KR20120035417A

KR20120035417A - 방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법

Info

Publication number: KR20120035417A
Application number: KR1020100096911A
Authority: KR
Inventors: 임영빈; 이해준; 전상록; 이윤실
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2010-10-05
Publication date: 2012-04-16
Also published as: KR101270761B1

Abstract

본 발명은 TA(transaldolase) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 환자의 시료 중에서 TA 단백질의 발현양을 측정함으로써 방사선 피폭을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법{Transaldolase, a marker for diagnosing radiation exposure, a composition for diagnosing radiation exposure to measure the level of expression of the marker, a kit for diagnosing radiation exposure comprising the composition, and a method for diagnosing radiation exposure using the marker}

본 발명은 방사선 피폭을 진단할 수 있는 새로운 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 방사선 피폭 진단용 마커, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법 제공하는 것이다.

본 발명은 교육과학기술부의 원자력기술개발사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다[과제고유번호: 20100003313, 과제명: 방사선손상인자발굴 및 제어기술개발].

방사선 피폭은 심장질환이나 암 발생의 위험을 증가시킨다. 방사선피폭에 의한 인체 손상정도를 측정하기 위해 세포학적, 유전학적인 측정법들이 지난 수십 년간 사용되어 왔다. 하지만 이러한 측정법들은 방사선에 대한 인체의 유전자 또는 세포의 손상 여부를 확인해 줄 수 있을 뿐이지, 방사선에 대한 인체 반응의 분자적 기작에 대한 정보는 제공하지는 않는다. 따라서, 방사선 피폭을 편리하고 정확하게 진단할 수 있도록 하는 마커를 찾기 위해 지금도 많은 노력이 경주되고 있다.

지난 수십 년간 방사선피폭 마커에 대한 연구는 주로 암에 집중되어 왔지만 최근 들어 방사선에 노출된 정상 조직에서 발견될 수 있는 피폭마커를 찾는 연구로 더욱 확대되었다. 이러한 피폭 마커는 원전사고, 테러 또는 방사선치료에 의한 피폭에 따른 인체의 영향과 예후판단에 중요하게 사용될 수 있을 것이다.

단백질은 세포의 가장 기본적인 기능단위이며 소변이나 혈액에서 쉽게 채집할 수 있고, 항원 항체반응의 특이성을 이용하여 체액이나 세포 그리고 조직에서 빠르고 신뢰성 있게 정량이 가능하며, 이러한 측정법들은 자동화가 가능하다는 점에 있어서 진단용 마커로서 장점이 있다. 하지만 지금까지 아밀라아제, Flt3-L, 및 시트룰린만이 방사선피폭 마커로 제안되었다. 아밀라아제는 이하선, Flt3-L는 골수, 그리고 citrulline은 소장상피조직에서의 방사선 피폭마커로 알려져 있다(Van den Brenk et al., Serum amylase as a measure of salivary gland radiation damage. Hyperamylasaemia following fractionated exposure to 4 MV X rays delivered in high pressure oxygen, and effects of certain steroids on this response. Br J Radiol 1969, 42, 688-700; Siegel, J. A. et al., Red marrow radiation dose adjustment using plasma FLT3-L cytokine levels: improved correlations between hematologic toxicity and bone marrow dose for radioimmunotherapy patients. J Nucl Med 2003, 44, 67-76; Lutgens, L. C. et al., Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage, Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003, 57, 1067-1074).

