CN101333555B - 新型的g蛋白偶联受体细胞水平筛选系统构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的G蛋白偶联受体(GPCR)细胞水平筛选系统及其构建方法与应用。所述筛选系统由HEK293细胞或CHO细胞构建，含有来自以下序列中不同组间基因序列构建的2种融合表达载体：第1组：(1)DnaE基因的C端与报告基因的C端的拼接序列：DnaE-C-Report-C，(2)DnaE基因的N端与报告基因的N端的拼接序列：Report-N-DnaE-N；第2组：①GPCR基因，②β-arrestin基因。本发明的有益效果主要体现在：应用本发明筛选系统进行G蛋白偶联受体(GPCR)细胞水平筛选，灵敏度高、特异性强，操作简单、快速，检测范围广，对任何靶细胞型中任何GPCR或GPCR信号转导途径的激动剂、拮抗剂都可以筛选。

Description

新型的G蛋白偶联受体细胞水平筛选系统构建与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种新型的G蛋白偶联受体(GPCR)细胞水平筛选系统及其构建方法，以及该在G蛋白偶联受体筛选系统在筛选GPCR或GPCR信号转导途径的激动剂或拮抗剂中的应用。

(二)背景技术

G蛋白偶联受体(GPCR)是细胞表面最大的受体家族，也是一个最多样化的蛋白质家族。GPCR享有一个共同的二级结构的特征——7个α螺旋跨膜结构，N端在细胞膜外侧，C端则位于细胞膜内侧，所以又叫7跨膜受体.GPCR担负着把细胞外信号传递到细胞内从而改变细胞的功能活性的重要作用，对生长发育、生殖、免疫细胞迁移、神经传导、代谢以及行为起到调控作用，这些化学信号分子包括：离子(作用于副甲状腺和肾化学感测器的钙离子)，氨基酸(谷氨酸盐和氨基酪酸)，单体胺(儿茶酚胺、乙酰胆碱、复合胺等)，脂类信号(前列腺素、凝血噁烷、大麻素，(内源的大麻碱)，血小板激活因子等)，嘌呤(腺苷和ATP)，神经肽(速激肽、神经肽Y、阿片样物质opioids、缩胆囊肽、血管活性肠肽(VIP)等等)，肽类激素(血管紧张素、缓激肽、胰高血糖素、降血钙素、副甲状腺激素等)，化学趋化因子(白介素8，RANTES，MIP-lalpha等)，糖蛋白类激素(TSH、LH/FSH、促性腺激素等)，以及蛋白酶(凝血酶)。G蛋白偶联受体与人类的疾病如心血管系统、胃肠道系统、神经系统和免疫系统疾病，以及跟肿瘤发生、炎症、肥胖症、糖尿病和骨质疏松等密切相关，所以世界各大制药公司都把G蛋白偶联受体为靶子研发新药，近20年来，大约有40～50％的处方药是针对G蛋白偶联受体。

G蛋白偶联受体作为药靶的药物筛选模型的建立主要基于受体活化后的第二信使cAMP和Ca²⁺，以及受体内吞。最早建立的药物筛选模型有用荧光图像平板读数器(FLIPR)测定细胞内与敏感性荧光染料结合的Ca²⁺浓度变化，基于GTP-GDP交换的[35S]GTPγS结合测试法，和报告基因检测法则基于GPCR受体被活化后的第二信使cAMP和Ca²⁺分别激活或抑制弱启动子上游的增强子CRE或NFAT，从而促使弱启动子的下游的报告基因-氯霉素乙酰转移酶(CAT)，荧光素酶(Luc)，碱性磷酸化酶(SEAP)，半乳糖苷酶(β-Gal)和绿色荧光蛋白(GFP)得到转录。后来又陆续建立了用闪烁邻近测定法(SPA)测定GTP的类似物[35S]GTPγS与G蛋白α亚单位的结合，用培养的非洲爪蟾黑素细胞系统检测GPCRs被活化后，cAMP的浓度增加可使黑素细胞内的色素颗粒的变化情况(Melanophore)，放免法测定细胞内cAMP浓度的筛选模型。最近又建立了用钙敏发光蛋白水母素测定细胞内Ca²⁺浓度变化，用绿色荧光蛋白融合β-arrestin2检测GPCR受体被活化后内吞过程和用生物发光共振能量转移检测法(BRET)测定当β-arrestin-GFP融合蛋白与受体-renilla荧光素酶(rLuc)融合蛋白结合而使绿色荧光蛋白的光谱发生的变化等的药物筛选模型。

内含肽(intein)是来自细菌的蛋白翻译产物(前体蛋白)阅读框架内的一段氨基酸序列，它靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来，同时以肽键将两端肽链相连形成成熟蛋白的方式介导蛋白质剪接(splicing)。1998年报来自蓝藻Synechocystis sp.PCC6803的DnaE intein是一种内含肽，其N端和C端剪接结构域的基因被750kb的基因组序列分开，蛋白翻译产物仍可以通过内含肽片段间的识别、重建完成外蛋白子(DnaE-N和DnaE-C)的剪接，最终形成完整的DanE蛋白。DnaE内含肽同样存在于另外些蓝藻中。DnaEintein的剪接特性应用于蛋白环化、蛋白纯化、蛋白片段同位素标记等，特别是应用于蛋白间的相互作用。将2个具有相互作用蛋白分别融合进DnaEintein的2个剪接片段，再直接与报告蛋白(如可发光检测的荧光素酶、增强型绿色荧光蛋白等)的C端和N端相连。两个蛋白相互作用导致内含肽相互靠近进而折叠显示出剪接活性，使两个分别在不同载体表达的无活性报告蛋白片段恢复完整的蛋白活性而发光，通过光检测而定量定性蛋白间相互作用。已报道用此方法来监测线粒体释放蛋白、核定位蛋白等。

Arrestins通过终止G蛋白介导的信号传导在调控7TM受体应答扮演着重要角色。Arrestin是胞质蛋白，激动剂刺激之后，当激动剂结合到7TM受体，Arrestin数秒分钟内易位到通常被磷酸化、有活性的受体上。Arrestin家族分子结合到7TM受体，空间上阻碍G蛋白结合，导致整体信号失活。

(三)发明内容

本发明应用细菌内含肽DnaE和β-arrestin蛋白，提供了一种可用于G蛋白偶联受体的功能检测和药物筛选的细胞水平筛选系统及其构建与应用。

本发明采用的技术方案是：

一种G蛋白偶联受体筛选系统，所述筛选系统由HEK293细胞或CHO细胞构建，含有来自以下序列中不同组间基因序列构建的2种融合表达载体：第1组：(1)DnaE基因的C端与报告基因的C端的拼接序列：DnaE-C-Report-C，(2)DnaE基因的N端与报告基因的N端的拼接序列：Report-N-DnaE-N；第2组：①GPCR基因，②β-arrestin基因；其中，所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因，包括各种发光蛋白(例如GFP，YFP，CFP，BFP，RFP等)及其突变体，还包括水母发光蛋白或克林霉素，以及各种荧光素酶、β-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和其它许多种酶类等。将报告基因一分为二，即报告基因N端和报告基因C端，这二部分均失去酶的活性或荧光，只有经内含肽(intern)将报告基因N端和报告基因C端重新拼接成完整的蛋白，才恢复原有的酶活性或荧光。

所述筛选系统由如下方法构建得到：

(1)将DnaE基因的C端与报告基因的C端拼接，所得拼接序列DnaE-C-Report-C与GPCR基因或β-arrestin基因融合表达，获得融合表达载体I-1或I-2；

(2)将DnaE基因的N端与报告基因的N端拼接，所得拼接序列Report-N-DnaE-N与β-arrestin基因或GPCR基因融合表达，获得融合表达载体II-1或II-2；

(3)将融合表达载体I-1和II-1、或融合表达载体I-2和II-2共转染HEK293细胞或CHO细胞，得到所述筛选系统。

本发明构建的细胞水平高通量筛选系统主要基于具蛋白剪接功能的DnaE和能与被激动剂活化后的受体相结合的β-arrestin两个蛋白的应用，其原理参见图1。由报告基因如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶(Luc)、碱性磷酸化酶(SEAP)、半乳糖苷酶(β-Gal)和绿色荧光蛋白(GFP)一分为二成报告基因N端和报告基因C端，报告基因N端与受体的C端相接，并与具有蛋白剪接功能的DnaE-N(DnaE基因N端)融合表达；报告基因C端则与β-arrestin的C端相接，并与具有蛋白剪接功能的DnaE-C(DnaE基因C端)融合表达.将两个表达载体共转染HEK293细胞或CHO细胞，并构建成稳定表达细胞株。当激动剂与G蛋白偶联受体结合并使之活化，β-arrestin由细胞质向位于细胞膜上的受体移动并结合，促使DnaE-C靠近DnaE-N，而由DnaE-N和DnaE-C共同作用把报告基因N端和报告基因C端连接成一个完整的报告基因，最后通过检测报告基因活性便可知受体的活化程度。具体的，所述筛选系统构建方法如下：

(1)构建含有GPCR基因的质粒i：pCMV-flag-GPCR gene；将DnaE基因的C端：DnaE-C与报告基因的C端：Report-C拼接，在DnaE-C与Report-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，在DnaE-C的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GClinker，得到DnaE-C-Report-C，将DnaE-C-Report-C插入到质粒i中，获得融合表达载体I：

pCMV-flag-GPCR gene-DnaE-C-Report-C；

(2)构建含有β-arrestin基因的质粒ii：pCDNA-β-arrestin gene；将DnaE基因的N端：DnaE-N与报告基因的N端：Report-N拼接，在DnaE-N与之间加入GS两个氨基酸序列，在Report-N的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GClinker，得到Report-N-DnaE-N，将Report-N-DnaE-N插入到质粒ii中，获得融合表达载体II：

pCDNA-β-arrestin gene-Report-N-DnaE-N；

(3)将融合表达载体I和融合表达载体II共转染HEK293细胞或CHO细胞，获得所述筛选系统。

或者，所述方法如下：

(1)构建含有GPCR基因的质粒i：pCMV-flag-GPCR gene；将DnaE基因的N端：DnaE-N与报告基因的N端：Report-N拼接，在DnaE-N与之间加入GS两个氨基酸序列，在Report-N的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到Report-N-DnaE-N，将Report-N-DnaE-N插入到质粒i中，获得融合表达载体I：pCMV-flag-GPCR gene-Report-N-DnaE-N；

