KR102197723B1 - 림프구의 종양 반응성 예측용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

림프구의 종양 반응성 예측용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 림프구의 종양 반응성 예측용 마커, 종양 반응성 예측용 조성물, 및 종양 반응성 예측방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 마커를 이용하여 배양된 림프구의 종양 반응성을 예측할 수 있는 예측모델을 구축할 수 있고, 이를 통해 림프구의 반응성을 예측함으로써 보다 정확하게 종양에 특이적인 림프구를 선별하여 효과적인 면역치료제를 생산할 수 있을 것이다. 또한, 상기 유전자 마커를 이용하면 종래 침습적인 방법에서 벗어나 체내 조직, 혈액, 또는 체액 등으로부터 보다 간편하게 비침습적인 방법으로 림프구를 분리하고 종양에 특이적인 활성을 갖는 림프구만을 선별하여 면역치료에 이용할 수 있어 응용 범위가 넓을 것으로 기대된다.

Description

림프구의 종양 반응성 예측용 마커 및 이의 용도{Markers for predicting the response of lymphocytes to a tumor and use thereof}
본 발명은 림프구의 종양 반응성 예측용 마커, 종양 반응성 예측용 조성물, 및 종양 반응성 예측방법에 관한 것이다.
최근 종양에서 면역인자의 중요성이 밝혀지면서 면역관련 인자들을 이용한 치료법들이 활발히 개발되고 있다. 예컨대, 면역치료에는 종양관련 항원을 표적으로 하는 백신, 억제 수용체(inhibitory receptor)의 과발현에 의한 T 세포 피로화를 막는 단클론항체, T 림프구의 공동자극 수용체를 활성화하여 T 림프구를 활성화 시키는 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 수용체 superfamily의 사용, 면역억제 인자를 표적으로 하는 치료, 자연살해세포(natural kiler cells; NK cells) 또는 종양 특이 T 림프구를 이용한 세포치료법 등이 있다. 최근에는 면역억제 인자를 인지하는 항체(immune checkpoint inhibitor, anti-PD1, anti-CTLA4 antibody)를 이용한 면역치료가 악성 흑색종 등의 종양에서 효과가 있는 것으로 밝혀졌으나, 항체를 기반으로 한 치료는 세포 표면에 위치한 항원을 표적으로하므로 세포 내에 있는 항원에는 적용이 불가능한 단점이 있다.
자연살해세포 또는 종양 특이 T 림프구를 이용한 세포치료법 등을 면역조절 세포치료제라고 하며, 이는 면역세포를 이용하여 체내의 면역반응을 활성화시켜 질병을 치료할 목적으로 사용되는 치료법이다. 면역조절 세포치료제는 주로 암 치료를 적응증으로 개발되고 있으며, 환자에게 직접 면역세포를 투여하여 면역 기능을 활성화함으로써 치료 효과를 얻기 때문에 기존의 암 치료에 이용되는 수술요법, 항암제나 방사선 치료와는 차별화되는 치료 기전 및 효능으로, 향후 바이오 신약의 주요한 부분을 차지할 것으로 예상되는 분야이다.
면역조절 세포치료제의 종류로는 크게 림포카인 활성 세포(LAK), 수지상세포, 및 T 세포 기반 치료제가 있으며, T 세포를 기반으로 한 세포치료제로는 대표적으로 환자의 종양 조직에 침투한 T 세포를 증식시켜 제조하는 종양침윤 T 세포(tumor-infiltrating lymphocytes; TIL)와 환자의 T 세포를 분리하여 T 세포 수용체(T cell receptor; TCR)나 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)의 유전자를 도입하는 T 세포 수용체 발현 T 세포(TCR-modified T cell, TCR-T), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-modified T cell, CAR-T)로 크게 구분할 수 있다.
종양침윤 T 세포(Tumor-infiltrating lymphocytes; TIL)는 종양 조직에 존재하는 림프구로써 환자의 종양 조직을 채취하여 종양 세포 살상능력이 있는 T 세포들을 분리하여 이를 증식시킨 다음 환자에게 다시 투여하는 것으로, 생검(biopsy)이 가능한 고형암종이 주로 연구되고 있다. TIL은 T 세포를 이용한 면역조절 세포치료제 중 가장 먼저 임상에서의 효능이 연구된 것으로, 미국의 국립암연구소(National Cancer Institute)의 Steven Rosenberg 박사팀을 통해 전이성 흑색종 환자에서 TIL을 투여하여 항암 효과를 관찰한 논문이 1988년 처음으로 보고되었으며, 현재까지 TIL 투여에 의한 심각한 부작용이 보고된 적은 없다. 그러나 종양 조직에서 종양 특이적인 T 세포를 분리하는 공정이 복잡하고 그 수율이 낮은 것이 기술적인 단점이며, 또한 LAK의 경우와 유사하게 항암 효능의 증강을 위해 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2)를 같이 투여하는데, 고농도로 투여된 IL-2에 의한 부작용 문제도 해결되어야 하는 실정이다.
따라서 상기와 같은 종래 TIL을 이용한 세포치료제의 한계점을 극복하고 보다 효과적인 T 세포 면역 세포치료제의 개발을 위해, 본 발명자들은 종양조직에 국한되지 않고 비침습적인 방법으로 체내에서 분리하여 배양한 림프구로부터 종양에 대한 특이적인 활성을 나타내는 림프구만을 효율적으로 선별할 수 있는 유전자 마커를 찾기 위해 연구 노력하였으며, 그 결과 17종의 마커를 발굴하였는바 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
Rosenberg SA, et al. 2015. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 2015 Apr 3;348(6230):62-8.
