CN112730846B - 一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法 - Google Patents

一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，免疫复合物包含有人源或人源化的生物大分子药物以及与其结合的在小鼠体内产生的抗药抗体，包括以下步骤，应用ELISA法检测若干只无治疗史小鼠的血清，获得若干第一阴性对照信号值；选取若干低于临界分位数区间的第一阴性对照信号值的小鼠血清进行混合，得到阴性对照，应用ELISA法检测阴性对照，获得第二阴性对照信号值；应用ELISA法检测待检样品，获得待检样品信号值，若待检样品信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定待检样品为阳性；临界值为S/N数值的平均值与2～10倍S/N数值的标准差之和，临界分位数区间介于25％分位数与75％分位数之间。

Description

一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法
技术领域
本发明涉及免疫复合物检测领域，具体为一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法。
背景技术
伴随着抗体技术的不断发展以及新型抗体的不断出现，治疗性蛋白药物已成为制药业发展最快的领域之一。随着对治疗性蛋白药物研究的不断深入，在治疗性蛋白药物给药过程中的产生的免疫原性问题所带来对药物安全性有效性的影响也越来越受到重视。作为治疗性蛋白药物开发、安全性评价和长期有效性评价的重要一环，在整个药物研发及安全有效性试验中，免疫原性的检测及评价被国家药品监督管理局药品审评中心(CenterFor Drug Evaluation,NMPA)列为一项常规检测。
酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
给予治疗性蛋白药物后，人或动物发生免疫反应进而产生的抗药抗体(Anti-DrugAntibody,ADA)在体内有两种存在形式，分别为游离型抗药抗体和与治疗性蛋白药物结合的结合型抗药抗体。免疫复合物指药物与抗药抗体结合所形成的复合物。大多数药物给药后由于免疫原性产生的不良反应或负面影响，如药效学失效，影响治疗暴露量或超敏反应，均是免疫复合物所致的结果。免疫复合物的产生可导致抗药抗体的进一步生产和潜在的免疫复合物形成，FcR通过识别免疫复合物而导致药物在体内的清除加速。
免疫复合物可能在体内沉积，进而引发一系列的连锁反应，从而造成脏器损伤出现免疫毒性。免疫复合物的沉积与否通常是通过病理学家的病理诊断获得的结论，具有一定的主观性。循环免疫复合物的检测结果可作为重要脏器免疫复合物沉积的佐证，进而帮助病理学家更科学的判定免疫毒性。
现有技术采用的桥连法ELISA对结合性抗药抗体检测有局限性，如果药物与抗药抗体形成免疫复合物(Immune Complex,IC)，现有方法可能检测为阴性，不能真实体现体内的抗药抗体产生情况，低估免疫原性的风险。现有技术对于抗药抗体检测的实际检测结果与真实存在差异，对于药物安全性评价来说是不利的。
目前可通过C1q和anti-C3d检测进行临床循环免疫复合物的检测。但这类补体检测方法所检测出的免疫复合物对于抗药抗体-药物所介导产生的免疫复合物不具有特异性，检测结果无法真实的反应由抗药抗体介导的免疫复合物情况。
综上，本领域技术人员进行临床前的免疫复合物检测时，亟需一种简单易行的免疫复合物检测手段，并特异识别由抗药抗体介导产生的免疫复合物，以加快药物研发的进程。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的是开发一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，以解决上述的问题，本发明的技术方案是：
一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，所述免疫复合物包含有人源或人源化的生物大分子药物以及与其结合的在小鼠体内产生的抗药抗体，
包括以下步骤，
