JPWO2018124005A1 - 被験物質の免疫原性を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価する方法:
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
[2]血液に由来する前記細胞集団が、末梢血単核球細胞(PBMC)に由来する細胞集団である、[1]の方法。
[3]前記血液がヒト由来である、[1]または[2]の方法。
[4]前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記T細胞の増殖が活発になる前である、[1]〜[3]のいずれかの方法。
[5]前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記培養開始後24時間〜72時間の間である、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6]前記被験物質がタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ワクチン、およびそれらのうち二つ以上のコンジュゲート、ならびにそれらのうち二つ以上の組み合わせを含む混合物からなる群より選択される、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]前記被験物質がタンパク質である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[8]前記被験物質が抗体である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の方法。
[9]前記IL-2分泌T細胞が占める割合の算出が、フローサイトメトリーで当該細胞数を測定することである、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより低い場合に前記被験物質の免疫原性が低いと決定する工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
[11]前記対照レベルが、免疫原性が低いことがわかっている物質の存在下で培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合(低免疫原性対照レベル)である、[10]の方法。
[12]工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に前記被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
[13]前記対照レベルが、免疫原性が高いことがわかっている物質の存在下で培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合(高免疫原性対照レベル)である、[12]の方法。
[14]前記対照レベルが、工程(a)の細胞集団を被験物質の非存在下で培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合(陰性対照レベル)である、[10]または[12]の方法。
[15]工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に前記被験物質を医薬品の候補物質として選択する工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
[16]工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に、ドナー(血液由来の細胞集団を得た対象)において前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
[17]工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い割合のIL-2分泌T細胞が検出されたドナーを陽性ドナーとし、同一試験中の総ドナー数における陽性ドナーの割合を免疫原性の評価指標とする工程をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
[18]被験物質の免疫原性を評価するための、IL-2分泌T細胞の使用。
[19]被験物質の免疫原性の評価において使用するためのIL-2分泌T細胞。
[20]IL-2分泌T細胞の割合を指標とする、免疫原性を評価する方法。
[21][1]〜[9]のいずれかの方法において免疫原性が低いと評価された被験物質を医薬品の候補物質として選択することを特徴とする、医薬品の候補物質をスクリーニングする方法。
[22]以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価するための、被験物質と共に培養された細胞集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞が占める割合を測定する方法:
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
[23]以下の工程を含む、免疫原性が低減された物質(改変体)を選択するための方法、または改変体の免疫原性が低減されているか評価する方法:
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を改変体または非改変体とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)改変体とともに培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、非改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が低減されていると判定する工程。
[24]以下の工程を含む、医薬品の候補物質をスクリーニングする方法:
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に医薬品の候補物質として選択する工程。
[25]以下の工程を含む、対象の被験物質による免疫療法に対する応答を予測する方法:
(a)対象から得られた血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に前記対象の前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程。
[26]IL-2検出試薬および免疫原性の高さがわかっている対照物質を含む、被験物質の免疫原性を評価するためのキット。
さらに、本発明によれば、被験物質の免疫原性の評価や医薬品候補物質のスクリーニングに要する1サイクルの時間を短縮し、試行錯誤をより多く行えることにより、被験物質の中から効率的かつ低コストで候補物質を選択する方法を提供することができる。