본 발명자들은 종양 특이적 반응성을 나타내는 림프구를 효과적으로 선별할 수 있는 유전자 마커를 발굴하기 위하여, 유방암 환자의 종양조직에서 분리한 림프구를 이용해 연구 노력한 결과 총 17종의 유전자 바이오마커를 발굴하고 이의 유효성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ITGA6(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2 및 NM_001365530.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 ATP6V0A1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001130020.3, NM_001130021.3, NM_001378522.1, NM_001378523.1 및 NM_001378530.1), ARRDC3(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001329670.2, NM_001329671.2, NM_001329672.2 및 NM_020801.4), CD23(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001207019.2, NM_001220500.2 및 NM_002002.4), CD200(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001004196.3, NM_001318826.1, NM_001318828.1, NM_001318830.1 및 NM_001365851.2), CD300C(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006678.5), CYSLTR1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001282186.1, NM_001282187.2, NM_001282188.2 및 NM_006639.4), ITGB1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_002211.4, NM_033668.2 및 NM_133376.2), MBOAT2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001321265.2, NM_001321266.2, NM_001321267.2 및 NM_138799.4), Met(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000245.4, NM_001127500.3, NM_001324401.2 및 NM_001324402.2), MYO9A(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006901.4), PTPN13(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006264.3, NM_080683.3, NM_080684.3 및 NM_080685.2), S100P(Genbank 접근(accession) 번호: NM_005980.3), SECTM1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_003004.3), TCN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000355.4 및 NM_001184726.1), TSPAN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001308315.1, NM_001308316.1 및 NM_005725.6) 및 VSIG1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001170553.1 및 NM_182607.5)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ATP6V0A1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001130020.3, NM_001130021.3, NM_001378522.1, NM_001378523.1 및 NM_001378530.1), MBOAT2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001321265.2, NM_001321266.2, NM_001321267.2 및 NM_138799.4), PTPN13(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006264.3, NM_080683.3, NM_080684.3 및 NM_080685.2), TCN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000355.4 및 NM_001184726.1) 및 TSPAN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001308315.1, NM_001308316.1 및 NM_005725.6)로 이루어진 군에서 선택되는 3종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 조성물은 ATP6V0A1, MBOAT2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 PTPN13, TCN2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 ARRDC3(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001329670.2, NM_001329671.2, NM_001329672.2 및 NM_020801.4), CD23(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001207019.2, NM_001220500.2 및 NM_002002.4), CD200(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001004196.3, NM_001318826.1, NM_001318828.1, NM_001318830.1 및 NM_001365851.2), CD300C(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006678.5), CYSLTR1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001282186.1, NM_001282187.2, NM_001282188.2 및 NM_006639.4), ITGA6(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2 및 NM_001365530.2), ITGB1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_002211.4, NM_033668.2 및 NM_133376.2), Met(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000245.4, NM_001127500.3, NM_001324401.2 및 NM_001324402.2), MYO9A(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006901.4), S100P(Genbank 접근(accession) 번호: NM_005980.3), SECTM1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_003004.3) 및 VSIG1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001170553.1 및 NM_182607.5)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 림프구는 종양 조직, 혈액, 또는 체액에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
다양한 체내 유래 림프구에서 종양에 특이적인 활성을 갖는 림프구만을 선택적으로 선별할 수 있으면 이를 기반으로 효과적인 면역치료제를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 유전자 마커를 이용하여 배양된 림프구의 종양 반응성을 예측할 수 있는 예측모델을 구축할 수 있고, 이를 통해 림프구의 반응성을 예측함으로써 보다 정확하게 종양에 특이적인 림프구를 선별하여 효과적인 면역치료제를 생산할 수 있을 것이다. 또한, 상기 유전자 마커를 이용하면 종래 침습적인 방법에서 벗어나 체내 조직, 혈액, 또는 체액 등으로부터 보다 간편하게 비침습적인 방법으로 림프구를 분리하고 종양에 특이적인 활성을 갖는 림프구만을 선별하여 면역치료에 이용할 수 있어 응용 범위가 넓을 것으로 기대된다.
도 1은 종양침윤림프구(TIL)만 존재하는 대조군에 비해 자가유래 유방암세포와 TIL을 동시 배양하였을 때 분비되는 IFN-γ의 비율과, 종양세포에 반응성을 보인 TIL에서의 각 유전자의 발현 값을 이변량 상관분석(Spearman Correlation)으로 상관성을 조사하여 유의한 상관관계(p<0.05)를 보이는 유전자를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 삼중음성유방암 환자 유래 TIL의 종양세포에 대한 반응성과 실시예 2에서 도출된 17개 유전자의 발현수준 간의 상관관계를 분석한 결과로서, 도 2a는 상기 17개 유전자 가운데 환자 유래 TIL의 종양 특이적 반응성 유무와 유의적 상관관계를 갖는 것으로 확인된 6개 유전자 각각에 대하여 상기 TIL의 반응성에 따른 발현수준 차이를 정량화한 결과이고, 도 2b는 TIL 종류 중 ITGA6의 발현과 유의한 상관관계가 있는 것으로 파악된 전체 TIL(CD45+), NKT 세포 및 T 세포에서 종양 특이적 반응성에 따른 ITGA6의 발현수준 차이를 정량화한 결과이다.
도 3은 기계학습 방법을 통한 종양 반응성 예측용 마커 유전자의 유효성 검증한 결과로서, 도 3a는 15명의 삼중음성유방암 환자 유래 TIL에 대하여 주성분(PCA) 분석을 실시한 결과이고, 도 3b는 각 환자 유래 TIL에 대하여 실시예 2에서 도출된 17개 유전자의 발현수준을 히트맵으로 나타낸 결과이며, 도 3c는 도 3a의 PCA 분석 결과를 Biplot 그래프로 나타내어 환자 유래 TIL 샘플과 유전자들을 함께 표시한 결과이고, 도 3d는 도 3c의 분석 결과 반응성을 갖는 그룹과 관련이 있는 것으로 보이는 6개 유전자의 발현수준을 히트맵으로 나타낸 결과이다.
도 4는 기계학습 방법을 통해 종양 반응성 예측용 마커 유전자 10개 조합을 도출하고 분석한 결과로서, 도 4a는 회귀분석을 실시하여 가장 높은 정확도를 나타낸 10개 유전자 조합을 확인하고 이에 대하여 13가지 조합의 변수를 도출한 후 유전자 조합의 발현수준을 히트맵으로 나타낸 결과이고, 도 4b는 상기 조합 변수 중 가장 큰 음의 coefficient 값을 나타낸 조합(2번)을 구성하는 각 유전자들의 발현수준을 히트맵으로 나타낸 결과이며, 도 4c는 가장 큰 양의 coefficient 값을 나타낸 조합(7번)을 구성하는 각 유전자들의 발현수준을 히트맵으로 나타낸 결과이고, 도 4d는 상기 도 4b 및 도 4c의 조합을 구성하는 유전자들 중 공통되지 않는 8개 유전자에 대한 히트맵 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 상기 도 4d의 8개 유전자 간의 상호작용을 고려하여 2~8개 유전자로 구성된 유전자 조합에 대하여 ROC 커브를 그리고 AUC 값을 도출한 결과로서, 도 5a는 상호작용이 없는 경우 및 각 유전자 조합 수에 따른 ROC 커브를 종합하여 그린 결과이고, 도 5b는 각 조합의 경우에 따른 ROC 커브를 구분하여 그린 것이다.
도 6은 회귀분석 및 랜덤 포레스트 기계학습 분석 결과 3개 유전자로 구성된 모델이 가장 높은 성능을 나타내는 것을 확인하고 구체적인 유전자 조합을 도출한 결과로서, 도 6a는 10가지 유전자 조합 변수 및 각각에 대한 ROC 커브를 그려 AUC 값을 도출하고 이를 종합적으로 나타낸 결과이고, 도 6b는 각 유전자 조합별로 ROC 커브를 각각 그려 나타낸 것이며, 도 6c는 도 6a 및 도 6b의 결과에서 AUC 값이 0.7 이상인 6개 조합을 표시하고 이의 ROC 커브를 그려 종합적으로 나타낸 결과이며, 도 6d는 각 6개 조합을 구분하여 ROC 커브를 각각 그린 결과이고, 도 6e는 상기 6개 조합 변수에 대하여 Confusion Matrix 분석을 실시해 종양에 대한 반응성 예측 정확도를 분석한 결과이다.