(2)构建含有β-arrestin基因的质粒ii：pCDNA-β-arrestin gene；将DnaE基因的C端：DnaE-C与报告基因的C端：Report-C拼接，在DnaE-C与Report-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，在DnaE-C的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到DnaE-C-Report-C，

将DnaE-C-Report-C插入到质粒ii中，获得融合表达载体II：

pCDNA-β-arrestin gene-DnaE-C-Report-C；

(3)将融合表达载体I和融合表达载体II共转染HEK293细胞或CHO细胞，获得所述筛选系统。

本发明构建的筛选系统是利用G蛋白偶联受体的内吞的原理，与偶联的G蛋白(Gi，Gs和Gq)无关，故可以适用于所有的G蛋白偶联受体。

优选的，所述报告基因为下列之一：①绿色荧光蛋白基因(EGFP)、②红色荧光蛋白基因(DsRed)、③Renilla荧光素酶基因(Renilla luciferase)、④Firefly荧光素酶基因(Firefly luciferase)、⑤碱性磷酸酶基因(SEAP)、⑥Bete-内酰胺酶基因(Beta-lactamase)、⑦LacZ基因。

所述DnaE基因来自蓝球藻Anacystis nidulans R2 PCC7942或点状念株藻Nostoc punctiforme PCC73102。所述β-arrestin基因为β-arrestinl或β-arrestin2，优选为β-arrestin2。Arrestin家族至少有4类成员，本发明使用的β-arrestin1和β-arrestin2，几乎分布在每一组织。β-arrestin类氨基酸的同源性在70％以上。Arrestins由3个结构功能部分组成，一个结合受体的氨基末端结构域，一个结合受体内吞相关蛋白(如笼形蛋白和AP-2(接头蛋白2))的羧基末端结构域和一个连接细胞膜组分如磷酸肌醇的中心区域。主要作用于视紫红质受体的视觉arrestin与笼形蛋白连接作用很弱，且通常未介导受体的内吞过程。如上所述，激动剂刺激后数分钟内arrestin会易位结合上被磷酸化有活性的受体，GPCR普遍通过此反应活化。因此，酶互补法或基于GPCR-arrestin相互作用的易位法对于大多数受体是有效的，同时对作用于未知功能的GPCRs(如孤儿受体)的配体的发现也有意义。

在该筛选系统中，DnaE-C与报告基因的C端通过overlap PCR拼接起来并与GPCR基因融合表达，为了便于检测该融合蛋白的表达，在该融合蛋白之前加上一个flag标签；在另一个表达载体中，DnaE-N与报告基因的N端通过overlap PCR拼接起来并与β-arrestin2基因融合表达。将两种表达载体共转染HEK293细胞，即可得到所述细胞系。为使细胞株稳定表达，可用含800ug/ml G418，10％FBS的DMEM培养基培养。当GPCR基因被其配体活化后，在GRKs作用下，GPCR基因的C端被磷酸化，此时β-arrestin2便与GPCR结合，从而使DnaE-N和DnaE-C发生相互作用，由于DnaE-N和DnaE-C具有蛋白剪接功能，因此在DnaE-N和DnaE-C的共同作用下将报告基因的N端和C端拼接到一起从而形成完整的报告基因，通过检测报告基因便可知GPCR基因被活化的程度。

具体的，GPCR基因为人烟酸受体HM74a时，当HM74a配体(烟酸)与HM74a受体结合后，HM74a受体被活化，在GRKs作用下HM74a受体的C末端被磷酸化，此时β-arrestin2便与HM74a受体结合，从而使DnaE-N和DnaE-C发生相互作用，由于DnaE-N和DnaE-C具有蛋白剪接功能，因此在DnaE-N和DnaE-C的共同作用下将rLuc-N和rLuc-C拼接到一起从而形成完整的荧光素酶rLuc基因，通过检测rLuc基因活性便可知HM74a受体被活化的程度。

本发明旨在提供一个GPCR功能性检测和药物筛选方法，也为GPCRs和GPCR信号转导途径筛选提供了新的方法；此项发明可以以编码受体的基因或下游信号元件开始，快速构建GPCRs筛选系统，其中一个目标是可以对GPCR和GPCR信号转导途径进行高通量筛选或高内涵筛选；另外，此发明还应适用于多种检测方式，包括荧光的、生物发光的、发磷光的或比色的方法。本发明的优点在于对任何靶细胞型中任何GPCR或GPCR信号转导途径的激动剂、拮抗剂都可以筛选；另一优点是在药物发现过程中可以进行GPCRs的去孤儿化；更大的优点是可以构建适合大范围的检测方式，实验室仪器操作或自动化操作。还有一优点就是适合任何细胞类型，既可以构建活体外的检测系统，也可以构建活体内的检测系统。

本发明构建的筛选筛选系统是利用G蛋白偶联受体的内吞的原理，与偶联的G蛋白(Gi，Gs和Gq)无关，故可以适用于所有的G蛋白偶联受体。

现有技术中，利用G蛋白偶联受体基因、响应元件(CRE、SRE和MRE)、荧光素酶报告基因，建立一个适用于受体激动剂高通量筛选模型，虽然响应元件能够灵敏地监控第二信使的变化，但是，由于影响第二信使变化的因素很多，可能出现不通过G蛋白偶联受体激活报告基因表达的现象，造成假阳性。而本发明构建的筛选系统只涉及G蛋白偶联受体本身和β-arrestin，当配体与受体结合并激活后，β-arrestin就会靠近并与受体结合，导致具蛋白剪接功能的DnaE的作用下将报告基因连接成一个完整的蛋白而恢复它的原有的活性，因此影响的因素很少，而实验中出现的假阳性就明显少。

另外，如通过响应元件(CRE、SRE和MRE)构建的报告基因筛选模型，要通过一系列信号转导，才能引起报告基因表达，所以需要孵育的时间数小时，长的要8小时之久。而本发明要构建的筛选模型是利用G蛋白偶联受体的内吞的原理，一般G蛋白偶联受体的内吞在配体与受体结合并激活后的数分钟内就发生，15分钟到半小时即可达到高峰，所以只需要孵育的数分钟到半小时就能检测到报告基因的活性。

再者，将绿色荧光蛋白(GFP)与β-arrestin或受体直接融合表达，可以通过由于配体作用引起GPCR的活化而导致β-arrestin在亚细胞结构中的重新分配进行成像检测，来确定GPCR的活性。这种方法往往需要价格昂贵的检测仪器，而本发明可运用诸如荧光素酶、β-内酰胺酶和β-半乳糖苷酶等，只需化学发光检测仪或普通的比色法就能测定。

从根本上说，将具拼接功能的内含肽使没有活性的报告基因两部分合而为有活性的酶或发光蛋白是一个普遍而灵活的方法，可以研究蛋白-蛋白复合物在活体细胞中的结合与解离，使之成为重要的药物发现研究工具。这种方法可以直接检测分子间的相互作用，而不必通过次级反应如转录活性或钙离子的释放。不必要用大分子标记蛋白，如完整的荧光蛋白。更由于在细胞或活体系统中进行拼接，当且仅当内源蛋白存在的条件下，相关细胞表达的蛋白经正确的翻译后加工显示出天然构象，直接或间接调控蛋白间的相互作用。这种方法可使用多种报告蛋白，能为任何仪器平台、自动操作系统、细胞类型和需要的试验方案特定设计。根据报告蛋白的选择，可以构建高内涵和高通量检测系统，并且能依据特定的靶点和对激动剂或拮抗剂在细胞内的作用方式来灵活的设计检测系统。在高内涵系统中，无论在细胞膜，细胞质，细胞核还是在其它的亚细胞室中的蛋白-蛋白复合物的亚细胞定位都可以被检测到，而且蛋白-蛋白复合物在刺激物或阻遏物作用下发生的移动也可进行可视化检测。在高通量检测系统中，可以通过标准荧光全自动定量绘图酶标仪定量检测流式细胞，多孔板或微量滴定板。这种方法能够定位信号转导途径中的蛋白。也可以用来验证新的靶点，主要通过检测哺乳动物细胞框架内特定蛋白与其它蛋白的互作，然后决定蛋白-蛋白复合物是否可以对激动剂、拮抗剂或抑制剂作出响应。

本发明的有益效果主要体现在：应用本发明筛选系统进行G蛋白偶联受体(GPCR)细胞水平筛选，灵敏度高、特异性强，操作简单、快速，检测范围广，对任何靶细胞型中任何GPCR或GPCR信号转导途径的激动剂、拮抗剂都可以筛选；在药物发现过程中还可以进行孤儿GPCRs的去孤儿化；适合任何细胞类型，既可以构建活体外的检测系统，也可以构建活体内的检测系统。

(四)附图说明

图1为本发明建模原理图；

图2为不同浓度烟酸对HM74a作用结果；

图3为不同时间烟酸对HM74a作用结果(烟酸浓度：300μM)；

图4为激动剂WIN 55，212-2(4μM)对CB1受体内吞的影响。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例中所涉及基因序列如下：