이에 본 발명자들은 방사선 피폭에 대한 단백질 마커를 개발하고자 연구한 결과, 방사선 피폭에 대해 뇌 조직 특이적인 단백질 마커를 발견하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 방사선 피폭에 대한 새로운 단백질 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 방사선 피폭에 대한 단백질 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방사선 피폭을 진단하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 방사선 피폭에 대한 단백질 마커의 발현 수준을 정상 대조군의 발현수준과 비교하여 방사선 피폭을 진단하는 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 TA(transaldolase)의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 TA(transaldolase) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방사선 피폭 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 방사선 피폭 진단용 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은

환자의 시료 중에서 TA(transaldolase) 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정된 TA 단백질의 발현수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 피폭을 진단하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

본 발명은 방사선 피폭에 대한 단백질 마커를 발견하기 위해 예의 연구한 결과, 방사선에 피폭 시 특정 단백질, 즉 TA(transaldolase) 및 그 mRNA 발현량이 뇌 조직 특이적으로 감소한다는 것을 발견하게 되어 TA의 뇌 조직 특이적인 방사선 피폭 마커로서의 용도를 발명하게 되었다. 구체적으로는, 마우스에 방사선을 조사하고 뇌, 폐, 비장, 및 소장 조직을 적출한 다음 단백질 추출용 버퍼를 이용하여 단백질 추출액을 획득한 다음 프로테오믹스 기법에 따라 동정될 수 있는 수많은 단백질 중 TA 및 그 mRNA의 발현량이 뇌조직 특이적으로 정상 대조군에 비해 유의적으로 감소한다는 것을 최초로 발견해 낸 것이다(실시예 1, 2, 실시예 4). 이러한 마우스에서의 조직 특이적 마커 TA는 사람의 뇌암세포주에서도 방사선 조사시 그 발현양이 감소한다는 것이 확인되어 인체에서도 조직 특이적인 방사선 피폭 마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 3).

따라서, 본 발명의 일 측면은 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커로서 사용될 수 있는 TA의 용도를 제공한다.

용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것이다. 본 발명에서의 진단은 방사선 피폭 여부 및/또는 그 정도를 확인하는 것이다.

용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker"란 시험군을 정상 대조군의 조직과 비교하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비해 방사선에 피폭된 군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서의 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커는 정상 대조군의 조직에 비하여, 방사선 피폭군의 조직에서 특이적으로 낮은 수준의 발현을 보이는 TA(transaldolase) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

TA 단백질은 트랜스알돌라제(transaldolase) 단백질로서, 본 명세서에서의 TA 단백질은 인간 및 마우스의 TA 단백질을 포괄하는 의미이며, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnical Information)에 등록되어 있다[Gene ID: 5803187(SEQ ID NO: 1), NP_006746.1(SEQ ID NO: 2,3); Gene ID: 42476292(SEQ ID NO: 4), NP_113999.2(SEQ ID NO: 5,6)]. 트랜스알돌라제는 펜토오스인산회로에 관여하여 하기 반응을 촉매하는 효소로 알려져 있으나, 방사선 피폭과의 연관성 또는 방사선 피폭에 의한 영향에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.

[반응식 1]

세도헵툴로오스-7-인산 + 글리세르알데히드-3-인산

프럭토오스-6-인산 + 에리트로오스-4-인산

상기 방사선 피폭에 의해 발현의 정도가 변화하는 TA 마커의 발현수준을 측정함으로써 방사선에 대한 피폭 여부 및 피폭 정도를 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은 TA 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물을 제공한다.

용어 "TA 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"란 방사선에 피폭된 개체에서 발현이 감소하는 마커인 TA 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출 및/또는 정량에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 일 구현예에 따르면 마커에 특이적인 항체, 마커에 특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드, 프라이머, 또는 프로브를 의미한다.

TA 단백질의 발현 수준은 TA 단백질의 발현양 또는 TA 유전자의 mRNA 발현양을 측정함으로서 알 수 있다.

상기 단백질의 발현양을 측정하는 제제는 일 구현예에 따르면, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드 이다.

