JP2008503201A - 嗅覚gpcrを産生するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞中でGPCRタンパク質、詳細には嗅覚GPCRタンパク質を産生するための方法に関する。
目的の文献には下記の参考文献が含まれる:非特許文献5;非特許文献6;非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;非特許文献12;非特許文献13;非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16;非特許文献17;非特許文献18および非特許文献19;特許文献1および特許文献2;ならびに特許文献3、特許文献4および特許文献5。
本発明は、細胞中で嗅覚GPCRを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚GPCRをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン(Schwann)細胞もしくは希突起膠細胞(oligodendritic cell)中へ導入する工程と、および嗅覚GPCRを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚GPCRをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚GPCR活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚GPCRを産生するためのキットも提供される。本発明は、香味料および芳香剤に関する研究において最も多く利用できるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
本発明について詳細に説明する前に、本発明は当然ながら相当に大きく変動する可能性があるので、本明細書に記載した特定の実施形態には限定されないことを理解されたい。さらに、本明細書で使用する用語は特定の実施形態を記載するためにのみ限定することは企図されていないことも理解されたい。他に特別に規定しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。
本発明は、細胞中で嗅覚GPCRを産生するための方法を提供する。一般に、本方法は、嗅覚GPCRをコードする核酸へ作動可能に連結したプロモーターを含有する発現カセットを大グリア細胞、例えばシュヴァン細胞もしくは希突起膠細胞中へ導入する工程と、および嗅覚GPCRを産生するために適切な条件下で前記細胞を維持する工程と、を含んでいる。さらに、嗅覚GPCRをコードする組換え核酸を含有する大グリア細胞、嗅覚GPCR活性の調節因子についてスクリーニングする方法、および大グリア細胞中で嗅覚GPCRを産生するためのキットも提供される。本発明は、例えば香味料および芳香剤の分析および同定において利用されるので、その結果として多種多様な研究および産業上の用途を有する。
1つの局面では、本発明は、細胞中で嗅覚GPCRを産生する方法を提供する。これらの方法を記載する際に、本方法において使用するための組成物を最初に記載しよう。
用語「嗅覚Gタンパク質結合受容体」(もしくはその略語、例えば「嗅覚GPCR」)は、化学的感覚に含まれるGPCRスーパーファミリーの系統発生的に別個の当技術分野において認識されたサブファミリーの任意のメンバーを意味する。嗅覚GPCRは、それらの全体が本明細書に特別に援用されるZozulya et al, (Genome Biol. 2:0018, 2001);Glusman et al, (Genome Res. 11:685−702, 2001)およびCrasto et al, (Nucleic Acids Res. 30:354−60, 2002)を含む、極めて多種多様な出版物および公共データベース内で一般的および詳細に開示されている。特に、Senselab.med.yale.eduのウェブサイトで見いだされる嗅覚GPCR配列のデータバース内で記載された嗅覚GPCRが関心の対象である。本方法において使用するために適合する代表的な嗅覚GPCRの非限定的リストは、特許請求の範囲の前に挿入した表1に提供した。表1は、European Bioinformatics Instituteのウェブサイトで見いだされるような、Swiss−Protデータベースからのタンパク質配列登録のアクセッション番号のリストである。表1に列挙したこれらのデータベース登録、特にそれらの登録に記載されたアミノ酸配列は、それらの全体が参考として本明細書に特別に援用される。
