CN114689837A - 与毛细血管内皮细胞的移植相关抗原致敏状态有关的培养物、其用途及包含其的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与毛细血管内皮细胞的移植相关抗原致敏状态有关的培养物，涉及所述培养物的用途，还涉及包含所述培养物的检测试剂盒。

Description

与毛细血管内皮细胞的移植相关抗原致敏状态有关的培养 物、其用途及包含其的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中与毛细血管内皮细胞的移植相关抗原致敏状态有关的培养物，涉及所述培养物的用途，还涉及包含所述培养物的检测试剂盒。
背景技术
中国是继美国后世界器官移植第二大国。除了同卵双生个体外，所有同种异体的器官移植均发生排异，其中慢性排斥反应是导致移植后器官功能丧失最重要的途径。虽然器官移植后使用大剂量免疫抑制剂可避免急性排异反应，但是还没有方法解决慢性排异反应。一个有欧洲八个国家参与的研究结果揭示了1989-2014年期间使用免疫抑制剂对器官移植后功能丧失率的影响。他们指出使用高效免疫抑制剂仅仅可使在0-1年内移植后功能丧失率从16.8％下降至 4.6％；而1-3年，3-5年和5-10年内的功能丧失的变化均维持在3.7％ -4.2％范围内(Legendre C.等Transplantation，102(9S1)：S1-S4， 2018DOI：10.1097/TP.00000002316)。因此使用免疫抑制剂期待改进长期生存率已经接近或者达到了瓶颈。
近十几年了，如何使用生物技术早期实验室诊断排异反应是当代移植科学的核心问题之一。自上世纪90年代以来，依赖补体的细胞毒/细胞自溶一直是移植免疫学病理诊断的核心，也是目前医院内移植手术前/后诊断是否触发和存在器官排斥反应的主要手段。然而，随着人们对器官移植排斥反应机理的不断提高，我们认识到上述检测只针对短期急性排斥反应，慢性排斥反应是非补体依赖的细胞毒/细胞激活的过程。特别是，检测依赖补体的细胞毒/细胞自溶使用的是外周血淋巴细胞，而免疫排异反应发生却在毛细血管组织内。更为重要的是病人进行器官移植以后新合成的特异性抗供者的抗体，英文缩写为DSA，则倾向于非补体依赖的细胞毒/细胞激活。因此，现在医院内使用的诊断方法不能全面准确地评估器官移植病人-是否-何时出现致病性的排斥反应。其中重要一条是诊断方法不当。我们还没有建立适用测量慢性器官排斥反应方法，因为慢性排斥反应与急性反应的机理截然不同。
令人惊喜的是，移植学的基础研究为我们实验室技术的研发提供了许多宝贵的理论和数据。首先，许多研究人员认识到我们过去几十年的移植物抗原集中在与HLA相关的排异抗体以及它们对补体的激活，但是，众多临床证据说明即使在HLA相同的亲属之间移植亦可以发生免疫排斥，非HLA移植相关抗原也是与免疫排异密切相关的(Jackson AM等，J AmSoc Nephrol，26：1161，2015，DOI： 10.1681/ASN.2013121277)。大量的移植病人即使在无HLA抗体的情况下依然排异移植的器官(Butler CL等Am J Transplantation 2020, 20:2768DOI:10.1111/ajt.15863；Filippone EJ等，Transplantation， 105：181，2021)。其次，存在于毛细内皮细胞表面的移植相关抗原在介导慢性抗体排异过程中起着重要作用也备受各界的关注，因为它是接受器官移植个体与供体组织第一个接触点。迄今为止，G-蛋白偶联受体(GPCR)、I型血管紧张素受体(AT1R)、A型内皮素受体(ETAR)、波形蛋白(vimentin)、串珠素(perlecan)、微管蛋白 (
Figure BDA0003535314850000021
-tubulin)、蛋白激酶Cζ、主要组织相容复合体I类相关A链，都已公认为可以激发形成抗内皮细胞的抗体，但是更多的移植相关抗原仍然没有披露或者被发现(Delville M等，J Am Soc Nephrol 30:692 2019DOI:10.1681/ASN.2018080868)。第三，特别值得一提的是，当血管内皮细胞被抗移植物抗体活化后，它更是主动参与排异过程。它的早期病理基础是毛细血管炎；晚期是动脉内膜纤维化和间质纤维化。具有致病性的抗体不但要与血管内皮细胞表面的HLA和非 HLA抗原紧密结合，使细胞表面致敏，进而触发细胞内的信号传导通路，造成内皮细胞激活(Bian H和Reed EF，JImmunol 163(2):1010–1018 1999)。持续激活的内皮细胞一方面加速释放炎性因子，另一方面在细胞表面增加粘附蛋白。这些反应的综合结果是在毛细血管周围浸润大量炎性细胞和细胞增殖，进一步发展为血管阻塞，萎缩，直到组织坏死(Haas M，Am J Transplant 18(12):2849– 2856 2018doi:10.1111/ajt.15088)。
