CN117769599A - 嵌合FcεRIα链基因、嵌合FcεRIα链蛋白质、细胞、分析用试剂盒、以及分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种用于提高过敏检查灵敏度的方案。本发明提供一种包含编码人FcεRIα链中的胞外结构域的第一碱基序列和编码非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域的第二碱基序列的嵌合FcεRIα链基因。另外，本发明还提供作为该嵌合FcεRIα链基因的表达产物的嵌合FcεRIα链蛋白质、以及包含该嵌合FcεRIα链基因的非人动物细胞。另外，本发明还提供包含该细胞的分析用试剂盒、以及使用该细胞的分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种嵌合FcεRIα链基因、嵌合FcεRIα链蛋白质、细胞、分析用试剂盒，以及分析方法。更特别地，本发明涉及一种用于进行与过敏相关的试验的嵌合FcεRIα链基因、嵌合FcεRIα链蛋白质、细胞和试剂盒、以及与过敏相关的分析方法。
背景技术
参与过敏反应的IgE是血清中极微量存在的抗体。IgE与例如肥大细胞及嗜碱性粒细胞等细胞表达的高亲和力IgE受体(在本说明书内中，高亲和力IgE受体也称为“FcεRI”)的α链非常牢固地结合(Ka＝1010M-1)。FcεRI可以包含一条α链、一条β链及γ链的同源二聚体。这些亚基在很多动物物种中只有形成四聚物后才会在细胞膜表面表达，但在人体中已知有不伴随有β链的表达形式。
B细胞产生过敏原(抗原)特异性IgE之后，IgE会随着血流与外周的免疫细胞、特别是肥大细胞及嗜碱性粒细胞表达的FcεRI结合，以致敏这些细胞。被IgE致敏后的这些细胞暴露于特异抗原后，抗原和IgE结合。此时，若1分子的抗原上存在多个IgE表位，则通过经由抗原结合多个IgE抗体，相应地会“交联”多个FcεRI。
以FcεRI的交联为触发，通过激活例如缔合于受体的胞内结构域的酪氨酸激酶等酶以及接头分子，产生例如钙离子的流入、组胺等化学介质的脱颗粒及脂质化学介质的产生亢进等细胞应答，从而引起即时过敏应答。并且，通过激活某种转录因子，诱导例如细胞因子及趋化因子等基因表达，而这会导致随后的炎症反应。
目前，已经提出了多种关于过敏的检查方法。例如，下述专利文献1公开了一种用于检查所述受试物质对于所述受试者是否为过敏原的方法，其包括：在来自受试者的生物样本存在下孵育细胞，所述细胞在细胞膜上具有对人IgE具有亲和力的Fc受体，并且在可供转录因子结合的增强子的控制下，依次具有启动子及报告基因；使受试物质与所述孵育后的细胞进行接触；以及确认与所述受试物质接触后的细胞中的所述报告基因的表达的增大。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011-19467号公报
发明内容
要求进一步提高过敏检查灵敏度。如果能够提高该灵敏度，将可以用于例如基于患者IgE的生物学意义的评价、微量过敏原的检测、以及抗过敏物质的高通量筛选等与各种过敏有关的试验。因而，本发明的主要目的在于提高过敏检查的灵敏度、特别是提高IgE检测方式的灵敏度。
本发明提供一种嵌合FcεRIα链基因，其包含可以编码人FcεRIα链中的胞外结构域的第一碱基序列和可以编码非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域的第二碱基序列。
所述第一碱基序列可以包含与序列ID No.7的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
所述第二碱基序列可以包含与序列ID No.5的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
所述第二碱基序列可以进一步包含与序列ID No.6的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
所述嵌合FcεRIα链基因可以进一步包含编码用于使基于该基因生成的嵌合FcεRIα链在细胞膜上表达的信号序列的第三碱基序列。
所述第三碱基序列可以包含与序列ID No.2的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
所述嵌合FcεRIα链基因可以具有与序列ID No.1的碱基序列具有50％以上的序列同源性的碱基序列。
所述非人动物可以为啮齿类的动物。
另外，本发明还提供一种嵌合FcεRIα链蛋白质，所述嵌合FcεRIα链蛋白质包含人FcεRIα链中的胞外结构域和非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域。
所述胞外结构域可以包含与序列ID No.14的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
所述跨膜结构域可以包含与序列ID No.12的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
所述嵌合FcεRIα链蛋白质可以进一步包含非人动物FcεRIα链中的胞内结构域，
该胞内结构域可以包含与序列ID No.13的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
所述嵌合FcεRIα链蛋白质可以具有与序列ID No.8的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
另外，本发明还提供一种载体，所述载体包含所述嵌合FcεRIα链基因。
另外，本发明还提供一种所述非人动物的细胞，所述非人动物的细胞包含所述嵌合FcεRIα链基因、所述嵌合FcεRIα链蛋白质或所述载体。
所述细胞可以进一步包含所述非人动物细胞的FcεRI的γ链的基因。
所述细胞可以形成包含基于所述嵌合FcεRIα链基因生成的嵌合FcεRIα链和所述细胞的FcεRI的γ链的缔合体。
所述细胞可以进一步包含通过所述缔合体彼此的交联诱导表达的报告基因。
另外，本发明还提供一种分析用试剂盒，所述分析用试剂盒包含所述细胞。
另外，本发明还提供一种分析方法，所述分析方法使用所述细胞。
所述分析方法可以包括执行孵育所述细胞的孵育工序、以及分析所述细胞的应答的分析工序。
所述孵育工序可以包括在孵育用材料中孵育所述细胞。
所述分析工序可以包括基于所述应答进行选自由过敏原性的评价、过敏的有无或风险的评价、针对IgE的分析、过敏抑制活性的评价、以及药物筛选组成的组中的至少一项。
所述分析工序可以包括进行I型过敏的有无或风险的评价。
附图说明
图1是用于对本发明的细胞进行说明的示意图。
图2是用于对本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质进行说明的示意图。
图3是示出本发明的嵌合FcεRIα链基因及嵌合FcεRIα链蛋白质的构成例的图。
图4是示出实施例中使用的嵌合FcεRIα链基因的碱基序列及由该基因编码的氨基酸序列的图。
图5是序列ID No.15的碱基序列。
图6是对用于基因插入的序列进行说明的图。
图7是示出发光强度的测定结果的图。
图8是示出流式细胞仪的测定结果的图。
图9是示出发光强度的测定结果的图。
图10是示出发光强度的测定结果的图。
图11是示出吸光度的测定结果的图。
图12是示出发光强度的测定结果的图。
图13是示出发光强度的测定结果的图。
图14是示出发光强度的测定结果的图。
图15是示出发光强度的测定结果的图。
图16是示出发光强度的测定结果的图。
图17是示出发光强度的测定结果的图。
图18是示出发光强度的测定结果的图。
图19是用于对实施例中使用的嵌合FcεRIα链基因及由该基因表达的嵌合FcεRIα链蛋白质的结构及功能进行说明的示意图。
图20是示出发光强度的测定结果的图。
图21是示出发光强度的测定结果的图。
图22是示出发光强度的测定结果的图。
图23是示出发光强度的测定结果的图。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的优选形式进行说明。需要说明的是，以下说明的实施方式示出了本发明的代表性实施方式，本发明的范围并不仅仅限定于这些实施方式。
按照以下的顺序对本发明进行说明。
1.本发明的说明
2.第一实施方式(嵌合FcεRIα链基因)
(1)第一碱基序列
(2)第二碱基序列
(3)第三碱基序列
(4)嵌合FcεRIα链基因整体
3.第二实施方式(嵌合FcεRIα链蛋白质)
(1)胞外结构域
(2)跨膜结构域及胞内结构域
(3)信号序列
(4)嵌合FcεRIα链蛋白质
4.第三实施方式(载体)
5.第四实施方式(细胞)
6.第五实施方式(分析用试剂盒)
7.第六实施方式(分析方法)
8.实施例
(1)嵌合FcεRIα链基因的合成
(2)嵌合FcεRIα链基因向RBL-NL4细胞的导入
(3)导入有嵌合FcεRIα链基因的细胞中的荧光素酶表达
(4)IgE对导入有嵌合FcεRIα链基因的细胞的结合能力的确认
(5)适合本发明的细胞的试验条件的探讨
(6)利用过敏患者血清的试验(花生过敏)
(7)本发明的细胞与其它细胞的比较(过敏检查、蛋类过敏)
(8)本发明的细胞与其它细胞的比较(过敏反应抑制剂的有效性评价)
(9)稳定性及再现性
1.本发明的说明
目前临床上常用的过敏试验法能够分为例如in vivo试验法、ex vivo试验法、invitro试验法这三种，它们各有利弊。in vivo试验法向患者自身施用过敏原，因此可靠性最高，但存在为患者带来较大负担的问题。在ex vivo试验法中，可以将患者的嗜碱性粒细胞取出至体外，并向该嗜碱性粒细胞施用过敏原。该ex vivo试验法以嗜碱性粒细胞的激活(例如释放组胺或向细胞表面表达CD203c/CD63等)为指标，因此可靠度高。但是，在该exvivo试验法中，由于使用全血，因此存在样品无法保存的问题。作为一种最常使用的invitro试验法，可列举ImmunoCAP法。ImmunoCAP法能够使用患者的血清或血浆来实施。ImmunoCAP法简便并且灵敏度较高，但存在假阳性非常多的问题。一般认为，该问题可能会在过敏原上仅存在一处IgE表位时产生。另外还认为，过敏原与IgE的结合亲和力低，不能保持FcεRI的交联也会导致该问题。
在上述ex vivo试验法中，患者的嗜碱性粒细胞的激活被定量，若对该方法进行一些修正，则能够考察患者血清中的嗜碱性粒细胞依赖性IgE的激活。即，在该修正后的方法中，首先，从健康者中分离外周血嗜碱性粒细胞，对分离出的嗜碱性粒细胞进行酸处理，使所结合的IgE从该嗜碱性粒细胞上脱离。然后，通过来自受试者的血清中的IgE被动性致敏该嗜碱性粒细胞，考察该致敏所导致的抗原特异性的嗜碱性粒细胞的激活。但是，该方式耗费精力，并且不能始终使用同一名健康者的外周血，因此存在试验的重现性欠缺的问题。
作为解决这种问题的方法，多个小组提出了如下方法：使用例如被称为大鼠培养肥大细胞株的RBL-2H3细胞中稳定表达人FcεRI得到的培养细胞株，将其用过敏患者血清致敏，并添加特异抗原，测定此时的脱颗粒量。在能够通过患者血清中的IgE致敏表达人FcεRI的培养肥大细胞，并检测抗原所引起的FcεRI的交联的意义上，该方法具有开创性。然而，该方法的脱颗粒测定的灵敏度低，存在产生假阳性的几率高的问题。
通过上述专利文献1所述的方法，能够应对这些问题。在上述专利文献1所述的方法中，使用在细胞膜上具有对人IgE具有亲和力的Fc受体，并且可供转录因子结合的增强子的控制下，依次具有启动子及报告基因的细胞。作为该细胞的示例，上述专利文献1中公开了细胞株RS-ATL8细胞，而该细胞株RS-ATL8细胞是在RBL-2H3细胞中稳定表达人FcεRI而得到的培养细胞株RBL-SX38细胞中导入被转录因子Nuclear Factor of Activated T-cells(NE-AT)依赖性地诱导萤火虫荧光素酶基因表达的报告基因而得到的。在上述专利文献1所述的方法中，将该细胞与例如稀释100倍的患者血清等培养过夜，从而用IgE将其致敏，该致敏后，使该细胞与特异抗原接触。通过该接触诱导FcεRI的交联。通过该交联，经由包含所述转录因子的胞内信号传导表达荧光素酶。由此，能够非常灵敏地检测抗原或特异性IgE。该方法也被称为“IgE-Crosslinking-induced Luciferase Expression(EXiLE)法”。该方法的流程非常简单，适合大量样本的筛选。并且，该方法具有非常优异的性能，例如，在针对蛋白过敏患者的ROC曲线分析中，曲线下面积超过0.97等。世界各国的研究者都已经在利用该方式，例如截止至2019年8月，该方式已经在以欧美为主的十六个国家使用。