本発明との関連において、「T細胞の増殖が活発な時」は、例えば、抗原特異的なT細胞が抗原非依存的に増殖できる時期、あるいはT細胞が機能発現に向けて分化した時期と表現することもできる。
血液に由来する細胞集団からCD8+T細胞およびCD25+T細胞を除去する方法は当業者に公知であり、例えば、本明細書の実施例の項に記載されているように抗CD8抗体および抗CD25抗体を利用して実施することができる。一方、血液から予めCD8+T細胞およびCD25+T細胞が除去された細胞集団を本発明の方法に利用することもできる。あるいは、血液に由来する細胞集団であってCD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団に、CD4+CD25-T細胞を加えたものを利用することもできる。したがって、本発明の方法は、血液に由来する細胞集団からCD8+T細胞およびCD25+T細胞を除去する工程を含んでもよいし、血液に由来する、CD8+T細胞およびCD25+T細胞が除去された細胞集団を用意する工程を含んでもよいし、あるいはCD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団に、CD4+CD25-T細胞を加えたものを用意する工程を含んでもよい。
本発明において、免疫原性の評価指標とするIL-2分泌T細胞の割合は、好ましくはIL-2分泌初期のタイムポイントにおけるIL-2分泌T細胞の割合であり、より好ましくはT細胞の増殖が活発になる前(被験物質の存在下での培養開始後5日間未満)のIL-2分泌T細胞の割合であり、特に好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約24時間〜約72時間におけるIL-2分泌T細胞の割合であり、最も好ましくは被験物質の存在下での培養開始後約48時間〜約67時間におけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合である。
また、抗体断片とは、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;ダイアボディ;線状抗体;単鎖抗体分子(例えば、scFv);および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
本発明の別の態様において、他の免疫原性評価方法により免疫原性が高いことがわかっている物質(例えば、臨床試験における抗薬物抗体の発現率が高い薬物、あるいはCD4+T細胞増殖誘導能が高い物質)の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合を免疫原性の評価における対照レベルとすることができ、当該対照レベルは「高免疫原性対照レベル」と称することができる。その場合、被験物質の存在下で培養した細胞集団におけるIL-2分泌T細胞が占める割合が高免疫原性対照レベルと同等またはより高い場合に、当該被験物質の免疫原性は高いと評価することができ、また、前記割合が高免疫原性対照レベルと比較して低い場合に、当該被験物質の免疫原性は高くないと評価することができる。
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。
本発明はまた、被験物質の免疫原性を評価するためのIL-2分泌T細胞の使用、および被験物質の免疫原性の評価において使用するためのIL-2分泌T細胞にも関する。これらの発明において、IL-2分泌T細胞は、好ましくはIL-2分泌初期のタイムポイントにおけるIL-2分泌T細胞であり、より好ましくはT細胞の増殖が活発になる前のIL-2分泌T細胞であり、さらに好ましくは被験物質の存在下での培養開始後24時間〜72時間のIL-2分泌T細胞である。
本発明において、「抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団」とは、実質的に抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団ということもでき、あるいは免疫応答が惹起される割合で抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含む細胞集団ということもできる。
本発明において、「CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団」とは、当該細胞集団におけるCD8+T細胞およびCD25+T細胞の合計が全体に占める割合が10%以下、好ましくは5%以下、特に好ましくは1%以下である細胞集団を意味する。
一態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を対照レベルと比較する工程であって、該割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に被験物質の免疫原性が高いことを示す、工程をさらに含む。別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルと同等またはそれより高い場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。また別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程(a)の培養工程を被験物質の非存在下で実施した場合の該割合(陰性対照レベル)より有意に高い場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。さらに別の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程(a)の培養工程を免疫原性が高いことがわかっている物質の存在下で実施した場合の該割合(高免疫原性対照レベル)と同等以上である場合に被験物質の免疫原性が高いと決定する工程をさらに含む。他の態様において、本発明の免疫原性評価方法は、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、工程(a)の培養工程を免疫原性が低いことがわかっている物質の存在下で実施した場合の該割合(低免疫原性対照レベル)と同等以下である場合に被験物質の免疫原性が低いと決定する工程をさらに含む。
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を改変体または非改変体とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)改変体とともに培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、非改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が低減されていると判定する工程。