核酸を操作するための遺伝子コードおよび組換え技術は知られており、そして嗅覚GPCRポリペプチドのアミノ酸配列は上述したので、嗅覚GPCRポリペプチドをコードする核酸の設計および産生は当業者の技術の範囲内に明白に含まれている。特定の実施形態では、標準組換えDNAテクノロジー(Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995;Sambrook, et al., Molecular Cloning:A Laboratoty Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.)法が使用される。例えば、嗅覚GPCRコーディング配列は、本明細書において詳細に記載する必要のない多種多様な組み換え方法の1つもしくは組み合わせを用いて1ライブラリーの嗅覚GPCRコーディング配列から単離することができる。タンパク質をコードする核酸配列中でのヌクレオチドの引き続いての置換、欠失、および/または付加は、さらにまた標準的な組換えDNA技術を用いて実施することもできる。
本明細書に記載した方法は、一般に培養大グリア細胞(すなわち、インビトロで培養された一次もしくは不死大グリア細胞)中で嗅覚GPCRを産生する工程を含んでいる。「大グリア細胞」は、シュヴァン細胞、希突起膠細胞および星状細胞ならびにそれらの誘導体を含む、様々なニューロン関連細胞タイプの任意の細胞を意味する。多数の実施形態では、適切な宿主細胞は、神経軸索の鞘を形成する物質であるミエリンを産生する「ミエリン産生」細胞であってよい。ミエリン産生大グリア細胞には、シュヴァン細胞、希突起膠細胞、ならびにミエリンを産生する所定タイプの星状細胞(例、嗅覚被覆細胞)が含まれる。ミエリン産生細胞は、通常は、それらがミエリンの構成要素であるガラクトセレブロシド、galCを合成することによって同定できる。
一般に本方法によると、嗅覚GPCR発現カセットがインビトロで大グリア細胞中に導入され、その細胞は嗅覚GPCRを発現させるために適合する条件に曝され、そしてGPCRは細胞内で発現して、細胞表面へ輸送される。
また別の局面では、本発明は生物活性嗅覚GPCRを産生する大グリア細胞を提供する。そのような細胞は、通常は嗅覚GPCRをコードする組換え核酸を含有しており、そして通常はその細胞(すなわち、組換え核酸の不在下の大グリア細胞)中で産生しない嗅覚GPCRを産生することができる。
本発明によって、さらにまた上述した本方法を実行するためのキットも提供される。本キットは、大グリア細胞、嗅覚GPCRをコードする核酸および嗅覚GPCRを含有する大グリア細胞のうちの少なくとも1つを含んでいる。本キットの核酸は、他のプラスミド内へのライゲーションを促進するために制限部位、複数のクローニング部位、プライマー部位なども有している。キットのその他のオプション構成要素には、本アッセイを実行するための、培養培地、GPCR活性を試験するための構成要素、およびGタンパク質をコードする核酸が含まれる。本キットの様々な構成要素は個別容器中に存在していてよい、または必要に応じて特定の適合する構成要素が単一容器中へ事前に結合されていてよい。
本発明は、嗅覚GPCR調節因子(すなわち、目的の嗅覚GPCRの活性を増加もしくは減少させる化合物)をスクリーニングする方法を提供する。特定の実施形態では、嗅覚GPCR調節因子は、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、およびアンタゴニストからなる群から選択される。一般に、本方法は、上述した方法によって生物活性嗅覚GPCRを産生する大グリア細胞(本明細書では「本大グリア細胞」と称する)を提供するために大グリア細胞中で嗅覚GPCRを産生する工程と、該細胞を候補因子と接触させる工程と、嗅覚GPCRの活性へ及ぼす候補因子の作用を評価する工程と、を含んでいる。
多種多様な試験化合物は、上記の方法によってスクリーニングすることができる。試験化合物は極めて多数の化学クラスを含んでいるが、典型的にはそれらは有機分子、好ましく小さい有機化合物である(すなわち、50ダルトンより大きく、かつ約2,500ダルトン未満(例、100〜1,000Da、通常は約500Da未満)の分子量を有する化合物)。試験化合物は、タンパク質との構造的相互作用、詳細には水素結合のために必要な官能基を含んでおり、そして典型的には少なくとも1つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは化学官能基のうちの少なくとも2つを含んでいる。試験化合物は、しばしば環状炭素もしくは複素環構造および/または上述した官能基の1つ以上と置換された芳香環もしくは多環芳香環構造を含んでいる。代表的および非限定的試験化合物は、脂肪酸、アルコール、ケトン、およびエステル;芳香環、脂環、多環および複素環構造を備える化学物質;およびこれらのタイプ各々の無数の置換化学物質、ならびにそれらの組み合わせを含んでいる。試験化合物は、さらにまたペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログもしくはそれらの組み合わせを含む生体分子間でも見いだされる。さらにまた別の試験化合物は、GPCRの天然リガンドの変異体を含んでいる。