上述专利文献1所述的方法虽然能够灵敏地检测抗原及特异性IgE，但仍需要进一步提高灵敏度。一般认为，进一步提高灵敏度可以用于例如基于患者IgE的生物学意义的评价、微量过敏原的检测及抗过敏物质的高通量筛选。
本发明人等发现，包含编码人FcεRIα链中的胞外结构域的第一碱基序列和编码非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域的第二碱基序列的嵌合FcεRIα链基因对于提高过敏检查灵敏度极其有用。例如，导入有所述嵌合FcεRIα链基因的该非人动物的细胞(例如肥大细胞)优选用于有关人过敏的试验，例如能够用作用于极其灵敏地检查人的过敏的材料。例如，所述嵌合FcεRIα链基因可以在例如上述专利文献1所述的方法中使用，特别是可以被导入上述专利文献1所述的方法中使用的细胞中。
以下，参考图1及2对具有本发明的嵌合FcεRIα链基因的细胞的示例、以及利用该细胞检测抗原或IgE的机理进行说明。
图1所示的细胞1为非人动物细胞。细胞1包含本发明的嵌合FcεRIα链基因和报告基因。细胞1进一步包含该非人动物细胞的FcεRIγ链基因。该非人动物细胞可以进一步包含该非人动物细胞的FcεRIβ链基因。
在细胞1中，表达所述嵌合FcεRIα链基因、所述FcεRIβ链基因及所述FcεRIγ链基因，生成嵌合FcεRIα链蛋白质、FcεRIβ链蛋白质及FcεRIγ链蛋白质。如图1所示，一个嵌合FcεRIα链蛋白质、一个FcεRIβ链蛋白质及两个FcεRIγ链蛋白质(同源二聚体)缔合而形成的四聚物、即嵌合FcεRI在细胞1的细胞膜表面上被表达。需要说明的是，在树突状细胞中，嵌合FcεRI以由一个α链及两个γ链组成的三聚物的构象被表达。
该嵌合FcεRI的更为详细的示意图示于图2A。如图2A所示，该嵌合FcεRI是由嵌合FcεRIα链蛋白质(图2A中示作h+rα)、FcεRIβ链蛋白质(图2A中的rβ)及FcεRIγ链蛋白质得到同源二聚体(图2A中的rγ)组成的四聚物。该α链蛋白质包含来自人FcεRIα链的第一部分(图2A中由点表示的部分)和来自非人动物FcεRIα链的第二部分(图2A中由阴影表示的部分)。
需要说明的是，应理解，图1及2是用于说明的示意图，并不反映实时的状态。
所述第一部分包含人FcεRIα链中的胞外结构域。如字面上所示，该胞外结构域可以露出至胞外。该胞外结构域包含人FcεRIα链中的IgE结合性区域。
例如如图2A所示，该胞外结构域存在于胞外，该α链蛋白质能够经由该胞外结构域中所含的IgE结合性区域与人IgE(hIgE)结合。
所述第二部分包含非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域。另外，该跨膜结构域有助于与非人动物FcεRIγ链的结合，其包含例如发挥该结合性的一个或多个氨基酸残基。该第二部分可以进一步包含该非人动物FcεRIα链的胞内结构域。
例如，如图2A所示，所述α链蛋白质可以经由该跨膜结构域中的所述一个或多个氨基酸残基与所述γ链蛋白质结合。另外，如图2A所示，所述α链蛋白质通过该跨膜结构域停留于细胞膜。
所述FcεRIβ链蛋白质可以为所述非人动物中内源性存在的所述FcεRIβ链基因的表达产物。
所述FcεRIγ链蛋白质也可以为所述非人动物中内源性存在的所述FcεRIγ链基因的表达产物。
需要说明的是，上文所述的RS-ATL8细胞表达的FcεRI的示意图示于图2B。RS-ATL8细胞是向使RBL-2H3细胞稳定表达人FcεRI而得到的RBL-SX38细胞中稳定导入NF-AT依赖性萤火虫荧光素酶表达载体而得到的细胞。如图2B所示，认为在RS-ATL8细胞中表达的FcεRI的α链及γ链属于人FcεRI(由点表示的部分)，β链属于大鼠FcεRI(由阴影表示的部分)。在RS-ATL8细胞中表达的FcεRI由于其α链属于人FcεRI，因此能够与人IgE结合。
RS-ATL8细胞的FcεRI的α链整体属于人FcεRI，图2A中的本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质的胞外结构域属于人FcεRI，而跨膜结构域属于非人动物的FcεRI。
另外，上文所述的RBL-2H3细胞表达的FcεRI的示意图示于图2C。该FcεRI的α链、β链及γ链均来自大鼠，α链结合于大鼠IgE。
如图1所示，I型过敏由下述内容引起：(1)FcεRI与IgE结合(致敏)；(2)针对IgE的抗原(过敏原)与结合于FcεRI的IgE结合(结合)；(3)结合于一个抗原的多个IgE结合FcεRI之间交联(交联)；(4)细胞释放组胺及血清素等生理活性物质(脱颗粒)；(5)生理活性物质引起全身性应答。
通过确认被上述(3)的多个IgE结合FcεRI之间的交联诱导表达的报告基因的基因表达，能够检测例如结合于IgE的抗原(特别是特异性抗原)。
2.第一实施方式(嵌合FcεRIα链基因)
以下，参考图3A对本发明的嵌合FcεRIα链基因的构成例进行说明。图3A是用于对本发明的嵌合FcεRIα链基因的构成进行说明的示意图。在图3A中，页面左侧是该基因的5’端，页面右侧是该基因的3’端。
另外，在该示意图的下方示出图3B，图3B示出通过本发明的嵌合FcεRIα链基因的表达生成的本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质的构成例。在图3B中，页面左侧是该蛋白质的N端，页面右侧是该蛋白质的C端。
如图3A所示，本发明的嵌合FcεRIα链基因包含编码人FcεRIα链中的胞外结构域的第一碱基序列和编码非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域的第二碱基序列。所述第二碱基序列编码特别是非人动物FcεRIα链中的跨膜结构域及胞内结构域，该跨膜结构域可以发挥与非人动物FcεRIγ链的结合性。
本发明的嵌合FcεRIα链基因可以进一步包含编码用于使基于该基因生成的嵌合FcεRIα链在细胞膜上表达的信号序列的第三碱基序列。
如图3B所示，通过本发明的嵌合FcεRIα链基因的表达生成的嵌合FcεRIα链蛋白质可以包含人FcεRIα链中的胞外结构域1和非人动物FcεRIα链中的跨膜结构域2及胞内结构域3。该胞外结构域1可以包含IgE结合性区域。该跨膜结构域2发挥与非人动物FcεRIγ链的结合性，可以包含发挥该结合性的一个或多个氨基酸残基。该嵌合FcεRIα链蛋白质可以进一步包含用于使该蛋白质在细胞膜上表达的信号序列4。
如上所述，所述嵌合FcεRIα链基因中所含的所述第一碱基序列对应于所述嵌合FcεRIα链蛋白质中所含的所述胞外结构域。所述第二碱基序列对应于所述跨膜结构域及所述胞内结构域。所述第三碱基序列对应于所述信号序列。
如图3A所示，所述第一至第三碱基序列从5’端起按照所述第三碱基序列、所述第一碱基序列及所述第二碱基序列的顺序依次排列。
如图3B所示，所述胞外结构域、所这跨膜结构域、所述胞内结构域及所述信号序列从N端起按照所述信号序列、所述胞外结构域、所述跨膜结构域及所述胞内结构域的顺序依次排列。另外，可以在这些区域之间插入或不插入一个以上的氨基酸残基。
(1)第一碱基序列
如上所述，所述第一碱基序列编码人FcεRIα链中的胞外结构域。该胞外结构域包含人FcεRIα链中的IgE结合性区域。该IgE结合性区域可以为结合于人的IgE的区域。
所述第一碱基序列优选包含与序列ID No.7的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。由该碱基序列编码的氨基酸序列优选用于对于IgE的结合性，其用作IgE结合性区域。
序列ID No.7如下所述。序列ID No.7是与后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号110～183对应的碱基序列。
序列ID No.7
在更优选的实施方案中，所述第一碱基序列可以包含与以下的序列ID No.3的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。由该碱基序列编码的氨基酸序列优选用于对IgE的结合性，并且也优选用于保持用来实现IgE结合性的结构。由该碱基序列编码的氨基酸序列可以构成本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质中的整个胞外结构域。
序列ID No.3为与后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号26～205对应的碱基序列。
序列ID No.3：
另外，所述第一碱基序列可以编码用作免疫球蛋白结构域的两个氨基酸序列。
该两个氨基酸序列中的一个为序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号44～108的氨基酸序列。编码该氨基酸序列的碱基序列对应于例如序列ID No.1中的碱基编号130～324。
该两个氨基酸序列中的另一个为序列ID No.8的氨基酸序列中的氨基酸残基编号121～194的氨基酸序列。编码该氨基酸序列的碱基序列对应于例如序列ID No.1中的碱基编号361～582。
另外，用作免疫球蛋白结构域的以上两个氨基酸序列之间的区域也被称为接头区域。该接头区域为序列ID No.8的氨基酸序列中的氨基酸残基编号109～120的氨基酸序列。编码该接头区域的碱基序列对应于例如序列ID No.1中的碱基编号325～360。
针对这些碱基序列，也允许如上述针对序列ID No.3所述的序列同源性。
需要说明的是，在本说明书中，碱基序列(或氨基酸序列)的“序列同源性”是，将两个碱基序列(或氨基酸序列)比对，以使待比较的两个碱基序列(或氨基酸序列)的碱基(或氨基酸残基)尽可能多地匹配，用匹配的碱基数(或匹配的氨基酸残基数)除以总碱基数(或总氨基酸残基数)后用百分率表示而得到的。所述比对化及所述百分率的计算可以使用如BLAST等熟知的算法来进行。
(2)第二碱基序列
如上所述，第二碱基序列至少编码非人动物FcεRIα链中的跨膜结构域。该跨膜结构域具有与γ链结合的功能。为了发挥该功能，该跨膜结构域可以包含参与和非人动物FcεRI的γ链的结合的氨基酸残基。例如，后述的跨膜结构域中包含的Asp可以参与该结合。
所述非人动物为例如啮齿类的动物，优选为大鼠、小鼠或仓鼠，更优选为大鼠或小鼠，特别优选为大鼠。
另外，第二碱基序列还可以进一步编码除所述跨膜结构域之外还包含该非人动物FcεRIα链中的该胞内结构域的区域。
特别优选地，第二碱基序列可以编码包含非人动物FcεRIα链中的该跨膜结构域及该胞内结构域两者的区域。并且，该跨膜结构域可以具有与所述非人动物FcεRIγ链结合的功能，可以包含用于发挥该功能的所述Asp。该Asp可以为后述序列ID No.12中的氨基酸编号219的Asp。
所述第二碱基序列优选包含与序列ID No.5的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列、以及与序列IDNo.6的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。由这样的碱基序列编码的氨基酸序列优选用于与非人动物FcεRIγ链的结合。
与序列ID No.5的碱基序列具有所述序列同源性的碱基序列对应于非人动物FcεRIα链的跨膜结构域。
与序列ID No.6的碱基序列具有所述序列同源性的碱基序列对应于非人动物FcεRIα链的胞内结构域。
序列ID No.5及序列ID No.6如下所述。
序列ID No.5为与后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号206～224(跨膜结构域)对应的碱基序列。
序列ID No.6是与该氨基酸序列中的氨基酸残基编号225～246(胞内结构域)对应的碱基序列。
序列ID No.5：
序列ID No.6：
在所述第二碱基序列中，与序列ID No.5的碱基序列具有所述序列同源性的所述碱基序列位于5’端侧，并且，与序列ID No.6的碱基序列具有所述序列同源性的所述碱基序列位于3’端侧。在以上两个碱基序列之间，可以不插入碱基序列(即，后者的碱基序列紧邻前者的碱基序列之后)，也可以插入例如15碱基～75碱基(相当于5氨基酸残基～25氨基酸残基)、特别是21碱基～60碱基(相当于7氨基酸残基～20氨基酸残基)、更特别是30碱基～45碱基(相当于10氨基酸残基～15氨基酸残基)、更特别是36碱基(相当于12氨基酸残基)。
编码包含所述跨膜结构域及所述胞内结构域两者的区域的所述第二碱基序列包含与序列ID No.4的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。被这种碱基序列编码的氨基酸序列优选用于与非人动物FcεRIγ链结合。
