KR102047292B1

KR102047292B1 - 초파리의 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법

Info

Publication number: KR102047292B1
Application number: KR1020170184475A
Authority: KR
Inventors: 이진환; 유은진
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-11-21
Also published as: KR20190081732A

Abstract

계면활성제 및 철 비드를 이용하여 감각기와 같은 초파리의 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

초파리의 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법{Method for Isolating Seven-Transmembrane Proteins from Olfactory Sensilla of Drosophila melanogaster}

본 발명은 초파리의 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다.

초파리(Drosophila melanogaster)에서 후각 수용체(odorant receptors, ORs)는 후각 감각 뉴런(olfactory sensory neurons, OSN)의 가지돌기 막(dendritic membranes)에 존재한다. OSN은 초파리 더듬이(안테나, antennae)의 세번째 분절(segment) 및 작은턱 수염(maxillary palps)에 위치한다. 이러한 후각 기관들은 후각 감각기(olfactory sensilla)로 덮여 있으며, 대부분의 후각 감각기는 감각 림프에 잠겨 있는 OSN 수상돌기를 포함한다. 후각 감각기는 일반적으로 두 개의 OSN을 갖고 있으며, 각각의 OSN은 냄새 특이적 후각 수용체 및 후각 공동 수용체인 Orco(odorant receptors co-rceptor)를 발현한다. 서로 다른 OSN의 활성은 단일 섬모 기록법(single sensillum recordings, SSR)을 이용한 OSN 고유의 특징적인 진폭(amplitude)과 각각의 냄새에 대한 민감도로 구분할 수 있다.

뉴런(OSN) 수준에서는 단일 섬모 기록법(SSR)을 이용하여 말초 후각 시스템(peripheral olfactory system)에 대한 광범위한 연구가 이루어졌으나, 곤충의 후각 수용체에 대한 단백질 수준의 연구는 몇몇 요인들에 의하여 기초적인 단계에 머무르고 있다. 특히, OR과 세포 내 단백질들 사이에 어떠한 상호작용이 있는지에 대해서는 밝혀진 바가 거의 없다.

그 이유는 첫째, 곤충의 후각 수용체는 7개의 막관통 도메인을 가지는 수용체이나, 후각 수용체 중에서 이례적인 단백질에 속하기 때문이다. 곤충의 후각 수용체는 초기에 GPCR(G protein-coupled receptors)의 일종일 것으로 예상했으나, 다른 감각 수용체 패밀리와 서열 상동성(sequence homology)이 떨어지고, 공동 수용체에 의존적인 특징을 나타낸다. 또한, 다른 GPCR과는 달리 곤충의 후각 수용체는 이온성 수용체(ionotropic receptor)와 유사한 특성을 나타내고, 특이적인 3차원 구조를 보인다. 즉, 이미 연구되어 있는 7-막관통 수용체들을 참고하여 진행할 수 있는 실험에 한계가 있기에 OR의 단백질 상호작용에 대한 연구가 기초적인 단계에 머무르고 있다.

둘째, 곤충의 OR은 이형 발현 시스템(heterologous expression system)에서 원형질막으로 정상적으로 이동하지 않는데, 이는 이형 발현 시스템이 곤충 OSN의 고유한 생체 환경을 불충분하게 모방하기 때문이다. 이렇듯 OR-상호작용 단백질을 새롭게 발굴하는 데 있어 이종 발현 시스템의 이용이 제한적이기 때문에 OR의 단백질 상호작용에 대한 연구는 실제 초파리 조직을 사용해야 하는 제약이 있다.

셋째, OR의 단백질 수준 연구를 위해서는 실제 초파리 조직을 사용해야 하나, OR은 일부의 세포에서 적은 양으로 발현되며, 그에 더하여 가늘고 거친 섬모 안에 물리적으로 숨겨져 있기 때문이다. 이렇게 OR을 포함하는 조직을 대량으로 수집하고, 조작하는 것에 어려움이 있기에 해당 조직을 사용하는 OR에 대한 연구도 제한적인 수준에 머물러 왔다.