HM74aNDA序列：

ATGAATCGGCACCATCTGCAGGATCACTTTCTGGAAATAGACAAGAAG

AACTGCTGTGTGTTCCGAGATGACTTCATTGTCAAGGTGTTGCCGCCG

GTGTTGGGGCTGGAGTTTATCTTCGGGCTTCTGGGCAATGGCCTTGCC

CTGTGGATTTTCTGTTTCCACCTCAAGTCCTGGAAATCCAGCCGGATTT

TCCTGTTCAACCTGGCAGTGGCTGACTTTCTACTGATCATCTGCCTGCC

CTTCCTGATGGACAACTATGTGAGGCGTTGGGACTGGAAGTTTGGGGA

CATCCCTTGCCGGCTGATGCTCTTCATGTTGGCTATGAACCGCCAGGGC

AGCATCATCTTCCTCACGGTGGTGGCGGTAGACAGGTATTTCCGGGTG

GTCCATCCCCACCACGCCCTGAACAAGATCTCCAATCGGACAGCAGCC

ATCATCTCTTGCCTTCTGTGGGGCATCACTATTGGCCTGACAGTCCACC

TCCTGAAGAAGAAGATGCCGATCCAGAATGGCGGTGCAAATTTGTGC

AGCAGCTTCAGCATCTGCCATACCTTCCAGTGGCACGAAGCCATGTTC

CTCCTGGAGTTCTTCCTGCCCCTGGGCATCATCCTGTTCTGCTCAGCCA

GAATTATCTGGAGCCTGCGGCAGAGACAAATGGACCGGCATGCCAAG

ATCAAGAGAGCCATCACCTTCATCATGGTGGTGGCCATCGTCTTTGTCA

TCTGCTTCCTTCCCAGCGTGGTTGTGCGGATCCGCATCTTCTGGCTCCT

CACACTTCGGGCACGCAGAATTGTGAAGTGTACCGCTCGGTGGACC

TGGCGTTCTTTATCACTCTCAGCTTCACCTACATGAACAGCATGCTGGA

CCCCGTGGTGTACTACTTCTCCAGCCCATCCTTTCCCAACTTCTTCTCC

ACTTTGATCAACCGCTGCCTCCAGAGGAAGATGACAGGTGAGCCAGAT

AATAACCGCAGCACGAGCGTCGAGCTCACAGGGGACCCCAACAAAAC

CAGAGGCGCTCCAGAGGCGTTAATGGCCAACTCCGGTGAGCCATGGA

GCCCCTCTTATCTGGGCCCAACCTCTCCTTAA；

HM74a氨基酸序列：

MNRHHLQDHFLEIDKKNCCVFRDDFIVKVLPPVLGLEFIFGLLGNGLAL

WIFCFHLKSWKS SRIFLFNLAVADFLLIICLPFLMDNYVRRWDWKFGDIPC

RLMLFMLAMNRQGSIIFLTVVAVDRYFRVVHPHHALNKISNRTAAIISCLL

WGITIGLTVHLLKKKMPIQNGGANLCSSFSICHTFQWHEAMFLLEFFLPL

GIILFCSARIIWSLRQRQMDRHAKIKRAITFIMVVAIVFVICFLP SVVVRIRI

FWLLHTSGTQNCEVYRSVDLAFFITLSFTYMNSMLDPVVYYFSSPSFPNF

FSTLINRCLQRKMTGEPDNNRSTSVELTGDPNKTRGAPEALMANSGEPW

SPSYLGPTSP。

β-arrestin2  DNA序列：

ACCATGGGGGAGAAACCCGGGACCAGGGTCTTCAAGAAGTCGAG

CCCTAACTGCAAGCTCACCGTGTACTTGGGCAAGCGGGACTTCGTAGA

TCACCTGGACAAAGTGGACCCTGTAGATGGCGTGGTGCTTGTGGACCC

TGACTACCTGAAGGACCGCAAAGTGTTTGTGACCCTCACCTGCGCCTT

CCGCTATGGCCGTGAAGACCTGGATGTGCTGGGCTTGTCCTTCCGCAA

AGACCTGTTCATCGCCACCTACCAGGCCTTCCCCCCGGTGCCCAACCC

ACCCCGGCCCCCCACCCGCCTGCAGGACCGGCTGCTGAGGAAGCTGG

GCCAGCATGCCCACCCCTTCTTCTTCACCATACCCCAGAATCTTCCATG

CTCCGTCACACTGCAGCCAGGCCCAGAGGATACAGGAAAGGCCTGCG

GCGTAGACTTTGAGATTCGAGCCTTCTGTGCTAAATCACTAGAAGAGA

AAAGCCACAAAAGGAACTCTGTGCGGCTGGTGATCCGAAAGGTGCAG

TTCGCCCCGGAGAAACCCGGCCCCCAGCCTTCAGCCGAAACCACACG

CCACTTCCTCATGTCTGACCGGTCCCTGCACCTCGAGGCTTCCCTGGA

CAAGGAGCTGTACTACCATGGGGAGCCCCTCAATGTAAATGTCCACGT

CACCAACAACTCCACCAAGACCGTCAAGAAGATCAAAGTCTCTGTGA

GACAGTACGCCGACATCTGCCTCTTCAGCACCGCCCAGTACAAGTGTC

CTGTGGCTCAACTCGAACAAGATGACCAGGTATCTCCCAGCTCCACAT

TCTGTAAGGTGTACACCATAACCCCACTGCTCAGCGACAACCGGGAGA

AGCGGGGTCTCGCCCTGGATGGGAAACTCAAGCACGAGGACACCAAC

CTGGCTTCCAGCACCATCGTGAAGGAGGGTGCCAACAAGGAGGTGCT

GGGAATCCTGGTGTCCTACAGGGTCAAGGTGAAGCTGGTGGTGTCTC

GAGGCGGGGATGTCTCTGTGGAGCTGCCTTTTGTTCTTATGCACCCCA

AGCCCCACGACCACATCCCCCTCCCCAGACCCCAGTCAGCCGCTCCG

GAGACAGATGTCCCTGTGGACACCAACCTCATTGAATTTGATACCAAC

TATGCCACAGATGATGACATTGTGTTTGAGGACTTTGCCCGGCTTCGGC

TGAAGGGGATGAAGGATGACGACTATGATGATCAACTCTGCTAG

β-arrestin2  氨基酸序列：

MGEKPGTRVFKKSSPNCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVD

PDYLKDRKVFVTLTCAFRYGREDLDVLGLSFRKDLFIATYQAFPPVPNPP

RPPTRLQDRLLRKLGQHAHPFFFTIPQNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDF

EIRAFCAKSLEEKSHKRNSVRLVIRKVQFAPEKPGPQPSAETTRHFLMSDR

SLHLEASLDKELYYHGEPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFS

TAQYKCPVAQLEQDDQVSPSSTFCKVYTITPLLSDNREKRGLALDGKLK

HEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKLVVSRGGDVSVELPFVL

MHPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARLR

LKGMKDDDYDDQLC^*

RLuc的DNA序列：

ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGGATGATAACT

GGTCCGCAGTGGTGGGCCAGATGTAAACAAATGAATGTTCTTGATTCA

TTTATTAATTATTATGATTCAGAAAAACATGCAGAAAATGCTGTTATTTT

TTTACATGGTAACGCGGCCTCTTCTTATTTATGGCGACATGTTGTGCCA

CATATTGAGCCAGTAGCGCGGTGTATTATACCAGATCTTATTGGTATGGG

CAAATCAGGCAAATCTGGTAATGGTTCTTATAGGTTACTTGATCATTAC

AAATATCTTACTGCATGGTTTGAACTTCTTAATTTACCAAAGAAGATCA

TTTTTGTCGGCCATGATTGGGGTGCTTGTTTGGCATTTCATTATAGCTAT

GAGCATCAAGATAAGATCAAAGCAATAGTTCACGCTGAAAGTGTAGTA

GATGTGATTGAATCATGGGATGAATGGCCTGATATTGAAGAAGATATTG

CGTTGATCAAATCTGAAGAAGGAGAAAAAATGGTTTTGGAGAATAACT

TCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAAC

CAGAAGAATTTGCAGCATATCTTGAACCATTCAAAGAGAAAGGTGAA

GTTCGTCGTCCAACATTATCATGGCCTCGTGAAATCCCGTTAGTAAAAG

GTGGTAAACCTGACGTTGTACAAATTGTTAGGAATTATAATGCTTATCT

ACGTGCAAGTGATGATTTACCAAAAATGTTTATTGAATCGGATCCAGGA

TTCTTTTCCAATGCTATTGTTGAAGGCGCCAAGAAGTTTCCTAATACTG

AATTTGTCAAAGTAAAAGGTCTTCATTTTTCGCAAGAAGATGCACCTG

ATGAAATGGGAAAATATATCAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAA

ATGAACAATAA

RLuc的氨基酸序列：

MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVI

FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHY

KYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVV

DVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEE

FAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASD

DLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGK

YIKSFVERVLKNEQ

RLuc的N端(RLuc-N，1～229aa)DNA序列：

ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGGATGATAACT

GGTCCGCAGTGGTGGGCCAGATGTAAACAAATGAATGTTCTTGATTCA

TTTATTAATTATTATGATTCAGAAAAACATGCAGAAAATGCTGTTATTTT

TTTACATGGTAACGCGGCCTCTTCTTATTTATGGCGACATGTTGTGCCA

CATATTGAGCCAGTAGCGCGGTGTATTATACCAGATCTTATTGGTATGGG

CAAATCAGGCAAATCTGGTAATGGTTCTTATAGGTTACTTGATCATTAC

AAATATCTTACTGCATGGTTTGAACTTCTTAATTTACCAAAGAAGATCA

TTTTTGTCGGCCATGATTGGGGTGCTTGTTTGGCATTTCATTATAGCTAT

GAGCATCAAGATAAGATCAAAGCAATAGTTCACGCTGAAAGTGTAGTA

GATGTGATTGAATCATGGGATGAATGGCCTGATATTGAAGAAGATATTG

CGTTGATCAAATCTGAAGAAGGAGAAAAAATGGTTTTGGAGAATAACT

TCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAAAGTTAGAAC

CAGAAGAATTTGCAGCATATCTTGAACCATTCAAAGAGAAAGGTGAA

GTTCGTCGTCCAACATTATCATGGCCTCGTGAAATCCCGTTAGTAAAAG

GTGGT；

RLuc的N端(RLuc-N，1～229aa)氨基酸序列：

MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVI

FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHY

KYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVV

DVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEE

FAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGG；

RLuc的C端(RLuc-C，230～311aa)DNA序列：

AAACCTGACGTTGTACAAATTGTTAGGAATTATAATGCTTATCTACGTG

CAAGTGATGATTTACCAAAAATGTTTATTGAATCGGATCCAGGATTCTT

TTCCAATGCTATTGTTGAAGGCGCCAAGAAGTTTCCTAATACTGAATTT

GTCAAAGTAAAAGGTCTTCATTTTTCGCAAGAAGATGCACCTGATGAA

ATGGGAAAATATCAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAAATGAA

CAATAA；

RLuc的C端(RLuc-C，230～311aa)氨基酸序列：

KPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFV

KVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQ。

RLuc的N端(RLuc-N，1～110aa)DNA序列：

ATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAGAACAAAGGAAACGGATGATAACT

GGTCCGCAGTGGTGGGCCAGATGTAAACAAATGAATGTTCTTGATTCA

TTTATTAATTATTTGATTCAGAAAAACATGCAGAAAATGCTGTTATTTT

TTTACATGGTAACGCGGCCTCTTCTTATTTATGGCGACATGTTGTGCCA

CATATTGAGCCAGTAGCGCGGTGTATTATACCAGATCTTATTGGTATGGG

CAAATCAGGCAAATCTGGTAATGGTTCTTATAGGTTACTTGATCATTAC

AAATATCTTACTGCATGGTTTGAACTTCTTAATTTACCA

RLuc的N端(RLuc-N，1～110aa)氨基酸序列：

MTSKVYDPEQRKRMITGPQWWARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVI

FLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHY

KYLTAWFELLNL

RLuc的C端(RLuc-C，111～311aa)DNA序列：

AAGAAGATCATTTTTGTCGGCCATGATTGGGGTGCTTGTTTGGCATTTC

ATTATAGCTATGAGCATCAAGATAAGATCAAAGCAATAGTTCACGCTGA

AAGTGTAGTAGATGTGATTGAATCATGGGATGAATGGCCTGATATTGAA

GAAGATATTGCGTTGATCAAATCTGAAGAAGGAGAAAAAATGGTTTTG

GAGAATAACTTCTTCGTGGAAACCATGTTGCCATCAAAAATCATGAGA

AAGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGCATATCTTGAACCATTCAAAGAG

AAAGGTGAAGTTCGTCGTCCAACATTATCATGGCCTCGTGAAATCCCG

TTAGTAAAAGGTGGTAAACCTGACGTTGTACAAATTGTTAGGAATTATA

ATGCTTATCTACGTGCAAGTGATGATTTACCAAAAATGTTTATTGAATC

GGATCCAGGATTCTTTTCCAATGCTTTGTTGAAGGCGCCAAGAAGTTT

CCTAATACTGAATTTGTCAAAGTAAAAGGTCTTCATTTTTCGCAAGAAG

ATGCACCTGATGAAATGGGAAAATATCAAATCGTTCGTTGAGCGAG

TTCTCAAAAATGAACAATAA

RLuc的C端(RLuc-C，111～311aa)氨基酸序列：

PKKIIFVGHDWGACLAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIE

EDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETMLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGE

VRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGF

FSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNE

Q

来自蓝球藻的DnaE的N端(Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-N，37～152aa)DNA序列：

GCCGAATATTGTTTGGCGGCAGATACAGAAGTTCTGACCGTTGAATATG

GCCCGATCGCGATTGGCAAACTAGTCGAAGAAAATATTCGTTGCCAAG

TTTATTGCTGTAACCCAGATGGCTATATCTACAGTCAGCCGATTGGTCA

ATGGCATCAACGAGGTGAACAGGAAGTGATTGAATACGAACTCAGTG

ATGGTCGCATCATTCGAGCAACTGCTGACCATCGCTTTATGACTGAAG

AGGGTGAAATGCTGTCGCTGGATGAAATCTTTGAGCGATCGCTAGAAC

TGAAGCAGATTCCGACACCATTGTTAGCGATCGCTCAGCCATCCCCGTT

AGCGACGGCGTAA；

Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-N(37～152aa)的氨基酸序列为：

AEYCLAADTEVLTVEYGPIAIGKLVEENIRCQVYCCNPDGYIYSQPIGQW

HQRGEQEVIEYELSDGRIIRATADHRFMTEEGEMLSLDEIFERSLELKQIPT

PLLAIAQPSPLATA；

Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-C(1～36aa)的DNA序列：

ATGGTCAAAATTGTTCGGCGGCGTTCCTTGGGTGTGCAACCCGTCTAC

GACCTTGGCGTGGCAACCGTACATAACTTTGTGCTGGCCAATGGCCTT

GTGGCCTCCAAC；

Anacystis nidulans R2 PCC7942 DnaE-C(1～36aa)的氨基酸序列为：

MVKIVRRRSLGVQPVYDLGVATVHNFVLANGLVASN。

来自点状念株藻Nostoc punctiforme PCC73102的DnaE  N端(Nostoc

punctiforme PCC73102 DnaE-N，37～141aa)DNA序列：

GCTGAATATTGTTTAAGCTATGAAACGGAAATATTGACAGTAGAATATG

GATTATTACCGATTGGTAAAATTGTAGAAAAGCGCATCGAATGTACTGT

TTATAGCGTTGATAATAATGGAAATATTTATACACAACCTGTAGCACAAT

GGCACGATCGCGGAGAACAAGAGGTGTTTGAGTATTGTTTGGAAGAT

GGTTCATTGATTCGGGCAACAAAAGACCATAAGTTTATGACTGTTGAT

GGTCAAATGTTGCCAATTGATGAAATATTTGAACGTGAATTGGATTTGA

TGCGGGTTGATAATTTGCCGAATTGA；

Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE-N(37～141aa)的氨基酸序列：

AEYCLSYETEILTVEYGLLPIGKIVEKRIECTVYSVDNNGNIYTQPVAQWH

DRGEQEVFEYCLEDGSLIRATKDHKFMTVDGQMLPIDEIFERELDLMRVD

NLPN；

Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE-C(1～36aa)的DNA序列：

ATGATCAAAATAGCCACACGTAAATATTTAGGCAAACAAAATGTCTATG

ACATTGGAGTTGAGCGCGACCATAATTTTGCACTCAAAAATGGCTTCAT

AGCTTCTAAT；

Nostoc punctiforme PCC73102 DnaE-C(1～36aa)的氨基酸序列为：

MIKIATRKYLGKQNVYDIGVERDHNFALKNGFIASN；

人大麻碱受体CB1基因cDNA序列：

ATGAAGTCGATCCTAGATGGCCTTGCAGATACCACCTTCCGCACCATCA

CCACTGACCTCCTGTACGTGGGCTCAAATGACATTCAGTACGAAGACA

TCAAAGGTGACATGGCATCCAAATTAGGGTACTTCCCACAGAAATTCC

CTTTAACTTCCTTTAGGGGAAGTCCCTTCCAAGAGAAGATGACTGCGG

GAGACAACCCCCAGCTAGTCCCAGCAGACCAGGTGAACATTACAGAA

TTTTACAACAAGTCTCTCTCGTCCTTCAAGGAGAATGAGGAGAACATC

CAGTGTGGGGAGAACTTCATGGACATAGAGTGTTTCATGGTCCTGAAC

CCCAGCCAGCAGCTGGCCATTGCAGTCCTGTCCCTCACGCTGGGCACC

TTCACGGTCCTGGAGAACCTCCTGGTGCTGTGCGTCATCCTCCACTCC

CGCAGCCTCCGCTGCAGGCCTTCCTACCACTTCATCGGCAGCCTGGCG

GTGGCAGACCTCCTGGGGAGTGTCATTTTTGTCTACAGCTTCATTGACT

TCCACGTGTTCCACCGCAAAGATAGCCGCAACGTGTTTCTGTTCAAAC

TGGGTGGGGTCACGGCCTCCTTCACTGCCTCCGTGGGCAGCCTGTTCC

TCACAGCCATCGACAGGTACATATCCATTCACAGGCCCCTGGCCTATAA

GAGGATTGTCACCAGGCCCAAGGCCGTGGTGGCGTTTTGCCTGATGTG

GACCATAGCCATTGTGATCGCCGTGCTGCCTCTCCTGGGCTGGAACTG

CGAGAAACTGCAATCTGTTTGCTCAGACATTTTCCCACACATTGATGA

AACCTACCTGATGTTCTGGATCGGGGTCACCAGCGTACTGCTTCTGTTC

ATCGTGTATGCGTACATGTATATTCTCTGGAAGGCTCACAGCCACGCCG

TCCGCATGATTCAGCGTGGCACCCAGAAGAGCATCATCATCCACACGT

CTGAGGATGGGAAGGTACAGGTGACCCGGCCAGACCAAGCCCGCATG

GACATTAGGTTAGCCAAGACCCTGGTCCTGATCCTGGTGGTGTTGATC

ATCTGCTGGGGCCCTCTGCTTGCAATCATGGTGTATGATGTCTTTGGGA

AGATGAACAAGCTCATTAAGACGGTGTTTGCATTCTGCAGTATGCTCT

GCCTGCTGAACTCCACCGTGAACCCCATCATCTATGCTCTGAGGAGTA

AGGACCTGCGACACGCTTTCCGGAGCATGTTTCCCTCTTGTGAAGGCA

CTGCGCAGCCTCTGGATAACAGCATGGGGGACTCGGACTGCCTGCAC

AAACACGCAAACAATGCAGCCAGTGTTCACAGGGCCGCAGAAAGCTG

CATCAAGAGCACGGTCAAGATTGCCAAGGTAACCATGTCTGTGTCCAC

AGACACGTCTGCCGAGGCTCTGTGA

人大麻碱受体CB1蛋白氨基酸序列为：

MKSILDGLADTTFRTITTDLLYVGSNDIQYEDIKGDMASKLGYFPQKFPLT

 SFRGSPFQEKMTAGDNPQLVPADQVNITEFYNKSL S SFKENEENIQCGENF

MDIECFMVLNPSQQLAIAVLSLTLGTFTVLENLLVLCVILHSRSLRCRPSY

HFIGSLAVADLLGSVIFVYSFIDFHVFHRKDSRNVFLFKLGGVTASFTASV

GSLFLTAIDRYISIHRPLAYKRIVTRPKAVVAFCLMWTIAIVIAVLPLLGWN

CEKLQSVCSDIFPHIDETYLMFWIGVTSVLLLFIVYAYMYILWKAHSHAV

RMIQRGTQKSIIIHTSEDGKVQVTRPDQARMDIRLAKTLVLILVVLIICWG

PLLAIMVYDVFGKMNKLIKTVFAFCSMLCLLNSTVNPIIYALRSKDLRHA

FRSMFPSCEGTAQPLDNSMGDSDCLHKHANNAASVHRAAESCIKSTVKI

AKVTMSVSTDTSAEAL*

实施例1：

(1)从人胎盘基因组DNA中克隆HM74a基因，从HEK293总RNA以RT-PCR克隆β-arrestin2基因，从蓝球藻菌株Anacystis nidulansR2(PCC7942)基因组DNA中克隆DnaE基因的N端(DnaE-N)和C端(DnaE-C)；构建质粒i：pCMV-flag-HM74a和质粒ii：pCDNA-β-arrestin2。