序列ID No.4如下所述。序列ID No.4为与后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号206～246(跨膜结构域及胞内结构域)对应的碱基序列。
序列ID No.4：
(3)第三碱基序列
如上所述，第三碱基序列编码用于使基于该基因生成的嵌合FcεRIα链在细胞膜上表达的信号序列。例如，可以编码用于引起嵌合FcεRIα链蛋白质的跨膜(特别是1次跨膜)的信号序列。
在本发明的一个实施方案中，该信号序列可以为例如人的FcεRIα链蛋白质中所含的信号序列，或者也可以为非人动物的FcεRIα链蛋白质中所合的信号序列。优选地，该信号序列为人的FcεRIα链蛋白质中所含的信号序列。由所述第三碱基序列编码的该信号序列使基于本发明的嵌合FcεRIα链基因生成的嵌合FcεRIα链蛋白质在细胞膜上表达。
在本发明的其它实施方案中，该信号序列可以为Igκ中所含的信号序列，例如可以为人Igκ或非人动物Igκ中所含的信号序列。该信号序列也可以使嵌合FcεRIα链蛋白质在细胞膜上表达。
所述第三碱基序列优选包含与序列ID No.2的碱基序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。这样的碱基序列对于嵌合FcεRIα链蛋白质在细胞膜上表达是优选的。
序列ID No.2如下所述。序列ID No.2为与后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号1～25(信号序列)对应的碱基序列。
序列ID No.2：
(4)嵌合FcεRIα链基因整体
本发明的嵌合FcεRIα链基因优选具备与序列ID No.1的碱基序列具有50％以上、更优选为60％以上、进一步更优选为70％以上、进一步更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的碱基序列。
序列ID No.1如下所述。序列ID No.1为编码后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列的碱基序列。
序列ID No.1：
序列ID No.1～No.7在考虑啮齿类的动物的密码子使用频率、特别是大鼠的密码子使用频率的同时被优化。因此，所述非人动物优选为啮齿类的动物，更优选为大鼠、小鼠或仓鼠，特别优选为大鼠。
(制造方法)
本发明的嵌合FcεRIα链基因能够通过例如本技术领域中已知的人工基因合成技术来制造。能够通过例如化学合成法或酶法来制造该嵌合FcεRIα链基因。
另外，本发明的嵌合FcεRIα链基因可以通过使用限制酶和/或PCR使多个基因组件结合来制造，或者也可以通过对非人动物细胞(特别是大鼠细胞)的FcεRIα链基因进行基因组编辑来制造。
3.第二实施方式(嵌合FcεRIα链蛋白质)
本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质的构成例示于图3B。该构成例如上述“2.第一实施方式(嵌合FcεRIα链基因)”中所述。即，该嵌合FcεRIα链蛋白质包含人FcεRIα链中的胞外结构域和非人动物FcεRIα链中的跨膜结构域。该嵌合FcεRIα链蛋白质还可以包含非人动物FcεRIα链中的胞内结构域。
所述胞外结构域可以包含人FcεRIα链中的IgE结合性区域。另外，所述跨膜结构域可以有助于与非人动物FcεRIα链中的非人动物FcεRIγ链的结合。
另外，该嵌合FcεRIα链蛋白质还可以进一步包含用于使该蛋白质在细胞膜上表达的信号序列。
(1)胞外结构域
所述胞外结构域包含所述IgE结合性区域，如上所述，该区域可以为人FcεRIα链中的结合于人IgE的区域。所述胞外结构域可以为例如对应于上述本发明的嵌合FcεRIα链基因中所含的所述第一碱基序列的结构域。即，所述胞外结构域可以具有由所述第一碱基序列编码的氨基酸序列。
所述胞外结构域可以优选包含与序列ID No.14的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。这样的氨基酸序列用作所述IgE结合性区域。
序列ID No.14如下所述。序列ID No.14对应于后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号110～183。序列ID No.14的氨基酸序列也可以为由序列ID No.7的碱基序列编码的氨基酸序列。
序列ID No.14：
在更优选的实施方案中，所述胞外结构域可以为与以下的序列ID No.10的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。该氨基酸序列优选用于对IgE的结合性，并且也优选用于保持用来实现IgE结合性的结构。该氨基酸序列可以构成本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质中的胞外结构域整体。
序列ID No.10为后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号26～205的氨基酸序列。
序列ID No.10：
另外，所述胞外结构域可以包含两个免疫球蛋白结构域。该两个免疫球蛋白结构域中的一个可以由序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号44～108的氨基酸序列形成。该两个氨基酸序列中的另一个可以由序列ID No.8的氨基酸序列中的氨基酸残基编号121～194的氨基酸序列形成。
另外，用作免疫球蛋白结构域的以上两个氨基酸序列之间的区域也被称为接头区域。该接头区域可以由序列ID No.8的氨基酸序列中的氨基酸残基编号109～120的氨基酸序列形成。
针对这些氨基酸序列，也允许如上述针对序列ID No.10所述的序列同源性。
这样的氨基酸序列适合用于对IgE的结合。
(2)跨膜结构域及胞内结构域
所述跨膜结构域可以具有与所述非人动物FcεRIγ链结合的功能。为了发挥该功能，所述跨膜结构域可以包含发挥该功能的一个或多个氨基酸残基。例如，后述的跨膜结构域中所含的Asp可以参与该结合。
即，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以至少包含非人动物FcεRIα链的跨膜结构域。并且，该跨膜结构域可以包含对于与所述非人动物FcεRIγ链的结合发挥功能的一个或多个氨基酸残基。该跨膜结构域可以包含例如所述Asp来作为这样的氨基酸残基。
另外，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以进一步包含该非人动物FcεRIα链的胞内结构域。特别优选地，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质包含该非人动物FcεRIα链的跨膜结构域及胞内结构域两者。
所述跨膜结构域可以优选包含与序列ID No.12的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。
与序列ID No.12的氨基酸序列具有所述序列同源性的氨基酸序列对应于非人动物FcεRIα链的跨膜结构域。
所述胞内结构域可以优选包含与序列ID No.13的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。这样的氨基酸序列优选用于与非人动物FcεRIγ链的结合。
与序列ID No.13的氨基酸序列具有所述序列同源性的氨基酸序列对应于非人动物FcεRIα链的胞内结构域。
序列ID No.12及序列ID No.13如下所述。
序列ID No.12为后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号206～224(跨膜结构域)。序列ID No.12的氨基酸序列也可以为由序列ID No.5的碱基序列编码的氨基酸序列。
序列ID No.13为与该氨基酸序列中的氨基酸残基编号225～246(胞内结构域)对应的碱基序列。序列ID No.13的氨基酸序列也可以为由序列ID No.6的碱基序列编码的氨基酸序列。
序列ID No.12：
序列ID No.13：
从对于非人动物FcεRIγ链的良好的结合性的观点出发，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以包含序列ID No.12的氨基酸序列和序列ID No.13的氨基酸序列两者。
与序列ID No.12的氨基酸序列具有所述序列同源性的所述氨基酸序列可以位于N端侧，并且，与序列ID No.13的氨基酸序列具有所述序列同源性的所述氨基酸序列可以位于C端侧。在以上两个氨基酸序列之间，可以不插入氨基酸残基(即，后者的氨基酸序列紧邻前者的氨基酸序列之后)，也可以插入例如5氨基酸残基～25氨基酸残基、特别是7氨基酸残基～20氨基酸残基、更特别是10氨基酸残基～15氨基酸残基、更特别是12氨基酸残基。
在本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质包含该非人动物FcεRIα链的跨膜结构域及胞内结构域两者的情况下，该蛋白质可以优选包含与序列ID No.11的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。
与序列ID No.11的氨基酸序列具有所述序列同源性的氨基酸序列对应于非人动物FcεRIα链的跨膜结构域及胞内结构域。
序列ID No.11如下所述。
序列ID No.11：
序列ID No.11为后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号206～246(跨膜结构域及胞内结构域)。序列ID No.11的氨基酸序列还可以为由序列ID No.4的碱基序列编码的氨基酸序列。
(3)信号序列
如上所述，所述信号序列为用于使嵌合FcεRIα链在细胞膜上表达的信号序列。所述信号序列促进本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质向细胞膜转移。
所述信号序列优选包含与序列ID No.9的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。这样的氨基酸序列对于嵌合FcεRIα链蛋白质向细胞膜表达是优选的。
序列ID No.9如下所述。序列ID No.9为后述的序列ID No.8(本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质)的氨基酸序列中的氨基酸残基编号1～25(信号序列)。另外，序列ID No.9的氨基酸序列还可以为由序列ID No.2的碱基序列编码的氨基酸序列。
序列ID No.9：
(4)嵌合FcεRIα链蛋白质
本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质优选具备与序列ID No.8的氨基酸序列具有70％以上、更优选为80％以上、进一步更优选为85％以上、特别优选为90％以上、92％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上的序列同源性的氨基酸序列。
序列ID No.8如下所述。
序列ID No.8：
另外，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以进一步包含非人动物FcεRIγ链的胞内结构域。由此，该α链蛋白质能够在表达本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质的细胞中发挥γ链的作用，该细胞中可以不表达γ链。
另外，本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以进一步包含例如Lyn或Syk等酪氨酸激酶的激酶结构域。该激酶结构域可以插入与序列ID No.13的氨基酸序列具有所述序列同源性的氨基酸序列的下游。能够通过该激酶结构域来调控表达本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质的细胞中的信号传导，能够控制例如脱颗粒等过敏应答。
通过这些组件，能够不依赖宿主细胞的γ链或酪氨酸激酶来诱导胞内信号传导。需要说明的是，在包含这些组件的情况下，为了进行该诱导，所述嵌合FcεRIα链蛋白质可以优选包含例如CD8或IL2Ra的跨膜结构域作为跨膜结构域。