후각 공동 수용체(Orco)는 곤충 후각 수용체 패밀리의 하나이며, 다른 OR과 달리 자연적인 냄새에 반응하지 않으나, 다른 OR의 유비쿼터스 공동-수용체(ubiquitous co-receptor)로 기능하여 OR의 정상적인 작용에 중요한 역할을 한다. Orco가 없으면 OR은 세포 내로 이동할 수 없고, 냄새에 대한 OSN의 반응이 억제된다. Orco는 거의 모든 OSN에서 발현되므로 Orco의 상호작용체(interactome)에 대한 연구는 곤충의 후각 세포에서 7-막관통 단백질을 분리해 내는 방법론적 진보와 동시에 곤충의 후각에 대한 전반적인 작용 기작을 제시할 수 있다.

본 발명자들은 알려지지 않은 ORco 상호작용 단백질을 동정하기 위한 플랫폼에 대하여 연구한 결과, 초파리 후각 조직으로부터 효율적으로 7-막관통 단백질을 분리하는 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 초파리 후각 조직을 분리하는 단계; 분리한 상기 후각 조직을 분쇄하는 단계; 및 분쇄한 후각 조직에 버퍼를 첨가하여 가열하는 단계를 포함하는 초파리 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은 초파리 후각 조직을 분리하는 단계; 분리한 상기 후각 조직을 분쇄하는 단계; 및 분쇄한 후각 조직에 버퍼를 첨가하여 가열하는 단계를 포함하는 초파리 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서 초파리의 후각 조직은 후각 감각기(olfactory sensilla), 후각 수용체(odorant receptors, OR) 및 후각 공동 수용체인 Orco(odorant receptors co-rceptor, Orco)를 포함한다.

상기 후각 조직을 분리하는 단계는 발명자가 고안한 미세조직 분리 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 미세조직 분리 장치는 분리하고자 하는 곤충 조직을 수용하는 조직 보관부; 상기 조직 보관부의 일측과 연결되고, 미세조직을 분리하는 필터가 구비된 조직 분리부; 및 상기 조직 분리부의 일측과 연결되고, 분리된 곤충 미세조직을 수용하는 미세조직 수용부를 포함할 수 있다. 조직 보관부의 필터는 50 내지 300 ㎛ 크기의 개구를 가질 수 있으며, 상기 개구의 크기는 분리하고자 하는 조직의 크기에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 후각 조직을 분쇄하는 단계는 철 비드를 이용할 수 있으며, 분리한 후각 조직과 철 비드를 혼합한 후 볼텍싱하여 후각 조직을 균일하게 분쇄할 수 있다.

또한, 상기 버퍼는 단백질의 가용화를 위하여 계면활성제를 포함할 수 있으며, 계면활성제는 Triton X-100, Nonidet P-40, Octyl-b-D-glucopyranoside, n-Dodecyl b-Dmaltoside(DDM) 및 Zwittergent 3-16으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서 상기 가열하는 단계는 40℃ 내지 60℃에서 이루어질 수 있으며, 가열 시간은 10분 내지 60분 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 방법을 이용하면 감각모와 같은 초파리 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 손쉽게 분리할 수 있다.

도 1은 초파리 후각 조직의 세부 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하여 초파리에서 후각 조직을 포함하는 미세조직 및 7-막관통 단백질을 포함하는 총 단백질(total protein)을 분리하는 과정을 보여준다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하여 초파리 후각 조직을 포함하는 미세조직을 수집하고, 수집한 미세조직에서 7-막관통 단백질을 분리한 결과를 보여준다.
도 4는 계면활성제의 종류에 따른 초파리 후각 조직 7-막관통 단백질의 가용화 정도 및 질랑분석용 계면활성제(n-Dodecyl b-Dmaltoside)를 사용한 샘플에서 분리 온도의 변화에 따른 초파리 후각 조직의 7-막관통 단백질 분리 결과를 보여준다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 초파리

실험에 이용한 초파리는 Bloomington Drosophila Stock Center(NIH P40OD018537)에서 수득하였고, w; Orco-GAL4, UAS-EGFP::Orco; Orco ¹ 은 이시온(Sion Lee)으로부터 제공받았다.