(1)应用酶联免疫吸附测定法检测若干只无治疗史小鼠的血清，获得若干第一阴性对照信号值；
(2)选取若干落入临界分位数区间的第一阴性对照信号值的小鼠血清进行混合，从而得到阴性对照，应用酶联免疫吸附测定法检测阴性对照，获得第二阴性对照信号值；
(3)应用酶联免疫吸附测定法检测待检样品，获得待检样品信号值，
若待检样品信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定待检样品为阳性；
其中，所述临界值为S/N数值的平均值与4～10倍S/N数值的标准差之和，所述S/N数值为所述第一阴性对照信号值除以所述第二阴性对照信号值；所述临界分位数区间介于25％分位数与75％分位数之间。
优选的，所述临界值为S/N数值的平均值与4～8倍S/N数值的标准差之和，优选的，所述临界值为S/N数值的平均值与5～7倍S/N数值的标准差之和，更优选的，所述临界值为S/N数值的平均值与5.5～6.5倍S/N数值的标准差之和，最优选的，所述临界值为S/N数值的平均值与6倍S/N数值的标准差之和。
优选的，若一个所述S/N数值的数值为离群值，剔除所述离群值，从新计算所述S/N数值的平均值和所述S/N数值的标准差。
优选的，还包括以下步骤，
(1)在第一反应体系中，将人源化治疗性蛋白药物和小鼠源特异性抗药抗体混合，在15℃～37℃环境下孵育0.5～3h后转移至0℃～10℃环境下孵育40～100h，从而得到阳性对照；
(2)应用酶联免疫吸附测定法检测阳性对照获得阳性对照信号值；
若阳性对照信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定阴性对照和阳性对照不存在瑕疵。
进一步，所述人源化治疗性蛋白药物选自人源化HGF抗体、人源化单克隆VEGF-A抗体、人源化Her2抗体或人源化CD20抗体，所述人源化HGF抗体包括Ficlatuzumab，所述人源化单克隆VEGF-A抗体包括Bevacizumab，所述人源化Her2抗体包括Herceptin，所述人源化CD20抗体包括Rituximab；
和/或所述小鼠源特异性抗药抗体选自人源化HGF抗体、人源化单克隆VEGF-A抗体、人源化Her2抗体或人源化CD20抗体，所述人源化HGF抗体包括Ficlatuzumab，所述人源化单克隆VEGF-A抗体包括Bevacizumab，所述人源化Her2抗体包括Herceptin，所述人源化CD20抗体包括Rituximab。
进一步，若阳性对照信号值低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定阴性对照或阳性对照存在瑕疵，重新制备阴性对照或阳性对照。
优选的，所述酶联免疫吸附测定法检测依次包括包被环节、第一洗板环节、封闭环节、第二洗板环节、加样环节、第三洗板环节、结合二抗环节、第四洗板环节、HRP环节、显色环节、终止环节和读数环节，在所述结合二抗环节选用特异性抗小鼠Fc片段的抗体进行检测。
进一步，所述特异性抗小鼠Fc片段的抗体选自山羊抗小鼠Fc片段抗体和兔抗小鼠Fc片段抗体中的一种。
本发明有以下有益效果：
1.本发明的一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，弥补现有技术对临床前免疫复合物检测手段的空白，可进一步鉴定药物产生的免疫原性类型，进而更好的进行药物临床前安全性评价工作。
2.本发明的一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，与现有基于C1q，anti-C3d临床检测免疫复合物的手段相比，能特异性检测抗药抗体介导的免疫复合物。
附图说明
图1为本发明的通用的从小鼠血样中检测免疫复合物的方法的检测方法的原理示意图；
图2为本发明的通用的从小鼠血样中检测免疫复合物的方法采用的治疗性蛋白药物的结构组成示意图；
图3为本发明的通用的从小鼠血样中检测免疫复合物的方法的实施检测分析例3中AMA202 PK检测血清中AMA202浓度，其中A01组小鼠的编号为1、4和7，A02组小鼠的编号为2、5和8，A03组小鼠的编号为3、6和9。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施制备例1～4