本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质可以使用本发明的嵌合FcεRIα链基因来生成。例如，通过在该基因中所含的第二碱基序列编码的跨膜结构域所来自的非人动物的细胞中表达本发明的嵌合FcεRIα链基因，可以生成本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质。例如，可以在导入有该基因的细胞的细胞膜上表达本发明的嵌合FcεRIα链蛋白质。
4.第三实施方式(载体)
本发明还提供包含所述嵌合FcεRIα链基因的载体。能够通过该载体将该基因导入非人动物细胞。该载体在向非人动物细胞导入时可以进行或不进行线性化。
所述载体可以通过例如向本技术领域中已知的质粒插入所述嵌合FcεRIα链基因来制造。该质粒具有例如至少一个克隆位点，所述嵌合FcεRIα链基因可以利用该克隆位点被插入该质粒。
质粒的种类可以由本领域技术人员根据非人动物细胞的种类适当选择，作为质粒的示例，能够列举例如pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司)。
本发明的载体可以包含例如Kozak序列。能够通过该Kozak序列提高翻译开始效率。该Kozak序列可以由例如所述嵌合FcεRIα链基因的开始密码子、紧邻该开始密码子之前(5’端侧)的1碱基～6碱基、以及紧邻该开始密码子之后(3’端侧)的1碱基～6碱基(特别是1碱基)组成。
5.第四实施方式(细胞)
本发明还提供包含所述嵌合FcεRIα链基因、所述嵌合FcεRIα链蛋白质或所述载体的非人动物的细胞。
所述嵌合FcεRIα链基因可以整合于例如所述非人动物的细胞的染色体，或者也可以整合于已导入所述非人动物的细胞内的载体内。为了进行稳定表达，优选所述嵌合FcεRIα链基因整合于所述非人动物的细胞的染色体。
本发明的细胞优选进一步包含所述非人动物细胞的FcεRI的γ链的基因。并且，本发明的细胞可以形成包含基于所述嵌合FcεRIα链基因生成的嵌合FcεRIα链蛋白质和所述细胞的FcεRI的γ链蛋白质的缔合体。该缔合体中可以包含一个该α链和两个该γ链。即，作为该γ链基因的表达产物的非人动物FcεRIγ链蛋白质可以与所述嵌合FcεRIα链蛋白质形成缔合体。该缔合体用作人IgE的Fc受体，形成高亲和力地结合有人IgE的复合物。一个抗原通过与多个(例如两个)该IgE结合，使多个(例如两个)该复合物交联，从而产生过敏反应。如此一来，通过使所述非人细胞进一步包含所述γ链基因，所述非人细胞能够引起过敏反应，这可以用于执行各种过敏检查。
本发明的细胞更优选进一步包含所述非人动物细胞的FcεRI的β链的基因。通过基于该β链基因生成的非人动物FcεRI的β链能够增强由所述交联引起的信号传导。
所述γ链基因及所述β链基因可以内源性存在于所述非人动物，例如可以天然存在于所述非人动物细胞的染色体内。例如，大鼠的γ链基因及β链基因的序列信息可以从NCBI Reference Sequence数据库获得。例如大鼠的γ链基因的信息(包含序列信息)可以从网页(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001131001)获得。另外，大鼠的β链基因的信息(包含序列信息)可以由网页(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22923.1)获得。另外，由这些基因表达的蛋白质的氨基酸序列信息能够从uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)获得。
本发明的细胞可以形成包含基于所述嵌合FcεRIα链基因生成的嵌合FcεRIα链、所述细胞的非人动物FcεRI的β链和所述细胞的非人动物FcεRI的γ链的缔合体。该缔合体中可以包含一个该α链、一个该β链以及两个该γ链。即，该缔合体为四聚物，本发明的细胞可以配置为形成该四聚物。可以通过该四聚物来增强参与所述过敏反应的信号传导。由此，能够更灵敏地执行使用该细胞的过敏检查。
本发明的细胞更优选进一步包含通过所述缔合体彼此的交联诱导表达的报告基因。能够通过该报告基因灵敏地执行使用该细胞的过敏检查。
如上所述，该报告基因为通过所述缔合体彼此的交联诱导表达的基因。被这样诱导的基因优选配置为由通过所述交联激活后的转录因子来诱导表达。该转录因子可以为选自NF-AT、NF-κB、AP-1、Elk-1、Egr-1、GATA-1及GATA-2组成的组中的任意一种，优选为NF-AT。NF-AT的激活适合用于从受试物质中检测可能对受试者引发I型过敏的过敏原。
例如，该报告基因可以处于可供所述激活转录因子结合的增强子的控制下。启动子可以配置于该报告基因的上游。例如，本发明的细胞包含所述增强子和该增强子控制下的启动子及报告基因。所述增强子、所述启动子及所述报告基因可以通过例如具有包含这三个元件的区域(以下也称为“报告基因区域”)的载体(例如质粒)来导入所述细胞。该报告基因区域可以被导入所述非人动物细胞的染色体内，或者也可以存在于所述非人动物细胞中的载体内。优选该报告基因区域被导入所述非人动物细胞的染色体内。由此，可以稳定表达该报告基因。该报告基因区域可以通过例如同源重组被导入染色体内。
所述增强子的序列可以由本领域技术人员根据所述转录因子的种类适当选择，可以为例如以下表1所示的序列中的任意一种。以下的表1的左列中记载有增强子序列。各增强子序列被括号括起，该括号外记载的数字是增强子序列的反复次数的示例。在本技术中，报告基因中所含的增强子的增强子序列反复次数不限定于表1中记载的数目，可以为例如1～15、2～15、特别是2～10、更特别是3～10中的任意数。表1的右列中记载了结合于各增强子序列的转录因子。
[表1]
表1：增强子序列
| 增强子序列 | 转录因子 |
| (TGACTAA)7 | AP-1 |
| (TGACTAA)6 | AP-1 |
| (GGGGTGGGGN)3 | Egr-1 |
| (GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGT)4 | NF-AT |
| (TGGGGACTTTCCGC)5 | NF-κB |
所述启动子可以为具有供包含细胞的RNA聚合酶的复合物结合的序列的启动子，例如可以为具有TATA盒的启动子，优选为可以具有序列TATATAA的启动子。
所述报告基因可以为例如编码酶的基因、编码荧光蛋白的基因及编码表面抗原(可以内源性存在于所述非人动物)的基因中的任意一种。
所述编码酶的基因可以为例如荧光素酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶及辣根过氧化物酶中的任意一种或一种以上。
所述编码荧光蛋白的基因可以为例如绿色荧光蛋白(GFP)、Sirius、EBFP、ECFP、EGFP、Venus及DsRed中的任意一种或一种以上。
本发明的非人动物细胞可以具有一个或一个以上相同或不同种类的报告基因。优选本发明的非人动物细胞可以包含1、2、3、4或5个报告基因。
本发明的细胞可以为非人动物的细胞。所述非人动物可以为例如啮齿类的动物，优选为大鼠、小鼠或仓鼠，更优选为大鼠。
本发明的非人动物细胞优选为配置为使所述嵌合FcεRIα链蛋白质和来自该非人动物细胞的FcεRIγ链蛋白质形成缔合体的细胞，更优选为配置为使所述嵌合FcεRIα链蛋白质和来自该非人动物细胞的FcεRIβ链蛋白质及FcεRIγ链蛋白质形成缔合体的细胞。作为这样的细胞，能够列举例如：肥大细胞(肥厚细胞)、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞及朗格汉斯细胞。即，本发明的细胞可以为以上所列举的细胞中的任意一种，更优选为肥大细胞、嗜碱性粒细胞或树突状细胞，进一步更优选为肥大细胞。
本发明的非人动物细胞优选为大鼠的肥大细胞、嗜碱性粒细胞或者树突状细胞或小鼠的肥大细胞、嗜碱性粒细胞或者树突状细胞，更优选为大鼠或小鼠的肥大细胞。
本发明的非人动物细胞可以通过例如向由动物体内分离出的细胞或确立的细胞中导入所述嵌合FcεRIα链基因来得到。作为可用于本发明的该确立的细胞的示例，能够列举：作为大鼠肥大细胞株的RBL-2H3细胞(细胞编号：JCRB0023、可从国立研究开发法人医药基础、健康及营养研究所JCRB细胞库获得或细胞编号：CRL-2256、可从ATCC(商标)获得)及作为小鼠肥大细胞株的MC/9细胞(可从ATCC(商标)获得)，但不限定于此。
本发明的非人动物细胞可以为例如按照保藏编号：NITE BP-03230保藏的细胞。该细胞在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)中进行国际保藏，保藏日期为令和2年(2020年)6月17日。
本发明的非人动物细胞可以用于例如分析方法，例如可以用于以下“7.第六实施方式(分析方法)”中将说明的分析方法。
另外，本发明的非人动物细胞适合用作例如上述专利文献1所述的方法中的细胞。即，本发明的非人动物细胞可以用于上文所述的EXiLE法。
6.第五实施方式(分析用试剂盒)
本发明提供包含本发明的细胞的分析用试剂盒。所述试剂盒可以用于例如与过敏有关的分析或诊断。所述试剂盒是用于执行选自由例如过敏原性的评价、过敏的有无或风险的评价、针对IgE的分析、过敏抑制活性的评价及药物筛选组成的组中的至少一种试验。
本发明的试剂盒可以包含报告基因的表达检测用材料。在例如报告基因表达酶的情况下，该检测用材料可以包含该酶的基质，例如可以包含荧光素酶的基质。
本发明的试剂盒可以包含例如用于孵育本发明的细胞的孵育材料。该孵育用材料表示用于孵育所述细胞的材料，例如可以为孵育所述细胞的培养基或缓冲液。该孵育材料可以为例如用于致敏用孵育的孵育材料、用于细胞应答诱导用孵育的孵育材料。另外，该孵育材料还可以为致敏及细胞应答诱导两者的孵育材料。
作为所述培养基，能够列举例如MEM培养基，但不限定于此。该培养基可以包含例如胎牛血清等辅助成分。
作为所述缓冲液，能够列举例如PBS，但不限定于此。该PBS可以用作例如细胞清洗液。
本发明的试剂盒可以包含细胞致敏成分。该成分可以包含于上文所述的用于致敏用孵育的孵育材料，例如可以包含于培养基或缓冲液中。或者该成分可以在未包含于培养基或缓冲液的状态下包含于所述试剂盒。
该细胞致敏成分可以为能够使本发明的细胞致敏的成分。细胞致敏成分为例如IgE或嵌合IgE。该IgE可以为灵长类的IgE，例如可以为人或非人灵长类(特别是猴子)的IgE，优选为人的IgE。该IgE可以为精制或分离后的IgE，或者也可以为未精制或分离的IgE。另外，所述嵌合IgE还可以为例如Fc部人源化后的嵌合IgE。
该细胞致敏成分可以为生物材料，例如可以为全血、血清、血浆或血液中所含的成分(例如血液细胞)等。
本发明的试剂盒可以包含细胞应答诱导成分。该成分可以包含于上文所述的用于细胞应答诱导用孵育的孵育材料，例如可以包含于培养基或缓冲液中。或者该成分可以在不包含于培养基或缓冲液的状态下包含于所述试剂盒。
所述细胞应答诱导成分可以为例如结合于所述细胞致敏成分来诱导本发明的细胞的应答的成分，例如可以为结合于所述IgE或嵌合IgE的成分。细胞应答诱导成分可以为例如抗IgE抗体，或者也可以为与IgE或嵌合IgE结合的(例如特异性向结合的)抗原或抗原候选物质。
作为所述细胞应答诱导成分，该抗原或抗原候选物质可以为能够对例如受试者引起过敏反应(特别是I型过敏反应)的物质(即可能作为过敏原的物质)。作为该物质，能够列举例如：尘；埃；头皮屑等皮屑；杉木花粉、厚桤木花粉、稻科花粉、菊科花粉等花粉；霉菌等真菌；蠓和蟑螂等昆虫；昆虫及海产品等所具有的刺激性或毒性的物质；大豆、蛋类、小麦、牛乳、荞麦、落花生、虾、蟹等中所含的物质；青霉素等药剂中所含的物质；排泄物等中所含的来自动物身体的物质；小麦粉及木材加工时产生的粉尘等植物性物质；其它天然或化学合成物质，但不限定于此。例如，在想要检测蛋白是否为受试者的过敏原的情况下，能够使用例如卵清蛋白、卵类粘蛋白、溶菌酶等蛋白中存在的物质的精产品或蛋白提取物作为受试物质。在使用嵌合IgE作为IgE的情况下，也可以使用例如硝基苯基之类的低分子半抗原作为抗原。
本发明的试剂盒可以进一步包含试验中使用的阳性对照材料和/或阴性对照材料。阳性对照材料可以包含例如钙离子载体(例如离子霉素等)。阴性对照材料可以为例如培养基。
另外，本发明的试剂盒可以包含抑制转录因子的活性的物质，例如可以包含抑制NF-AT的活性的物质。该物质可以为例如环孢素A或他克莫司。需要说明的是，在本发明的试剂盒为抗过敏活性物质的筛选用试剂盒的情况下，该物质可以用作抗过敏活性物质的阳性对照。
本发明的试剂盒可以进一步包含药剂。