目前，生物科技公司CareDx(www.caredxinc.com)开发出了依据核酸分子杂交技术平台生产直接与器官移植相关的分子诊断技术。 CareDx产品的核心技术是使用基因表达芯片，在外周血淋巴细胞中测定与排异相关基因的表达程度以确定患者的免疫排异状态。
生物科技公司One Lambda则开发出了将一定数目的HLA分子片段，即不等氨基酸数目的合成肽，包被在微球表面作为靶点，即 Luminex单抗原微球(SAB)从而结合患者血清中的抗移植物的抗体的技术。因为目前的人工肽合成技术、标记技术、和HLA分子群的复杂性，其无法涵盖临床上异种移植的所有抗原。
正如Albrecht等人指出的：器官移植受者对供着产生的抗体受到亚型(subclass)、滴度(titer)、位点(epitope)和价数(valence) 等诸多因素的影响，这些因素对维系抗原-抗体结合反应分子的三维立体空间结构是必须的，因此人工合成的肽片段是否可以代表抗原分子依然是一个有激烈争议的课题。为此，美国于2017年提过FDA 机构认为使用人工包被抗原的方法对理解抗体介导的排异反应，以及其诊断，预后判断是医学上未确定的部分，特别是在临床应用上应保留谨慎的态度(Albrecht R等，Transplantation102：e257,2018)。虽然商品名为XM-ONE方法使用从外周血中分离的祖内皮细胞(endothelial progenitor cells)但是，其临床效果一直没有得到一致的认可(BreimerME等,Transplantation 87:549 2009,doi: 10.1097/TP.0b013e3181949d4e.)。由此可见，精准评估移植抗体的致病性依赖于抗移植物抗体与血管内皮细胞的相互作用是评估器官移植术后长期生存的重要指标(Dragun D等,Kidney International 90:280 2016DOI1:10.1016/jkint.2016.03.019)。所以当今诊断技术在临床使用上存在假阳性、假阴性率都很高的问题，难以指导临床医生对移植术后受者状态的准确判定，降低了移植受者的移植成功率、存活率等指标。
因此，在移植器官稀缺的现状下，目前急需能真实监测移植术后受者，指导术后治疗方案，从而提升移植成功率、存活率的检测试剂盒。
发明内容
鉴于上述当前技术背景，本发明深化检测内皮细胞表面分子 HLA和非HLA的独特优势，结合免疫组化途径，开辟它在测定器官移植后受体血清中抗供者抗体的新用途，开发出多项功能的试剂盒，旨在从实验室诊断角度提供早期发现慢性排异反应的新数据用于指导临床实践。
本发明一方面涉及一种检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒，其包含带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞，所述移植相关抗原的致敏由所述移植相关抗原与抗移植物抗体的结合反应导致；所述移植相关抗原包括所述毛细血管内皮细胞表面上的抗供体HLA分子和抗供体非HLA分子；在移植受者血清中存在所述抗移植物抗体时，能够检测到所述移植相关抗原的致敏。
在此种试剂盒中，所述毛细血管内皮细胞培养物来自器官移植供体或非供体组织，后者为依据供体HLA抗原分型要求而完全组合的混合培养物，所述HLA抗原分型是依据血清分型为标准。
在此种试剂盒中，对所述移植相关抗原的致敏的检测是通过显示在内皮细胞膜上的信号，所述信号为来自间接免疫组化染色或间接免疫荧光染色的信号。
此种试剂盒中包含抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体，标记分子选自如下组的任一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金-银溶液、异硫氰酸荧光素FITC、四乙基罗丹明Rhodamine和四甲基异硫氰酸TRIC。
在此种试剂盒中，确定所述毛细血管内皮细胞培养物中的内皮细胞标记已用细胞质内VWF标记。