EGFP가 표지된 모든 Orco 실험은 w; Orco-GAL4, UAS-EGFP::Orco; Orco ¹ 으로 수행하였다(Orco-GAL4 (Wang et al., 2003); UAS-EGFP::Orco (Benton et al., 2006); Orco ¹ (Larsson et al., 2004)). 유전적 배경 대조 실험(Genetic background control experiments)은 w; Orco-GAL4, UAS-myr::GFP(myr::GFP (Pfeiffer et al., 2010)); Orco ¹ 으로 수행하였다.

2. 조직 분리 및 단백질 분리

초파리 머리 용해물(head lysate)의 경우, 온전한 형태의 더듬이가 부착된 100개의 초파리 머리(암컷 50개, 수컷 50개)를 튜브에 담아 드라이 아이스 위에서 해부하였다.

초파리 미세조직 용해물(tissue lysate)의 제조에는 발명자가 고안한 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하였다. 상기 초파리 미세조직 분리 장치는 두 개의 50 ㎖ 튜브가 두 개의 중공형 뚜껑(hollow lids)으로 연결되어 있으며, 고정된 금속 그물망(metal mesh; 기공 크기 180 ㎛²)를 갖는 체(sieve)가 중공형 뚜껑 사이에 위치해 있다.

초파리 미세조직 분리 장치의 사용은 다음과 같았다. 한쪽 튜브에 초파리 성체를 모아 20 ㎖까지 담고, 상기 초파리 미세조직 분리 장치를 완전체 상태로 조립 후 -80℃에서 최소 30분 동안 보관하여 동결시켰다. 이후 초파리의 조직을 크기에 따라 분리하기 위하여 초파리 분리 장치를 활발히 볼텍싱(vortexing)하고, 이 과정에서 체로 거른 미세조직을 새로운 튜브로 옮겼다. 곧이어 미세조직이 들어있는 튜브에 세 개의 철 비드(steel bead; 3 ㎜ 직경)를 추가하고, 2분 동안 볼텍싱하여 초파리 미세조직을 균일하게 분쇄하였다.

분쇄된 초파리 미세조직에 곧바로 용해 버퍼 300 ㎕를 첨가하고, 1분 동안 볼텍싱하여 균질하게 혼합하였다. 이후 혼합물을 4℃(Zwittergent 3-16 또는 SDS를 이용한 경우에는 10℃) 및 10,000xg에서 5분 동안 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 중간 단계의 상등액을 새로운 튜브로 옮긴 후, 추가로 원심분리하여 단백질이 포함된 초파리 미세조직의 용해물(이하, 조직 용해물로 기재함)을 수득하였다.

용해 버퍼는 계면활성제 1%(v/v 또는 w/v)를 포함하는 희석 버퍼(GFP-Trap®_A protocol; ChromoTek, Germany)에 cOmplete™ EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(Roche, 04693159001)을 첨가한 용액이다. 계면활성제로는 Tween 20 (Biosesang, T1027), Triton X-100 (Bio Basic, TB0198), Nonidet P-40 (Bio Basic, NDB0385), Octyl-b-D-glucopyranoside (Fluka, 75083), n-Dodecyl b-Dmaltoside (DDM; ThermoFisher, 89903), CHAPS (Sigma-Aldrich, C5070), CHAPSO (Calbiochem, 220201) 및 Zwittergent 3-16 (Calbiochem, 693023)을 이용하였다.

단백질 정량은 Pierce™ BCA Protein Assay Kit(ThermoFisher, 23227)를 사용하였으며, 최종 조직 용해물은 -80℃에 보관하였다.

도 2에 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하여 초파리에서 후각 조직을 포함하는 미세조직 및 7-막관통 단백질을 포함하는 총 단백질(total protein)을 분리하는 과정을 개략적으로 도시하였다.

3. 면역블롯팅 ( immunoblotting )

분쇄한 초파리 미세조직에서 면역블로팅(immunoblotting)을 통해 7-막관통 단백질을 가시화하기 위해서, 분쇄된 미세조직에 즉시 SDS 버퍼(GFP-Trap®_A protocol; ChromoTek, Germany)를 첨가하여 혼합하거나, 상기 2.에서 용해 버퍼를 이용하여 획득한 조직 용해물에 해당 SDS 버퍼를 2X 비율로 섞어서 샘플을 준비하였다. SDS 버퍼와 혼합한 용해물은 Eppendorf ThermoMixer™ C(Hamburg, Germany)을 이용하여 500 rpm으로 진동시키면서, 50℃에서 30분 동안 가열하였다.