该药剂可以为致敏抑制剂，或者也可以为有望阻碍致敏的药剂。该药剂可以为例如结合于IgE或嵌合IgE的成分，例如可以为抗IgE抗体或抗嵌合IgE抗体。
该药剂可以为细胞应答抑制剂，或者也可以为有望阻碍细胞应答的药剂。该药剂可以为例如阻碍由FcεRI的交联引起的信号传导的信号传导抑制剂。
本发明的试剂盒可以进一步包含供用于试验的反应所进行的容器、特别是具有用于保持本发明的细胞的空间的容器。作为该容器的示例，能够列举例如孔板(96孔板等)。
7.第六实施方式(分析方法)
本发明还提供一种分析方法，所述分析方法使用本发明的细胞。该方法可以用于进行与过敏相关的分析或诊断。该方法可以包括：使用该细胞进行例如过敏原性的评价、过敏的有无或者风险的评价、针对IgE的分析、过敏抑制活性的评价或药物筛选。即，本发明的分析方法可以作为过敏原性的评价方法、过敏的有无或者风险的评价方法、IgE的分析方法、过敏抑制活性的评价方法或药物筛选方法。
本发明的方法可以按照例如执行上述专利文献1所述的方法的方式进行，即，可以按照执行EXiLE法的方式进行。
另外，本发明的方法可以用于抗原特异性IgE的二次筛选。例如，本发明的方法可以用于评价是否为生物学有意义的IgE、用于执行测定中和抗体的测试或用于执行交差反应性的测试。
另外，本发明的方法可以用于药物筛选、特别是高通量药物筛选。例如，本发明的方法可以用于选择或评价阻碍IgE与FcεRI的结合的物质或者选择或评价细胞(特别是肥大细胞或嗜碱性粒细胞等)的胞内信号传导阻碍的物质。
另外，本发明的方法可以用于基础科学研究。例如，本发明的方法可以用于机理分析或生物标志物探索。
本发明的方法可以包括例如孵育本发明的细胞的孵育工序和/或分析所述细胞的应答的分析工序。
在所述孵育工序中，可以孵育例如本发明的细胞。如下所述，所述孵育工序由两个以上孵育工序构成。
所述孵育工序可以包含例如在孵育用材料中孵育本发明的细胞。在本说明书中，“孵育用材料”表示用于孵育所述细胞的材料，可以为利用例如孵育所述细胞的培养基或缓冲液。
在所述分析工序中，可以分析本发明的细胞的应答。该分析可以为例如上述所说明的报告基因的表达的分析。该报告基因的表达可以为上述“5.第四实施方式(细胞)”中所说明的通过所述缔合体彼此的交联诱导的表达。报告基因的表达分析的具体的方式可以由本领域技术人员根据报告基因的种类适当选择。例如，在报告基因表达酶蛋白质的情况下，在分析工序中，可以分析利用该酶蛋白质的酶反应。例如，在酶蛋白质为荧光素酶的情况下，可以分析通过利用荧光素酶的基质分解所产生的发光。例如，在报告基因表达荧光蛋白的情况下，在分析工序中，可以分析由该荧光蛋白产生的荧光。
另外，所述分析可以为该细胞中的过敏应答的分析，特别是可以为I型过敏应答的分析。在该分析中，可以分析例如脱颗粒等过敏应答。
所述分析工序可以在所述孵育工序后执行，或者也可以在进行所述孵育工序期间执行。例如，所述分析工序可以在进行两个以上的孵育工序中的任意一个孵育工序期间(特别是进行最后的孵育工序期间)执行。
在本发明的一个实施方案中，所述孵育工序包括两个孵育工序。以下，也将这两个孵育工序称为“第一孵育工序”及“第二孵育工序”。第一孵育工序可以为致敏用孵育工序，其用于进行对本发明的细胞带来致敏的处理。第二孵育工序可以为细胞应答诱导用孵育工序，其诱导进行该处理后的细胞中的应答。
在该实施方案中，所述分析工序可以在例如进行第一孵育工序期间执行，也可以在第一孵育工序和所述第二孵育工序之间执行，还可以在进行所述第二孵育工序期间执行，或者也可以在所述第二孵育工序之后执行。
以下，分别对这些工序进行说明。
(1-1)第一孵育工序
所述第一孵育工序中使用的孵育用材料可以为致敏用材料或致敏分析用材料。即，所述第一孵育工序包括在致敏用材料或致敏分析用材料中孵育所述细胞。该材料可以为例如培养基或缓冲液。所述培养基或所述缓冲液的种类可以由本领域技术人员根据例如分析的目的等适当选择。例如，该培养基可以为MEM培养基。该材料可以包含辅助成分，例如可以包含胎牛血清(FBS)。该材料可以包含例如一种或两种以上的抗生物质作为辅助成分。
在本说明书中，“致敏用材料”是指用于致敏所述细胞的材料。该致敏用材料可以表示包含能够致敏所述细胞的成分(在本说明书中，也称为“细胞致敏成分”)的材料。
所述“细胞致敏成分”为例如IgE或嵌合IgE。该IgE或嵌合IgE可以为灵长类的IgE或嵌合IgE，例如可以为人或非人灵长类(特别是猴子)的IgE或嵌合IgE，优选为人的IgE或嵌合IgE。该IgE或嵌合IgE可以为精制或分离后的IgE或嵌合IgE，或者也可以为未精制或分离的IgE或嵌合IgE。
所述“包含能够致敏细胞的成分的材料”可以为例如包含细胞致敏成分的培养基或缓冲液，特别是包含该成分的培养基。
在本发明的一个实施方案中，所述致敏用材料可以为例如包含精制或分离后的IgE的材料(特别是培养基或缓冲液)。
在本发明的其它实施方案中，所述致敏用材料可以为包含已知包含IgE的生物成分(特别是来自灵长类的生物成分、来自人或非人灵长类(猴子)的生物成分)的材料(培养基或缓冲液)，更具体而言，可以为包含全血、血清或者血浆或血液构成成分(例如血液细胞)的材料(培养基或缓冲液)等。
在本说明书中，所述“致敏分析用材料”是指待进行有关是否能够致敏所述细胞的分析的材料。该致敏分析用材料可以表示可包含所述细胞致敏成分的材料。
所述“细胞致敏成分”可以如上文所述。
所述“可以包含细胞致敏成分的材料”可以为不清楚是否包含该成分的材料(培养基或缓冲液)，或者也可以已知包含该成分，但不清楚该成分的种类或含量的材料。例如，该材料可以为实施本发明的方法后判断其包含或不包含该成分的材料或判断该成分的含量和/或者种类的材料。
(1-2)第二孵育工序
所述第二孵育工序中使用的孵育用材料可以为细胞应答诱导用材料或细胞应答诱导分析用材料。即，所述第二孵育工序包括在细胞应答诱导用材料或细胞应答诱导分析用材料中孵育所述细胞。该材料可以为例如培养基或缓冲液。所述培养基或所述缓冲液的种类可以由本领域技术人员根据例如分析的目的等适当选择。例如，该培养基可以为MEM培养基。该材料可以包含辅助成分，例如可以为胎牛血清(FBS)。该材料可以包含例如一种或两种以上的抗生物质作为辅助成分。
在本说明书中，“所述细胞应答诱导用材料”可以为包含诱导细胞的应答的成分(以下，也称为“细胞应答诱导成分”)，特别是包含诱导致敏后的细胞的应答的成分的材料。
“所述细胞应答诱导用材料”除所述细胞应答诱导成分之外还可以包含或不包含上述所说明的细胞致敏成分。
所述细胞应答诱导成分可以为例如结合于所述细胞致敏成分而诱导本发明的细胞的应答的成分，例如，可以为结合于所述IgE或嵌合IgE的成分。细胞应答诱导成分可以为例如抗IgE抗体，或者也可以为与IgE或嵌合IgE结合(例如特异结合)的抗原或抗原候选物质。
通过所述细胞应答诱导成分诱导的细胞应答可以为例如上述所说明的报告基因的表达。特别是，该表达可以为通过所述缔合体彼此的交联诱导的表达。
另外，所述细胞应答可以为该细胞的过敏应答，特别是可以为与I型过敏相关的细胞应答。所述细胞应答可以为例如脱颗粒等过敏应答。
在本说明书中，所述“细胞应答诱导分析用材料”是指待分析其是否能细胞应答的材料。所述“细胞应答诱导分析用材料”可以表示例如可包含细胞应答诱导成分的材料，特别是可以表示可包含诱导致敏后的细胞的应答的成分。
所述“细胞应答诱导成分”可以如上文所述。
所述“可包含细胞应答诱导成分的材料”可以为不清楚是否包含该成分的材料(培养基或缓冲液)，或者也可以为已知包含该成分，但不清楚该成分的种类和/或含量的材料。例如，该材料可以为实施本发明的方法后判断包含或不包含该成分的材料或者判断该成分的含量和/或者种类的材料。
(1-3)分析工序
在所述分析工序中，分析所述细胞的应答。该应答可以为例如上述所说明的报告基因的表达。特别是，该表达可以为通过所述缔合体彼此的交联诱导的表达。报告基因的表达分析的具体方式可以由本领域技术人员根据报告基因的种类适当选择。例如，在报告基因表达酶蛋白质的情况下，可以在分析工序分析酶反应。例如，在酶蛋白质为荧光素酶的情况下，可以分析通过利用荧光素酶的基质分解产生的发光。例如，在报告基因表达荧光蛋白的情况下，可以在分析工序中进行荧光分析。
另外，所述应答可以为该细胞的过敏应答，特别是可以为与I型过敏相关的细胞应答，例如可以为胞内钙离子浓度升高或脱颗粒等过敏应答。这些过敏应答可以使用荧光指示剂来测定。
另外，为了分析所述应答，可以使用倏逝波来分析伴随过敏应答产生的细胞膜的折射率变化等。
(1-4)药剂的使用
在本发明的分析方法中，可以使用会影响本发明的细胞中的应答的药剂。该药剂可以为用于例如阻碍或抑制过敏反应的药剂，例如可以为致敏抑制剂或细胞应答抑制剂。该药剂可以用于例如所述第一孵育工序之前、执行所述第一孵育工序期间、所述第一孵育工序和所述第二孵育工序之间、执行所述第二孵育工序期间或所述第二孵育工序之后中的任意一个或两个以上的阶段。
通过使用该药剂执行本发明的方法，可以评价例如该药剂的过敏反应抑制活性。另外，通过使用各种药剂执行本发明的方法，还可以进行药物筛选。
该药剂在例如包含于上文所述的孵育材料中的状态下使用。该药剂在各工序中的使用例如下所述。
例如，在上述(1-1)中所述的所述第一孵育工序中，该药剂可以包含于致敏用材料或致敏分析用材料。在该情况下，该药剂可以为致敏抑制剂，或者也可以为有望阻碍致敏的药剂。该药剂可以为例如结合于IgE或嵌合IgE的成分，例如可以为抗IgE抗体或抗嵌合IgE抗体。可选地，该药剂可以为诱导受体的下调的药物。通过如上使用药剂，能够筛选具有抑制过敏反应(特别是I型过敏反应)的作用的药剂，或者也能够评价过敏反应抑制剂(特别是I型过敏反应抑制剂)的抑制作用。
可选地，可以在所述第一孵育工序之前使该药剂与所述致敏用材料或所述致敏分析用材料中所含的细胞致敏成分接触。通过在该接触后于所述致敏用材料或所述致敏分析用材料中孵育所述细胞，也可以进行所述筛选或所述评价。
另外，在上述(1-2)中所述的所述第二孵育工序中，该药剂可以包含于细胞应答诱导用材料或细胞应答诱导分析用材料。在该情况下，该药剂可以为细胞应答抑制剂，或者也可以为有望阻碍细胞应答的药剂。该药剂可以为阻碍例如由FcεRI的交联所引起的信号传导的信号传导抑制剂。作为该药剂的示例，能够列举：例如环孢素及他克莫司等钙调磷酸酶抑制剂；例如Genistein，Herbimycin A及Piceatannol等酪氨酸激酶抑制剂；例如U73122等PLC抑制剂；例如Wortmannin等PI3-kinase抑制剂；以及例如BAPTA-AM等胞内钙离子螯合剂，但不限定于此。
通过如上使用药剂，也可以筛选具有抑制过敏反应(特别是I型过敏反应)的作用的药剂，或者也可以评价过敏反应抑制剂(特别是I型过敏反应抑制剂)的抑制作用。
可选地，在所述第一孵育工序与所述第二孵育工序之间，使该药剂与所述细胞应答诱导用材料或所述细胞应答诱导分析用材料中所含的细胞应答诱导成分接触。也可以通过在该接触后于所述细胞应答诱导用材料或所述细胞应答诱导分析用材料中孵育所述细胞来进行所述筛选或所述评价。
(1-5)过敏原性评价的示例
在该示例中，所述第二孵育工序中使用的细胞应答诱导成分(特别是抗原或抗原候选物质)被用作受试试样，可以评价该细胞应答诱导成分的过敏原性。
在该示例中，在所述第一孵育工序中，于例如包含从对象(人)得到的IgE或含IgE血清的致敏用材料中孵育本发明的细胞。由此，通过该对象的IgE致敏该细胞。
接着，在所述第二孵育工序中，于包含作为受试试样的抗原的细胞应答诱导用材料中，孵育所述致敏后的细胞。由此，通过该抗原，在本发明的细胞的细胞膜上形成如上所述的缔合体，接着，可以通过形成该缔合体来形成例如报告基因。
接着，在所述分析工序中，分析细胞应答。例如，在分析工序中，可以分析该报告基因的表达。通过分析该表达，能够评价所述抗原对于所述对象的过敏原性。
(1-6)过敏的有无或者风险的评价
在该示例中，所述第一孵育工序中使用的细胞致敏成分(特别是IgE或含IgE生物成分)被用作受试试样，可以评价该细胞致敏成分所来自的对象对于规定抗原的过敏(特别是I型过敏)的有无或者风险。
在该示例中，在所述第一孵育工序中，于例如包含从对象(人)得到的IgE或含IgE生物成分(特别是含IgE血清)的致敏用材料中孵育本发明的细胞。由此，通过该对象的IgE致敏该细胞。
接着，在所述第二孵育工序中，于包含规定的抗原的细胞应答诱导用材料中孵育所述致敏后的细胞。由此，通过该抗原在本发明的细胞的细胞膜中形成如上所述的缔合体，并且，通过形成该缔合体，可以表达例如报告基因。
接着，在所述分析工序中，分析该报告基因的表达。通过分析该表达，能够评价所述对象对于所述规定的抗原的过敏的有无或风险。
(1-7)针对IgE的分析
在该示例中，所述第一孵育工序中使用的细胞致敏成分(特别是IgE或含IgE生物成分)被用作受试试样，可以进行该细胞致敏成分自身的分析。