嗅覚GPCRのリガンドは、候補因子と嗅覚GPCRとを接触させる工程と、候補因子が嗅覚GPCRへ結合するかどうかを決定する工程とによって同定できるが、このとき前記結合は候補因子が嗅覚GPCRのリガンドであるという指標となる。特定の実施形態では、候補因子は標識することができる。特定の実施形態では、候補因子は放射標識することができる。
A. トリチウムガスを用いた触媒還元 − この方法は、通常は高比活性生成物を産生し、ハロゲン化もしくは未飽和前駆物質を必要とする。
B. 水素化ホウ素ナトリウム[3H]を用いた還元 − この方法は余り費用がかからず、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
C. 水素化アルミニウムリチウム[3H]を用いた還元 − この方法は、ほぼ理論的比活性で生成物を提供する。これもまた、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどの還元性官能基を含有する前駆物質を必要とする。
D. トリチウムガス曝露による標識化 − この方法は、適切な触媒の存在下で置換可能な陽子を含有する前駆物質をトリチウムガスへ曝露させる工程を含んでいる。
E. ヨウ化メチル[3H]を用いたN−メチル化 − この方法は、高比活性ヨウ化メチル(3H)を用いて適切な前駆物質を処理する工程によって、通常はO−メチルもしくはN−メチル(3H)生成物を調製するために使用される。この方法は、一般に例えば約70〜90Ci/mmolなどのより高い比活性を可能にする。
A. サンドマイヤー(Sandmeyer)および類似反応 − この方法はアリールもしくはヘテロアリールアミンをテトラフルオロホウ酸塩などのジアゾニウム塩へ、そして引き続き125Iナトリウムを用いて125I標識化合物へ転換させる。上述の方法は、Zhu,D.−G. and co−workers、J. Org Chem.2002,67,943−948によって報告された。
B. フェノールのオルト125ヨウ素化 − この方法はCollier, T. L. and co−workers、J. Labeled Compd Radiopharm.1999,42,S264−S266.によって報告されたように、フェノールのオルト位置での125Iの組込みを可能にする。
C. 125Iを用いたアリールおよびヘテロアリールブロミドの置換 − この方法は、一般に2段階プロセスである。第1工程は、Pd触媒反応[すなわち、Pd(Ph3P)4]を用いて、または例えばトリ−アルキルスズハライドもしくはヘキサアルキルジスズ[例、(CH3)3SnSn(CH3)3]の存在下でアリールもしくはヘテロアリールリチウムを通しての、アリールもしくはヘテロアリールブロミドから対応するトリーアルキルスズ中間物への変換である。代表的な方法は、Bas, M.−D. and co−workers、J. Labeled Compd Radiopharm.2001,44,S280−S282によって報告されている。
本発明はさらにまた、臭気物質ミメティックを同定する方法を提供するが、このときミメティックは特定臭気物質と類似の、実質的に同様もしくは同一の機能的特徴を有するが、該臭気物質とは相違する化学構造を有する合成もしくは天然化合物である。言い換えると、本発明は目的の臭気物質と同一の「ニオイがする」が、目的の臭気物質と同一の化学構造を有していない臭気物質ミメティックを同定する方法を提供する。一般に、これらの方法は、上述した方法を用いて1ライブラリーの嗅覚GPCRを産生する工程と、目的の臭気物質によって活性化される1組の嗅覚GPCRを同定する工程と、および同一セットの嗅覚GPCRを活性化する物質を同定するために該ライブラリーの嗅覚GPCRを候補因子と接触させる工程と、を含んでいる。大多数の実施形態では、目的の臭気物質と同一セットの嗅覚GPCRを活性化する物質は目的の臭気物質のミメティックである、すなわち目的の臭気物質と類似の臭気を有しているはずである。