도 4에 사용된 샘플의 경우, 6개의 튜브에 조직 용해물을 동일한 부피로 분주하고, 각 튜브를 50, 55, 60, 65, 및 70℃에서 30분 동안 가열하거나 또는 95℃에서 10분 동안 가열하였다.

모든 웰에는 30 ㎍의 총 단백질(total protein)을 로딩(loading)하였으며, 10% SDS-PAGE로 전기영동한 총 단백질을 PVDF 막(Merck, IPVH00010)에 이동시킨 후 PVDF 막을 1차 항체와 4℃에서 밤새 접촉시켰다. GFP는 5% 스킴 밀크/TBST에 1/5,000으로 희석한 anti-GFP (ThermoFisher, A-11122) 항체로 확인하고, TBST에 1/2,000으로 희석한 GAPDH 항체(antiglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; abcam, ab125247)는 로딩 대조군(loading control)으로 이용하였다. 다음날 실온에서 2차 항체와 2시간 동안 접촉시켰으며, 2차 항체는 1/10,000으로 희석한 anti-rabbit HRP-결합 항체(Merck, AP132P) 또는 1/5,000으로 희석한 anti-mouse 항체(ThermoFisher, 31430)를 이용하였다. 모든 실험 과정에서, 로딩 대조군은 먼저 접촉시킨 항체를 제거(stripping; Atto, WSE-7240)한 후 해당 항체와 접촉시켰다.

4. 면역침전( Immunoprecipitation , IP) 및 온- 비드 다이제스천 (on-bead digestion)

모든 면역침전-질량 분석 샘플은 MS(mass spectrometry) 등급의 물로 당일 제조된 1%(w/v) DDM 용해 버퍼에 준비하였다. 튜브에 GFP-Trap®_A bead slurry 50 ㎕를 담은 후 용해 버퍼 500 ㎕로 3회 적정(equilibrated)시키고, 단백질 5 ㎎을 첨가하였다. 단백질과 비드의 결합 반응은 실온에서 회전 플랫폼으로 2시간 동안 수행하였다. 2시간 후 비드를 수거하여 용해 버퍼 1㎖로 5회 세척하고, Tris-HCl(pH 8.5) 1㎖로 1회 세척하였다. 온-비드 다이제스천은 당 업계에 알려진 방법을 이용하였다(Mol Cell Proteomics. 2011 May; 10(5): M110 006460).

5. 질량 분석(Mass spectrometric analysis, MS analysis)

비드 위 가수분해(온-비드 다이제스천, on-bead digestion)　이후,　C18　디스크(3M, 2215)가 채워진　STAGE-Tips을 이용하여 분해된 펩티드로부터 염을 제거하고,　진공 농축기로 건조시켰다.　이후 질량 분석을 위하여 건조된 펩티드에　0.1%　포름산(formic acid)을 첨가하여 산성화시켰다.　　펩티드 분석은 자체 제작한 나노일렉트로스프레이 이온 소스(nanoelectrospray ion source)가 구비된　Q-Exactive　질량분석기(Thermo Fisher)와 연결된　EASY-nLC 1000　액(Thermo Fisher)으로 수행하였다.　　펩티드는　3　㎛ 크기의　100-Å C18　비드가 채워진 내부 직경　75　㎛의　15　㎝ 역상 컬럼(reversed phase column)으로 분리하였다. 0.1%　포름산에 아세토니트릴을 혼합한 용매를　9.5%　부터　36.5%까지 농도구배를 적용하고,　유속은　350 nL/분으로 하여　130분 동안 펩티드를 분석하였다. 　전체-스캔 질량스펙트럼(full-scan MS)과 탠덤 질량스펙트럼(tandem MS)　사이를 자동으로 전환하기 위하여,　질량 분석기(mass spectrometer)는 데이터-의존성 모드(data-dependent mode)로 작동시켰다.　　전체-스캔 질량 스펙트럼은　70,000　해상도에서　AGC(automated gain control)값　1,000,000을 이용하여　Orbitrap (300-1800　m/z)에서 수집하였다.　　　전체-스캔에서 가장 강한 이온　12개는　17,500　해상도에서　AGC500,000을 이용하여 분리하였다.　　분리된 이온은　27%의 정규화된 충돌 에너지와　2　m/z　격리 폭을 갖는 충돌-유도성 해리(collisionally-induced dissociation)에 의하여 고 충돌 해리 셀(high collision dissociation cell)에서 단편화되었다.