前記方法の別の態様において、改変体同士を比較して免疫原性がより低減された改変体を選択することができる。このような態様においては、前記工程(d)は、ある改変体とともに培養した場合に工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が、別の改変体とともに培養した場合の前記割合よりも低い場合に、前記改変体の免疫原性が前記別の改変体と比べて低減されていると判定する工程である。
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより低い場合に医薬品の候補物質として選択する工程。
工程(d)において、工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合の比較対象とする対照レベルは、スクリーニングの目的に応じて適宜設定することができる。例えば、医薬品候補の最適化プロセスにおいて、他の被験物質と比べて相対的に前記IL-2分泌T細胞割合が低いものを候補物質として選択することができる。あるいは、予め設定された対照レベルと比べて相対的に前記IL-2分泌T細胞割合が低いものを候補物質として選択することもできる。
(a)対象から得られた血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程、
(d)工程(c)で算出されたIL-2分泌T細胞が占める割合が対照レベルより高い場合に前記対象の前記被験物質による免疫療法に対する応答性が高いと決定する工程。
〔凍結PBMCの融解〕
凍結PBMC(Lonza社)を37℃で融解し、室温の培地で洗浄して細胞懸濁液からDMSOを除去した。洗浄後の細胞をカウントして1×107個/mLの細胞懸濁液を調製した。
1×107個/mLのPBMC懸濁液に必要量(25μL/107個のPBMC)のDynabeads(登録商標) CD8を加えた。転倒混和により細胞とビーズを均一にした後、振とうさせながら4℃、遮光下で30分間反応させた。反応終了後、ビーズを除去してCD8-PBMC懸濁液を回収し、遠心分離して上清を除去した細胞をカウントして2.5×107個/mLの細胞懸濁液を調製した。
2.5×107個/mLのCD8-PBMC懸濁液に必要量(25μL/2.5×107個のCD8-PBMC)のDynabeads(登録商標) CD25を加えた。転倒混和により細胞とビーズを均一にした後、振とうさせながら4℃、遮光下で30分間反応させた。反応終了後、ビーズを除去してCD8-CD25lowPBMC懸濁液を回収し、遠心分離して上清を除去した細胞をカウントして1×106個/mLの細胞懸濁液を調製した。当該細胞懸濁液を1 mL/wellで24well平底プレートに播種し、被験物質または陽性対照物質添加前に37℃、5% CO2インキュベーターで約1時間の前培養を行った。
前培養後の細胞に被験物質または陽性対照物質を添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで種々の時間、細胞培養を行った。
被験物質または陽性対照物質の存在下または非存在下での培養後、IL-2 catch reagent(IL-2 secretion assay kit、Miltenyi Biotec)を各wellに10μL添加し、37℃、5% CO2インキュベーターで1時間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を回収し、4℃での遠心分離により培養液の除去と洗浄を行った。洗浄後の細胞は氷上で4℃のフローサイトメトリー洗浄・染色液を用いて150 μLの細胞懸濁液として96well丸底プレートにて抗体混合液(抗CD3抗体(BD)、抗CD4抗体(BD)、抗CD14抗体(BD)、IL-2 Detection Antibody(IL-2 secretion assay kit、Miltenyi Biotec))と混合し、遮光下で30min、4℃で染色した。続いて、未反応の抗体の除去と洗浄を行い、洗浄後の細胞を7AAD(7-Amino-Actinomycin D)を用いて遮光下で3分間、室温で核染色を行った。
染色後の細胞を、リンパ球ゲートで最大測定数200000の条件でのフローサイトメトリー測定に供した。
各被験物質に対する抗薬物抗体(ADA)の発現を以下の方法により測定し、ADAの発現が検出されたドナーの頻度(発現率)を算出した。
抗体A:ECL法、Enbrel、Reopro:ELISA法、hA33:Biacore法
〔1−1.活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合の分析〕
免疫刺激物質で種々の時間刺激したCD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞サブセットの割合を分析した。具体的には、KLHの存在下で24〜72時間培養したCD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞をIL-2 catch reagent及びIL-2 Detection Antibody(IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec)を用いて検出し、CD8-CD25lowPBMCの集団におけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合をフローサイトメトリーにより分析した。図1および図2に示されているように、KLHの存在下で42、48、67、72時間培養した場合、免疫刺激物質の非存在下(NA)で同時間培養した場合と比べて高い割合のIL-2分泌T細胞が検出された。中でも、KLHの存在下で67時間培養した場合に特に高い割合のIL-2分泌T細胞が検出され、免疫原性が比較的高いことが知られている抗hA33抗体の存在下で培養した場合も同様であった。なお、抗hA33抗体は、当業者であれば、例えばWO1994/013805の記載を参照することにより作製することができる。一方、これらのタイムポイントにおいても、免疫原性が低いことが知られている市販医薬品Enbrel(エンブレル(登録商標))の存在下で培養した場合に検出されたIL-2分泌T細胞の割合は、免疫刺激物質の非存在下(NA)で同時間培養した場合と同程度であった。これらの結果は、被験物質による刺激後、活発な増殖を示す前のタイムポイントにおけるIL-2分泌CD4+T細胞の割合を、被験物質の免疫原性を評価するための早期マーカーとして利用できることを示している。
〔2−1.活発な抗原特異的な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標としたタンパク質製剤の免疫原性の評価〕