实施例1～4为本发明的一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法的阳性对照PCs的制备方法。
选择人源化治疗性蛋白药物及小鼠源特异性抗药抗体(H-ADA)进行阳性对照(PCs)制备。使用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)构建反应体系。使用PBS稀释药物，人源化治疗性蛋白药物选自人源化HGF抗体、人源化单克隆VEGF-A抗体、人源化Her2抗体或人源化CD20抗体，人源化HGF抗体包括Ficlatuzumab，人源化单克隆VEGF-A抗体包括Bevacizumab，人源化Her2抗体包括Herceptin，人源化CD20抗体包括Rituximab；小鼠源特异性抗药抗体选自人源化HGF抗体、人源化单克隆VEGF-A抗体、人源化Her2抗体或人源化CD20抗体，人源化HGF抗体包括Ficlatuzumab，人源化单克隆VEGF-A抗体包括Bevacizumab，人源化Her2抗体包括Herceptin，人源化CD20抗体包括Rituximab。得到浓度约为2μg/mL的缓冲液Buffer A，使用PBS稀释H-ADA，得到浓度约为2μg/mL的Buffer B。按约1:1的体积混合Buffer A和Buffer B，在第一孵育温度环境下孵育第一孵育时间后转移至第二孵育温度环境下孵育第二孵育时间。孵育完成后的所得的溶液即为阳性对照。
表1阳性对照(PCs)制备参数
参数 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
药物种类 Ficlatuzumab Bevacizumab Herceptin Rituximab
第一孵育温度/℃ 15 20 25 37
第二孵育温度/℃ 0 8 2 10
第一孵育时间/min 180 120 60 30
第二孵育时间/min 100 60 90 40
基于目前治疗性抗体类蛋白的特性，选择特异性抗小鼠Fc片段的抗体(anti-mouse IgG Fc-HRP)进行检测优化，降低治疗性抗体类蛋白自身带来的背景，详细检测方法format参见图1。
阳性对照并不是真实试验小鼠所产生的治疗性蛋白药物与ADA的免疫复合物，但此处制备所得的阳性对照具有类似免疫复合物特征，可以作为阳性对照质控监测方法的性能。
参见图2，在图1中，“-u-”所示类型药物为全人源化药物，目前治疗性蛋白药物并非全人源化药物，大部分在研的治疗性蛋白药物多为嵌合抗体或人源化抗体，参见图1和图2，在图2中，“-xi-”“-zu-”“-xizu-”所示类型药物为嵌合抗体或人源化抗体，其中，Non-human的片段多来自于小鼠。
实施检测例1
实施检测例1为本发明的一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法的CICs检测方法。
(1)溶液配制
配置洗涤液，取一袋PBS粉末置于1L烧杯中，用取超纯水1.5L，加入烧杯中，搅拌至完全溶解，加超纯水稀释至2L，然后使用0.22μm微孔滤膜过滤，即得PBS溶液。用移液器量取2.5mL 40％的Tween 20加入到2L PBS溶液中，摇匀后，放置于室温保存，有效期为2周。
配置Assay Buffer，吸取1mL 40％的Tween 20与40mL 10x PBS缓冲液加入到360mL超纯水中，充分混合后，再加入4g BSA，充分溶解混合后，置于2～8℃冰箱中保存，有效期为2周。
配置封闭液，吸取1mL 40％的Tween 20与40mL 10x PBS缓冲液加入到360mL超纯水中，充分混合后，再加入20g BSA，充分溶解混合后，置于2～8℃冰箱中保存，有效期为2周。
配置Rabbit Anti-Mouse IgG,Fc Fragment Specific-Biotin的制备，取1支Biotin，加入200uL去离子水，重悬冻干粉，即得5.0mg/mL的BiotinS储备液，备用；取10μL溶液浓度为54.7mg/mL的Rabbit Anti-Mouse IgG,Fc Fragment Specific加入至537μL的PBS缓冲液中，即得1.0mg/mL，备用；Rabbit Anti-Mouse IgG,Fc Fragment Specific和Biotin以1:20的体积比混合，进行标记，混合后立即振荡保证充分混合，室温条件下静置孵育1h；