본 발명자들은 종양 특이적 활성을 나타내는 림프구를 효과적으로 선별할 수 있는 유전자 마커를 발굴하기 위하여, 유방암 환자의 종양조직에서 분리한 림프구를 이용해 연구 노력한 결과 총 17종의 유전자를 발굴하였고, 이들의 유효성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명은 ITGA6(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2 및 NM_001365530.2) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
상기 마커 조성물은 ATP6V0A1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001130020.3, NM_001130021.3, NM_001378522.1, NM_001378523.1 및 NM_001378530.1), ARRDC3(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001329670.2, NM_001329671.2, NM_001329672.2 및 NM_020801.4), CD23(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001207019.2, NM_001220500.2 및 NM_002002.4), CD200(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001004196.3, NM_001318826.1, NM_001318828.1, NM_001318830.1 및 NM_001365851.2), CD300C(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006678.5), CYSLTR1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001282186.1, NM_001282187.2, NM_001282188.2 및 NM_006639.4), ITGB1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_002211.4, NM_033668.2 및 NM_133376.2), MBOAT2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001321265.2, NM_001321266.2, NM_001321267.2 및 NM_138799.4), Met(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000245.4, NM_001127500.3, NM_001324401.2 및 NM_001324402.2), MYO9A(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006901.4), PTPN13(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006264.3, NM_080683.3, NM_080684.3 및 NM_080685.2), S100P(Genbank 접근(accession) 번호: NM_005980.3), SECTM1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_003004.3), TCN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000355.4 및 NM_001184726.1), TSPAN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001308315.1, NM_001308316.1 및 NM_005725.6) 및 VSIG1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001170553.1 및 NM_182607.5)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ITGA6 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 ATP6V0A1, ARRDC3, CD23, CD200, CD300C, CYSLTR1, ITGB1, MBOAT2, Met, MYO9A, PTPN13, S100P, SECTM1, TCN2, TSPAN2 및 VSIG1으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ITGA6 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 예측방법은 ATP6V0A1, ARRDC3, CD23, CD200, CD300C, CYSLTR1, ITGB1, MBOAT2, Met, MYO9A, PTPN13, S100P, SECTM1, TCN2, TSPAN2 및 VSIG1으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 종양 특이적 활성을 나타내는 림프구를 효과적으로 선별할 수 있는 유전자 마커를 발굴하기 위하여, 15명의 삼중음성유방암 환자의 종양조직에서 분리한 림프구를 이용하여 총 17종의 유전자 마커를 발굴하였다. 보다 상세하게 본 발명의 일실시예에서는, 15명의 삼중음성유방암 환자로부터 유래된 종양침윤림프구(TIL)를 각 환자 유래 유방암세포와 공동 배양한 결과 6명의 환자에서 반응성을 보인 것을 확인하였다. 반응성을 보인 6명의 환자군과 반응성을 보이지 않은 9명의 환자군에서 차별적으로 발현되는 유전자를 분석한 결과 총 709개 유전자의 발현이 차별적으로 나타난 것을 확인하였으며, 상기 유전자들 중 세포표면에서 발현되는 17개 유전자 즉, Met, CD200, ITGB1, PTPN13, CYSLTR1, VSIG1, MBOAT2, MYO9A, CD23, S100P, SECTM1, CD300C, TSPAN2, ARRDC3, ITGA6, TCN2 및 ATP6V0A1을 선별하였다(실시예 2 참조).
나아가 본 발명의 다른 실시예에서는, 삼중음성유방암 환자 유래 TIL의 종양 특이적 반응성과 상기 17개 유전자의 발현수준 간의 상관관계를 분석한 결과 상기 유전자들 가운데 ITGA6의 발현수준이 종양세포에 대한 반응성을 나타내는 환자 유래 TIL, 특히 전체 TIL, NKT 세포 및 T 세포에서 유의하게 높게 나타난 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 결과는 ITGA6가 유방암 환자에서 환자 유래 TIL의 종양 반응성을 예측하는데 더욱 유효한 마커 유전자임을 입증하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, “림프구의 종양 반응성 예측”이란 림프구가 종양 조직, 보다 바람직하게는 자가유래 종양 조직 내 종양세포를 항원으로 인식하고 이에 반응하여, 면역반응 유도를 통해 결과적으로 종양에 대한 항암효과를 유도할 수 있는지 여부를 예측하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 림프구는 종양 조직을 포함하는 체내 조직, 혈액, 또는 체액에서 분리된 것일 수 있고, 상기 체액은 림프구가 포함되어 있는 복수액, 흉수액 및 담도액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 종양은 바람직하게는 유방암일 수 있고, 더욱 바람직하게는 삼중음성유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 또 다른 실시예에서, 기계학습 분석을 통해 실시예 2에서 차등적으로 발현된 17개 유전자에 대하여 다양한 조합 모델의 종양 반응성 예측 성능에 대한 유효성을 분석하였다. 그 결과, 3개 유전자로 구성된 조합 모델이 가장 예측 정확도가 높은 것으로 확인되었으며, 구체적으로 조합 변수 가운데 ATP6V0A1*TSPAN2*MBOAT2 및 PTPN13*TCN2*TSPAN2 조합의 경우 유의한 종양 반응성 예측 성능을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 4 및 5 참조).
이에 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 ATP6V0A1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001130020.3, NM_001130021.3, NM_001378522.1, NM_001378523.1 및 NM_001378530.1), MBOAT2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001321265.2, NM_001321266.2, NM_001321267.2 및 NM_138799.4), PTPN13(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006264.3, NM_080683.3, NM_080684.3 및 NM_080685.2), TCN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000355.4 및 NM_001184726.1) 및 TSPAN2(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001308315.1, NM_001308316.1 및 NM_005725.6)로 이루어진 군에서 선택되는 3종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 마커 조성물을 제공한다.
보다 바람직하게, 상기 마커 조성물은 ATP6V0A1, MBOAT2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함할 수 있고, 또한 상기 마커 조성물은 PTPN13, TCN2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 마커 조성물은 ARRDC3(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001329670.2, NM_001329671.2, NM_001329672.2 및 NM_020801.4), CD23(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001207019.2, NM_001220500.2 및 NM_002002.4), CD200(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001004196.3, NM_001318826.1, NM_001318828.1, NM_001318830.1 및 NM_001365851.2), CD300C(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006678.5), CYSLTR1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001282186.1, NM_001282187.2, NM_001282188.2 및 NM_006639.4), ITGA6(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2 및 NM_001365530.2), ITGB1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_002211.4, NM_033668.2 및 NM_133376.2), Met(Genbank 접근(accession) 번호: NM_000245.4, NM_001127500.3, NM_001324401.2 및 NM_001324402.2), MYO9A(Genbank 접근(accession) 번호: NM_006901.4), S100P(Genbank 접근(accession) 번호: NM_005980.3), SECTM1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_003004.3) 및 VSIG1(Genbank 접근(accession) 번호: NM_001170553.1 및 NM_182607.5)으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ATP6V0A1, MBOAT2, PTPN13, TCN2 및 TSPAN2로 이루어진 군에서 선택되는 3종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 림프구의 종양 반응성 예측용 키트를 제공한다.