용어 "단백질 발현양 측정"이란 방사선 피폭을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 방사선 피폭 진단 유전자에서 발현된 단백질의 발현양을 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드를 이용하여 단백질을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 방사선 피폭 마커인 TA에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, TA 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 TA 유전자에 의해 코딩되는 TA 단백질을 얻고, 얻어진 TA 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

용어 "단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드"란 온전한 항체의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위(결합 도메인)를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 부분 펩티드는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다. 상기 부분 펩티드는 최소한 7개 이상의 아미노산, 바람직하게는 9 개 이상의 아미노산, 보다 바람직하는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

유전자의 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 구현에에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, TA 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRANA에 대해 특이적으로 결합하는 프라미어 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

용어 "mRNA 발현양 측정"이란 방사선 피폭을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 방사선 피폭 마커 유전자의 mRNA 발현정도를 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 TA 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 파라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 방사선 피폭을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 TA 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현양을 측정함으로써 방사선 피폭 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 TA 단백질 및 그 유전자의 mRNA 발현량은 방사선 피폭 시 소장 조직 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물은 방사선 피폭이 의심되는 개체 중에서 특히 소장으로부터 얻어진 시료에서의 단백질 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 방사선 피폭 진단용 조성물을 포함하는, 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 방사선 피폭 진단용 키트는 방사선 피폭 마커인 TA 단백질의 발현수준을 그 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현양을 측정함으로써 방사선 피폭을 진단할 수 있다. 본 발명의 방사선 피폭 진단용 키트는 앞서 설명한 TA 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제, 즉 TA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, TA 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드, TA 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 또는 이들의 조합을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 TA 단백질 발현수준을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 방사선 피폭 진단용 키트는 TA 단백질의 mRNA의 발현양을 측정하기 위한 키트일 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머쌍 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방사선 피폭 진단용 키트는 TA 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 발현양을 측정할 수 있는, 방사선 피폭 진단용 마이크로어레이일 수 있다. 상기 방사선 피폭 진단용 마이크로어레이는 상기 본 발명의 마커를 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 일 구현예에 따르면 상기 TA 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은

용어 "환자"는 방사선 피폭이 의심되는 개체를 의미하고, 방사선 피폭에 의해 TA 단백질의 발현이 변화하는 임의의 개체를 포함하며, 바람직하게는 인간, 또는 마우스를 포함한 설치류일 수 있다.

용어 "환자의 시료"란 방사선 피폭 마커인 TA의 발현수준에 있어서 피폭 전후에 있어서 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 환자의 시료는 뇌로부터 얻어진 시료이다.

상기 TA 단백질의 발현수준은 TA 단백질의 발현양 또는 TA 유전자의 mRNA 발현양을 측정함으로서 알 수 있다.

상기 진단하는 방법으로 방사선 피폭을 진단하기 위한 정보가 제공될 수 있으며, 상기 방법은 구체적으로는, TA 단백질의 발현 수준을 TA 단백질 발현양 또는 mRNA 발현양으로 검출할 수 있고, 환자의 시료로부터 단백질 또는 mRNA를 분리하는 것은 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 환자의 뇌 조직을 단백질 추출용 버퍼또는 핵산 추출용 버퍼로 균질화한 다음 원심분리후 얻어진 상등액을 환자의 시료로서 사용할 수 있다.

상기 방사선 피폭을 진단하는 방법에 따르면, 환자의 시료 및 정상 대조군의 TA 단백질의 발현양을 비교함으로써, 방사선 피폭을 진단할 수 있다. 구체적으로는, 방사선 피폭이 의심되는 환자의 시료에서 TA 단백질의 발현수준을 측정하고, 정상 대조군의 TA 단백질의 발현수준을 측정하고 비교하여 환자의 시료에서 TA 단백질의 발현수준이 더 감소하는 정도에 따라 방사선 피폭 여부 및 그 정도를 측정할 수 있다.

본 발명에서는 방사선 피폭에 의해 그 발현수준이 감소하는 새로운 방사선 피폭 진단용 마커를 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 방사선 진단용 마커의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물 또는 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트를 이용하여 방사선 피폭 여부 및 정도를 진단할 수 있다.