标记蛋白纯化：取1支脱盐柱，掰断柱子尾部并松开盖子(勿不加盖子)，在柱子一侧做上标记，并将标记侧朝离心机外；将柱子嵌套在合适大小的洁净离心管内，1000g离心2min，弃滤液；以1mL/支的量向脱盐柱中加入PBS，1000g离心2min，弃滤液；重复上一步操作2次；预处理完毕后的脱盐柱嵌套至新的洁净离心管内备用。取500μL上述混合溶液加入至预处理完毕的脱盐柱的柱床中心(2mL脱盐柱：当加入的工作液体积<350μL时，待工作液被柱床吸收完毕后，补加40μL PBS)，1000g离心2min，收集滤液，经BSA蛋白浓度测定标记蛋白浓度为256.5μg/mL，命名为Rabbit Anti-Mouse IgG,Fc Fragment Specific-Biotin，储存于-25～-15℃条件下，备用。
(2)应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测无治疗史小鼠的血清、阳性对照、阴性对照和待检样品。
包被环节，用包被缓冲液(0.1mol/L,pH 9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液)将抗体Sheep anti-Human Immunoglobulins稀释至1.0μg/mL，将稀释后溶液按80μL/孔加至酶标板中，用光学粘性膜密封酶标板并将其置于2～8℃冰箱，孵育过夜。
第一洗板环节，将包被的酶标板从冰箱取出平衡至室温，弃去酶标板孔内溶液，并每孔加入300μL洗涤液洗板，甩尽孔内溶液并在吸水纸上拍干，共进行洗板过程4次，确保孔内无残留的洗涤液。
封闭环节，每孔加入200μL封闭液，密封酶标板并将其置于微孔板振荡器，400r/min，室温反应1.5±0.5h。
第二洗板环节，洗板操作如1.2所述。
加样环节，按实验设计在对应的孔加入稀释后的无治疗性蛋白治疗史小鼠(小鼠)的血清、阴性对照、阳性对照及待测样品，复孔分析，每孔80μL。加样前，使用Assay Buffer对阴性对照、阳性对照及待测样品进行100倍稀释。密封酶标板并将其置于微孔板振荡器，400r/min，室温反应2.0h。
第三洗板环节，洗板操作如1.2所述。
结合二抗环节，选用特异性抗小鼠Fc片段的抗体进行检测，特异性抗小鼠Fc片段的抗体选自山羊抗小鼠Fc片段抗体和兔抗小鼠Fc片段抗体中的一种；用Assay Buffer将抗体Rabbit Anti-Mouse IgG,Fc Fragment Specific-Biotin稀释至工作浓度100ng/mL，按80μL/孔加至酶标板，密封酶标板并将其置于微孔板振荡器，400r/min，室温反应1.0h。
第四洗板环节，洗板操作如1.2所述。
HRP环节，用Assay Buffer将HRP-Conjugated Streptavidin稀释100000倍后按80μL/孔加至酶标板，密封酶标板并将其置于微孔板振荡器，400r/min，室温反应1.0h。
显色环节，按80μL/孔的添加量将平衡至室温的TMB显色液添加至酶标板，室温孵育5min-10min。
终止环节，于各反应孔中各加入80μL Stop Buffer。
读数环节，酶标仪在450nm和650nm下进行读板检测，最终吸光度(OpticalDensity,OD)＝450nm OD–650nm OD。
实施检测分析例1
实施检测分析例1的实验方法是：选取24只(12M/12F)小鼠的Balb/C小鼠进行阴性对照的制备，/>为未使用过含人源治疗性蛋白。取24只小鼠的血清，作为单只小鼠血清。由1名研究员在1天完成对24只小鼠的一次检测(共进行了1次分析批)，采用实施检测例1的方法进行检测。选取若干低于临界分位数区间的第一阴性对照信号值的小鼠血清进行混合，临界分位数区间介于25％分位数与75％分位数之间。
表2检测24只小鼠的血清样品得到的信号值
动物编号 分析批1 动物编号 分析批1
1 0.0501 13 0.0455
2 0.0495 14 0.0450
3 0.0494 15 0.0449
4 0.0490 16 0.0447
5 0.0486 17 0.0447
6 0.0478 18 0.0444