(2)将Anacystis nidulans R2 DnaE-C(1-36aa)分别与两种Renilla荧光素酶基因C端(rLuc-C，111-311aa)通过overlapPCR将DnaE-C与rLuc-C拼接起来，在DnaE-C与rLuc-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，并且在DnaE-C的N端连上一个GC linker(其氨基酸序列为GGGGSG)；将两种Renilla荧光素酶基因N端(rLuc-N，1-110aa)与Anacystis nidulans R2 DnaE-N(37-152aa)通过overlap PCR将rLuc-N与DnaE-N拼接起来，在rLuc-N与DnaE-N之间加入GS两个氨基酸序列，在rLuc-N的N端同样连上一个GC linker。

(3)将上述构建的DnaE-C-rLuc-C及rLuc-N-DnaE-N分别插入到质粒i和质粒ii中，便可获得融合表达载体I：

pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C和融合表达载体II：

pCDNA-β-arrestin2-rLuc-N-DnaE-N；

(4)HEK293细胞以3×10⁵密度传代于6孔细胞培养板中，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂环境培养。第二天用Lipofectamine2000(invitrogen公司)共转染质粒pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C和pCDNA-β-arrestin2-rLuc-N-DnaE-N，24小时后传至24孔细胞培养板中继续培养过夜。

(5)吸去上述培养板中的培养基，分别用含不同浓度(1mM，100μM，10μM，1μM，0.1μM和0.01μM)烟酸的DMEM培养基培养共转染细胞60min；

及用含300μM烟酸的DMEM培养基培养不同时间，吸去培养基，用PBS洗两次，再用Renilla Luciferase Assay System(Promega公司)裂解液裂解细胞，加入反应底物(按试剂盒要求进行)，用化学发光检测仪(Berthold公司)测定2S钟内荧光强度，结果见图2、图3。

细胞培养和稳定表达细胞株构建：用于本发明的细胞株主要有HEK293和CHO细胞。这2种细胞均用DMEM培养基加10％FBS。细胞转染或共转染受体表达载体和报告基因表达载体用Lipofectamine-2000.转染24小时后，加入G418，HEK293细胞为800μg/ml，而CHO细胞为600μg/ml，3～4天换一次含G418新鲜培养基。二周后，可见明显的细胞群落，挑20～30个细胞群落扩增后，用流式细胞仪分析受体细胞表面表达，把高表达细胞株扩增后冻存，或用于药物筛选和结合活性测试等实验。

萤光素酶活性的测定：细胞水平筛选细胞系萤光素酶活性测定用Promega试剂盒，按试剂盒要求，在反应结束后，加入溶胞缓冲液，立即用Topcounter或化学发光检测仪(Berthold公司)测定2S钟内荧光强度，读出RLU(相对光强度单位)。

实施例2：

(1)从人胎盘基因组DNA中克隆HM74a基因，从HEK293总RNA以RT-PCR克隆β-arrestin2基因，从点状念株藻Nostocpunctiforme(PCC73102)基因组DNA中克隆DnaE基因的N端(DnaE-N，37-141aa)和C端(DnaE-C，1～36aa)；

(2)将Nostoc punctiforme DnaE-C(1-36aa)分别与两种Renilla荧光素酶基因C端(rLuc-C，229-311aa)通过overlap PCR将DnaE-C与rLuc-C拼接起来，在DnaE-C与rLuc-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，并且在DnaE-C的N端连上一个GC linker(其氨基酸序列为GGGGSG)；将两种Renilla荧光素酶基因N端(rLuc-N，1-229aa)与Nostoc punctiforme DnaE-N(37-141aa)通过overlap PCR将rLuc-N与DnaE-N拼接起来，在rLuc-N与DnaE-N之间加入GS两个氨基酸序列，在rLuc-N的N端同样连上一个GC linker。

(3)将上述构建的DnaE-C-rLuc-C及rLuc-N-DnaE-N分别插入到质粒i和质粒ii中，便可获得融合表达载体I：

pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C和融合表达载体II：

pCDNA-β-arrestin2-rLuc-N-DnaE-N；

(4)CHO细胞以3×10⁵密度传代于6孔细胞培养板中，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂环境培养。第二天用Lipofectamine  2000(invitrogen公司)共转染质粒pCMV-flag-HM74a-DnaE-C-rLuc-C  和pCDNA-β-arrestin2-rLuc-N-DnaE-N。

(5)转染24小时后，加入G418至浓度为600μg/ml，3～4天换一次含G418新鲜培养基。二周后，可见明显的细胞群落，挑20～30个细胞群落扩增后，用流式细胞仪分析受体细胞表面表达，把高表达细胞株扩增后冻存，或用于药物筛选和结合活性测试等实验。

实施例3：人大麻碱受体CB1内吞活性的检测

按照实施例1方法，构建质粒载体pCMV-Flag-CB1-rLucN-DnaEN和pcDNA-βArrestin2-DnaEC-rLucC，再用Lipofectamine-2000转染试剂将pCMV-Flag-CB1-rLucN-DnaEN和pcDNA-βArrestin2-DnaEC-rLucC表达载体共转染到HEK293细胞，经G418(800μg/ml)2～3周的选择得到稳定表达细胞株。稳定表达细胞用胰酶-EDTA消化后，转到24孔培养板，经12～16小时37℃在CO₂培养箱培养，加入含4μM激动剂WIN 55,212-2的无血清DMEM培养基在37℃的CO₂培养箱培养4～6小时，然后用化学发光检测仪检测荧光素酶活性，结果见图4。