本発明は、バイオセンサーをさらに提供するが、このときバイオセンサーは、典型的には複数の相違する嗅覚GPCRを産生する複数の大グリア細胞である。多数の実施形態では、細胞はアドレス指定可能なフォーマットで配列されるが、このときそのアレイの各アドレスは単一組換え嗅覚GPCRを産生する大グリア細胞を含有している。典型的には、前記複数は2以上、5以上、約10以上、約20以上、約50以上、約100以上、約200以上、約300以上、約500以上、約1,000以上、または約10,000以上まででさえあってよい。このためバイオセンサーは、約5、約10、約20、約30以上、約50以上、約100以上、約200以上、通常は約500以上まで、通常は約1,000以上までの組換え嗅覚GPCRを含有していてよい。嗅覚GPCRは、同一性が公知の、もしくは同一性が知られていない嗅覚GPCR、またはそれらの混合物であってよい。嗅覚GPCRは、単一種の動物由来であってよい、または2種、約5種まで、約10種まで、約50種まで、約100種まで、もしくは約1,000種までの動物由来であってよい。特定の実施形態では、嗅覚GPCRはヒトである。
嗅覚GPCRを産生する本方法は、特に食品および芳香剤に関連する様々な研究および産業上の用途において利用される。
一次ラットシュヴァン細胞の単離:
シュヴァン細胞の調製は以前に記載されたとおりに実施した(例、Hung, Int. J. Oncol. 20:475−82, 2002;Hung, Int. J. Oncol. 1999 14:409−15;Wood, Brain Res. 115:361−75, 1976;Wood, Ann. N.Y. Acad. Sci. 605:1−14, 1990;およびBrockes, J. Exp. Biol. Dec;95:215−30, 1981など)。手短には、P1ラット新生児由来の坐骨神経を採取し、10%熱不活化ウシ胎児血清を補給したダルベッコの改変培地中で細胞を維持した。2μMフォルスコリンおよびウシ下垂体抽出物(Sigma社製)を用いてシュヴァン細胞を拡張させた。第3継代まで細胞を増殖させ、保管するために冷凍した。
第5継代のシュヴァン細胞を1ウェル当たり8×104細胞でポリ−D−リシンを被覆した8ウェルチャンバースライド(Falcon社製)上に蒔いた。Fugene 6試薬(Roche社製)およびOptimem血清無含有培地(Invitrogen社製)を用いて、0.5μgの嗅覚GPCR発現プラスミドによりシュヴァン細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は、4時間にわたり37℃の5% CO2加湿インキュベーター内で維持した。PBSを用いて細胞を洗浄し、新鮮増殖培地と取り換えた。24時間後、細胞を発現についてアッセイした。
PBSCM(PBS+0.5mM Ca2++1mM MgCl2)を用いてトランスフェクトした細胞を洗浄し、4%ホルマリンを用いて固定した。50mM NH4Cl/PBSCMを用いて細胞をクエンチし、2回洗浄した。一次抗体抗マウスHA(Roche社製)をブロッキングバッファー(PBSCM w/o トリトン中の2% BSA)中で1:1,000に希釈し、細胞上に1時間放置した。PBSCMを用いて3回洗浄した後、二次抗体(Alexa 488結合体化ロバ抗マウスIgG)1:2,000およびDAPI 1:2,000は暗所で30分間にわたり細胞上に放置した。細胞はPBSCMを用いて3回洗浄し、flourosave(Calbiochem社製)を被覆してカバースリップを被せた。細胞は適切なUVフィルターによって分析した。
受容体の発現:
大グリア細胞の一過性トランスフェクションは一次ラットシュヴァン細胞について実施例1に記載したとおりに実施できる。大グリア細胞系の安定性トランスフェクションは、本明細書に記載したとおりに実施できる。
[35S]GTPγSアッセイ:Gタンパク質結合受容体がリガンド結合または構成性活性化の任意の結果として活性状態にある場合は、受容体はGタンパク質に結合し、GDPの放出およびそれに続くGTPのGタンパク質への結合を刺激する。Gタンパク質受容体複合体のαサブユニットはGTPaseとして機能し、GTPからGDPへ緩徐に加水分解し、その時点で受容体は通常不活性化される。活性化された受容体は、GTPに対してGDPを置換し続ける。非加水分解性GTPアナログである[35S]GTPγSを利用すると、活性化受容体を発現する膜への[35S]GTPγSの強化された結合を証明することができる。活性化を測定するための[35S]GTPγS結合を使用することの長所は:(a)これが一般にすべてのGタンパク質結合受容体へ適用できること;
(b)膜表面の近位に存在するので細胞内カスケードに影響を及ぼす分子を取り上げる可能性を低くさせることである。