보다 바람직하게, 상기 조성물은 ATP6V0A1, MBOAT2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있고, 또한 상기 조성물은 PTPN13, TCN2 및 TSPAN2 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 ARRDC3, CD23, CD200, CD300C, CYSLTR1, ITGA6, ITGB1, Met, MYO9A, S100P, SECTM1 및 VSIG1으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 ATP6V0A1, MBOAT2, PTPN13, TCN2 및 TSPAN2로 이루어진 군에서 선택되는 3종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 예측방법은 ARRDC3, CD23, CD200, CD300C, CYSLTR1, ITGA6, ITGB1, Met, MYO9A, S100P, SECTM1 및 VSIG1으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머(Primer)”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로서, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브(Probe)”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 모두 포함한다.
본 발명에 따른 림프구의 종양 반응성 예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 포함하는 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
본 발명에 따른 림프구의 종양 반응성 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 림프구는 피검자 유래 조직, 혈액, 또는 체액에서 에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 피검자는 바람직하게는 유방암 환자일 수 있고, 더욱 바람직하게는 삼중음성유방암 환자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 “림프구의 종양 반응성 예측을 위한 정보제공방법”은 림프구를 이용한 면역치료를 위한 예비적 단계로써 종양세포에 특이적 활성을 나타내는 림프구만을 선별할 수 있는 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA 수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 종양침윤림프구의 배양
종양침윤림프구(TIL)를 분리하고 배양하기 위해, 먼저 수술 직후의 유방암 조직을 수집한 다음 실험실로 옮겨 2시간 내에 상기 종양 조직으로부터 TIL을 단리한 후, 하기와 같은 방법에 따라 배양하였다. 이때, 사용된 상기 모든 유방암 조직은 유방암 전이가 있는 림프절에서 유래한 유방암 조직을 제외하고 유방에서 유래한 것만을 이용하였다. 보다 구체적으로, 종양 조직을 1X ZellShield 항생제제(Minerva Biolabs, Berlin, Germany)가 포함된 인산 완충액(PBS, pH 7.4, Biowest)으로 세척하고 직경 1 mm의 조각으로 절제하였다. 이후 상기 조직으로부터 TIL을 단리하기 위해, 10% 소태아혈청(FBS, Corning, VA, USA), 1× ZellShield, 50 nM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol, Life Technologies, NY, USA) 및 1,000 IU/mL 인간 재조합 IL-2(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)가 포함된 RPMI 1640 배지(Life technologies, NY, USA)가 2 mL씩 담긴 24-웰 플레이트에 각 웰 당 2조각씩 분주한 후 14일 동안 5% CO2 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 기간 동안 2일에 한 번씩 배지의 절반을 교체해 주었으며, 배지 색이 붉은 색에서 노란색으로 바뀌면 세포를 두 개 웰로 나누어 주었다. 14일 후 종양 조직 및 잔여물을 제거하기 위해 배양된 TIL을 40 μm 극공(pore)의 나일론 메쉬 여과기에 거른 다음, 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였으며, 세포 수 및 생존율을 확인한 후 다음 실험이 진행되기 전까지 동결보존하였다.
한편, 추가적인 급속 증식(rapid expansion; REP)을 위해, 상기 방법으로 분리한 TIL을 건강한 공여자로부터 얻은 방사선 조사(50 Gy)된 동종의 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs)와 함께 10% FBS, 1× ZellShield, 1,000 IU/mL 인간 재조합 IL-2, 및 30ng/mL 인간 항-CD3 항체(OKT3, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)가 포함된 REP 배지(50% RPMI 1640 및 50% AIM-V 배지, Life Technologies)에서 배양하였다. 상기 REP 배지는 2일 또는 3일마다 새로 첨가하였고, 14일 후 배양된 TIL(post-REP TILs)을 수집하여 동결보존하였다.
1-2. 일차 암세포 배양
종양조직에서 일차 암세포를 분리 및 배양하기 위하여, 상기 실시예 1-1의 방법으로 얻은 유방암 조직 조각을 분해 완충액(digestion buffer) 즉, 2% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Invitrogen, CA, USA), 10㎍/mL 인슐린(Life technologies), 10ng/mL EGF(Invitrogen), 및 1× 콜라게나제/히알루로니다제(collagenase/hyaluronidase, Gendepot, Barker, TX, USA)가 첨가된 DMEM-F12 배지(Life Technologies)의 존재 하에 1시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하여 분해되도록 하였다. 이후 분해된 조직에서 얻어진 펠렛을 80 x g에서 30초 동안 원심분리한 다음 0.25% 트립신/EDTA에서 재현탁하고 피펫팅하여 단일세포로 분리하였다. 단일세포가 포함된 현탁액을 100μm 공극 여과기로 여과하고 2% FBS가 포함된 차가운 HBSS(Hank’s balanced salt solution) 용액으로 세척한 다음, 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 단일 암세포를 수득하였다. 상기 방법으로 얻어진 해리된 세포를 2% FBS, 5ng/mL 인간 재조합 EGF, 0.3㎍/mL 하이드로코르티손(Sigma-Aldrich, St. Louis), 0.5ng/mL 콜레라 톡신(Sigma-Aldrich), 5nM 3,3′, 5-트리요오드-L-티로닌(3,3′,5-triiodo-L-thyronine, Sigma-Aldrich), 0.5nM 베타-에스트라디올(β-estradiol, Sigma-Aldrich), 5μM 이소프로테레놀 염산염(isoproterenol hydrochloride, Sigma-Aldrich), 50nM 에탄올아민(ethanolamine, Sigma-Aldrich), 50nM O-포스포릴에탄올아민(O-phosphorylethanolamine, Sigma-Aldrich), 1× 인슐린/트렌스페린/셀레늄, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM/F12 (1:1) 배지(Life Technologies)를 이용해 콜라겐 I이 코팅된 100mm 플레이트(Corning)에서 37℃, CO2 배양기로 배양하였다. 이후 최소 2회 계대배양한 후 동결보존하였다.
1-3. 종양침윤림프구의 반응성 평가
상기 실시예 1-1의 방법으로 대량 증식시킨 TIL의 잠재적인 기능성을 평가하기 위하여, 96웰 플레이트에서 웰 당 1 x 105개의 TIL을 32.4nM PMA 및 1㎍/mL 이노마이신(ionomycin)으로 24시간 동안 자극시켰다. 이후 배양 플레이트를 1,500 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 수집한 다음, ELISA 분석을 통해 IFN-γ 단백질 수준을 측정하였다.
또한, TIL의 자가 유래 암세포에 대한 반응성을 조사하기 위해, 96웰 플레이트에서 4 x 105개의 TIL을 1 x 105개의 자가 유래 유방암 세포와 24시간 동안 공동 배양한 다음, 상등액을 수집하여 ELISA 분석을 통해 TIL에서 분비된 IFN-γ 단백질 수준을 측정하였다.
1-4. ELISA 분석
본 실시예에서 수행한 ELISA는 ELISA 키트(K0331121, Koma Biotech, Seoul, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 간략히, 각 웰을 세척 용액으로 세척 한 다음, 샘플, 표준물질 및 블랭크를 각 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였으며, 모든 테스트는 2회 또는 3회 실시하였다. 이후 액체를 제거한 다음, 플레이트를 세척 용액으로 세척하고 비오틴화된 검출 항체를 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이후 다시 플레이트를 세척하고 스트렙타비딘-홀스레디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Strepavidin-horesradish peroxidase conjugate)를 첨가한 다음 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 세척 후, 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine) 용액을 첨가하고, 적절한 발색을 위해 실온에서 배양하였다. 정지 용액을 각 웰에 첨가한 후 마이크로플레이트 판독기(Spectramax 340PC, Molecular Devices)로 450 nm 흡광도에서 IFN-γ 수준을 측정하였다.