7 0.0470 19 0.0444
8 0.0469 20 0.0443
9 0.0467 21 0.0443
10 0.0464 22 0.0437
11 0.0463 23 0.0436
12 0.0459 24 0.0435
实施检测分析例1的实验结果是：检测24只小鼠的血清样品得到的信号值的结果详见表2，选取若干低于临界分位数区间的第一阴性对照信号值的小鼠血清进行混合，本实验检测分析例具体是12只(动物编号为13～24)，从而得到阴性对照。
实施检测分析例2
实施检测分析例2的实验方法是：阳性对照制备完成后，对阳性对照进行性能确认，由2名研究员在2天以上对阳性对照进行五次检测(共进行了5次分析批)，采用实施检测例1的方法进行检测，获得阳性对照样品性能确认S/N数值，对阳性对照S/N数值进行分析。S/N数值为每个样品(阳性对照、待检小鼠样品)检测所得信号值除以每个检测板上的第二阴性对照信号值所得。第二阴性对照信号值为实施检测分析例1所获得的阴性对照的信号值。
实施检测分析例2的实验结果是：5个分析批检测所得阳性对照的S/N数值的平均值为2.86，参见实施检测分析例2，阳性对照的S/N数值的平均值大于临界值CP(CP＝1.312)，故本阳性对照可作为质量监控用。
表3阳性对照样品性能确认S/N数值
S/N数值
分析批1 2.93
分析批2 2.76
分析批3 2.80
分析批4 3.11
分析批5 2.69
Mean 2.86
％CV 5.8％
本检测分析例所得的5个分析批检测所得阳性对照的精密度为5.8％，检测结果符合作为阳性对照的精密度要求，方法重现较好，适合用于推广应用。
实施检测分析例3
实施检测分析例3的实验方法是：选取27只(13M/14F)小鼠的Balb/C小鼠进行临界值(Cut point,CP)的确认，/>为未使用过含人源治疗性蛋白。取27只小鼠的血清，作为单只小鼠血清。由2名研究员在2天以上完成对27只小鼠的四次检测(共进行了4次分析批)，用酶联免疫吸附测定法检测阴性对照，S/N数值为27只(13M/14F)/>小鼠的样品检测所得信号值除以对应的检测板上的第二阴性对照信号值所得。获得可表征小鼠总体血清背景的代表性样品的S/N数值。第二阴性对照信号值为实施检测分析例1所获得的阴性对照的信号值。
实施检测分析例3的实验结果：检测结果第二阴性对照信号值为0.0280。
对已获得的数据进行统计分析，获得S/N数值，详见表4，以获得临界值。
表4检测27只小鼠的血清样品得到的S/N数值
对同一编号动物4次分析批结果进行分析离群值的去除，使用狄克逊(Dixon)检验法。去除分析离群值的结果详见表5。
表5使用狄克逊(Dixon)检验法去除离群值结果
从表4可以看出，本实验结果使用狄克逊(Dixon)检验法未发现离群值。
对去除分析离群值后的所有数值进行生物离群值的去除，使用箱型图(Box)检验法。去除生物离群值的结果祥见表6。
表6使用箱型图(Box)检验法去除离群值结果
动物编号 分析批1 分析批2 分析批3 分析批4
1 - - - -
2 1.1302 1.0442 1.0361 0.9148
3 1.0533 0.9996 0.9938 0.9095
4 1.1302 1.0425 1.1172 0.9398
5 1.1187 1.1009 1.0485 0.9915
6 1.0668 1.0322 1.0326 0.9345
7 1.0610 1.0271 0.9604 0.9291
8 1.0706 1.0614 1.0238 0.9380
9 1.0764 1.0391 1.0256 0.9612
10 1.0822 1.0580 1.0150 0.9666
11 1.0284 0.9910 1.0026 0.8917
12 1.0822 1.0666 1.0396 0.9862
13 1.0168 1.0477 0.9833 0.9612
14 0.9899 0.9910 0.9568 1.0147
15 - - - -
16 1.0130 1.0614 0.9463 0.9862
17 1.0264 1.0734 0.9251 0.9452
18 1.0053 1.0614 0.9797 1.0254
19 0.9976 1.0150 0.9445 0.9630