市販の医薬品を含む種々のタンパク質製剤を免疫刺激物質とした場合の活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を分析した。具体的には、LONZA社より購入した16〜31人のドナー(HLA-DRB1 coverage: Caucasian 70%、Japanese 60%)に由来する凍結PBMCからCD8-CD25lowPBMCをOpTmizer CTS T-cell Expansion SFM (gibco)で1x106/mlに調製し、1ml/wellで平底の24ウェルプレートに播種し37℃、5%CO2インキュベーター内で1時間前培養した。その後、種々の被験物質を添加し67時間培養した。培養した細胞集団におけるIL-2分泌細胞を、培地中にMiltenyi Biotec社のIL-2 catch reagent (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec) を10μl/wellで添加し更に1時間培養することで標識した。続いて、培養後のCD8-CD25lowPBMCを室温で回収後、4℃で遠心分離し、上清を除去した。氷上で細胞を4℃のフローサイトメトリー用洗浄・染色液に懸濁し、丸底の96ウェルプレートに移し、洗浄した。細胞を抗CD3抗体(BD)、抗CD4抗体(BD)、抗CD14抗体(BD)並びにIL-2 Detection Antibody (IL-2 secretion assay kit, Miltenyi Biotec)で染色後、洗浄した。7AADを添加後、フローサイトメトリーに供し、IL-2分泌CD4+T細胞の割合を測定した。結果を図3に示す。
表1には、無刺激の陰性対照(NA)よりも高いIL-2分泌CD4+T細胞割合を0.07%以上に設定した場合に陽性と評価されるPBMCのドナーの数およびその割合も示した。この割合を評価指標としてt検定により評価した結果、抗hA33抗体について、EnbrelおよびReoproと比べて有意に多くのIL-2分泌CD4+T細胞が検出されたと評価された。例えば、IL-2分泌CD4+T細胞割合を0.07%以上に設定した場合のReoproの陽性ドナー頻度と抗hA33抗体の陽性ドナー頻度の間である約20〜60%、約20〜50%、約20〜40%、約20〜30%等を対照レベルとして、医薬品の候補物質のスクリーニングを行うことができる。
次に、結合標的が共通の異なる複数種の改変抗体の免疫原性を、活発な増殖を示す前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を指標として評価した。具体的には、10人のドナーに由来する凍結PBMCからCD8-CD25lowPBMCを調製し、抗体Aおよびその改変体である抗体A2〜A6、ならびに免疫原性が高いことが公知の抗hA33抗体の存在下で67時間培養した。培養した細胞集団におけるIL-2分泌細胞の割合を、実施例2−1と同様に測定した結果を図4に示す。
実施例2において公知の免疫原性評価指標であるADA発現率と同等の評価結果が得られることがわかった本発明の評価指標(T細胞の活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合)を用いて、種々の被験物質の免疫原性の評価を行った。具体的には、ワクチン(インフルエンザHAワクチン:図5A)、抗体Bもしくは抗体Bとその抗原との複合体(図5B)、またはタンパク質製剤に混入しうる不純物(エンドトキシン(LPS):図5C)を被験物質とし、実施例2と同様に活発な増殖前のIL-2分泌CD4+T細胞の割合を測定した。結果を図5に示す。
また、免疫感作の際のキャリアタンパク質として用いられる高免疫原性のKLHの存在下で細胞培養を行った場合も明確なIL-2分泌CD4+T細胞が検出されたが、低免疫原性タンパク質製剤として用いられうる抗体単独を被験物質とした場合にはIL-2分泌CD4+T細胞はほとんど検出されず、当該抗体と抗原との複合体を被験物質とした場合はIL-2分泌CD4+T細胞が検出された(図5B)。
タンパク質製剤に混入しうる不純物の例として種々の濃度のエンドトキシン(LPS)の存在下で細胞培養を行った場合、LPS濃度が0.1 ng/ml以上で明確なIL-2分泌CD4+T細胞が検出された(図5C)。一方、血液成分の例として血液凝固第VIII因子(Factor VIII)を被験物質とした場合は、Factor VIII濃度が10μg/mlであっても明確なIL-2分泌CD4+T細胞は検出されなかった(図5C)。
タンパク質より分子量の小さいペプチドを被験物質とした場合は、図5Dに示されているように、検出されたIL-2分泌CD4+T細胞はごくわずかであった。
したがって、本発明の免疫原性評価方法は、タンパク質に限定しない種々の被験物質について適用可能であることが明らかとなった。
Claims (9)
- 以下の工程を含む、被験物質の免疫原性を評価する方法:
(a)血液に由来する、抗原提示細胞(APC)とCD4+T細胞を含み、CD8+T細胞およびCD25+T細胞を実質的に含まない細胞集団を被験物質とともに培養する工程、
(b)工程(a)で培養された細胞集団におけるIL-2を分泌するT細胞を、そのIL-2分泌初期のタイムポイントで検出する工程、
(c)工程(b)で検出されたIL-2分泌T細胞が占める割合を算出する工程。 - 血液に由来する前記細胞集団が、末梢血単核球細胞(PBMC)に由来する細胞集団である、請求項1に記載の方法。
- 前記血液がヒト由来である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記T細胞の増殖が活発になる前である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL-2分泌初期のタイムポイントが、前記培養開始後24時間〜72時間の間である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験物質が、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ワクチン、およびそれらのうち二つ以上のコンジュゲート、ならびにそれらのうち二つ以上の組み合わせを含む混合物からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験物質がタンパク質である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験物質が抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記IL-2分泌T細胞が占める割合の算出が、フローサイトメトリーで当該細胞数を測定することである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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