Cre−Lucレポーターアッセイ(Gs関連受容体):大グリア細胞は1ウェル当たり2×104細胞の密度で96ウェルプレート上に蒔き、製造業者の指示書にしたがって翌日、リポフェクトアミン試薬(BRL社製)を用いてトランスフェクトした。DNA/脂質混合物は各6ウェルトランスフェクションのために下記のとおりに調製した:100μLのDMEM中の260ngのプラスミドDNAを100μLのDMEM中の2μLの脂質と穏やかに混合した(260ngのプラスミドDNAは200ngの8×CRE−Lucレポータープラスミド、内因性受容体もしくは非内因性受容体を含む50ngのpCMVまたはpCMV単独、および10ngのGPRS発現プラスミド(pcDNA3(Invitrogen社製)中のGPRS)から構成された。8×CRE−Luc受容体プラスミドは下記のとおりに調製した:ベクターSRIF−β−galは、pβgal−Basic Vector(Clontech社製)中のBglV−HindIII部位でラットソマトスタチンプロモーター(−71/+51)をクローニングする工程によって入手した。8コピーのcAMP応答エレメントをPCRによってアデノウイルステンプレートAdpCF126CCRE8(7 Human Gene Therapy 1883(1996)を参照されたい)から入手し、Kpn−BgIV部位でSRIF−β−galベクター内へクローニングすると、8×CRE−β−galレポーターベクターが生じた。この8×CRE−Lucレポータープラスミドは、8×CRE−β−galレポーターベクター内のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をHindIII−BamHI部位でpGL3−ベーシックベクター(Promega社製)から入手したルシフェラーゼ遺伝子と置換する工程によって入手した。室温での30分間のインキュベーション後、400μLのDMEMを用いてDNA/脂質混合物を希釈し、希釈混合物100μLを各ウェルへ添加した。細胞培養インキュベーター内での4時間のインキュベーション後、各ウェルへ10%FCSを含む100μLのDMEMを添加した。翌日、トランスフェクトした細胞は10%FCSを含む200μL/ウェルのDMEMに変更した。8時間後、ウェルは、PBSを用いた1回の洗浄後、フェノールレッドを含まない100μL/ウェルのDMEMへ変更した。ルシフェラーゼ活性は、製造業者の指示書にしたがってLucLite(商標)レポーター遺伝子アッセイキット(Packard社製)を用いて翌日測定し、1450 MicroBeta(商標)シンチレーションおよびルミネセンスカウンター(Wallac社製)上で読み取った。
Gq刺激を検出する方法は、Gq依存性ホスホリファーゼCがそれらのプロモーター中でAP1エレメントを含有する遺伝子の活性化を誘発する公知の能力に左右される。PathdetectTMAP−1 cis−Reporting System(Stratagene社製、製品番号219073)は、リン酸カルシウム沈降物の構成成分が410ngのpAP1−Luc、80ngのpCMV−受容体発現プラスミド、および20ngのCMV−SEAPであった以外は、CREBレポーターアッセイに関して上述したプロトコールセットにしたがって使用できる。
Gq刺激を検出する1つの方法は、Gq依存性ホスホリファーゼCがそれらのプロモーター中で血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を誘発する公知の能力に左右される。Pathdetect(商標)SRF−Luc−Reporting System(Stratagene社製)を使用すると、例えばCOS7細胞中でGq結合活性についてアッセイすることができる。細胞は、Mammalian TransfectionTM Kit(Stratagene社製、製品番号200285)を製造業者の指示書にしたがって用いて、本システムのプラスミド構成成分および内因性もしくは非内因性GPCRをコードする指定発現プラスミドを用いてトランスフェクトされる。手短には、410ngのSRF−Luc、80ngのpCMV−受容体発現プラスミドおよび20ngのCMV−SEAP(分泌アルカリホスファターゼ発現プラスミド;サンプル間のトランスフェクト効率における変動について対照するためにアルカリホスファターゼ活性はトランスフェクトした細胞中で測定する)を製造業者の指示書にしたがってリン酸カルシウム沈降物中で結合させる。沈降物の半分を96ウェルプレート上の3つのウェルの上方に同等に分布させ、血清無含有培地中で細胞を24時間維持する。最後の5時間に、細胞を選択した化合物と一緒にインキュベートする。細胞を溶解させ、LucliteTMキット(Packard社製、製品番号6016911)ならびに「Trilux 1450 Microbeta」液体シンチレーションおよびルミネセンスカウンター(Wallac社製)を製造業者の指示書にしたがって用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイする。データは、GraphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.社製)を用いて分析できる。