1-5. 통계분석
자가 유래 종양세포에 대한 특이적 활성을 갖는 림프구를 구분할 수 있는 유전자 마커를 발굴하기 위해, 하기와 같은 방법으로 통계분석을 진행하였다.
1) 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 자가 유래 종양세포와 동시 배양 시 TIL에서 분비되는 IFN-γ의 양을 TIL이 단독으로 있을 때 분비되는 IFN-γ의 양으로 나누어 그 비율(ratio)을 구하고, 그 값이 2 이상일 때 반응성이 있는 것으로 정의하였음.
2) 상기 1) 분석을 통해 나타난 종양에 대한 반응성이 있는 군과 반응성이 없는 군의 배양된 TIL에서 RNA를 추출하고 전사체 서열분석(transcriptome sequencing)을 실시하여 차별적으로 발현되는 유전자를 분석하였으며, 발현수준이 2배 이상 차이나는 유전자를 차별 발현된 것으로 정의하였음.
3) 종양세포와 동시 배양 시 TILs에서 분비된 IFN-γ의 양을 종양침윤림프구가 단독으로 있을 때 분비되는 IFN-γ의 양으로 나누어 구한 ratio와 각 유전자의 발현 값을 이변량 상관분석(Spearman Correlation)을 통해 조사하여 유의한 상관관계(p < 0.05)를 보이는 유전자 군을 선별하였음.
실시예 2. 종양 특이적 림프구 선별 마커 탐색
상기 실시예 1-3의 방법에 따라 15명의 삼중음성유방암(Triple-negative breast cancer; TNBC) 환자로부터 유래된 TIL을 각 환자 유래 유방암세포와 배양한 결과 6명의 환자에서 반응성을 보였다. 이어서 상기 1-5의 두 번째 방법에 따라 반응성을 보인 6명의 환자군과 반응성을 보이지 않은 9명의 환자군에서 차별적으로 발현되는 유전자를 분석한 결과 13,827개 유전자 가운데 총 709개의 발현이 차별적으로 나타난 것을 확인하였으며, 상기 유전자들 중 세포표면에서 발현되는 17개 유전자를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 세포표면에서 발현되는 유전자들을 기반으로 FACS 등의 방법을 통해 살아있는 세포를 선별할 수 있다.
나아가 도 1의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 실시예 1-5의 세 번째 방법으로 개시된 상관분석을 통해서 IFN-γ 비율과 유의한 상관성을 보인 유전자는 총 1,923개로 나타났으며, 상기 차별적으로 발현되는 709개 유전자들에서 공통적으로 존재하는 유전자는 총 46개임을 확인하였다. 하기 표 1의 17개 유전자 중에서 상기 46개 유전자에 포함되는 유전자는 상단에 존재하는 8개 유전자임을 확인하였다.
유전자 Official full name
Met MET proto-oncogene, receptor tyrosine kinase
CD200 CD200 molecule
ITGB1 (CD29) integrin subunit beta 1
PTPN13 protein tyrosine phosphatase non-receptor type 13
CYSLTR1 cysteinyl leukotriene receptor 1
VSIG1 V-set and immunoglobulin domain containing 1
MBOAT2 membrane bound O-acyltransferase domain containing 2
MYO9A myosin IXA
CD23 Fc fragment of IgE receptor II; FCER2
S100P S100 calcium binding protein P
SECTM1 secreted and transmembrane 1
CD300C CD300c molecule
TSPAN2 tetraspanin 2
ARRDC3 arrestin domain containing 3
ITGA6 (CD49f) integrin subunit alpha 6
TCN2 transcobalamin 2
ATP6V0A1 ATPase H+ transporting V0 subunit a1
실시예 3. 종양 반응성 예측용 마커 유전자의 유효성 검증
3-1. TNBC-REP TIL의 종양 특이적 반응성과 17종 유전자의 발현수준 간의 상관관계 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 도출된 17개의 유전자 마커에 대하여 종양 특이적 림프구를 선별할 수 있는 마커로써 유효성을 검증하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
먼저 14명의 삼중음성유방암 환자에서 분리하여 급속 증식시킨 TIL(TNBC-REP TIL) 각각에서 상기 실시예 2에서 도출된 17개 유전자의 발현수준을 FACS를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Sample: reacti- vity CD23 ITGB1 ITGA6 CD200 CD300c Met S100P TSP AN ARRDC3 ATP6 VOA CYS LTR1 MBOAT2 MY09A PTPN13 SEC TM1 TCN2 VSIG1
BC1544 0 0.1 100.0 7.0 0.3 46.8 0.1 0.1 0.0 0.1 0.3 0.8 0.3 0.0 0.1 0.6 0.1 0.6
BC16048 0 0.3 100.0 4.1 1.9 67.1 0.1 0.0 0.0 0.2 0.2 0.9 0.6 0.1 0.1 0.9 0.1 0.5
BC16092 1 0.0 100.0 33.9 6.9 68.4 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.1 0.0 0.5 0.1 0.1
BC16126 0 0.1 99.9 5.5 0.3 40.2 0.2 0.1 0.0 0.2 0.3 0.6 0.4 0.0 0.1 0.6 0.1 0.1
BC16127 1 0.2 99.8 80.9 0.5 34.7 0.1 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.0 0.1 0.3 0.0 0.0
BC16143 0 0.8 99.9 59.8 0.6 14.4 0.2 0.0 0.0 0.1 0.2 0.3 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.4
BC16147 1 0.6 99.6 43.9 1.1 23.6 0.2 0.0 0.0 0.1 0.3 0.2 0.2 0.0 0.0 0.5 0.1 0.2
BC16151 0 0.1 99.6 31.5 0.3 34.2 0.2 0.1 0.0 0.1 0.2 0.4 0.4 0.1 0.0 0.3 0.2 0.2
BC16154 1 0.1 100.0 81.0 3.5 93.8 0.1 0.0 0.0 0.0 0.6 0.1 0.2 0.0 0.0 0.1 0.1 0.0
BC16158 1 5.4 99.0 68.2 4.3 49.1 0.1 0.0 0.0 0.0 0.1 0.1 0.1 0.0 0.0 0.2 0.0 0.1
BC16166 0 0.2 100.0 22.5 1.2 9.5 0.2 0.1 0.0 0.1 0.3 0.1 0.4 0.1 0.0 0.5 0.1 0.1
BC16208 0 0.5 99.7 14.7 0.7 57.3 0.2 0.1 0.0 0.2 0.2 0.2 0.1 0.0 0.0 0.2 0.1 0.2
BC16223 0 0.0 99.8 7.1 0.3 19.8 0.3 0.1 0.0 0.1 0.3 0.9 0.8 0.1 0.1 0.4 0.1 0.3
BC17009 0 0.0 99.8 38.4 0.2 56.2 0.3 0.0 0.0 0.2 0.3 0.2 0.2 0.0 0.1 0.5 0.1 0.0
나아가 반응성이 있는 TIL(reactivity=1)과 반응성이 없는 TIL(reactivity=0)의 세포에서 발현되는 유전자들의 발현수준 간에 유의적인 차이가 있는지 여부를 알아보기 위해 SPSS 통계분석을 실시하였다. 그 결과, 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 17개 유전자 가운데 ITGA6, CD200, S100P, ARRDC3, CYSLTR1 및 VSIG1에서 유의적 차이가 나는 것을 확인하였다.