20 0.9880 1.0013 0.9322 0.9576
21 0.9918 1.0408 0.9639 0.9790
22 1.0668 1.0751 1.0273 1.0147
23 1.0380 1.0133 0.9868 0.9737
24 1.0207 1.0477 1.0115 1.0111
25 1.0495 1.0614 1.0379 0.9737
26 1.0130 0.9790 0.9974 0.9398
27 0.9938 1.0322 0.9956 1.0004
对去除分析及生物离群值后的数据(详见表6)进行正态检验，使用Shapiro-Wilk检验法进行正态检验(P＝0.864(P≥0.05))，结果见表7，表明数据呈正态分布。
表7正态检验去除离群值后的数据结果
套用公式对临界值公式进行计算，临界值CP＝平均值Mean+n×标准差SD。式中，n值选取与治疗性蛋白药物的种类和人源化水平相关；平均值Mean为1.012，标准差SD为0.050；若n＝2，CP为1.112，若n＝4，CP为1.212；若n＝5，CP为1.262；若n＝5.5，CP为1.287；若n＝6，CP为1.312；若n＝6.5，CP为1.337；若n＝7，CP为1.362；若n＝8，CP为1.412；若n＝10，CP为1.512。
参见表2，5个分析批检测所得阳性对照的S/N数值的平均值为2.86，因此大于临界值(CP＝1.112～1.512),故本阳性对照可作为质量监控用，判定阴性对照和阳性对照不存在瑕疵，可以进行相应的实验。
若实施检测分析例1得到的5个分析批检测所得阳性对照的S/N数值的平均值，低于实施检测分析例2得到的临界值，判定阴性对照或阳性对照存在瑕疵，从新制备阴性对照或阳性对照。
实施检测分析例4
实施检测分析例4的实验方法：本实施检测分析例为治疗性蛋白药物AMA202的PK给药研究，具体的实验方案参数参见表8；经过一定时间后然后检测小鼠血清中的治疗性蛋白药物得浓度，若检测到小鼠血清中蛋白药物的浓度明显降低，将应当认为小鼠存在潜在抗药抗体，出现免疫复合物；然后使用本免疫复合物检测方法对可能出现免疫原性的样品进行检测，采用实施检测例1的方法进行检测，检验本发明的方法是否可以成功检测治疗性蛋白临床前小鼠的免疫复合物。
AMA202为治疗性蛋白药物，选自人源化Her2抗体包括Pertuzumab，Herceptin或Kadcyla的一种或多种。
实施检测分析例4的实验结果：小鼠血清AMA202浓度参见图3和表9。
表8小鼠PK单次给药动物试验的动物实验方案
供试品 AMA202
给药途径 尾静脉
给药频率 单次
给药剂量/mg/kg 5
给药体积/ml/kg 10
给药浓度/mg/ml 0.5
动物数(雄性)/只 9
供试品需求量/mg 1.7
溶媒 PBS
从图3和表9，可以看到小鼠编号8在504h采取的血清样品，检测的蛋白药物的浓度为0.240μg/mL，既明显低于小鼠编号8在72h采取的血清样品的38.5μg/mL，又明显低于小鼠编号7在504h采取的血清样品的18.9μg/mL，和明显低于小鼠编号9在504h采取的血清样品的19.8μg/mL，因此小鼠编号8在504h所采集的血清样本出现了潜在免疫原性，即存在潜在抗药抗体介导的免疫复合物。
表9 AMA202 PK检测血清中AMA202浓度的结果
使用实施制备例1～4制备得到的阳性对照PCs，使用实施检测例1的方法，检测得到小鼠编号8在504h采集的血清样品的信号值为0.1819，除以第二阴性对照信号值0.0280，即小鼠编号8在504h所采集的血清样品的信号值的S/N数值结果为6.496，综合治疗性蛋白药物的种类和人源化水平相关，实施检测分析例1～2所得的临界值CP为1.312，明显小于本样品的S/N数值结果6.496，即检测小鼠编号8在504h采集的血清样品的信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，因此，判定小鼠编号8在504h采取的血清样品为阳性，即小鼠编号8在504h所采集的血清样本中出现了抗药抗体介导的免疫复合物。
本方法成功对潜在出现免疫原性的小鼠血清样本进行了检测，检测结果为免疫复合物阳性。故本方法可成功检测治疗性蛋白临床前小鼠的免疫复合物。