第1日に、受容体(内因性および/または非内因性)を含む細胞は24ウェルプレート上で、通常は1ウェルに付き1×105細胞でプレートに蒔かれ得る(しかしこの数は最適化できる)。第2日に、細胞は1ウェルに付き50μLの血清無含有DMEM中の0.25μgのDNAおよび1ウェルに付き50μLの血清無含有DMEM中の2μLリポフェクトアミンを最初に混合する工程によってトランスフェクトすることができる。溶液を穏やかに混合し、室温で15〜30分間にわたりインキュベートする。細胞は0.5mLのPBSを用いて洗浄し、400μLの血清無含有培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に添加する。細胞を次に37℃/5% CO2で3〜4時間インキュベートし、トランスフェクション培地を除去し、1mL/ウェルの標準増殖培地と取り替える。
標的受容体(実験的)および各クローン系から安定性にトランスフェクトしたpCMV(ネガティブコントロール)細胞を、翌日アッセイするために、完全培養培地(10%FBS、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM)を含む5.5×104細胞でポリ−D−リシン前処理96ウェルプレート(Becton−Dickinson社製、製品番号356640)内へ播種した。Fluo4−AM(Molecular Probe社製、製品番号F14202)インキュベーションバッファーストック液を調製するために、1mg Fluo4−AMを467μLのDMSOおよび467μLのPluoronic acid(Molecular Probe社製、製品番号P3000)中へ溶解させて、−20℃で1カ月間にわたり保管できる1mMストック液を入手する。Fluo4−AMは、蛍光カルシウム指示染料である。
Claims (28)
- 嗅覚GPCRを産生する方法であって、
該嗅覚GPCRをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む発現カセットを、インビトロで大グリア細胞中へ導入する工程、および
該嗅覚GPCRの産生に適した条件下で、該細胞を維持し、該嗅覚GPCRを産生する工程、
を包含する、方法。 - 前記大グリア細胞がミエリン産生細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記大グリア細胞がシュヴァン細胞、希突起膠細胞または嗅神経鞘細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記大グリア細胞が一次シュヴァン細胞である、請求項3に記載の方法。
- 前記細胞が不死化大グリア細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記嗅覚GPCRが細胞表面で検出可能である、請求項1に記載の方法。
- 嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法に従って大グリア細胞中において嗅覚GPCRを産生する工程であって、ここで、該嗅覚GPCRがGタンパク質へ結合される、工程;
該細胞を候補因子と接触させる工程;および
該嗅覚GPCRの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚GPCRの活性を調節する候補因子が嗅覚調節因子である、方法。 - 嗅覚GPCRの調節因子をスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法に従って大グリア細胞中において嗅覚GPCRを産生する工程であって、ここで、該嗅覚GPCRがGタンパク質へ結合される、工程;
前記細胞を候補因子と接触させる工程;および
該嗅覚GPCRの活性に対する該候補因子の作用を評価する工程
を包含し、ここで、該嗅覚GPCRの活性を調節する候補因子が該嗅覚GPCRの調節因子である、方法。 - 前記物質が小有機分子である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記物質が臭気物質である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記接触させる工程が前記嗅覚GPCRの公知のアゴニストの存在下で実施される、請求項7または8に記載の方法。