CD23 ITGB1 ITGA6 CD200 CD300c Met S100P TSPAN ARRDC3
Mann-Whitney의 U 18.000 18.500 3.000 6.000 14.000 8.500 7.500 22.500 .000
Wilcoxon의 W 63.000 33.500 48.000 51.000 59.000 23.500 22.500 37.500 15.000
Z -.610 -.549 -2.600 -2.225 -1.133 -2.032 -2.327 .000 -3.003
근사 유의확률(양측) .542 .583 .009 .026 .257 .042 .020 1.000 .003
정확한 유의확률[2* (단측유의확률)] .606b .606b .007b .029b .298b .060b .042b 1.000b .001b
정확한 유의확률
(양측) 		.571 .610 .007 .025 .298 .073 .031 1.000 .001
정확한 유의확률
(단측) 		.290 .327 .003 .013 .149 .048 .028 1.000 .000
점 확률 .019 .045 .001 .004 .029 .045 .028 1.000 .000
ATP6 VOA CYS LTR1 MBOAT2 MY09A PTPN13 SEC TM1 TCN2 VSIG1
Mann-Whitney의 U 15.500 6.000 10.500 20.500 11.000 14.500 14.500 7.500
Wilcoxon의 W 30.500 21.000 25.500 35.500 26.000 29.500 29.500 22.500
Z -.944 -2.202 -1.605 -.267 -1.533 -1.068 -1.069 -2.002
근사 유의확률(양측) .345 .028 .108 .789 .125 .286 .285 .045
정확한 유의확률[2*
(단측유의확률)] 		.364b .029b .112b .797b .147b .298b .298b .042b
정확한 유의확률
(양측) 		.375 .027 .118 .823 .147 .313 .315 .045
정확한 유의확률
(단측) 		.188 .013 .059 .411 .073 .156 .159 .022
점 확률 .018 .002 .008 .025 .017 .014 .020 .003
구체적으로 상기 6개 유전자 각각에 대하여 반응성에 따른 발현수준 차이를 정량적으로 그래프화한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 ITGA6와 CD200은 반응성이 없는 그룹(00)과 비교하여 반응성이 있는 그룹의 TIL(1.00)에서 발현수준이 더 높은 것으로 나타났으며, 나머지 S100P, ARRDC3, CYSLTR1 및 VSIGI의 경우에는 반응성이 있는 그룹의 TIL에서 발현수준이 더 낮게 나타났다. 이에, 상기 결과로부터 반응성이 있는 TIL을 선별하기 위한 마커로써 발현수준이 증가한 ITGA6와 CD200을 선별하고 하기 실험을 진행하였다.
3-2. TIL 종류별 ITGA6와 CD200의 발현수준 분석
본 발명자들은 상기 실시예 3-1에서 선별한 ITGA6와 CD200의 발현이 종양에 침윤한 면역세포(TIL) 중 어떤 세포에서 차이가 나는지 알아보고자 하였다. 이를 위해, TIL을 CD3, CD4, CD8, CD56 항체와 ITGA6 또는 CD200을 같이 염색하여 FACS 분석을 실시한 후, 전체 TIL(CD45+), NKT 세포(CD45+CD56+CD3+), T 세포(CD45+CD56-CD3+), CD4 T 세포 (CD45+CD56-CD3+CD4+CD8-) 및 CD8 T 세포(CD45+CD56-CD3+CD4-CD8+) 각각에서 ITGA6 및 CD200의 발현을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 각각 나타내었다.
Sample ITGA6+
CD45 		ITGA6+
NKT cells 		ITGA6+
T cells 		ITGA6+
CD4 T cells 		ITGA6+
CD8 T cells
BC1544 15.9 2.47 12.7 21.6 3.09
BC16048 11.7 4.65 11.4 30.5 4.35
BC16092 47 59.6 43.9 50 48
BC16126 10.6 13.1 8.76 48.9 10.5
BC16127 88.5 77.3 86.5 96 77.5
BC16143 77.3 72.7 72.6 74 59
BC16147 55.4 26.5 50.7 63.7 41.7
BC16151 41.6 24.6 37.7 76.2 40.5
BC16154 89 50 87.5 89.5 41.6
BC16158 78.9 72.2 75.7 85.3 38.6
BC16166 31.3 22.8 27.5 65.6 19.6
BC16208 13.7 12.2 11.4 41.8 13.8
BC16223 24.8 9.69 21.7 28.2 14.6
BC17009 53.8 25.7 54.2 92.7 52.2
Sample CD200+
CD45 		CD200+
NKT cells 		CD200+
T cells 		CD200+
CD4 T cells 		CD200+
CD8 T cells
BC1544 0.5 1.33 0.26 0.34 0.2
BC16048 4.33 3 2.84 7.24 0.73
BC16092 9.45 15.1 6.84 3.66 8.59
BC16126 0.33 0.85 0.22 0.49 0.1
BC16127 0.42 0.92 0.14 0.33 0.061
BC16143 0.98 25 0.52 0.61 0.43
BC16147 1.38 5.36 0.81 1.68 0.074
BC16151 0.23 1.89 0.11 0.66 0.11
BC16154 6.45 4.35 3.8 4.25 4.12
BC16158 9.22 21.4 6.1 8.07 0
BC16166 1.9 10.1 1.12 5.57 0.036
BC16208 1.12 3.59 0.7 1.02 0.12
BC16223 1.8 1.75 1.31 4.03 0.51
BC17009 1.15 6.29 0.28 1.44 0.19
나아가 SPSS 프로그램을 이용하여 통계분석을 실시한 결과, 하기 표 6 및 도 2b에서 볼 수 있는 바와 같이 전체 TIL(CD45+)과, NKT 세포 및 T 세포에서 반응성 없는 그룹에 비해 반응성 있는 그룹에서 ITGA6의 발현이 유의적으로 높게 발현된 것을 확인하였다. 그러나 CD200의 경우에는 전체 TIL뿐만 아니라 NKT 세포 및 T 세포에서도 유의한 발현의 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과로부터 CD200은 실험적 변수로 판단하였고, ITGA6를 종양 특이적 림프구 반응성 예측 마커로 선별하였다.