本发明另一方面涉及一种检测/监测接受器官移植受者体内抗移植物抗体的存在和/或滴度的试剂盒，其包含前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及前述试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
本发明还有一方面涉及一种预测/监测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒，其包含前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及前述试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
上述这两种试剂盒还包含：膜内/膜共染色介质、清洗介质、细胞板固定介质、促细胞生长温育介质、温育封闭介质、以及所述标记显色所需的底物，可选包含阳性血清、阴性血清、清洗介质及温育稀释介质。
本发明另一方面还涉及前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物在制备用于检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒、检测/监测接受器官移植受者体内的使毛细血管内皮细胞表面的移植相关抗原致敏的抗体存在和/或滴度的试剂盒、以及监测/预测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒中的用途。
本发明的核心技术使用供体组织或者使用HLA确定的毛细血管培养物，它们的细胞表面包含有全部的天然抗原，因此，可准确、特异地鉴定那些使细胞致敏的抗体，从而深化它们在诊断慢性排异的重要性。
本发明在试验设计上使用供者或者与供者相同HLA分型的组织细胞，同时又提供抗移植物抗体与毛细血管内皮细胞的致敏作用，因此，它为临床医师监视接受器官移植病人的移植物体长期内生存状况提供了一个窗口。临床医师可在不需进行活检材料情况下既可获得最直接最有力的病理诊断结果，预测移植物内是否发生毛细血管内膜炎。众所周知，早期的排斥反应是可逆反应，可以治疗的。在通常情况下，医生会在手术后一周、一个月、三个月、六个月、一年内在病人以内取活检，观察病情变化。这不仅是费用问题，活检也是创伤性，多次长期活检不是临床实践的首选。更重要的是–当病人病理活检出现异常时通常预示是不可逆病变。因此，我们迫切需要建立非创伤性的分子诊断技术可以更早期发现排异反应。
本发明实现了下述效果，包括但不限于：
One Lambda公司单抗原微球技术检测群体反应抗体，所以只依据制造厂商规定的抗原检测出与合成肽片段反应的抗体，是一种纯化学法抗体检测法。本申请的试剂盒的机制与此不同，可以依据是否存在细胞致敏而迅速检测出接受异种器官个体是否产生了针对异体移植物的任何抗移植物抗体，是一种生物法抗体检测法。
由于使用供者组织或者依据个体化组织分型而制定的内皮细胞培养物，其细胞膜表面上提供了处于自然三级结构的供者抗原或根据HLA类型从配型库中获得的HLA同型抗原的所有识别区域，所以较人工交联在微球上的合成肽片段而言，覆盖了更全面的HLA相关抗原识别区域，所以可以通过毛细血管内皮细胞的致敏状态检测，检测出更接近实际体内情况的抗体形成情况。此试验检测是灵敏、特异、和高效的方法。本发明具有临床指导意义。
本发明用血清检测，取血清技术成熟，可在异地操作，通过快捷邮递方便患者，从而使更大范围的患者在异地进行定期检测。
本发明使用供体或者与供体HLA分型相同的毛细血管内皮细胞为检测对象，不同与使用淋巴细胞的交叉配型试验，主要用于器官移植术后慢性排异反应的长期监测。
附图说明
附图仅说明了一些实施方式，因此不应视为对范围的限制。
图1表征是用于测试细胞抗体致敏的体外毛细血管培养物形态学特征的镜下照片。
图2A.使用间接荧光(FITC标记的二抗)测试由抗体所致敏的阳性反应试验结果：细胞膜表面存在抗内皮细胞的致敏抗体(呈现绿色)；细胞质内含有内皮细胞特异的VWF分子(呈现红色荧光)。
图2B.使用间接荧光(FITC标记的二抗)测试未由抗体所致敏的阴性反应试验结果：仅有细胞质内含有内皮细胞特异的VWF分子(呈现红色荧光)。
图3A.使用辣根过氧化物酶/DBA染色系统测试抗体致敏的阳性反应结果：细胞表面存在抗微血管培养物的致敏抗体(呈深棕色，细胞核为深蓝色)。
图3B.使用辣根过氧化物酶/DBA染色系统测试抗体致敏的阴性反应结果：细胞表面无抗微血管培养物只呈现细胞核着色(呈深蓝色)。
具体实施方式