                                                      序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江大学

<120>新型的G蛋白偶联受体细胞水平筛选细胞系统构建与应用

<160>24

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1092

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>  1

 atgaatcggc accatctgca ggatcacttt ctggaaatag acaagaagaa ctgctgtgtg     60

 ttccgagatg acttcattgt caaggtgttg ccgccggtgt tggggctgga gtttatcttc    120

 gggcttctgg gcaatggcct tgccctgtgg attttctgtt tccacctcaa gtcctggaaa    180

 tccagccgga ttttcctgtt caacctggca gtggctgact ttctactgat catctgcctg    240

 cccttcctga tggacaacta tgtgaggcgt tgggactgga agtttgggga catcccttgc    300

 cggctgatgc tcttcatgtt ggctatgaac cgccagggca gcatcatctt cctcacggtg    360

 gtggcggtag acaggtattt ccgggtggtc catccccacc acgccctgaa caagatctcc    420

 aatcggacag cagccatcat ctcttgcctt ctgtggggca tcactattgg cctgacagtc    480

 cacctcctga agaagaagat gccgatccag aatggcggtg caaatttgtg cagcagcttc    540

 agcatctgcc ataccttcca gtggcacgaa gccatgttcc tcctggagtt cttcctgccc    600

 ctgggcatca tcctgttctg ctcagccaga attatctgga gcctgcggca gagacaaatg    660

 gaccggcatg ccaagatcaa gagagccatc accttcatca tggtggtggc catcgtcttt    720

 gtcatctgct tccttcccag cgtggttgtg cggatccgca tcttctggct cctgcacact    780

 tcgggcacgc agaattgtga agtgtaccgc tcggtggacc tggcgttctt tatcactctc    840

 agcttcacct acatgaacag catgctggac cccgtggtgt actacttctc cagcccatcc    900

 tttcccaact tcttctccac tttgatcaac cgctgcctcc agaggaagat gacaggtgag    960

 ccagataata accgcagcac gagcgtcgag ctcacagggg accccaacaa aaccagaggc   1020

 gctccagagg cgttaatggc caactccggt gagccatgga gcccctctta tctgggccca   1080

 acctctcctt aa                                                       1092

<210>2

<211>363

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

 Met Asn Arg His His Leu Gln Asp His Phe Leu Glu Ile Asp Lys Lys

 1               5                   10                  15

 Asn Cys Cys Val Phe Arg Asp Asp Phe Ile Val Lys Val Leu Pro Pro

             20                  25                  30

 Val Leu Gly Leu Glu Phe Ile Phe Giy Leu Leu Gly Asn Gly Leu Ala

         35                  40                  45

 Leu Trp Ile Phe Cys Phe His Leu Lys Ser Trp Lys Ser Ser Arg Ile

    50                   55                  60

 Phe Leu Phe Asn Leu Ala Val Ala ASp Phe Leu Leu Ile Ile Cys Leu

 65                  70                  75                  80

 Pro Phe Leu Met Asp Asn Tyr Val Arg Arg Trp Asp Trp Lys Phe Gly

                 85                  90                  95

 Asp Ile Pro Cys Arg Leu Met Leu Phe Met Leu Ala Met Asn Arg Gln

             100                 105                 110

 Gly Ser Ile Ile Phe Leu Thr Val Val Ala Val Asp Arg Tyr Phe Arg

         115                 120                 125

 Val Val His Pro His His Ala Leu Asn Lys Ile Set Asn Arg Thr Ala

     130                 135                 140

 Ala Ile Ile Ser Cys Leu Leu Trp Gly Ile Thr Ile Gly Leu Thr Val

 145                 150                 155                 160

 His Leu Leu Lys Lys Lys Met Pro Ile Gln Asn Gly Gly Ala Asn Leu

                 165                 170                 175

 Cys Ser Ser Phe Ser Ile Cys His Thr Phe Gln Trp His Glu Ala Met

             180                 185                 190

 Phe Leu Leu Glu Phe Phe Leu Pro Leu Gly Ile Ile Leu Phe Cys Ser

         195                 200                 205

 Ala Arg Ile Ile Trp Ser Leu Arg Gln Arg Gln Met Asp Arg His Ala

    210                 215                  220

 Lys Ile Lys Arg Ala Ile Thr Phe Ile Met Val Val Ala Ile Val Phe

 225                 230                 235                 240

 Val Ile Cys Phe Leu Pro Ser Val Val Val Arg Ile Arg Ile Phe Trp

                 245                 250                 255

 Leu Leu His Thr Ser Gly Thr Gln Asn Cys Glu Val Tyr Arg Ser Val

             260                 265                 270

 Asp Leu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Met Asn Ser Met

         275                 280                 285

 Leu Asp Pro Val Val Tyr Tyr Phe Ser Set Pro Ser Phe Pro Asn Phe

     290                 295                 300

 Phe Ser Thr Leu Ile Asn Arg Cys Leu Gln Arg Lys Met Thr Gly Glu

305                 310                  315                 320

 Pro Asp Asn Asn Arg Ser Thr Ser Val Glu Leu Thr Gly Asp Pro Asn

                 325                 330                 335

Lys Thr Arg Gly Ala Pro Glu Ala Leu Met Ala Asn Ser Gly Glu Pro

            340                 345                 350

Trp Ser Pro Ser Tyr Leu Gly Pro Thr Ser Pro

       355                 360

<210>3

<211>1233

<212>DNA

<213>human embryonic kidney293

<400>3

accatggggg agaaacccgg gaccagggtc ttcaagaagt cgagccctaa ctgcaagctc     60

accgtgtact tgggcaagcg ggacttcgta gatcacctgg acaaagtgga ccctgtagat    120

ggcgtggtge ttgtggaccc tgactacctg aaggaccgca aagtgtttgt gaccctcacc    180

tgcgccttcc gctatggccg tgaagacctg gatgtgctgg gcttgtcctt ccgcaaagac    240

ctgttcatcg ccacctacca ggccttcccc ccggtgccca acccaccccg gccccccacc    300

cgcctgcagg accggctgct gaggaagctg ggccagcatg cccacccctt cttcttcacc    360

ataccccaga atcttccatg ctccgtcaca ctgcagccag gcccagagga tacaggaaag    420

gcctgcggcg tagactttga gattcgagcc ttctgtgcta aatcactaga agagaaaagc    480

cacaaaagga actctgtgcg gctggtgatc cgaaaggtgc agttcgcccc ggagaaaccc    540

ggcccccagc cttcagccga aaccacacgc cacttcctca tgtctgaccg gtccctgcac    600

ctcgaggctt ccctggacaa ggagctgtac taccatgggg agcccctcaa tgtaaatgtc    660

cacgtcacca acaactccac caagaccgtc aagaagatca aagtctctgt gagacagtac    720

gccgacatct gcctcttcag caccgcccag tacaagtgtc ctgtggctca actcgaacaa    780

gatgaccagg tatctcccag ctccacattc tgtaaggtgt acaccataac cccactgctc    840

agcgacaacc gggagaagcg gggtctcgcc ctggatggga aactcaagca cgaggacacc    900

aacctggctt ccagcaccat cgtgaaggag ggtgccaaca aggaggtgct gggaatcctg    960

gtgtcctaca gggtcaaggt gaagctggtg gtgtctcgag gcggggatgt ctctgtggag   1020

ctgccttttg ttcttatgca ccccaagccc cacgaccaca tccccctccc cagaccccag   1080

tcagccgctc cggagacaga tgtccctgtg gacaccaacc tcattgaatt tgataccaac   1140

tatgccacag atgatgacat tgtgtttgag gactttgccc ggcttcggct gaaggggatg   1200

aaggatgacg actatgatga tcaactctgc tag                                1233

<210>4

<211>409

<212>PRT

<213>human embryonic kidney293

<400>4

Met Gly Glu Lys Pro Gly Thr Arg Val Phe Lys Lys Ser Ser Pro Asn

1               5                    10                 15

Cys Lys Leu Thr Val Tyr Leu Gly Lys Arg Asp Phe Val Asp His Leu

            20                  25                  30

Asp Lys Val Asp Pro Val Asp Gly Val Val Leu Val Asp Pro Asp Tyr

        35                  40                  45

Leu Lys Asp Arg Lys Val Phe Val Thr Leu Thr Cys Ala Phe Arg Tyr

    50                  55                  60

Gly Arg Glu Asp Leu Asp Val Leu Gly Leu Ser Phe Arg Lys Asp Leu

65                  70                  75                  80

Phe Ile Ala Thr Tyr Gln Ala Phe Pro Pro Val Pro Asn Pro Pro Arg

                85                  90                      95

Pro Pro Thr Arg Leu Gln Asp Arg Leu Leu Arg Lys Leu Gly Gln His

            100                 105                     110

Ala His Pro Phe Phe Phe Thr Ile Pro Gln Asn Leu Pro Cys Ser Val

        115                 120                     125

Thr Leu Gln Pro Gly Pro Glu Asp Thr Gly Lys Ala Cys Gly Val Asp

    130                 135                    140

Phe Glu Ile Arg Ala Phe Cys Ala Lys Ser Leu Glu Glu Lys Ser His

145                 150                 155                 160

Lys Arg Asn Ser Val Arg Leu Val Ile Arg Lys Val Gln Phe Ala Pro

                165                 170                 175

Glu Lys Pro Gly Pro Gln Pro Ser Ala Glu Thr Thr Arg His Phe Leu

            180                 185                 190

Met Ser Asp Arg Ser Leu His Leu Glu Ala Ser Leu Asp Lys Glu Leu

        195                 200                 205

Tyr Tyr His Gly Glu Pro Leu Asn Val Asn Val His Val Thr Asn Asn

    210                 215                 220

Ser Thr Lys Thr Val Lys Lys Ile Lys Val Ser Val Arg Gln Tyr Ala

225                 230                 235                 240

Asp Ile Cys Leu Phe Ser Thr Ala Gln Tyr Lys Cys Pro Val Ala Gln

                245                 250                 255

Leu Glu Gln Asa Asp Gln Val Ser Pro Ser Ser Thr Phe Cys Lys Val

           260                  265                 270

Tyr Thr Ile Thr Pro Leu Leu Ser Asp Asn Arg Glu Lys Arg Gly Leu

    275                     280                 285

Ala Leu Asp Gly Lys Leu Lys His Glu Asp Thr Asn Leu Ala Ser Ser

290                     295                 300

Thr Ile Val Lys Glu Gly Ala Asn Lys Glu Val Leu Gly Ile Leu Val

305                 310                 315                 320

Ser Tyr Arg Val Lys Val Lys Leu Val Val Ser Arg Gly Gly Asp Val

                 325                330                 335

Ser Val Glu Leu Pro Phe Val Leu Met His Pro Lys Pro His Asp His

            340                 345                 350

Ile Pro Leu Pro Arg Pro Gln Ser Ala Ala Pro Glu Thr Asp Val Pro

        355                 360                 365

Val Asp Thr Asn Leu Ile Glu Phe Asp Thr Asn Tyr Ala Thr Asp Asp

    370                 375                  380

Asp Ile Val Phe Glu Asp Phe Ala Arg Leu Arg Leu Lys Gly Met Lys

385                390                  395                 400

Asp Asp Asp Tyr Asp Asp Gln Leu Cys

                405

<210>5

<211>936

<212>DNA

<213>Renilla reniformis

<400>5

atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg     60

tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa    120

aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg    180

cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga tcttattggt    240

atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat    300

cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat    360

tggggtgctt gtttggcatt tcattatagc tatgagcatc aagataagat caaagcaata    420

gttcacgctg aaagtgtagt agatgtgatt gaatcatggg atgaatggcc tgatattgaa    480

gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc    540

ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca    600

gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct    660

cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggtaaa cctgacgttg tacaaattgt taggaattat    720

aatgcttatc tacgtgcaag tgatgattta ccaaaaatgt ttattgaatc ggatccagga    780

ttcttttcca atgctattgt tgaaggcgcc aagaagtttc ctaatactga atttgtcaaa    840

gtaaaaggtc ttcatttttc gcaagaagat gcacctgatg aaatgggaaa atatatcaaa    900

tcgttcgttg agcgagttct caaaaatgaa caataa                              936

<210>6

<211>311

<212>PRT

<213>Renilla reniformis

<400>6

Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr

1               5                   10                  15

Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser

            20                  25                  30

Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile

        35                  40                  45

Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val

    50                  55                  60

Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly

65                  70                  75                  80

Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp

                85                  90                  95

His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys

            100                 105                 110

Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His

        115                 120                 125

Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu

    130                 135                 140

Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu

145                 150                 155                 160

Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu

                165                 170                 175

Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg

            180                 185                 190

Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu

        195                 200                 205

Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro

    210                 215                 220

Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr

225                 230                 235                 240

Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu

                245                 250                 255

Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys

            260                 265                 270

Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln

        275                 280                 285

Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu

    290                 295                  300

Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln

305                 310

<210>7

<211>687

<212>DNA

<213>Renilla reniformis

<400>7

atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg  60

tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa 120

aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg 180

cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga tcttattggt 240

atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat 300

cttactgcat ggtttgaact tcttaattta ccaaagaaga tcatttttgt cggccatgat 360

tggggtgctt gtttggcatt tcattatagc tatgagcatc aagataagat caaagcaata 420

gttcacgctg aaagtgtagt agatgtgatt gaatcatggg atgaatggcc tgatattgaa 480

gaagatattg cgttgatcaa atctgaagaa ggagaaaaaa tggttttgga gaataacttc 540

ttcgtggaaa ccatgttgcc atcaaaaatc atgagaaagt tagaaccaga agaatttgca 600

gcatatcttg aaccattcaa agagaaaggt gaagttcgtc gtccaacatt atcatggcct 660

cgtgaaatcc cgttagtaaa aggtggt                                     687

<210>8

<211>229

<212>PRT

<213>Renilla reniformis

<400>8

Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr

1               5                   10                  15

Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser

            20                  25                  30

Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile

        35                  40                 45

Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val

    50                  55                  60

Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly

65                  70                  75                  80

Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Ash Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp

