのみＣＣＬ８の産生が認められた（図９Ａ）。これらの結果は，ＣＤ３εおよびＣＤ２８のＣＤ４＋Ｔ細胞へのクロスリンクがインビトロでＣＣＬ８の発現を誘導しなかったことを示す。また，抗ＣＤ３ε抗体および抗ＣＤ２８抗体または同種樹状細胞で刺激したＣＤ４＋Ｔ細胞において細胞増殖とＩＦＮ－γの分泌が認められた（図９Ｂ）。白色バーはミトコンドリア活性を反映する色素を用いて測定した細胞増殖（グラフ左数値）を，灰色バーはＩＦＮ－γの分泌量を表す（グラフ右数値）。同種抗原提示でもＴＣＲのクロスリンクでも，いずれもＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が生じていることがわかる。
　以上の結果より，同種抗原認識の分子マーカーとしてのＣＣＬ８の発現機序は，
１．　抗原提示細胞によるＭＨＣクラスＩＩを介した，ＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する抗原提示ないしは活性化刺激；および
２．　同種抗原認識後のＴ細胞活性化に伴うＩＬ－２，ＩＦＮ－γの発現；
の両方が関与していると考えられる。
　本発明は，宿主対移植片疾患の診断および経過のモニタリング，ならびに治療に有用である。

Claims (7)

  1. 宿主対移植片疾患を検査するための方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を宿主対移植片疾患の診断または経過の指標とすることを特徴とする方法。
  2. ＣＣＬ８蛋白質の量が抗ＣＣＬ８抗体を用いて測定される，請求項１に記載の方法。
  3. ＣＣＬ８蛋白質の量が，質量分析計，高速液体クロマトグラフィーおよび２次元電気泳動からなる群より選択される方法を用いて測定される，請求項１または２に記載の方法。
  4. 抗ＣＣＬ８抗体を含む宿主対移植片疾患の検査薬。
  5. 宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質を選択する方法であって，
    宿主対移植片疾患のモデル動物に試験物質を投与し，
    前記モデル動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，そして，
    試験物質を投与したときに投与していないときと比較してＣＣＬ８蛋白質の量が低い場合に，その試験物質を宿主対移植片疾患の治療薬の候補物質として選択する，
    の各工程を含む方法。
  6. 宿主対移植片疾患を診断する方法であって，被験者または被検動物から得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定し，得られた測定値を健常な対照の測定値と比較することを含み，ここで，得られた測定値が対照の測定値より高いことは宿主対移植片疾患に罹患していることを示すことを特徴とする方法。
  7. 宿主対移植片疾患の経過をモニタリングする方法であって，被験者または被検動物から複数の時点で得た試料中のＣＣＬ８蛋白質の量を測定することを含み，ここで，得られた測定値が上昇していることは疾患の進行を示し，低下していることは疾患の改善を示すことを特徴とする方法。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004517078A (ja) * 2000-12-01 2004-06-10 シェーリング　コーポレイション 哺乳動物遺伝子および関連試薬の使用
JP2008525110A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 バイオサイト インコーポレイテッド 全身性炎症反応症候群において治療計画を決定するための方法および組成物
WO2008114037A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Isis Innovation Limited Treatment of inflammation and/or endotoxic shock
WO2009001545A1 (ja) * 2007-06-22 2008-12-31 Sapporo Medical University 移植片対宿主疾患の検査および治療方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004517078A (ja) * 2000-12-01 2004-06-10 シェーリング　コーポレイション 哺乳動物遺伝子および関連試薬の使用
JP2008525110A (ja) * 2004-12-23 2008-07-17 バイオサイト インコーポレイテッド 全身性炎症反応症候群において治療計画を決定するための方法および組成物
WO2008114037A1 (en) * 2007-03-22 2008-09-25 Isis Innovation Limited Treatment of inflammation and/or endotoxic shock
WO2009001545A1 (ja) * 2007-06-22 2008-12-31 Sapporo Medical University 移植片対宿主疾患の検査および治療方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABDI R. ET AL: "Differential role of CCR2 in islet and heart allograft rejection: tissue specificity of chemokine/chemokine receptor function in vivo", J IMMUNOL., vol. 172, no. 2, 15 January 2004 (2004-01-15), pages 767 - 775, XP008128051 *
OTA A. ET AL: "Upregulation of plasma CCL8 in mouse model of graft-vs-host disease", EXP. HEMATOL., vol. 37, no. 4, April 2009 (2009-04-01), pages 525 - 531, XP026064032, DOI: doi:10.1016/j.exphem.2008.12.006 *

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