以下通过试剂盒的具体操作步骤，结合数据和图表使技术领域的人员对本发明的实施详细介绍。其保护范围包括但不限于权利要求所要求保护的内容，所用试剂和步骤也可相应进行本领域技术人员能理解的修改及调整。
定义
本文所述的“慢性抗体介导的排异”是指器官移植一年后，在没有急性排异和药物中毒等明确因素作用存在下，其功能逐步丧失的病理过程。
本文所述的“抗HLA抗体”是指机体由于输血、妊娠，或者器官移植暴露非自身HLA谱而合成的针对异体HLA分子的抗体。其中包括尤其是从移植后新合成的(de novo)与慢性移植相关的抗体，类型基本上是IgG。
本文所述的“抗非-HLA抗体”是指机体由于输血、妊娠，或者器官移植暴露非自身非HLA抗原而合成的针对除异体HLA分子以外其它分子的抗体。
本文所述的“毛细血管内皮细胞交叉配型”是指使用由供体组织分离并扩增的体外培养的毛细血管内皮细胞与受者的血清抗体共同温育以检测是否发生免疫学反应的试验。
本文所述的“免疫组化和免疫荧光”是指通过在抗体分子上标记反应性酶分子或者发荧光分子指示是否存在预期的抗原-抗体的免疫反应，所述反应性酶分子或者发荧光分子选自如下组的任一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金-银溶液、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine)和四甲基异硫氰酸(TRIC)。
本文所述的“毛细血管细胞致敏”是指毛细血管细胞表面的抗原分子被相应抗体分子结合。
本文所述的“移植相关抗原”是指同种异体之间涉及自我识别而参与排异反应的生物分子。
本文所述的“抗移植物抗体或DSA”，包括但是不限于“抗-人HLA 抗体”，由于历史的原因，HLA分子被认为是主要组织相容分子的核心部分，它们是跨白细胞膜的蛋白质分子，是免疫系统识别异体组织的首要组成部分。但是，随着科学研究的不断发展，非白细胞表面的组织细胞也存在可介导次级排异反应的抗原，从而激发机体产生相应的抗体。与HLA不同的是，许多非HLA的抗原缺乏具体明确的分子特征。因此，抗移植物抗体包含了针对HLA和非HLA两类分子而产生的抗体。
本文所述的“检测”、“监测”可互换使用，针对现状，“预测”则针对现状和未来状况。
具体地，本发明一方面涉及一种检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒，其包含带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞，所述移植相关抗原的致敏由所述移植相关抗原与抗移植物抗体的结合反应导致；所述移植相关抗原包括所述毛细血管内皮细胞表面上的抗供体HLA分子和抗供体非HLA分子；在移植受者血清中存在所述抗移植物抗体时，能够检测到所述移植相关抗原的致敏。
在此种试剂盒中，所述毛细血管内皮细胞培养物来自器官移植供体或非供体组织，后者为依据供体HLA抗原分型要求而完全组合的混合培养物，所述HLA抗原分型是依据血清分型为标准。
在此种试剂盒中，对所述移植相关抗原的致敏的检测是通过显示在内皮细胞膜上的信号，所述信号为来自间接免疫组化染色或间接免疫荧光染色的信号。
此种试剂盒中包含抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体，标记分子选自如下组的任一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金-银溶液、异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(Rhodamine) 和四甲基异硫氰酸(TRIC)。
在此种试剂盒中，所述毛细血管内皮细胞培养物中的内皮细胞已用细胞质内VWF标记。
具体地，本发明的另一方面涉及一种检测/监测接受器官移植受者体内抗移植物抗体的存在和/或滴度的试剂盒，其包含前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及前述试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
具体地，本发明还有一方面涉及一种监测/预测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒，其包含前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及前述试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