CD200_ CD45 CD200_ NKT CD200_ T CD200_ CD4T CD200_ CD8T ITGA6_ CD45 ITGA6_ NKT ITGA6_ T ITGA6_ CD4T ITGA6_ CD8T
Mann-Whitney의 U 10.000 16.000 11.000 17.000 20.000 3.000 4.000 4.000 10.000 9.000
Wilcoxon의 W 55.000 61.000 56.000 62.000 35.000 48.000 49.000 49.000 55.000 54.000
Z -1.667 -.867 -1.533 -.733 -.333 -2.600 -2.467 -2.469 -1.667 -1.800
근사 유의확률
(양측) 		.096 .386 .125 .463 .739 .009 .014 .014 .096 .072
정확한 유의확률[2*(단측유의확률)] .112b .438b .147b .518b .797b .007b .012b .012b .112b .083b
정확한 유의확률
(양측) 		.112 .438 .147 .518 .797 .007 .012 .011 .112 .083
정확한 유의확률
(단측) 		.056 .219 .073 .259 .399 .003 .006 .006 .056 .041
점 확률 .014 .037 .017 .040 .049 .001 .002 .002 .014 .011
실시예 4. 기계학습 방법을 통한 종양 반응성 예측용 마커 유전자의 유효성 검증
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 도출된 17개 마커 유전자를 대상으로 종양 크기 및 선행항암화학요법(neoadjuvant chemotherapy; NAC)의 유무를 이용한 기계학습 방법을 통해 종양에 대한 반응성과 비반응성을 예측할 수 있는 바이오마커 유전자를 도출하기 위한 분석을 진행하였다. 이를 위해 여러 기계학습 방법 중 로지스틱 회귀 분석(Logistic regression)법을 이용해 분석을 진행하였다.
먼저, 15명의 삼중음성유방암 환자 유래 TIL에 대하여 주성분 분석(Principal Component Analysis; PCA)을 실시하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 반응성 여부에 따라 반응성 그룹(Active)과 비반응성 그룹(Non-active)의 두 개 클러스터로 분명하게 구분되지는 않았지만 몇 개의 클러스터가 관찰되었다.
다음으로, 각 환자유래 TIL에서 17종 유전자의 발현수준을 분석하여 히트맵(Heatmap)으로 분석을 실시하였으며, 반응성을 보인 환자 유래 샘플의 결과는 초록색으로 표시하였다. 분석 결과, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 17개 유전자 가운데 PTPN13 유전자가 반응성을 보이는 그룹에서 주로 높은 발현수준을 보였고, MET 유전자는 NAC를 진행한 샘플에서 낮은 발현수준을 보였다.
또한, 상기 도 3a의 PCA 분석 결과를 Biplot 그래프로 나타내어 샘플과 유전자들을 함께 표시하여 각 그룹에 어떤 유전자들이 영향을 미치는지 분석한 결과, 도 3c에서 볼 수 있는 바와 같이 SECTM1, PTPN13, S100P, CD200, TCN2 및 FCER2(CD23) 유전자가 BC16110 샘플을 제외한 반응성을 갖는 그룹과 관련이 있는 것을 확인하였다. 나아가 상기 6종류의 유전자를 이용해 히트맵을 그려 분석한 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이 PTPN13 유전자가 반응성을 갖는 샘플에서 발현수준이 주로 높게 나타났으며, PTPN13 이외의 유전자에서는 뚜렷한 발현수준의 차이가 나타나지 않은 것을 확인하였다.
실시예 5. 종양 반응성 예측용 마커 유전자 조합 발굴 및 유효성 검증
5-1. 10개 유전자로 구성된 조합 도출 및 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2를 통해 도출된 17개의 유전자들을 대상으로 종양 특이적 반응성을 갖는 림프구 선별을 위한 유효한 마커 조합을 발굴하기 위해 분석을 진행하였다.
보다 구체적으로, 17종류의 차등적으로 발현된 유전자들 간의 상호작용(interaction)을 고려하여 기계학습을 진행하기 위해 먼저 sklearn에서 제공하는 PolynomialFeatures 라이브러리를 사용해서 각 유전자들 사이의 interaction을 구하였다. 그 결과, 변수(Feature)의 수가 너무 많아 lasso를 사용해 feature 선별을 진행하였으며 그 결과는 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
Feature interaction Feature의 수
2 136 -> 10
3 680 -> 11
4 2380 -> 11
5 6188 -> 10
6 12376 -> 8
7 19448 -> 10
8 24310 -> 12
9 24310 -> 11
10 19448 -> 13
11 12376 -> 11
12 6188 -> 7
13 2380 -> 12
14 680 -> 5
15 136 -> 6
16 17
17 1
이후 각각의 interaction에 대하여 SMOTE 방법을 사용하여 oversampling을 진행하였다. 그 후에 로지스틱 회귀분석을 실시하였으며, 하기 표 8에서 볼 수 있는 바와 같이 정확도(accuracy) 및 AUC 값이 1인 값을 제외하고 가장 높게 나타난 10개 유전자를 사용한 경우를 선택하여 히트맵으로 유전자들의 발현수준을 비교하였다.
Training Accuracy Test Accuracy AUC
2 1 1 1
3 1 1 1
4 1 1 1
5 1 1 1
6 1 0.83 1
7 1 0.83 1
8 1 0.5 0.67
9 1 0.5 0.78
10 1 0.83 0.78
11 1 0.66 0.67
12 1 0.5 0.11
13 1 0.33 0.56
14 1 0.33 0.11
15 1 0.33 0.11
16 1 0.5 0.33
17 0.75 0.5 0.89
보다 구체적으로, 도 4a에 13가지 feature에 해당하는 10개 유전자 조합 및 환자 유래 TIL 샘플에서 각 유전자 조합의 발현수준을 나타내었다. 분석 결과 반응성을 나타내는 환자유래 샘플에서 좌측으로부터 4, 12, 13, 5 및 10번 조합은 발현수준이 낮은 경향을 보였다. 나아가 양의 coefficient 값은 반응성으로 예측하는데 영향력이 크고 음의 coefficient 값은 비반응성으로 예측하는데 영향을 크게 미치므로, 각각 양과 음의 coefficient 값이 가장 큰 feature에 속하는 유전자 조합 즉, 7번(coefficient 값 양수인 경우, 빨강) 및 2번(coefficient 값이 음수인 경우, 녹색)으로 각각 히트맵을 그려 분석을 실시하였다.
보다 상세하게, coefficient 값이 음수인 2번 조합에 해당하는 10개 유전자를 이용해 히트맵 분석을 실시한 결과를 도 4b에 나타내었으며, 상기 조합의 coefficient 값은 -9.30E-05이었다. coefficient 값이 가장 큰 양수를 나타내는 7번의 10개 유전자와 비교하였을 때 공통적이지 않은 4개 유전자들을 녹색 원으로 표시하였다. 이중 MET과 ATP6V0A1 유전자는 NAC를 실행하면 발현수준이 낮은 경향을 나타내는 것으로 보였으며, PTPN13 유전자가 반응성을 보이는 그룹에서 주로 높은 발현수준을 나타내었다. 또한, coefficient 값이 양수인 7번 조합에 해당하는 10개 유전자를 이용해 히트맵 분석을 실시한 결과는 도 4c에 나타내었으며 해당 10개 유전자 조합의 coefficient 값은 8.92E-04이었다. 상기 2번의 10개 유전자에 포함되지 않는 다른 4개 유전자를 녹색 원으로 표시하였고, 히트맵 결과를 분석한 결과 상기 4개 유전자 중에서 TSPAN2와 MYO9A 유전자의 경우 NAC를 실행한 샘플에서 발현수준이 낮은 경향을 보였으며, CD300C 유전자는 NAC를 실행하면 발현수준이 높은 경향을 보였다. 종합적으로, 상기 결과들로부터 각 유전자들 간에 환자 유래 샘플의 반응성 여부에 따른 발현수준의 차이가 발견되지 않았다. 이에, 본 발명자들은 양과 음의 coefficient 값을 갖는 상기 각 2번 및 7 조합에서 공통되지 않는 총 8개 유전자들만을 가지고 히트맵을 그려 분석하였으나, 역시 반응성 유무에 따라 각 유전자들의 발현수준에는 차이가 나타나지 않은 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기 8개 유전자 즉, MET, ATP6V0A1, S100P, PTPN13, CD23, TCN2, TSPAN2, MBOAT2의 interaction을 구하여 기계학습으로 분석을 진행하였다.