                85                  90                  95

His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys

            100                 105                 110

Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala Phe His

        115                 120                 125

Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His Ala Glu

    130                 135                 140

Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu

145                 150                 155                 160

Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu

                165                 170                 175

Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg

            180                 185                 190

Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu

        195                 200                 205

Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro

    210                 215                 220

Leu Val Lys Gly Gly

225

<210>9

<211>249

<212>DNA

<213>Renilla reniformis

<400>9

aaacctgacg ttgtacaaat tgttaggaat tataatgctt atctacgtgc aagtgatgat     60

ttaccaaaaa tgtttattga atcggatcca ggattctttt ccaatgctat tgttgaaggc    120

gccaagaagt ttcctaatac tgaatttgtc aaagtaaaag gtcttcattt ttcgcaagaa    180

gatgcacctg atgaaatggg aaaatatatc aaatcgttcg ttgagcgagt tctcaaaaat    240

gaacaataa                                                            249

<210>10

<211>82

<212>PRT

<213>Renilla reniformis

<400>10

Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg

l               5                   10                  15

Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe

            20                  25                  30

Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu

         35                 40                  45

Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Ser Gln Glu Asp Ala Pro Asp

    50                  55                  60

Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu Arg Val Leu Lys Asn

65                  70                  75                  80

Glu Gln

<210>11

<211>333

<212>DNA

<213>Renilla reniformis

<400>11

atgacttcga aagtttatga tccagaacaa aggaaacgga tgataactgg tccgcagtgg     60

tgggccagat gtaaacaaat gaatgttctt gattcattta ttaattatta tgattcagaa    120

aaacatgcag aaaatgctgt tattttttta catggtaacg cggcctcttc ttatttatgg    180

cgacatgttg tgccacatat tgagccagta gcgcggtgta ttataccaga tcttattggt    240

atgggcaaat caggcaaatc tggtaatggt tcttataggt tacttgatca ttacaaatat    300

cttactgcat ggtttgaact tcttaattta cca    333

<210>  12

<211>    110

<212>  PRT

<213>Renilla reniformis

<400>    12

Met Thr SeT Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr

1    5    10    15

Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser

    20    25    30

Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala ValIle

    35    40    45

Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val

    50    55    60

Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly

65    70    75    80

Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly ASn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp

    85    90    95

His Tyr Lys Tyr LeuThr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu

    100    105    110

<210>13

<211>603

<212>DNA

<213>Renillla reniformis

<400>13

aagaagatca tttttgtcgg ccatgattgg ggtgcttgtt tggcatttca ttatagctat     60

gagcatcaag ataagatcaa agcaatagtt cacgctgaaa gtgtagtaga tgtgattgaa    120

tcatgggatg aatggcctga tattgaagaa gatattgcgt tgatcaaatc tgaagaagga    180

gaaaaaatgg ttttggagaa taacttcttc gtggaaacca tgttgccatc aaaaatcatg    240

agaaagttag aaccagaaga atttgcagca tatcttgaac cattcaaaga gaaaggtgaa    300

gttcgtcgtc caacattatc atggcctcgt gaaatcccgt tagtaaaagg tggtaaacct    360

gacgttgtac aaattgttag gaattataat gcttatctac gtgcaagtga tgatttacca    420

aaaatgttta ttgaatcgga tccaggattc ttttccaatg ctattgttga aggcgccaag    480

aagtttccta atactgaatt tgtcaaagta aaaggtcttc atttttcgca agaagatgca    540

cctgatgaaa tgggaaaata tatcaaatcg ttcgttgagc gagttctcaa aaatgaacaa    600

taa                                                                  603

<210>14

<211>201

<212>PRT

<213>Renillla reniformis

<400>14

Pro Lys Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Cys Leu Ala

1               5                   10             15

Phe His Tyr Ser Tyr Glu His Gln Asp Lys Ile Lys Ala Ile Val His

            20                  25                  30

Ala Glu Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp

        35                   40                 45

Ile Glu Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met

    50                  55                   60

Val Leu Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Met Leu Pro Ser Lys Ile

65                  70                   75                  80

Met Arg Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe

                85                  90                  95

Lys Glu Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu

            100                 105                 110

Ile Pro Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg

        115                 120                  125

Asn Tyr Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Met Phe

    130                 135                 140

Ile Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala

145                 150                 155                 160

Lys Lys Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe

                165                 170                 175

Ser Gln Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe

            180                 185                 190

Val Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln

        195                 200

<210>15

<211>351

<212>DNA

<213>Anacystis nidulans

<400>15

gccgaatatt gtttggcggc agatacagaa gttctgaccg ttgaatatgg cccgatcgcg    60

attggcaaac tagtcgaaga aaatattcgt tgccaagttt attgctgtaa cccagatggc    120

tatatctaca gtcagccgat  tggtcaatgg catcaacgag gtg8acagga agtgattgaa   180

tacgaactca gtgatggtcg catcattcga gcaactgctg accatcgctt tatgactgaa    240

gagggtgaaa tgctgtcgct ggatgaaatc tttgagcgat cgctagaact gaagcagatt    300

ccgacaccat tgttagcgat cgctcagcca tccccgttag cgacggcgta a             351

<210>16

<211>116

<212>PRT

<213>Anacystis nidulans

<400>16

Ala Glu Tyr Cys Leu Ala Ala Asp Thr Glu Val Leu Thr Val Glu Tyr

1               5                   10                  15

Gly Pro Ile Ala Ile Gly Lys Leu Val Glu Glu Asn Ile Arg Cys Gln

            20                  25                  30

Val Tyr Cys Cys Asn Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Ser Gln Pro Ile Gly