上述的这两种试剂盒还包含：膜内/膜共染色介质、清洗介质、细胞板固定介质、促细胞生长温育介质、温育封闭介质、以及所述标记显色所需的底物，可选包含阳性血清、阴性血清、清洗介质及温育稀释介质。
具体地，本发明的另一方面还涉及前述试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物在制备用于检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒、检测/监测接受器官移植受者体内的使毛细血管内皮细胞表面的移植相关抗原致敏的抗体存在和/或滴度的试剂盒、以及监测/检测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒中的用途。
本发明的用于检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒、检测/监测接受器官移植受者体内的使毛细血管内皮细胞表面的移植相关抗原致敏的抗体存在和/或滴度的试剂盒采用的原理为细胞学方法，具体表征为使用器官移植供体或者使用已知组织相容抗原分型的体外培养毛细血管培养物(附图1)作为移植相关抗原的靶点，测定在接受器官移植后患者的血清中是否存在抗移植相关抗原的抗体(附图2)。本发明所述的检测试剂盒可以同时测定毛细血管内皮细胞表面人类白细胞相关抗原(HLA)和/或非HLA 的致敏状态(附图3)。
具体的，所述血管内皮细胞培养物均具高度选择性和有确定 HLA抗原谱。所述血管内皮细胞为高度选择性是指，它们来自(1) 供体组织；(2)种植的细胞HLA分型是由医师依据供者的HLA抗原的类型而由实验室人员为受检者而设计、特殊制定的。具体的，当医师申请使用此诊断试剂的同时，亦提交已植入病人体内供者器官的人类白细胞组织相容抗原的分型即HLA－A，HLA－B，HLA－C， HLA－DR，HLA－DQ，HLA－DP。依据此抗原分型谱在细胞库内提取、复苏、种植表达这些抗原的细胞于96-孔细胞培养微孔板的底部，种植数量为3000-4000活细胞/孔。因此，毛细血管内皮细胞培养物固有地表达非HLA和/或与内皮细胞相关的移植相关抗原，含有检测抗HLA和抗非-HLA抗体的抗原决定簇。
试剂盒的具体操作流程包括：将含有抗HLA和抗非-HLA抗体的患者血清加入毛细血管培养物，在确定条件下温育后，抗原与相应的抗体结合后，经过洗脱步骤，然后加入标记的抗人抗体(二抗)。如果显色或者有荧光反应(阳性)，显示患者血清内抗HLA和抗非 -HLA抗体的存在；如果患者血清内不存在抗HLA和抗非-HLA抗体，则无显色或者有荧光反应(阴性)。
在具体的实施方案中，所述标记的抗人抗体(二抗)包括但是不限于：辣根过氧化物酶标记的抗人Ig G抗体，碱性磷酸酶标记的抗人Ig G抗体，亦可为加入胶体金-银溶液标记的抗人Ig G抗体，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人Ig G抗体，四乙基罗达明(Rhodamine) 标记的抗人Ig G抗体，和四甲基异硫氰酸(TRIC)标记的抗人Ig G 抗体。
在具体的实施方案中，显色或者有荧光反应(阳性)的细胞定位为细胞膜。
在具体的实施方案中，显色反应底物为但是不限于：3,3’-二氨基联苯胺(DAB)和其衍生物，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)与5-溴-4- 氯-3-吲哚基磷酸酯甲苯胺盐(BCIP)溶液。
在具体的实施方案中，所述试剂盒包括阳性对照血清，阴性对照血清，空白试剂，共染色介质，封闭缓冲液，温育介质1，温育介质2。
其中所述的空白试剂，封闭缓冲液，温育介质1，温育介质2，温育介质3溶液的组分和例举的浓度如下：
1.空白试剂：内含1％白蛋白(重量/体积)磷酸盐缓冲液
2.共染色介质：内含1：1000稀释的抗人VWF分子抗体
3.封闭缓冲液：10％(体积/体积)羊血清磷酸盐缓冲液
4.温育介质1：100U/mL肿瘤坏死因子(TNF-
Figure BDA0003535314850000111
)磷酸盐缓冲液
5.温育介质2：0.1％吐温-20磷酸盐缓冲液
6.温育介质3：氯化硝基四氮唑蓝(NBT)与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯甲苯胺盐(BCIP)溶液。
实施例
制备例：制备毛细血管内皮细胞培养物:
1.分离：使用0.1％胶原酶将毛细血管内皮细胞从脂肪组织中分离出来；