도 1a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌, 폐, 비장, 소장에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌, 폐, 비장, 소장에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과. 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2c는 방사선을 조사한지 0, 6, 12, 24 시간 후에 마우스의 뇌에서의 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 다음, 대조군에 대한 상대적인 TA1 발현양을 계산하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3a는 인간 뇌암세포주에 방사선을 조사한지 0, 3, 6, 9, 12, 24 시간 후에 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 인간 뇌암세포주에 방사선을 조사한지 0, 3, 6, 9, 12, 24 시간 후에 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 mRNA의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 mRNA의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실험방법

1) 실험동물: 자성 6-7 주령 C57BL/6 마우스를 Charles River Japan Inc.에서 구입하여 청정 환경에서 유지하였다. 사육환경은 온도 22ㅁ 2, 습도 50ㅁ 10%, 12 시간 간격으로 조명을 조절하였다.

2) 세포배양: 한국세포주은행에서 분양받은 인간 뇌암세포주인 T98G와 U373은 100units/ml의 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO)과 10%의 FBS (Fetal bovine serum)가 함유된 DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2) 방사선 조사: 감마선 (137Cs)(Atomic Energy of Canada Ltd.)을 마우스에게는 1분간 총 1 Gy, 인간 암세포주에게는 1분간 총 10 Gy의 선량을 조사하였다. 방사선을 조사한지 24시간 후 실험동물의 뇌, 폐, 비장, 소장 조직을 적출하여 액체질소에 보관하였다.

3) 이차원 전기영동과 이미지 분석: 대조군과 조사된 실험군에서 적출한 조직에서 2-DE sampling 버퍼(40 mM Tris, 7 M 요소, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 100 mM 1,4-디티오에리트리톨, 1 μg/mL 아프로티닌(aprotinin), 1 μg/mL 류펩틴(leupeptin), 1 μg/mL 펩스타틴(pepstatin))를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질의 일차 Isoelectric focusing (IEF)를 위하여 IPG strip은 18 cm, pH 3-10을 사용하였으며 IEF후 전기영동을 실시하여 단백질을 분자량에 따라 분리하였다. 전기영동 후 5% 인산 및 40% 메탄올 수용액에서 30분간 고정한 후 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)를 이용하여 겔(gel)을 염색하였다. 겔 이미지를 GS710 스캐너를 이용하여 스캔닝해서 TIFF의 포맷으로 저장하였다. 저장된 이미지는 Progenesis Discovery software(version 2005; Nonlinear Technology)를 이용하여 이미지 분석을 수행하였다.

4) 단백질 동정: 이미지 분석을 통해 선정된 스팟(spot)의 질량분석에는 4800 MALDI-TOF/TOF^TM Analyzer를 이용하였다. 질량분석은 reflectron 방식으로 가속전압 20 kV의 조건으로 수행되었다. 질량분석데이타를 이용한 단백질 동정에는 MASCOT search engine을 사용하였다

5) 전기영동과 웨스턴블랏팅: 단백질 분석을 위하여 PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행한 후, 웨스턴블랏팅은 다음과 같이 수행하였다. 시료속의 단백질을 용해용액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40)을 이용하여 추출한 후, 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮긴 다음 면역블롯팅(immunoblotting)을 이용하여 분석하였다.

6) mRNA 추출법: RNA 추출을 위해 세포 또는 조직을 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline)로 세척한 후 적정량의 트리졸(Invitrogen)을 넣고 제조사의 지침에 따라 총 RNA를 분리하였고 mRNA 정제를 위해서는 Omniscript RT kit (QIAGEN)을 사용하였다.

실시예 1

A. 방사선에 의한 단백질 발현량 변화

C57B 마우스에 1 분 동안 총 1 Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선을 조사한지 24 시간 후 뇌, 폐, 비장, 소장 조직을 적출하여 단백질을 용해한 후 이차원 전기영동 및 이미지 분석에 의해 분석된 스팟의 수를 카운팅하고, 방사선 조사에 의해 발현량이 2배 이상 변화가 일어나는 스팟의 수를 카운팅하고, MOWSE 스코어가 60 이상인 스팟의 수(규명된 단백질 스팟의 수)를 카운팅하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 상기 규명된 스팟의 단백질의 세부사항, 즉 NCBI accession number, 분자량, 이론적 등전점(pI), 매칭된 펩타이드 수, MOWSE 스코어, coverage(%), 발현량 변화의 배수(조사/sham 처리)를 조직별로 정리하여 표 2에 나타내었다. MOWSE 스코어가 60 보다 클 경우 유의적인 단백질 매치를 나타낸다(p<0.05).