6. 데이터 분석

미가공 데이터 파일(raw date file)은　UniProt　Drosophila melanogaster　데이터베이스(UP000000803; Mar. 15, 2017)에서　MaxQuant(버전　1.6.0.1)를 이용하여 검색하였다. 　검색에 사용한 변수(parameter)는 트립신 가수분해(tryptic digestion),　미절단 최대　2개까지 허용,　시스테인의 카바미도메틸 수식화 고정(fixed carbamidomethyl modifications of cysteine),　메티오닌의 유동적 산화　(variable oxidation of methionine)　및 단백질　N-말단의 유동적 아세틸화　(variable acetylation of protein N-termini)를 적용하였다.　　전구체 이온의 질량 허용 오차(mass tolerance)는　4.5 ppm이고,　단편화된 이온의 질량 허용 오차는　20 ppm으로 설정하였다.　　오발견율(false discovery rate, FDR)을 확인하기 위하여,　표적 데이터베이스(target database)를 반전시켜 교란 데이터베이스(decoy database)를 만들었다.　　단백질과 펩티드 수준의 오발견율은　1%로 고정하고,　하나 이상의 특이(unique)펩티드로 동정된 단백질만을 선정하였다.

실험 결과

1. 조직 수집 및 단백질 분리

효율적으로 면역침전(immunoblotting)을 수행하기 위하여, 생체 내에서 정상적으로 기능하고, N-말단에 EGFP가 융합된 Orco 단백질(EGFP::Orco)을 이용하였다. 또한, 상호작용 단백질에 대하여 야생형 Orco 단백질과 EGFP::Orco가 경쟁하는 것을 방지하기 위하여 Orco-결핍(null) 돌연변이체(Orco ¹ )에서 EGFP::Orco를 발현시켰다.

초파리 성체의 후각 조직으로부터 Orco의 상호작용체(interactome)를 분리하기 위하여 우선적으로 후각 조직의 수집 방법을 개선하였다. 먼저, 후각 조직을 50 ㎖ 튜브에 바로 수집하기 위하여 초파리 미세조직 분리 장치를 고안하였다. 발명자가 고안한 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하면 손으로 조직(초파리의 안테나 또는 머리)을 해부하여 수집하는 것보다 훨씬 빠르고 쉽게 후각 조직을 수집할 수 있다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이 초파리 미세조직 분리 장치를 이용하여 수집된 미세조직은 머리 조직에 비해 EGFP가 표지된 Orco를 상대적으로 더 많이 포함하고 있는 것을 확인할 수 있다.

체질(sieving)로 분리된 미세조직 내 후각 조직에서는 OSN의 축삭(axon)이 파괴되기 때문에 분리한 단백질을 가능한 빨리 가용화(solubilized)시켰다.

수집된 미세조직의 가늘고 단단한 미세 섬모 내부에 존재하는 7-막관통 단백질(특히 Orco)이 용해 버퍼에 더 효과적으로 배출되도록 하기 위하여 다양한 조직 분쇄 방법을 고려하였다. 그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 철 비드로 조직을 균질화하는 경우 단백질이 유사한 양으로 일관되게 분리되는 것을 확인할 수 있었다.

도 구	반복 차수	단백질 농도(㎍/㎕)	표준 편차
플라스틱 봉 (Plastic pestle)	1	0.89	0.34
	2	1.12
	3	1.69
	4	1.29
철 비드 (Steel beads)	1	1.47	0.16
	2	1.34
	3	1.69
	4	1.65