在该示例中，在所述第一孵育工序中，于例如包含从对象(人)得到的IgE或含IgE生物成分(特别是含IgE血清)的致敏用材料中孵育本发明的细胞。由此，通过该对象的IgE致敏该细胞。
接着，在所述第二孵育工序中，于包含规定的抗原的细胞应答诱导用材料中孵育所述致敏后的细胞。由此，通过该抗原在本发明的细胞的细胞膜上形成如上所述的缔合体，并且，通过形成该缔合体，可以表达例如报告基因。
接着，在所述分析工序中，进行该报告基因的表达。通过分析该表达，能够进行IgE的评价。
(1-8)过敏抑制活性的评价方法
在该示例中，药剂被用作受试试样，能够评价由该药剂引发的过敏反应抑制活性。
在该示例中，在所述第一孵育工序中，于例如包含IgE或含IgE生物成分(特别是含IgE血清)的致敏用材料中孵育本发明的细胞。由此，通过该对象的IgE致敏该细胞。
接着，在所述第二孵育工序中，于规定的细胞应答诱导用材料中孵育所述致敏后的细胞。由此，通过该抗原在本发明的细胞的细胞膜上形成如上所述的缔合体，并且，通过形成该缔合体，可以表达例如报告基因。
其中，具有过敏抑制活性的物质或认为其具有过敏抑制活性的物质(药剂)包含在所述致敏用材料或所述细胞应答诱导用材料中。在该物质包含于所述致敏用材料中的情况下，该物质可以用作致敏抑制剂。在该物质包含于所述细胞应答诱导用材料中的情况下，该物质可以用作细胞应答抑制剂。
接着，在所述分析工序中，分析该报告基因的表达。通过分析该表达，能够评价该物质的过敏抑制活性。
(1-9)药物筛选
在该示例中，各种药剂被用作受试试样，评价由该各种药剂引发的过敏反应抑制活性。并且，能够选择具有更好的过敏反应抑制活性的药剂。
在该示例中，在所述第一孵育工序中，于例如包含IgE或含IgE生物成分(特别是含IgE血清)的致敏用材料中孵育本发明的细胞。由此，通过该对象的IgE致敏该细胞。
接着，在所述第二孵育工序中，于规定的细胞应答诱导用材料中孵育所述致敏后的细胞。由此，通过该抗原在本发明的细胞的细胞膜上形成如上所述的缔合体，并且，通过形成该缔合体，可以表达例如报告基因。
其中，认为其具有过敏抑制活性的各种物质分别包含于所述致敏用材料或所述细胞应答诱导用材料。在该各种物质包含于所述致敏用材料的情况下，该各种物质有望用作致敏抑制剂。在该各种物质包含于所述细胞应答诱导用材料的情况下，该各种物质有望用作细胞应答抑制剂。
接着，在所述分析工序中，分析分别使用该各种物质时的该报告基因的表达。通过分析该表达，可以从该各种物质中选择具有更好过敏抑制活性的物质。
8.实施例
(1)嵌合FcεRIα链基因的合成
通过人工基因合成制造在人FcεRIα链的胞外结构域上连接大鼠FcεRIα链的跨膜结构域及胞内结构域而成的嵌合受体(人-大鼠嵌合FcεRIα链，Human-Rat chimeric FcεRIαchain)基因。该基因的碱基序列及由该基因编码的氨基酸序列示于图4。在图4中，上段为碱基序列，下段表示翻译后的氨基酸序列。图4所示的碱基序列及氨基酸序列分别与序列IDNo.1的碱基序列及序列ID No.8的氨基酸序列相同。另外，图4所示的碱基序列及氨基酸序列和所述嵌合受体蛋白质的结构及功能的关系示于图19。
如图19所示，图4所示的氨基酸序列中的氨基酸残基编号1～25为信号序列，氨基酸残基编号26～205为胞外结构域，氨基酸残基编号206～224为跨膜结构域，并且，氨基酸残基编号225～246为胞内结构域。
构成所述胞外结构域的氨基酸残基编号26～205的氨基酸序列与序列ID No.10所示的序列相同。所述胞外结构域包含IgE结合性区域，该IgE结合性区域为氨基酸残基编号110～183。氨基酸残基编号110～183的氨基酸序列与序列ID No.14所示的序列相同。如图19所示，在该IgE结合性区域中所含的氨基酸残基中，特别是S110、D111、W112、W135、W138、K142、I144、A151、Y154、W155、Y156、E157、W181、Q182及L183是与和IgE的结合性相关的氨基酸。在这些氨基酸中，K142、1144、A151、Y154、W155、Y156及E157形成第一个IgE结合性部位，S110、D111、W112、W135、W138、W181、Q182及L183形成第二个IgE结合性部位。
另外，氨基酸残基编号44～108及121～194为免疫球蛋白结构域。
所述跨膜结构域的氨基酸序列为大鼠的FcεRIα链中所含的跨膜结构域的氨基酸序列。氨基酸残基编号206～224的序列与序列ID No.12所示的序列相同。另外，序列IDNo.5所示的序列为编码该跨膜结构域的氨基酸序列的碱基序列的示例。如图19所示，所述跨膜结构域发挥与γ链的结合性，作为带电氨基酸的D219为特别与γ链结合性相关的氨基酸。
所述胞内结构域的氨基酸序列为大鼠的FcεRIα链中所含的胞内结构域的氨基酸序列。氨基酸残基编号225～246的序列与序列ID No.13所示的序列相同。另外，序列IDNo.6所示的序列为编码该胞内结构域的氨基酸序列的碱基序列的示例。
所述信号序列为人的FcεRIα链中所含的信号序列。氨基酸残基编号1～25的序列与序列ID No.9所示的序列相同。另外，序列ID No.2所示的序列为编码该信号序列的氨基酸序列的碱基序列的示例。
序列ID No.1的碱基序列在考虑大鼠的密码子使用频率的同时被优化，以在大鼠的培养细胞中更有效表达基因。另外，优化前的碱基序列为图5所示的序列ID No.15的碱基序列。下面，将这两个碱基序列比较，以说明序列ID No.1的碱基序列所具有的特征。
序列ID No.15的碱基序列的密码子适应指数(Codon Adaptation Index，CAI)为0.72。另一方面，序列ID No.1的碱基序列的对于大鼠的所述密码子适应指数为0.83。密码子适应指数越高越优选，最高为1，优选为0.8以上，更优选为大于0.8，一般认为，此时细胞中的基因表达水平高，故优选。
序列ID No.1的碱基序列的密码子适应指数比序列ID No.15的碱基序列更高，因此更适合用于在大鼠细胞中的表达。
本发明的嵌合FcεRIα链基因的碱基序列的密码子适应指数可以为例如0.7以上，优选为0.8以上，更优选为超过0.8，进一步更优选为0.81以上、0.82以上。该密码子适应指数可以为例如1.0以下、0.99以下或0.95以下。
密码子适应指数可以用作，基于核糖体相关基因等高表达基因的同义密码子使用频率的偏向，根据这些高表达基因的密码子偏倚和待观察基因的密码子偏倚的相关，推测相对表达量的尺度。密码子适应指数可以按照例如，P.M.Sharp and W.H.Li(NucleicAcids Res.1987 Feb 11；15(3)：1281-1295)中记载的方法来计算。
在序列ID No.15的碱基序列中，使用频率(最高密码子设为100时的密码子使用频率)为91～100的密码子的比例为47％。另一方面，在序列ID No.1的碱基序列中，使用频率为91～100的密码子的比例为59％。
一般认为，使用频率高的密码子的比例越高，越有利于细胞中的高基因表达水平。
在序列ID No.1的碱基序列中，使用频率为91～100的密码子的比例比序列IDNo.15的碱基序列更高，因此更适合用于大鼠细胞中的表达。
在本发明的嵌合FcεRIα链基因中，表达该基因的细胞(特别是非人动物的细胞)中使用频率为91～100的密码子的比例可以为例如40％以上，优选为50％以上，更优选为53％以上，进一步更优选为55％以上。该比例可以为例如100％以下、90％以下、80％以下、70％以下或60％以下。
序列ID No.15的碱基序列的GC含量为45.53％，而序列ID No.1的碱基序列的GC含量为51.05％。GC含量越高，转录产物mRNA的半衰期越容易延长，对于高基因表达水平而言越优选。因此，一般认为，序列ID No.1的碱基序列能够实现比序列ID No.15更高的基因表达水平。
本技术的嵌合FcεRIα链基因的GC含量可以为例如40％以上，优选为47％以上，更优选为50％以上。该GC含量可以为例如80％以下、70％以下或60％以下。
序列ID No.15的碱基序列包含两个限制酶ScaI所识别的序列(AGTACT)。另一方面，序列ID No.1的碱基序列不包含所述序列。
本技术的嵌合FcεRIα链基因虽然可以包含限制酶序列，但优选为不包含限制酶序列。
序列ID No.15的碱基序列包含三个与拼接相关的顺式作用元件(GGTGAT)，包含一个作为多聚A信号的顺式作用元件(AATAAA)，包含一个与mRNA的不稳定化相关的顺式作用元件(ATTTA)，并且包含一个作为多聚A信号的顺式元件(AAAAAAA)。另一方面，序列ID No.1的碱基序列不包含这些顺式元件。因此，序列ID No.1的碱基序列删除了例如可能被误认作剪接位点的序列、可能误添加多聚A的序列及会引起mRNA的不稳定化的序列。
本技术的嵌合FcεRIα链基因虽然可以包含一个或多个以上顺式作用元件，但优选不包含这些顺式作用元件。
序列ID No.15的碱基序列具有一对反向重复序列，而序列ID No.1的碱基序列不具有序列。因此，后者能够抑制形成不需要的高阶结构。
(2)嵌合FcεRIα链基因向RBL-NL4细胞的导入
如图6所示，人工合成核酸(DNA)，该核酸(DNA)具有在序列ID No.1的5’端添加有“限制酶BamHI的识别部位(GGATCC)”和用于形成“KOZAK序列的序列(CACC)”，并且在其3’端添加有“限制酶EcoRI的识别部位(GAATTC)”的碱基序列。该核酸利用该两个部位被插入多克隆位点内具有所述两个限制酶识别部位的pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司)中。通过本技术领域已知的方式大量制备插入该核酸后的载体。然后，使用BamHI及EcoRI将插入所述核酸后的载体线性化。
得到向RBL-2H3细胞(细胞编号：JCRB0023，国立研究开发法人医药基础、健康及营养研究所JCRB细胞库)中稳定导入NF-AT(Nuclear factor activated T-cell)依赖性萤火虫荧光素酶表达载体(pHTS-NFAT，Biomyx公司)后的细胞(以下，也称为“RBL-NL4细胞”)。使用Lipofectamine3000向该RBL-NL4细胞导入所述线性化后的载体，进行利用Hygromycin的药剂选择。然后，通过有限稀释法进行克隆，得到导入有嵌合FcεRIα链基因的七个克隆。
RBL-NL4细胞表达大鼠的内源性FcεRI的α链基因、β链基因及γ链基因。因此，通过使所述导入后的嵌合FcεRIα链基因表达，使通过该基因的表达生成的嵌合FcεRIα链蛋白质与β链及γ链缔合而成的FcεRI在该细胞的细胞膜上功能性表达。
(3)导入有嵌合FcεRIα链基因的细胞中的荧光素酶表达
通过离子霉素、抗人IgE抗体或特异抗原对培养上述(2)中得到的七个克隆及RBL-NL4细胞而得到的培养物施加刺激，并确认此时的荧光素酶表达。具体而言，如下进行该确认。
在添加10％灭活胎牛血清的MEM培养中基培养每个克隆及RBL-NL4细胞。该培养基的组成如下所述。
MEM培养基(Earle‘s salts(+)，L-Glutamine(-)；Gibco 11090)
胎牛血清(Gibco 10437-028，在56℃下灭活30分，使用时的浓度为10％)
GlutaMAX-I(Gibco 35050)
青霉素-链霉素(Sigma P4333)
遗传霉素(Geneticin，Gibco 10131，使用时的浓度为500μg/mL)
潮霉素B(Hygromycin B，Invirtogen 10687-10，使用时的浓度为200μg/mL)
为防止细菌感染，向所述培养基中加入青霉素及链霉素。遗传霉素及潮霉素B为选择标志物。
通过塑料制细胞培养烧瓶(T25)，在37℃、5％二氧化碳存在下的培养箱中进行所述培养。
如下进行细胞传代。即，通过倾析丢弃所述烧瓶中的培养上清(包含悬浮的细胞)后，加入5mL新的培养基。使用细胞刮板轻轻剥下细胞，吹打后，按照1/40量(0.125mL)加入预先装入5mL培养基的传代用烧瓶中，在37℃、5％CO2下培养5天。
需要说明的是，当为了在后述的各种试验中使用而大量培养时，使用T75烧瓶及倍量的培养基(10mL)。
在进行用于确定施加了所述刺激时的荧光素酶表达的试验前一天，进行以下的操作。即，向所述MEM培养基添加精制人IgE(ab65866，Abcam)(最终浓度50ng/mL)。将该培养基加入底面透明的塑料制白色96孔板(产品编号：165306，Thremo公司)的每个孔中。接着，将每个克隆的细胞按照每孔5×104细胞/50μL接种，在培养箱中静置过夜致敏。