- 前記調節因子が、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストからなる群から選択される、請求項7または8に記載の方法。
- 前記評価する工程がGTPγS結合のレベルの測定を通して行われる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記評価する工程が、環状AMP(cAMP)、環状GMP(cGMP)、イノシトール1,4,5−三リン酸(IP3)、ジアシルグリセロール(DAG)、およびCa2+の群から選択される第2メッセンジャーのレベルの測定を通して行われる、請求項7または8に記載の方法。
- 前記第2メッセンジャーがcAMPである、請求項14に記載の方法。
- 嗅覚GPCRのリガンドをスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚GPCRを産生する工程;
該嗅覚GPCRを候補因子と接触させる工程;および
該候補因子の該嗅覚GPCRへの結合を評価する工程、
を包含する、方法。 - 前記候補因子が標識される、請求項16に記載の方法。
- 嗅覚GPCRのリガンドをスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法に従って大グリア細胞中において該嗅覚GPCRを産生する工程;
該嗅覚GPCRを、標識された該嗅覚GPCRの公知のリガンドの存在下で候補因子と接触させる工程;および
該標識された該嗅覚GPCRの公知のリガンドの結合を評価する工程
を包含し、ここで、該候補因子の存在下での該標識された公知のリガンドの結合の減少が、該嗅覚GPCRのリガンドである該候補因子の指標である、方法。 - 嗅覚調節因子をスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚GPCRを産生する工程であって、ここで、該嗅覚GPCRの各々がGタンパク質へ結合される、工程;
第1の因子によって活性化される異なる嗅覚GPCRのセットを同定する工程であって、ここで、該第1の因子が公知の嗅覚調節因子である、工程;
該GPCRのセットを第2の因子と接触させる工程;および
該第2の因子の該嗅覚GPCRの活性に対する作用を評価する工程
を包含し、ここで、該第1の因子によって調節された該異なるGPCRセットの1つ以上のGPCRを調節する第2の因子が、嗅覚調節因子である、方法。 - 前記セットが3つ以上のGPCRを含む、請求項19に記載の方法。
- 嗅覚GPCRをコードする組換え核酸を含む大グリア細胞。
- 大グリア細胞;および
嗅覚GPCRをコードする核酸
を備える、キット。 - 前記大グリア細胞を用いて前記嗅覚GPCRを産生するための指示書をさらに備える、請求項22に記載のキット。
- サンプル中において目的の臭気物質を同定する方法であって、
サンプルを、請求項1に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚GPCRを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚GPCRの各々がGタンパク質へ結合される、工程;および
該臭気物質の存在に対する該嗅覚GPCRの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、予め決定された嗅覚GPCRの活性化が、該サンプルにおける該臭気物質の存在を示す、方法。 - 臭気物質の「フィンガープリント」を決定する方法であって、
サンプルを、請求項1に記載の方法に従って複数の異なる嗅覚GPCRを産生する複数の大グリア細胞と接触させる工程であって、ここで、該嗅覚GPCRの各々がGタンパク質へ結合される、工程;および
該臭気物質による活性化に対する該嗅覚GPCRの活性化を評価する工程
を包含し、ここで、該「フィンガープリント」が該臭気物質によって活性化された異なる嗅覚GPCRのセットを含む、方法。 - 前記接触させる工程が、前記複数の嗅覚GPCRのうちの1つ以上の公知のアゴニストの存在下で実施される、請求項25に記載の方法。
- 前記複数の細胞が、細胞のアドレス指定可能なアレイであり、ここで、該アレイの各アドレスが単一の組換え嗅覚GPCRを産生する大グリア細胞を含有する、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GPCR活性化が、GPCR活性化の発光レポーターを用いて評価される、請求項27に記載の方法。
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