다음으로 후각 조직을 분리한 뒤, 7-막관통 단백질인 Orco의 면역블로팅(immunoblotting) 및 질량분석에 적합한 상태를 최적화하기 위하여 다양한 계면활성제를 포함하는 버퍼 및 다양한 샘플 제조 온도에서 EGFP::Orco의 가용화에 대한 가능성을 확인하였다. 확인 결과, 도 4의 A에 나타난 바와 같이 Tween 20, CHAPS 및 CHAPSO를 제외한 모든 계면활성제가 EGFP::Orco를 가용화시키는 것을 알 수 있었다. 이 결과를 토대로 질량분석을 포함한 모든 향후 실험에는 1% DDM이 포함된 용해 버퍼를 이용하였다. 또한, 도 4의 B에 나타난 바와 같이 SDS 및 β-mercaptoethanol의 존재 하에 단백질 샘플을 가열하면 온도가 상승할수록 DDM으로 가용화된 EGFP::Orco의 가용화 정도가 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 50에서 EGFP::Orco를 가용화시키는 것이 면역블로팅(immunoblotting)에 최적화된 상태인 것을 확인하였다.

2. IP-MS( Immunoprecipitation -mass spectrometry) 결과

비드 및 EGFP 표지에 결합된 비특이적 단백질을 분류하기 위하여, 지질체가 결합된 GFP(myristoylated GFP, myr::GFP)와 병렬 IP 실험을 수행하였다. Anti-GFP 나노바디(the variable domain of the Camelidae heavy chain antibody; Harmsen and De Haard, 2007)가 연결된 아가로스 비드를 이용하여 IP를 수행하였다.

그런 다음 액체 크로마토그래피-탠덤 MS (liquid chromatography-tandem MS, LC-MS/MS) 분석으로 Orco와 함께 면역침전된 단백질을 동정하였다. Orco와 함께 면역침전된 단백질을 동정하기 위해서는 온-비드 다이제스천을 수행하였는데, 이는 나노바디에 결합된 상태의 면역침전 샘플에 바로 트립신을 처리한 후 생성된 펩티드(tryptic peptide)를 MS로 분석하는 방법이다.

3. 데이터 처리 및 분석

미가공 질량분석 데이터는 Uniprot Drosophila melanogaster 데이터베이스에 대해 MaxQuant를 이용하여 검색하였다. 최초 1,057개의 동정된 단백질을 획득하였으며 이 목록을 실험군과 대조군의 iBAQ 값 비율(experimental-to-control iBAQ value ratios)에 따라 순위를 평가하였다. 그 중에서도 Orco와 상호작용할 가능성이 높은 단백질을 선별하기 위하여, 대조군의 iBAQ 값이 0임과 동시에 실험군의 모든 생물학적 복제 샘플(biological replicates)에서 iBAQ 값이 검출된 단백질만 남겼다. 그 결과, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 높은 확률로 서로 상호작용할 것이 예상되는 네 개의 단백질이 예상되었다. 표 2의 결과에 따르면, 면역침전(immunoprecipitate)한 Orco가 가장 많은 양으로 분리된 것을 확인할 수 있다. 이는 도 2의 과정 및 위에 명시된 특정 IP-MS 방법을 이용하여 상호작용체를 획득할 시 효과적으로 7-막관통 단백질을 분리할 수 있음을 보여준다.

유전자 이름	해당 단백질	실험군 iBAQ 값	대표적 Cellular Component Ontology
Orco	Odorant receptor coreceptor	5.40 x 10⁸	수상 돌기, 원형질 막
CG34309	(미정)	5.47 x 10⁷	막단백질
Or92a	Odorant receptor 92a	1.95 x 10⁷	수상 돌기, 원형질 막
CG5382	Zinc finger protein-like 1 homolog	2.43 x 10⁶	세포내막계

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

초파리 후각 조직을 분리하는 단계;
분리한 상기 후각 조직을 분쇄하는 단계;
분쇄한 후각 조직에 계면활성제를 포함하는 용해 버퍼를 첨가하고 혼합하는 단계; 및
상기 혼합물을 원심분리하여 상층액을 얻는 단계를 포함하고,
상기 초파리 후각 조직을 분리하는 단계는
개구의 크기가 50 내지 300μm인 필터가 장착된 초파리 미세조직 분리장치에 의해 초파리 성체로부터 후각 조직을 분리하는 것인,
초파리 후각 조직으로부터 7-막관통 단백질을 분리하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 후각 조직을 분쇄하는 단계는 철 비드를 이용하는 것인 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS, Triton X-100, Nonidet P-40, Octyl-b-D-glucopyranoside, n-Dodecyl b-Dmaltoside 및 Zwittergent 3-16으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
삭제