B. 전기영동과 면역반응을 이용한 방사선 피폭 마커 단백질 확인

상기 과정에서 프로테오믹스 방법으로 확인한 방사선 마커 단백질을 면역반응을 이용하여 재확인하기 위해 방사선에 피폭된 실험군(방사선 조사군)과 대조군(방사선 비조사군)의 마우스에서 뇌를 적출한 다음, SDS-PAGE와 웨스턴블랏팅을 실시하여 TA1의 발현량을 측정하였다. 실험군 및 대조군 각각에 대해 마우스 1 마리씩 실험하고, 총 3 번의 실험을 반복하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 1b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

도 1의 결과에 따르면, 방사선에 피폭될 경우 뇌에서의 TA1의 발현이 현저히 저해된다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 방사선 피폭 마커 단백질의 조직 특이성 확인

상기 실시예 1에서 확인한 방사선 마커 단백질인 TA1의 조직 특이성을 확인하기 위하여 방사선을 조사한지 24시간 후에 뇌, 폐, 비장, 소장 적출물에서 대해 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏팅을 실시하여 TA1을 정량하였다. 실험군 및 대조군 각각에 대해 마우스 1 마리씩 실험하고, 총 3 번의 실험을 반복하였다. 그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다. 또한, 방사선 조사 0, 6, 12, 24 시간 후에 뇌에서의 TA1 발현량을 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏팅을 실시하여 측정한 결과를 그래프로서 도 2c에 나타내었다.

도 2a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌, 폐, 비장, 소장에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 2b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌, 폐, 비장, 소장에서 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과. 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

도 2c는 1 Gy의 방사선을 조사한지 0, 6, 12, 24 시간 후에 마우스의 뇌에서의 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 다음, 대조군에 대한 상대적인 TA1 발현양을 계산하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 2a 및 도 2b의 결과에 따르면, 방사선에 피폭될 경우 TA1의 발현 저해는 폐, 비장, 소장에서는 나타나지 않고, 오직 뇌에서만 특이적으로 나타난다는 것을 알 수 있다. 도 2c의 결과에 따르면, 방사선에 피폭될 경우 방사선 조사 후 24시간까지 시간의 경과에 따라 TA1의 뇌에서의 발현 저해 정도가 증가하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 인간 세포에서의 방사선 피폭 마커 단백질 확인

상기 도 2에서 웨스턴블랏팅을 이용하여 확인한 조직특이적인 방사선 마커 단백질을 인간의 조직특이적인 세포수준에서 재확인하기 위하여 인간 뇌암세포주인 T98G, U373 세포주에 방사선을 조사한지 24 시간 후, SDS-PAGE를 수행한 후 웨스턴블랏팅으로 인간 TA(NP_006746.1, GI:5803187)의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3a는 인간 뇌암세포주에 방사선을 조사한지 0, 3, 6, 9, 12, 24 시간 후에 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 3b는 인간 뇌암세포주에 방사선을 조사한지 0, 3, 6, 9, 12, 24 시간 후에 TA1의 발현을 웨스턴블랏팅을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

도 3에 따르면 방사선에 의해 인간 뇌암세포주인 T98G, U373 모두에서 TA1의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 4: 방사선 피폭 마커 단백질에 대한 mRNA 발현량 측정