另外，除不添加精制人IgE之外，相同地将每个克隆的细胞加入所述96孔板的每个孔中，接着，在所述培养箱内静置过夜(即，同时准备未致敏的细胞)。
第二天，通过PBS多次清洗细胞。向包含致敏后的细胞的孔中添加通过所述培养基制备的100ng/mL抗人IgE抗体(产品编号A80-108A，BETHYL公司，最终浓度100ng/mL)，接着，对该细胞在37℃下施加刺激3小时。同样地，在包含未致敏的细胞的孔中也添加100ng/mL的抗人IgE抗体，接着，对该细胞在37℃下施加刺激3小时。
另外，在包含未致敏的细胞的另外的孔中添加250μM的离子霉素，接着，对该细胞在37℃下施加刺激3小时。
施加所述刺激之后，向每个孔内分别按照50μL/孔加入基质液(One-GloLuciferase Assay System，Promega公司)，并使其反应5分钟，然后，用光度计(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图7。
图7中，七个克隆的测定结果分别示于“HuRa-11”、“HuRa-19”、“HuRa-21”、“HuRa-29”、“HuRa-37”、“HuRa-38”及“HuRa-40”。另外，RBL-NL4细胞的测定结果示于“NL4”。
图7中，黑点表示测定后的荧光素酶发光强度(单位：CPS)(右侧的轴：LUMINESCENCE(CPS))。另外，图7中，各柱分别表示向未通过人IgE致敏的细胞中加入抗人IgE抗体时(no IgE)、向致敏后的细胞中加入抗人IgE抗体并施加刺激时(aIgE)及向未致敏的细胞中加入离子霉素刺激时(Iono)的相对发光强度(左侧的轴：Luciferase activity(fold change))。相对发光强度是以每个克隆无刺激时的发光强度为1时的相对的发光强度，其由对数刻度表示。
如图7所示，由致敏时(aIgE)及未致敏时(no IgE)的比较可知，在所有克隆中，通过抗人IgE抗体刺激使荧光素酶表达量均增加数十倍～100倍。另一方面，未表达嵌合FcεRIα链基因的RBL-NL4细胞几乎不对抗人IgE抗体刺激应答。由此可知，通过导入嵌合FcεRIα链基因，赋予检测人IgE的能力。
需要说明的是，如图7所示，通过离子霉素刺激RBL-NL4细胞时(Iono)的荧光素酶表达量相比通过抗人IgE抗体刺激RBL-NL4细胞的两种情况下(no IgE及aIgE)大幅度增加。离子霉素是不经由FcεRI而刺激NFAT的物质。因此，在RBL-NL4细胞中确认到，NFAT的激活使荧光素酶表达系统正常作用。
另外，在上述七个克隆中，HuRa-40在对于抗体刺激的应答性、FcεRI表达量及增殖能力方面特别优异。HuRa-40在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NPMD)中国际保藏，其保藏日期为令和2年(2020年)6月17日，保藏编号为NITE BP-03230。
(4)IgE对导入有嵌合FcεRIα链基因的细胞的结合能力的确认
针对每个克隆，通过流式细胞术，如下测定其人IgE对于细胞表面的结合性。
首先，针对每个克隆，分别准备被50ng/mL的人IgE致敏过夜的细胞样品和未致敏的细胞样品。接着，将这两种细胞样品分别在冰上与1μg/mL的人IgE接触30分钟，用IgE占有所有的FcεRI。另外，针对部分未致敏的细胞样品，不在冰上使其与人IgE接触。然后，将每个样品用FITC标记抗人IgE抗体染色。如此一来，针对每个克隆分别准备以下的三个样品。
样品1：无致敏，无冰上与人IgE接触，FITC染色；
样品2：无致敏，冰上与人IgE接触，FITC染色；
样品3：致敏，冰上与人IgE接触，FITC染色。
另外，针对RBL-NL4细胞(阴性对照)及RS-ATL8细胞(阳性对照)，也准备上述三个样品。
针对如上准备的样品，通过流式细胞仪测定FITC的荧光强度。测定结果示于图8。如图8所示，在样品1、2及3中，确认到FITC的荧光的细胞数量依次增加，特别是，在样品3中，确认到FITC的细胞的数量相比样品1及2大幅度增加。另外，作为阳性对照的RS-ATL8细胞也得到了相同的结果。另一方面，作为阴性对照的RBL-NL4细胞未得到这样的结果。由这些结果确认，IgE特异性结合于每个克隆的细胞。
(5)适合本发明的细胞的试验条件的探讨
(5-1)刺激时间
将悬浮于包含稀释100倍后的健康者血清(COSMO BIO公司)的含10％FBS的MEM培养基中的HuRa-40细胞按照5.0×104细胞/50μL/孔接种于96孔的微孔板(ISOPLATE-96TC，PerkinElmer公司)，在CO2培养箱内致敏过夜。
将所述致敏后的细胞清洗，然后，按照50μL/孔的量添加用被含10％FBS的MEM培养基稀释后的抗人IgE抗体(0.1μg/mL)，刺激1小时、3小时、6小时或8小时。
另外，向不进行刺激的细胞中添加培养基。
经过所述刺激时间之后，按照50μL/孔的量向每个孔中加入ONE-Glo EXLuciferase Assay System(Promega公司)的基质液，在室温下避光反应5分钟。然后，用酶标仪(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图9。
按照下式计算图9所示的相对发光强度(Luciferase activity(fold change))。
Luciferase activity(fold change)＝(抗体刺激后的HuRa-40细胞的每个时间的发光强度-培养基的发光强度)/(添加培养基后的HuRa-40细胞在0小时的发光强度-培养基的发光强度)
由图9所示的结果可知，刺激时间优选为1小时以上，更优选为1.5小时以上，进一步更优选为2小时以上。另外，刺激时间可以优选为8小时以下，更优选为7小时以下，进一步更优选为6小时以下，5小时以下，或4小时以下。刺激时间可以为例如1小时～8小时，更优选为2小时～8小时，进一步更优选为1.5小时～7小时，2小时～6小时，2小时～5小时，或2小时～4小时，特别优选为3小时～4小时。
(5-2)血清浓度
将悬浮于以各种浓度包含健康者血清(COSMO BIO公司)的含10％FBS的MEM培养基中的HuRa-40细胞按照5.0×104细胞/50μL/孔接种于96孔的微孔板(ISOPLATE-96TC，PerkinElmer公司)，在CO2培养箱内致敏过夜。所使用的血清浓度为0体积％、0.01体积％、0.1体积％、1体积％或10体积％这五种。
将所述致敏后的细胞清洗后，按照50μL/孔的量添加被含10％FBS的MEM培养基稀释后的抗人IgE抗体(0.1μg/mL)，刺激3小时。
另外，向不进行刺激的细胞添加培养基。
经过所述刺激时间后，如上述(5-1)中所述那样测定发光强度。测定结果示于图10。按照下面的式子计算图10所示的相对发光强度(Luciferase activity(foldchange))。
Luciferase activity(fold change)＝(各种血清浓度下的HuRa-40细胞的发光强度-培养基的发光强度)/(血清浓度为0体积％时的HuRa-40细胞的发光强度-培养基的发光强度)
由图10所示的结果可知，用于致敏的血清浓度优选为0.01体积％以上，更优选为0.1体积％以上，选一步更优选为0.5体积％以上，0.6体积％以上，0.7体积％以上，0.8体积％以上，或0.9体积％以上。另外，用于致敏的血清浓度可以为例如10体积％以下，优选为8体积％以下，更优选为7体积％以下，进一步更优选为6体积％以下，5体积％以下，4体积％以下，3体积％以下，或2体积％以下。血清浓度可以为例如0.1体积％～10体积％，更优选为0.5体积％～5体积％，进一步更优选为0.7体积％～3体积％，特别优选为1体积％。
(5-3)细胞毒性
使用CytotoxicityLDH Assay Kit-WST(同仁化学研究所公司)，以释放至胞外的LDH为指标，评价人血清对于HuRa-40细胞的细胞毒性。在包含各种浓度(0体积％、0.01体积％、0.1体积％、1体积％或10体积％)的人血清的MEM培养基中，将所述细胞培养过夜，将得到的培养物的细胞上清按照50μL/孔接种于96孔微孔板，将所述试剂盒中所含的WorkingSolution按照50μL/孔加入每个孔中，室温下避光进行30分钟呈色反应。最后，将所述试剂盒中所含的Stop Solution按照25μL/孔加入每个孔中，用酶标仪(iMark，Bio Rad公司)测定490nm的吸光度。测定结果示于图11。
由图11可知，血清浓度1％时无毒性、及血清浓度10％时有毒性。
(5-4)冷冻保存
探讨-80℃保存对HuRa-40细胞的表型的稳定性的影响。准备在-80℃下冷冻前、冷冻2个月后或冷冻4个月后的HuRa-40细胞。将这三种细胞在包含人IgE(ab65866，Abcam，最终浓度50ng/mL)的MEM培养基中致敏过夜。该致敏后，用PBS清洗3次。该清洗后，用抗人IgE抗体刺激3小时。使用离子霉素(250nM)作为阳性对照。所述刺激后，添加基质液(One-GloLuciferase Assay System，Promega公司)，测定发光强度。测定结果示于图12。
根据图12所示的结果，至少4个月冷冻时，确认到受体特异性反应的稳定性。需要说明的是，即使在-80℃下保存8个月之后，仍能够确认到产生细胞的受体特异性应答。
(5-5)传代数
向传代数4(P4)或传代数50(P50)的HuRa-40细胞中加入杉木花粉症患者血清(特异性IgE抗体价100以上)致敏过夜。该致敏后，用PBS清洗每种细胞，接着，用杉木花粉过敏原提取物刺激。该刺激后，加入基质液(Bright-Glo，Promega公司)，测定发光。测定结果示于图13。
由图13所示的结果可知，对于杉木花粉提取物的应答在P4及P50中没有显著差异。
(6)使用过敏患者血清的试验(花生过敏)
(6-1)使用各种RAST评分的患者血清的抗原特异性应答
将悬浮于包含稀释100倍后的健康者血清或具有各种RAST评分的花生过敏患者血的含10％FBS的MEM培养基中的HuRa-40细胞按照5.0×104细胞/50μL/孔接种于96孔的微孔板(ISOPLATE-96TC，PerkinElmer公司)，在CO2培养箱内致敏过夜。
将所述致敏后的细胞清洗后，按照各种浓度添加被含10％FBS的MEM培养基稀释后的过敏原刮擦提取物(花生)，在37℃下刺激3小时。
另外，对未进行所述致敏的细胞进行相同的刺激处理。
经过所述刺激时间后，将ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega公司)的基质液按照50μL/孔的量加入每个孔中，室温下避光反应5分钟。然后，用酶标仪(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图14。
由图14所示的结果可知，HuRa-40细胞应答于抗原特异性。
(6-2)本发明的细胞与其它细胞的比较
将HuRa-40细胞的抗原特异性应答与RS-ATL8细胞比较。另外，在该比较中，使用RBL-NL4细胞作为阴性对照。
RS-ATL8细胞是向在RBL-2H3细胞中稳定表达人FcεRI而成的RBL-SX38细胞中稳定导入NF-AT依赖性萤火虫荧光素酶表达载体(Biomyx公司)而得到的细胞。
如上所述，RBL-NL4细胞是HuRa-40细胞的宿主细胞，它是向RBL-2H3细胞中稳定导入NF-AT依赖性萤火虫荧光素酶表达载体(Biomyx公司)而得到的细胞。
将所述三种细胞分别悬浮于包含RAST评分6(＞100UA/mL)的花生过敏患者血清(100倍稀释)的含10％FBS的MEM培养基，按照5.0×104细胞/50μL/孔接种于96孔的微孔板(ISOPLATE-96TC，PerkinElmer公司)，在CO2培养箱内致敏过夜。
将所述致敏后的细胞清洗后，按照各种浓度(0、0.1、1、10、100或1000ng/mL)添加被含10％FBS的MEM培养基稀释后的过敏原刮擦提取物(花生)，在37℃下刺激3小时。
经过所述刺激时间后，将ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega公司)的基质液按照50μL/孔的量加入每个孔中，室温下避光反应5分钟。然后，用酶标仪(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图15。
由图15所示的结果可知，与RS-ATL8细胞相比，HuRa-40细胞显示优异的抗原应答。另外，在大范围的抗原浓度中，HuRa-40细胞的应答性均优于RS-ATL8细胞。
(7)本发明的细胞与其它细胞的比较(过敏检查、蛋类过敏)
将HuRa-40细胞的抗原特异性应答与RS-ATL8细胞比较。另外，在该比较中，使用RBL-NL4细胞作为阴性对照。