2.培养物的预处理：在使用细胞培养物前，将移除细胞生长液，加入温育介质1，在37℃、5％CO2湿润条件下温育18-24小时；
3.在温育结束后，使用清洗介质1冲洗细胞，重复三次；
4.在细胞孔内加入固定介质，室温下30分钟，或者4℃下18-20 小时；
5.固定结束后，使用清洗介质1冲洗细胞，重复三次；
6.室温下加入温育介质3，以封闭固定后细胞，静置1-2小时；
7.室温下加入共染介质，静置1-2小时，结束后吸出所有液体；
8.使用清洗介质1冲洗细胞，重复三次。
实施例1：致敏状态试剂盒
(一)操作步骤
1.在封闭细胞板的同时，使用温育介质2以1：2和1：4的比例稀释患者血清；
2.将待测稀释血清分别加入毛细血管内皮细胞培养物的指定细胞孔位置；
3.温育：在37℃湿润条件下1小时，或者在4℃湿润条件下18-20 小时；
4.在完成患者血清抗体温育后，使用清洗介质2冲洗细胞，重复三次，每次至少5分钟；
5.加入1：10至1：100稀释的标记的二抗，在37℃湿润条件下温育1小时；
6.使用清洗介质2冲洗细胞，重复三次，每次至少5分钟；
7.加入相应的底物(仅在使用氧化物酶标记的抗人Ig G抗体，碱性磷酸酶标记的抗人Ig G抗体的时候才使用)，在显微镜下掌握染色的强度；
8.使用纯净水终止反应，使用苏木素或者DAPI复染细胞核；
9.使用树脂或者荧光保护液封片。
阳性对照和阴性对照
参照试剂盒操作步骤2-9对阳性对照和阴性对照进行同样操作。
(二)数据收集和结果分析
在普通光镜或者荧光显微镜下，主要观察细胞膜的底物或者荧光反应强度。底物反应强度以光密度程度判定，荧光反应强度以视野内阳性细胞占比判定，分为0-4五度，规定如下：
0度–与空白和阴性血清对照相比，无可察觉到的底物颜色改变，或者视野内荧光反应阳性细胞占比0-2％
1度–与空白和阴性血清对照相比，可见微弱、不连续的底物颜色改变，或者视野内荧光反应阳性细胞占比>2％且≤10％
2度–可见微弱、连续的底物颜色改变，或者视野内荧光反应阳性细胞占比>10％且≤25％
3度–可见较强、连续的底物颜色改变，或者视野内荧光反应阳性细胞占比>25％且≤50％
4度–可见强连续底物颜色改变，或者视野内荧光反应阳性细胞占比>50％且≤100％(与阳性对照反应强度一致)
记录底物强度或者荧光反应强度计算得出致敏结果，以阳性率 (％)计。
以上统计分析数据为：
1)在最少十个随机放大倍数400×的视野内，拍摄和保留数码记录50个细胞的染色结果。
2)在最少十个随机放大倍数1000×的视野内，拍摄和保留数码记录10个细胞的染色结果。
<结论>
我们使用此方法检测了13例肾脏移植后患者，检测了细胞板致敏结果阳性状态，用百分率表示。
并对移植后患者进行了生化检测判断其处于何种病程。临床上肾小球滤过率和肌酐水平为较常用指标，轻度排异组判断标准为肾小球滤过率在121-160ml/min，血肌酐水平在100-130μmol/L。严重排异组组判断标准为肾小球滤过率在160ml/min以上，肌酐水平在血肌酐水平在130μmol/L以上。
根据上述标准将这些患者分为早期排异组(患者为7例)，严重排异组(患者为6例)。
测试结果见表1
毛细血管内皮细胞致敏结果阳性率(％
早期排异组(n＝7) 6/7(86％)
严重排异组(n＝6) 5/6(83％)
结果是早期排异组的7名中的6名为阳性，严重排异组的6名中的5名为阳性。
对早期排异组检出阳性率具有重要临床意义，因为在这个阶段可以及时调整免疫抑制剂来进行使器官移植排斥可逆转的治疗。
虽然严重排异组结果并未达到100％，但是因为在移植后患者出现严重排异时，免疫机制并非完全是抗体介导的慢性移植免疫排斥，参与的抗体包括不仅是免疫球蛋白如IgG2和IgG4，还涉及细胞介导或者其他旁路免疫排斥，所以对于临床免疫病理机制的研究能提供进一步辅助指导。
实施例2：检测抗移植物抗体滴度的试剂盒
该试剂盒的制备参照上述制备例。
为测定抗移植物抗体的滴度，首先需将患者血清连续稀释1：2、 1：4、1：16、1：64、1：256五个不同浓度，分别加入毛细血管内皮细胞培养物指定细胞孔的位置，其余试剂盒操作步骤参见实施例1。
以出现阳性的最低滴度作为最终测得的抗移植物抗体滴度。
上述13名患者的抗体阳性滴度结果统计见下表2
Figure BDA0003535314850000141
实施例3：检测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒
对疑似患有器官移植后内膜动脉炎的患者经病理活检判断为阳性和阴性，同时进行毛细血管细胞致敏反应测定。肾脏移植受者判断是否出现移植免疫排斥的检测标准中包括对于内膜动脉炎的检测，以及肾小球炎、平滑肌炎、CD4+、T细胞浸润等。其中如果出现5项指标中的3项阳性，即可判断出现移植免疫排斥。
表3.检测检测器官移植受者体内内膜动脉炎的灵敏度和特异性
Figure BDA0003535314850000142
由上述试剂盒检测结果发现，此试剂盒可比较灵敏、特异地反映移植受者是否患有内膜动脉炎，而且因为仅需取体液即可检测，从而相比于病理活检这种会带来痛苦、依从性较差的移植排斥定期复查检测手段，未来临床上具有不可预见的替代意义。
虽然已经根据所示的实现方式提供了本公开，但是本领域普通技术人员将容易地认识到，可以存在对实施例的变型，并且这些变型将在本公开的范围内。因此，在不脱离所附权利要求的范围的情况下，本领域普通技术人员可以进行许多修改。

Claims (10)

1.一种检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒，其包含带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞，所述移植相关抗原的致敏由所述移植相关抗原与抗移植物抗体的结合反应导致；
所述移植相关抗原包括所述毛细血管内皮细胞表面上的抗供体HLA分子和抗供体非HLA分子；
在移植受者血清中存在所述抗移植物抗体时，能够检测到所述移植相关抗原的致敏。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述毛细血管内皮细胞培养物来自器官移植供体或非供体组织，后者为依据供体HLA抗原分型要求而完全组合的混合培养物，所述HLA抗原分型是依据血清分型为标准。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中对所述移植相关抗原的致敏的检测是通过显示在内皮细胞膜上的信号，所述信号为来自间接免疫组化染色或间接免疫荧光染色的信号。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体，标记分子选自如下组的任一种：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金-银溶液、异硫氰酸荧光素FITC、四乙基罗丹明Rhodamine和四甲基异硫氰酸TRIC。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述毛细血管内皮细胞培养物中的内皮细胞已用细胞质内VWF标记。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，还包含：膜内/膜共染色介质、清洗介质、细胞板固定介质、促细胞生长温育介质、温育封闭介质、以及所述标记显色所需的底物，可选包含阳性血清、阴性血清、清洗介质及温育稀释介质。
7.一种检测/监测接受器官移植受者体内抗移植物抗体的存在和/或滴度的试剂盒，其包含根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及根据权利要求5所述的试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
8.一种监测/预测器官移植受者移植物体内内膜动脉炎的试剂盒，其包含根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物，及根据权利要求5所述的试剂盒中包含的抗所述移植物抗体的标记的抗-人Ig G抗体。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，还包含：膜内/膜共染色介质、清洗介质、细胞板固定介质、促细胞生长温育介质、温育封闭介质、以及所述标记显色所需的底物，可选包含阳性血清、阴性血清、清洗介质及温育稀释介质。
10.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒中含有的带有所述移植相关抗原的毛细血管内皮细胞培养物在制备用于检测毛细血管内皮细胞培养物的移植相关抗原的致敏状态的试剂盒、检测/监测接受器官移植受者体内的使毛细血管内皮细胞表面的移植相关抗原致敏的抗体存在和/或滴度的试剂盒、以及监测/预测器官移植受者体内内膜动脉炎的试剂盒中的用途。
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