综上，本发明的治疗性蛋白药物临床前小鼠通用的抗药抗体检测方法可以对小鼠免疫复合物进行检测，弥补现有技术对临床前免疫复合物检测手段的空白，与现有基于C1q，anti-C3d临床检测免疫复合物的手段相比，能特异性检测抗药抗体介导的免疫原性复合物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或更替，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种用于小鼠血样检测免疫复合物的方法，所述免疫复合物包含有人源或人源化的生物大分子药物以及与其结合的在小鼠体内产生的抗药抗体，其特征在于，
包括以下步骤，
（1）应用酶联免疫吸附测定法检测若干只无治疗史小鼠的血清，获得若干第一阴性对照信号值；
（2）选取若干落入临界分位数区间的第一阴性对照信号值的小鼠血清进行混合，从而得到阴性对照，应用酶联免疫吸附测定法检测阴性对照，获得第二阴性对照信号值；
（3）应用酶联免疫吸附测定法检测待检样品，获得待检样品信号值，若待检样品信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定待检样品为阳性；
其中，所述临界值为 S/N 数值的平均值与 2～10 倍 S/N 数值的标准差之和，所述S/N 数值为所述第一阴性对照信号值除以所述第二阴性对照信号值；所述临界分位数区间介于 25%分位数与 75%分位数之间。
2. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述临界值为 S/N 数值的平均值与 2～10 倍 S/N 数值的标准差之和。
3. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，若一个所述 S/N 数值为离群值，剔除所述离群值，重新计算所述 S/N 数值的平均值和所述 S/N 数值的标准差。
4. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤，
（1）在第一反应体系中，将人源化治疗性蛋白药物和小鼠源特异性抗药抗体混合，在15℃～37℃环境下孵育0.5～3 h后转移至0℃～10℃环境下孵育40～100 h，从而得到阳性对照；
（2）应用酶联免疫吸附测定法检测阳性对照获得阳性对照信号值；
若阳性对照信号值不低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定阴性对照和阳性对照不存在瑕疵。
5. 如权利要求 4 所述的方法，其特征在于，所述人源化治疗性蛋白药物选自人源化HGF抗体、人源化单克隆VEGF-A抗体、人源化Her2 抗体或人源化CD20抗体，所述人源化 HGF抗体包括 Ficlatuzumab，所述人源化单克隆 VEGF-A 抗体包括 Bevacizumab，所述人源化Her2 抗体包括 Herceptin，所述人源化 CD20抗体包括Rituximab；
和/或所述小鼠源特异性抗药抗体选自人源化 HGF 抗体、人源化单克隆VEGF-A 抗体、人源化 Her2 抗体或人源化 CD20 抗体，所述人源化 HGF 抗体包括Ficlatuzumab，所述人源化单克隆 VEGF-A 抗体包括 Bevacizumab，所述人源化 Her2 抗体包括 Herceptin，所述人源化 CD20 抗体包括 Rituximab。
6. 如权利要求 4 所述的方法，其特征在于，若阳性对照信号值低于临界值乘以第二阴性对照信号值，判定阴性对照或阳性对照存在瑕疵，重新制备阴性对照或阳性对照。
7. 如权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述酶联免疫吸附测定法检测依次包括包被环节、第一洗板环节、封闭环节、第二洗板环节、加样环节、第三洗板环节、结合二抗环节、第四洗板环节、HRP 环节、显色环节、终止环节和读数环节，在所述结合二抗环节选用特异性抗小鼠 Fc 片段的抗体进行检测。
8. 如权利要求 7 所述的方法，其特征在于，所述特异性抗小鼠 Fc 片段的抗体选自山羊抗小鼠 Fc 片段抗体和兔抗小鼠 Fc 片段抗体中的一种。
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