所述三种细胞分别悬浮于包含蛋类过敏患者血清(特异性IgE抗体价100以上)或健康受试者的混合血清的含10％FBS的MEM培养基，并按照5.0×104细胞/50μL/孔接种于96孔的微孔板(ISOPLATE-96TC，PerkinElmer公司)，在CO2培养箱内致敏过夜。
将所述致敏后的细胞用PBS清洗后，按照各种浓度(0.1、1、10、100或1000ng/mL)添加被含10％FBS的MEM培养基稀释后的蛋白过敏原提取物、在37℃下刺激3小时。
经过所述刺激时间后，将ONE-Glo EX Luciferase Assay System(Promega公司)的基质液按照50μL/孔的量加入每个孔，室温下避光反应5分钟。然后，用酶标仪(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图16。
由图16所示的结果可知，在使用蛋类过敏患者血清的情况下，与RS-ATL8细胞相比，HuRa-40细胞显示优异的应答性。另外，在使用健康受试者混合血清的情况下，未发现对于蛋白过敏原提取物的应答。由以上结果可知，HuRa-40细胞显示出比RS-ATL8细胞更加优异的抗原特异性应答性。
(8)本发明的细胞与其它细胞的比较(过敏反应抑制剂的有效性评价)
奥马珠单抗是支气管哮喘、季节性过敏性鼻炎及慢性荨麻疹的治疗药物。奥马珠单抗是人源化抗人IgE单克隆抗体，其通过阻碍IgE与高亲和力受体(FcεRI)的结合来抑制嗜碱性粒细胞、肥厚细胞等炎症细胞的激活。竞争性阻碍人IgE与FcεRI的结合，进而减少血清中的游离IgE浓度。需要说明的是，其不会与已经与FcεRI结合的IgE结合。本发明的细胞能够用于例如奥马珠单抗等过敏反应抑制剂的有效性评价。以下，将对示出其能够用于该有效性评价的实验及其结果进行说明。
准备HuRa-40细胞及RS-ATL8细胞。向悬浮于含10％FBS的MEM培养基中的这些细胞中分别添加各种最终浓度(0、0.001、0.01、0.1、1、10或100μg/mL)的奥马珠单抗，添加30分后，加入50ng/mL人IgE，致敏过夜。
将所述致敏后的细胞用PBS清洗3次后，添加人IgE抗体，在37℃下刺激3小时。
经过所述刺激时间后，将Bright-Glo(Promega公司)的基质液按照50μL/孔的量加入每个孔中，室温下避光反应5分钟。然后，用酶标仪(GloMax，Promega公司)测定发光强度。测定结果示于图17。
由图17所示的结果可知，关于RS-ATL8细胞，随着奥马珠单抗浓度从0.1μg/mL增加至1μg/mL，发光强度稍微降低，接着，随着从1μg/mL增加至10μg/mL，发光强度进一步降低。并且，由图17可知，关于RS-ATL8细胞，奥马珠单抗的50％阻碍浓度(IC50)超过1μg/mL。另一方面，由图17可知，关于HuRa-40细胞，在奥马珠单抗浓度从0.1μg/mL增加至1μg/mL的阶段，已经观察到发光强度大幅度降低。由图17可知，关于HuRa-40细胞，奥马珠单抗的IC50低于1μg/mL。即，与RS-ATL8细胞相比，HuRa-40细胞能够在更低浓度下检测奥马珠单抗的作用。因此可知，与RS-ATL8细胞相比，HuRa-40细胞更适合抗过敏活性物质的筛选，能够通过HuRa-40细胞来更加灵敏地筛选抗过敏活性物质。
另外，由图17所示的结果可知，关于RS-ATL8细胞，当奥马珠单抗浓度最大(100μg/mL)时，与0μg/mL时相比，发光强度仅降低至1/4左右。另一方面，关于HuRa-40细胞，奥马珠单抗浓度100μg/mL时的发光强度显著降低，达到0μg/mL时的1/30以下。即，与RS-ATL8细胞相比，HuRa-40细胞几乎没有背景残留。由该结果也可知，HuRa-40细胞与RS-ATL8细胞相比更适合抗过敏活性物质的筛选，能够通过HuRa-40细胞更加灵敏地筛选抗过敏活性物质。
使用环孢素A代替奥马珠单抗，进行与以上所说明的试验相同的试验。具体而言，向RS-ATL8细胞或HuRa-40细胞中添加最终浓度0～1μg/mL的环孢素A30分钟后，加入50ng/mL人IgE，致敏过夜。用PBS清洗3次后，用抗人IgE抗体刺激3小时，加入Bright-Glo，测定发光。测定结果示于图18。
由图18所示的结果可知，在HuRa-40细胞中，通过添加0.1μg/mL的环孢素A，发现了抑制趋势，与RS-ATL8细胞相同地，通过添加0.5μg/mL的环孢素A显著抑制了应答。
(9)稳定性及再现性
如下进行HuRa-40细胞的冷冻保存时的表型的稳定性评价试验及再现性评价试验。
如下进行这些试验中使用的荧光素酶测定。
即，向HuRa-40细胞悬浮培养基中加入1/100vol.的患者血清或Human IgE(ab65866，Abcam)(最终浓度50ng/mL)，以达到5.0×104细胞/50μL/孔的方式，接种于96孔板(165306，Thermo公司)，在37℃、CO2培养箱内致敏过夜。该致敏后，用PBS清洗细胞3次，该清洗后，分别按照50μL/孔加入通过培养基制备的蛋白过敏原提取物或抗人IgE抗体(A80-108A，BETHYL公司)(最终浓度100ng/mL)，在37℃、CO2下刺激3小时。分别按照50μL/well加入以下的基质液，使其反应5分钟后，用光度计(GloMax，Promega公司)测定发光强度。
<基质液>
One-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)
One-Glo EX Luciferase Assay System(Promega公司)
Bright-Glo(Promega公司)
(HuRa-40的表型的稳定性的评价1)
向冷冻前、冷冻2个月后、冷冻4个月后、冷冻6个月后或冷冻2年5个月后的HuRa-40细胞中加入Human IgE，致敏过夜。用PBS清洗3次后，用抗人IgE抗体刺激3小时。加入One-Glo Luciferase Assay System，测定发光强度。测定结果示于图20。
如图20所示，确认到HuRa-40细胞的至少2年5个月的受体特异性反应的稳定性。
(HuRa-40的表型的稳定性的评价2)
向冷冻2个月后或冷冻2年5个月后的HuRa-40细胞中加入蛋类过敏患者血清(特异性IgE抗体滴度100以上)或健康受试者的混合血清，致敏过夜后，用PBS清洗，并用蛋白过敏原提取物刺激，加入One-Glo EX Luciferase Assay System，测定发光强度。测定结果示于图21。
由图21所示，确认到HuRa-40细胞的至少2年5个月的受体特异性反应的稳定性。
(实验室间再现性评价)
在两个设施(对应图22的A及B)及三次尝试3(对应图22的EXP1、2、3)下，实施以下探讨(实验室间共同试验)。向HuRa-40细胞中加入Human IgE，致敏过夜。该致敏后，用PBS清洗3次，该清洗后，用抗人IgE抗体刺激3小时。加入均质荧光素酶基质液(Bright-Glo)，测定发光强度。测定结果如图22所示。
如图22所示，使用HuRa-40细胞的试验的再现非常高。
(中间精密度评价)
通过单一试验室确认再现性。向HuRa-40细胞中加入不同批次Human IgE(对应图23的OLD及NEW)，致敏一晚。该致敏后，用PBS清洗3次，该清洗后，用抗人IgE抗体刺激3小时。加入均质荧光素酶基质液(Bright-Glo)，测定发光强度。测定结果示于图23。
如图23所示，使用HuRa-40细胞的试验的再现性非常高。
保藏编号
大鼠细胞：NITE BP-03230
PCT
/>
PCT/RO/134表
Claims (24)
1.一种嵌合FcεRIα链基因，其包含编码人FcεRIα链中的胞外结构域的第一碱基序列和编码非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域的第二碱基序列。
2.如权利要求1所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述第一碱基序列包含与序列IDNo.7的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
3.如权利要求1或2所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述第二碱基序列至少包含与序列ID No.5的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
4.如权利要求1至3中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述第二碱基序列进一步包含与序列ID No.6的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
5.如权利要求1至4中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述嵌合FcεRIα链基因进一步包含编码用于使基于该基因生成的嵌合FcεRIα链在细胞膜上表达的信号序列的第三碱基序列。
6.如权利要求5所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述第三碱基序列包含与序列IDNo.2的碱基序列具有70％以上的序列同源性的碱基序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述嵌合FcεRIα链基因具有与序列ID No.1的碱基序列具有50％以上的序列同源性的碱基序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因，其中，所述非人动物为啮齿类的动物。
9.一种嵌合FcεRIα链蛋白质，其包含人FcεRIα链中的胞外结构域和非人动物FcεRIα链中的至少跨膜结构域。
10.如权利要求9所述的嵌合FcεRIα链蛋白质，其中，所述胞外结构域包含与序列IDNo.14的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
11.如权利要求9或10所述的嵌合FcεRIα链蛋白质，其中，所述跨膜结构域包含与序列ID No.12的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
12.如权利要求9至11中任一项所述的嵌合FcεRIα链蛋白质，其中，所述嵌合FcεRIα链蛋白质进一步包含非人动物FcεRIα链中的胞内结构域，该胞内结构域包含与序列ID No.13的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
13.如权利要求9至12中任一项所述的嵌合FcεRIα链蛋白质，其中，所述嵌合FcεRIα链蛋白质包含与序列ID No.8的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性的氨基酸序列。
14.一种载体，其包含权利要求1至8中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因。
15.一种所述非人动物的细胞，其包含权利要求1至8中任一项所述的嵌合FcεRIα链基因、权利要求9至13中任一项所述的嵌合FcεRIα链蛋白质或权利要求14所述的载体。
16.如权利要求15所述的细胞，其进一步包含所述非人动物细胞的FcεRI的γ链的基因。
17.如权利要求16所述的细胞，其中，形成包含基于所述嵌合FcεRIα链基因生成的嵌合FcεRIα链和所述细胞的FcεRI的γ链的缔合体。
18.如权利要求17所述的细胞，其进一步包含通过所述缔合体彼此的交联诱导表达的报告基因。
19.一种分析用试剂盒，其包含权利要求15至18中任一项所述的细胞。
20.一种使用权利要求15至18中任一项所述的细胞的分析方法。
21.如权利要求20所述的分析方法，其中，所述分析方法包括执行孵育所述细胞的孵育工序、以及分析所述细胞的应答的分析工序。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述孵育工序包括在孵育用材料中孵育所述细胞。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中，所述分析工序包括基于所述应答进行选自由过敏原性的评价、过敏的有无或风险的评价、针对IgE的分析、过敏抑制活性的评价、以及药物筛选组成的组中的至少一项。
24.如权利要求21至23任一项所述的方法，其中，所述分析工序包括进行I型过敏的有无或风险的评价。
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