5-2. 8개 유전자로 구성된 조합에 대한 기계학습 분석
본 발명자들은 상기 실시예 5-1을 통해 도출된 8개 유전자를 이용하여 종양 반응성 예측할 수 있는 유효한 마커 조합을 발굴하기 위한 실험을 진행하였다. 상기 실시예 5-1에서와 동일한 방법으로 8개 유전자들 간에 interaction을 고려하여 먼저 PolynomialFeatures 라이브러리를 사용해서 각 유전자들 사이의 interaction을 구하였고, lasso를 사용해 feature 선별을 진행하였으며 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
Feature interaction Feature의 수
2 28 -> 15
3 56 -> 20
4 70 -> 11
5 56 -> 10
6 28 -> 10
7 8
8 1
이어서 각 유전자 조합을 이용한 모델의 성능을 조사하기 위해 oversampling 진행 후, 로지스틱 회귀분석과 랜덤 포레스트(random forest) 분석을 실시하였다. 먼저 로지스틱 회귀분석 결과, 하기 표 10, 도 5a 및 도 5b에 나타낸바와 같이 interaction 수가 3 및 4인 경우 테스트 정확도 및 AUC 값이 1인 값을 제외하고 가장 높게 나타났다. 또한 랜덤 포레스트 분석 결과, 하기 표 11에 나타낸 바와 같이 interaction 수가 3인 경우에서 모델의 성능이 1인 값을 제외하고 가장 높게 나타난 것을 확인하였다.
Training Accuracy Test Accuracy AUC
No-interaction 1 0.66 0.78
2 1 1 1
3 1 0.83 0.89
4 1 0.83 0.89
5 1 0.5 0
6 1 0.16 0.33
7 1 0.33 0.67
8 0.5 0.5 0.5
Training Accuracy Test Accuracy AUC
No-interaction 1 0.83 1
2 1 0.83 1
3 1 0.83 0.78
4 0.91 1 1
5 1 0.5 0.78
6 0.83 1 1
7 0.91 0.5 0.67
8 0.83 0.33 0.28
5-3. 종양 반응성 예측용 마커 유전자 조합 최종 도출
상기 실시예 5-2의 분석 결과, 회귀분석 및 랜덤 포레스트 분석법을 통해 공통적으로 interaction 수가 3인 경우 즉, 3개 유전자의 조합으로 구성된 모델의 종양 반응성 예측 성능이 가장 높은 것으로 확인되었는바, 본 발명자들은 3종류의 유전자로 구성된 양의 coefficient 값을 나타내는 10가지 feature 각각에 대하여 ROC 커브(curve)를 그렸다. 도 6a 및 도 6b는 각 10가지 유전자 조합을 표로 나타내고 10가지 feature 모든 경우에 대한 ROC 커브를 종합적으로 그리고 또한 이를 각각 구별하여 그린 결과이며, 도 6c 및 도 6d는 양의 coefficient 값을 가진 경우 중 AUC 값이 0.7 이상인 것(2, 5, 6, 8, 9 및 10번 조합)만 사용해 ROC 커브를 종합적으로 그리고 이를 각각 구별하여 나타낸 것이다.
이에 더하여 본 발명자들은 상기 AUC 값이 0.7 이상인 6개 feature에 대하여 각각 confusion matrix를 그려 각 조합으로 구성된 모델의 성능을 비교하였다. 그 결과, 도 6e에서 볼 수 있는 바와 같이 8번과 10번 feature가 반응성(1로 표시)을 3개 전부 맞추었고, 비반응성(0으로 표시)에서도 다른 feature에 비해 정확도가 더욱 높은 것을 확인하였다.
따라서 상기 결과들로부터, 8번(ATP6V0A1*TSPAN2*MBOAT2) 및 10번(PTPN13*TCN2*TSPAN2) 조합을 림프구의 종양 반응성을 예측하는 유의한 마커 유전자 조합으로 최종 선별하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. Genbank 접근 번호 NM_000210.4, NM_001079818.3, NM_001316306.2, NM_001365529.2 및 NM_001365530.2로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 ITGA6 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 림프구의 종양 반응성 예측용 조성물로서,
    상기 종양은 삼중음성유방암인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Genbank 접근 번호 NM_001130020.3, NM_001130021.3, NM_001378522.1, NM_001378523.1 및 NM_001378530.1로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 ATP6V0A1; Genbank 접근 번호 NM_001329670.2, NM_001329671.2, NM_001329672.2 및 NM_020801.4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 ARRDC3; Genbank 접근 번호 NM_001207019.2, NM_001220500.2 및 NM_002002.4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 CD23; Genbank 접근 번호 NM_001004196.3, NM_001318826.1, NM_001318828.1, NM_001318830.1 및 NM_001365851.2로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 CD200; Genbank 접근 번호 NM_006678.5의 염기서열로 이루어진 CD300; Genbank 접근 번호 NM_001282186.1, NM_001282187.2, NM_001282188.2 및 NM_006639.4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 CYSLTR1; Genbank 접근 번호 NM_002211.4, NM_033668.2 및 NM_133376.2로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 ITGB1; Genbank 접근 번호 NM_001321265.2, NM_001321266.2, NM_001321267.2 및 NM_138799.4로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 MBOAT2; Genbank 접근 번호 NM_000245.4, NM_001127500.3, NM_001324401.2 및 NM_001324402.2로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 Met; Genbank 접근 번호 NM_006901.4의 염기서열로 이루어진 MYO9A; Genbank 접근 번호 NM_006264.3, NM_080683.3, NM_080684.3 및 NM_080685.2로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 PTPN13; Genbank 접근 번호 NM_005980.3의 염기서열로 이루어진 S100P; Genbank 접근 번호 NM_003004.3의 염기서열로 이루어진 SECTM1; Genbank 접근 번호 NM_000355.4 또는 NM_001184726.1의 염기서열로 이루어진 TCN2; Genbank 접근 번호 NM_001308315.1, NM_001308316.1 및 NM_005725.6로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 TSPAN2; 및 Genbank 접근 번호 NM_001170553.1 또는 NM_182607.5의 염기서열로 이루어진 VSIG1으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 림프구는 종양 조직, 혈액, 또는 체액에서 분리된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
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