상기 실시예 1에서 확인한 방사선이 뇌의 TA1 단백질에 미치는 영향이 TA1의 mRNA에도 적용되는지 알아보기 위하여 방사선을 조사한지 24시간 후에 마우스의 뇌 적출물에 대해 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 실시하여 TA1 mRNA를 정량하였다. 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 mRNA의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 4b는 1 Gy의 방사선을 조사한지 24 시간 후에 마우스의 뇌에서 TA1의 mRNA의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과, 대조군에 대한 상대적인 발현양을 그래프로 나타낸 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Transaldolase, a marker for diagnosing radiation exposure, a composition for diagnosing radiation exposure to measure the level of expression of the marker, a kit for diagnosing radiation exposure comprising the composition, and a method for diagnosing radiation exposure using the marker <130> pn090278 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1319 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (51)..(1061) <400> 1 cgcgcccgtc ccgtcgccgc cgccgccgcc gcagacccct cggtcttgct atg tcg agc 59 Met Ser Ser 1 tca ccc gtg aag cgt cag agg atg gag tcc gcg ctg gac cag ctc aag 107 Ser Pro Val Lys Arg Gln Arg Met Glu Ser Ala Leu Asp Gln Leu Lys 5 10 15 cag ttc acc acc gtg gtg gcc gac acg ggc gac ttc cac gcc atc gac 155 Gln Phe Thr Thr Val Val Ala Asp Thr Gly Asp Phe His Ala Ile Asp 20 25 30 35 gag tac aag ccc cag gat gct acc acc aac ccg tcc ctg atc ctg gcc 203 Glu Tyr Lys Pro Gln Asp Ala Thr Thr Asn Pro Ser Leu Ile Leu Ala 40 45 50 gca 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Ala Gly Lys Glu Leu Glu Glu Gln His 145 150 155 160 Gly Ile His Cys Asn Met Thr Leu Leu Phe Ser Phe Ala Gln Ala Val 165 170 175 Ala Cys Ala Glu Ala Gly Val Thr Leu Ile Ser Pro Phe Val Gly Arg 180 185 190 Ile Leu Asp Trp His Val Ala Asn Thr Asp Lys Lys Ser Tyr Glu Pro 195 200 205 Gln Glu Asp Pro Gly Val Lys Ser Val Thr Lys Ile Tyr Asn Tyr Tyr 210 215 220 Lys Lys Phe Gly Tyr Lys Thr Ile Val Met Gly Ala Ser Phe Arg Asn 225 230 235 240 Thr Gly Glu Ile Lys Ala Leu Ala Gly Cys Asp Phe Leu Thr Ile Ser 245 250 255 Pro Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Lys Asp Ser Ser Lys Leu Ala Pro 260 265 270 Thr Leu Ser Val Lys Ala Ala Gln Thr Ser Asp Leu Glu Lys Ile His 275 280 285 Leu Asp Glu Lys Ala Phe Arg Trp Leu His Asn Glu Asp Gln Met Ala 290 295 300 Val Glu Lys Leu Ser Asp Gly Ile Arg Lys Phe Ala Ala Asp Ala Ile 305 310 315 320 Lys Leu Glu Arg Met Leu Thr Glu Arg Met Phe Ser Ala Glu Asn Gly 325 330 335 Lys

Claims

TA(transaldolase) 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 방사선 피폭 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제가 TA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제가 TA 단백질에 특이적인 결합 도메인을 갖는 부분 펩티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 제제가 TA 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 뇌로부터 얻어진 시료에서 상기 TA 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트.
제 7 항에 있어서, TA 단백질 또는 그 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA의 발현양을 측정할 수 있는 방사선 피폭 진단용 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 방사선 피폭 진단용 키트.
환자의 시료 중에서 TA(transaldolase) 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 TA 단백질의 발현수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 피폭을 진단하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 환자의 시료는 뇌로부터 얻어진 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 TA 단백질의 발현수준의 측정은 TA 단백질의 발현양 또는 TA 유전자의 mRNA 발현양을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 단백질 발현양의 측정은 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 질량분석기 중 하나 이상의 방법에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 mRNA 발현양의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 중 하나 이상의 방법에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.