        35                  40                  45

Gln Trp His Gln Arg Gly Glu Gln Glu Val Ile Glu Tyr Glu Leu Ser

    50                  55                  60

Asp Gly ArgIle Ile Arg Ala Thr Ala Asp His Arg Phe Met Thr Glu

65                  70                  75                  80

Glu Gly Glu Met Leu Ser Leu Asp Glu Ile Phe Glu Arg Ser Leu Glu

                85                  90                  95

Leu Lys Gln Ile Pro Thr Pro Leu Leu Ala Ile Ala Gln Pro Ser Pro

            100                 105                 110

Leu Ala Thr Ala

        115

<210>17

<211>108

<212>DNA

<213>Anacystis nidulans

<400>17

atggtcaaaa ttgttcggcg gcgttccttg ggtgtgcaac ccgtctacga ccttggcgtg    60

gcaaccgtac ataactttgt gctggccaat ggccttgtgg cctccaac                108

<210>18

<211>36

<212>PRT

<213>Anacystis nidulans

<400>18

Met Val Lys Ile Val Arg Arg Arg Ser Leu Gly Val Gln Pro Val Tyr

1               5                   10                  15

Asp Leu Gly Val Ala Thr Val His Asn Phe Val Leu Ala Asn Gly Leu

            20                  25                  30

Val Ala Ser Asn

        35

<210>19

<211>318

<212>DNA

<213>Nostoc sp.PCC73102

<400>19

gctgaatatt  gtttaagcta tgaaacggaa atattgacag tagaatatgg attattaccg    60

attggtaaaa ttgtagaaaa gcgcatcgaa tgtactgttt atagcgttga taataatgga    120

aatatttata cacaacctgt agcacaatgg cacgatcgcg gagaacaaga ggtgtttgag    180

tattgtttgg aagatggttc attgattcgg gcaacaaaag accataagtt tatgactgtt    240

gatggtcaaa tgttgccaat tgatgaaata tttgaacgtg aattggattt gatgcgggtt    300

gataatttgc cgaattga                                              318

<210>20

<211>105

<212>PRT

<213>Nostoc sp.PCC73102

<400>20

Ala Glu Tyr Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr

1               5                   10                  15

Gly Leu Leu Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr

            20                  25                  30

Val Tyr Ser Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala

        35                  40                  45

Gln Trp His Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu

    50                  55                  60

Asp Gly Ser Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val

65                  70                  75                  80

Asp Gly Gln Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp

                85                  90                  95

Leu Met Arg Val Asp Asn Leu Pro Asn

            100                 105

<210>21

<211>108

<212>DNA

<213>Nostoc sp.PCC73102

<400>21

atgatcaaaa tagccacacg taaatattta ggcaaacaaa atgtctatga cattggagtt    60

gagcgcgacc ataattttgc actcaaaaat ggcttcatag cttctaat                108

<210>22

<211>36

<212>PRT

<213>Nostoc sp.PCC73102

<400>22

Met Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr

1               5                   10                  15

Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe

             20                 25                  30

Ile Ala Ser Asn

        35

<210>23

<211>1419

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

atgaagtcga tcctagatgg ccttgcagat accaccttcc gcaccatcac cactgacctc    60

ctgtacgtgg gctcaaatga cattcagtac gaagacatca aaggtgacat ggcatccaaa   120

ttagggtact tcccacagaa attcccttta acttccttta ggggaagtcc cttccaagag   180

aagatgactg cgggagacaa cccccagcta gtcccagcag accaggtgaa cattacagaa   240

ttttacaaca agtctctctc gtccttcaag gagaatgagg agaacatcca gtgtggggag   300

aacttcatgg acatagagtg tttcatggtc ctgaacccca gccagcagct ggccattgca   360

gtcctgtccc tcacgctggg caccttcacg gtcctggaga acctcctggt gctgtgcgtc   420

atcctccact cccgcagcct ccgctgcagg ccttcctacc acttcatcgg cagcctggcg   480

gtggcagacc tcctggggag tgtcattttt gtctacagct tcattgactt ccacgtgttc   540

caccgcaaag atagccgcaa cgtgtttctg ttcaaactgg gtggggtcac ggcctccttc   600

actgcctccg tgggcagcct gttcctcaca gccatcgaca ggtacatatc cattcacagg   660

cccctggcct ataagaggat tgtcaccagg cccaaggccg tggtggcgtt ttgcctgatg   720

tggaccatag ccattgtgat cgccgtgctg cctctcctgg gctggaactg cgagaaactg   780

caatctgttt gctcagacat tttcccacac attgatgaaa cctacctgat gttctggatc   840

ggggtcacca gcgtactgct tctgttcatc gtgtatgcgt acatgtatat tctctggaag   900

gctcacagcc acgccgtccg catgattcag cgtggcaccc agaagagcat catcatccac   960

acgtctgagg atgggaaggt acaggtgacc cggccagacc aagcccgcat ggacattagg  1020

ttagccaaga ccctggtcct gatcctggtg gtgttgatca tctgctgggg ccctctgctt  1080

gcaatcatgg tgtatgatgt ctttgggaag atgaacaagc tcattaagac ggtgtttgca  1140

ttctgcagta tgctctgcct gctgaactcc accgtgaacc ccatcatcta tgctctgagg  1200

agtaaggacc tgcgacacgc tttccggagc atgtttccct cttgtgaagg cactgcgcag  1260

cctctggata acagcatggg ggactcggac tgcctgcaca aacacgcaaa caatgcagcc  1320

agtgttcaca gggccgcaga aagctgcatc aagagcacgg tcaagattgc caaggtaacc  1380

atgtctgtgt ccacagacac gtctgccgag gctctgtga                         1419

<210>24

<211>472

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>24

Met Lys Ser Ile Leu Asp Gly Leu Ala Asp Thr Thr Phe Arg Thr Ile

1               5                   10                  15

Thr Thr Asp Leu Leu Tyr Val Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Glu Asp

            20                  25                  30

Ile Lys Gly Asp Met Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Phe Pro Gln Lys Phe

        35                  40                  45

Pro Leu Thr Ser Phe Arg Gly Ser Pro Phe Gln Glu Lys Met Thr Ala

    50                  55                  60

Gly Asp Asn Pro Gln Leu Val Pro Ala Asp Gln Val Asn Ile Thr Glu

65                  70                  75                  80

Phe Tyr Asn Lys Ser Leu Ser Ser Phe Lys Glu Asn Glu Glu Asn Ile

                85                  90                  95

Gln Cys Gly Glu Asn Phe Met Asp Ile Glu Cys Phe Met Val Leu Asn

            100                 105                 110

Pro Ser Gln Gln Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Leu Thr Leu Gly Thr

        115                 120                 125

Phe Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Leu Cys Val Ile Leu His Ser

    130                 135                 140

Arg Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Tyr His Phe Ile Gly Ser Leu Ala

145                 150                 155                 160

Val Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val Ile Phe Val Tyr Ser Phe Ile Asp

                165                 170                 175

Phe His Val Phe His Arg Lys Asp Ser Arg Asn Val Phe Leu Phe Lys

            180                 185                 190

Leu Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Thr Ala Ser Val Gly Ser Leu Phe

        195                 200                 205

Leu Thr Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ser Ile His Arg Pro Leu Ala Tyr

    210                 215                 220

Lys Arg Ile Val Thr Arg Pro Lys Ala Val Val Ala Phe Cys Leu Met

225                 230                 235                240

Trp Thr Ile Ala Ile Val Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu Gly Trp Asn

                245                 250                 255

Cys Glu Lys Leu Gln Ser Val Cys Ser Asp Ile Phe Pro His Ile Asp

            260                 265                 270

Glu Thr Tyr Leu Met Phe Trp Ile Gly Val Thr Ser Val Leu Leu Leu

        275                 280                 285

Phe Ile Val Tyr Ala Tyr Met Tyr Ile Leu Trp Lys Ala His Ser His

    290                 295                 300

Ala Val Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile Ile Ile His

305                 310                 315                 320

Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Gln Val Thr Arg Pro Asp Gln Ala Arg

                325                 330                335

Met Asp Ile Arg Leu Ala Lys Thr Leu Val Leu Ile Leu Val Val Leu

            340                 345                 350

lle Ile Cys Trp Gly Pro Leu Leu Ala Ile Met Val Tyr Asp Val Phe

        355                 360                 365

Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile Lys Thr Val Phe Ala Phe Cys Ser Met

    370                 375                 380

Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Leu Arg

385                 390                 395                 400

Ser Lys Asp Leu Arg His Ala Phe Arg Ser Met Phe Pro Ser Cys Glu

                405                 410                 415

Gly Thr Ala Gln Pro Leu Asp Asn Ser Met Gly Asp Ser Asp Cys Leu

            420                 425                 430

His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala Ala Glu Ser

        435                 440                 445

Cys Ile Lys Ser Thr Val Lys Ile Ala Lys Val Thr Met Ser Val Ser

    450                 455                 460

Thr Asp Thr Ser Ala Glu Ala Leu

465                 470

Claims (9)

1.一种新型的G蛋白偶联受体细胞水平筛选系统，所述筛选系统由HEK293细胞或CHO细胞构建，含有来自以下序列中不同组间基因序列构建的2种融合表达载体：第1组：(1)DnaE基因的C端与报告基因的C端的拼接序列：DnaE-C-Report-C，(2)DnaE基因的N端与报告基因的N端的拼接序列：Report-N-DnaE-N；第2组：①GPCR基因，②β-arrestin基因；其中，所述报告基因为用于检测的有活性的酶基因或可发光的蛋白基因。

2.如权利要求1所述的筛选系统，其特征在于所述筛选系统由如下方法构建得到：

(1)将DnaE基因的C端与报告基因的C端拼接，所得拼接序列DnaE-C-Report-C与GPCR基因或β-arrestin基因融合表达，获得融合表达载体I-1或I-2；

(2)将DnaE基因的N端与报告基因的N端拼接，所得拼接序列Report-N-DnaE-N与β-arrestin基因或GPCR基因融合表达，获得融合表达载体II-1或II-2；

(3)将融合表达载体I-1和II-1、或融合表达载体I-2和II-2共转染HEK293细胞或CHO细胞，得到所述筛选系统。

3.一种构建如权利要求1所述筛选系统的方法，其特征在于，所述方法如下：

(1)将DnaE基因的C端与报告基因的C端拼接，所得拼接序列DnaE-C-Report-C与GPCR基因或β-arrestin基因融合表达，获得融合表达载体I-1或I-2；

(2)将DnaE基因的N端与报告基因的N端拼接，所得拼接序列Report-N-DnaE-N与β-arrestin基因或GPCR基因融合表达，获得融合表达载体II-1或II-2；

(3)将融合表达载体I-1和II-1、或融合表达载体I-2和II-2共转染HEK293细胞或CHO细胞，得到所述筛选系统。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)构建含有GPCR基因的质粒i：pCMV-flag-GPCR gene；将DnaE基因的C端：DnaE-C与报告基因的C端：Report-C拼接，在DnaE-C与Report-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，在DnaE-C的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到DnaE-C-Report-C，将DnaE-C-Report-C插入到质粒i中，获得融合表达载体I：pCMV-flag-GPCR gene-DnaE-C-Report-C；

(2)构建含有β-arrestin基因的质粒ii：pCDNA-β-arrestin gene；将DnaE基因的N端：DnaE-N与报告基因的N端：Report-N拼接，在DnaE-N与之间加入GS两个氨基酸序列，在Report-N的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到Report-N-DnaE-N，将Report-N-DnaE-N插入到质粒ii中，获得融合表达载体II：pCDNA-β-arrestin gene-Report-N-DnaE-N；

(3)将融合表达载体I和融合表达载体II共转染HEK293细胞或CHO细胞，获得所述筛选系统。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)构建含有GPCR基因的质粒i：pCMV-flag-GPCR gene；将DnaE基因的N端：DnaE-N与报告基因的N端：Report-N拼接，在DnaE-N与之间加入GS两个氨基酸序列，在Report-N的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到Report-N-DnaE-N，将Report-N-DnaE-N插入到质粒i中，获得融合表达载体I：pCMV-flag-GPCR gene-Report-N-DnaE-N；

(2)构建含有β-arrestin基因的质粒ii：pCDNA-β-arrestin gene；将DnaE基因的C端：DnaE-C与报告基因的C端：Report-C拼接，在DnaE-C与Report-C之间加入CFNGT 5个氨基酸序列，在DnaE-C的N端连接一个氨基酸序列为GGGGSG的GC linker，得到DnaE-C-Report-C，将DnaE-C-Report-C插入到质粒ii中，获得融合表达载体II：pCDNA-β-arrestin gene-DnaE-C-Report-C；

(3)将融合表达载体I和融合表达载体II共转染HEK293细胞或CHO细胞，获得所述筛选系统。

6.如权利要求3～5之一所述的方法，其特征在于所述报告基因为下列之一：①绿色荧光蛋白基因、②红色荧光蛋白基因、③Renilla荧光素酶基因、④Firefly荧光素酶基因、⑤碱性磷酸酶基因、⑥Bete-内酰胺酶基因、⑦LacZ基因。

7.如权利要求3～5之一所述的方法，其特征在于所述DnaE基因来自蓝球藻Anacystis nidulans R2 PCC7942或点状念株藻Nostoc punctiformePCC73102。

8.如权利要求3～5之一所述的方法，β-arrestin基因为β-arrestin-1或β-arrestin-2。

9.如权利要求1所述的筛选系统在检测GPCR配体与GPCR结合活性中的应用，所述GPCR配体为烟酸，所述GPCR为HM74a。

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