CN102839193A - 一种g蛋白偶联受体对化合物特异性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种G蛋白偶联受体对化合物特异性的检测方法,该方法包括以下步骤:制备重组HEK-293细胞悬液;在细胞悬液中加入腔肠素,得到重组细胞液;将重组细胞液分为对照组和待测组,在待测组中加入待测化合物溶液,在对照组中加入Hank's平衡盐溶液;若待测组发出的荧光信号强度高于对照组,具有显著差异,则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有激活作用,反之则无;继续在待测组中加入GPCR相应的激动剂,检测其荧光信号;若检测到的荧光信号强度显著低于对照组,则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有抑制作用,反之则无。本发明所提供的方法是一种灵活可变的检测模式,不但可以通过已知GPCR来检测未知化合物,而且可以通过已知化合物来反向检测与其特异性结合的GPCR。
Description
技术领域
本发明涉及一种G蛋白偶联受体对化合物特异性的检测方法。
背景技术
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是一类含有7个跨膜α螺旋的膜蛋白,是人类细胞膜表面最大的受体家族。在人类的基因组中约有800个基因编码GPCR蛋白。当膜外的配体作用于GPCR受体时,该受体的膜内部分与G蛋白结合,从而激活G蛋白。G蛋白通过多种信号传导途径将细胞外信号传递至细胞内,对生长发育、生殖、免疫、神经传导、代谢以及行为都有重要的调控作用。
GPCR配体种类非常广泛,涵盖了味觉、嗅觉、光、金属离子、生物胺、脂肪酸、甾体等类别。约有80%的激素、神经肽和神经调节物质的信号传递都是由GPCR蛋白介导。GPCR与人类的各类疾病(包括心血管疾病、胃肠道疾病、神经系统疾病、免疫疾病以及肿瘤的诱发和扩散等)密切相关。世界各大制药公司目前都在积极开发以GPCR为靶点的药物。近20年来,被美国FDA批准上市的药物中,40%~50%是针对GPCR作为靶标的药物。
GPCR介导的信号传导主要有以下几种途径:
一、由第二信使cAMP介导的信号通路。激动型G蛋白(Stimulatory Gprotein,Gs)偶联受体与其特异配体结合后,激活腺苷酸环化酶(AC)活性;而抑制型G蛋白(Inhibitory G protein,Gi)偶联受体与配体结合后,抑制AC的活性。AC可催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)转变成环腺嘌呤核苷三磷酸(cAMP),从而引起一系列的细胞生物活动,如:打开离子通道,激活蛋白激酶A(PKA)等(见图1虚线左侧示意图)。
目前,基于cAMP信号传导的化合物特异性检测方法主要是通过检测cAMP浓度的变化来判断化合物是否激活GPCR信号通路。cAMP浓度的变化一般通过荧光共振能量转移(FRET)的方法来测定。该测定方法价钱昂贵,且抑制型GPCR信号通路试验常常会伴随太强的干扰信号。
第二、由IP3介导的信号通路。Gq/11蛋白(与磷酸脂酶C活化相关G蛋白)偶联受体与配体结合后会激活β磷酸脂酶C(PLC-β),PLC-β裂解其底物PIP2生成IP3和DAG。IP3浓度的增加刺激内质网释放钙离子,导致细胞质内钙离子浓度迅速增加;同时非极性的1,2-DAG在质膜上激活蛋白激酶C(PKC),使细胞内相关蛋白质磷酸化,从而起到调节这些蛋白质的活性的作用(见图1虚线左侧示意图)。
基于IP3信号传导原理的化合物特异性检测方法主要通过检测钙离子浓度的瞬时变化来检测。钙离子浓度的测定方法一般需要荧光标记的钙离子浓度指示剂,主要包括化学合成的荧光指示剂和通过生物体表达的荧光指示剂。测定方法包括钙敏发光蛋白水母素测定法、β-arrestin发光共振能量转移测定法(FRET)、钙离子染色法(FLIPR)等。
除以上两种GPCR信号传导途径外,还有少部分信号通路是通过G12/13蛋白偶联受体传导的。
以上不同类型GPCR对化合物的检测方法只能针对某一类型的GPCR信号通路,不能同时适用于其它的GPCR信号通路。并且,以上常规的GPCR化合物特异性检测方法通常需要构建稳定的细胞株,而构建稳定的细胞株耗时耗力。少数公司和科研机构利用形态学电阻抗原理对GPCR信号进行检测,但这类技术成本极其昂贵,常规客户难以承受。因此,在GPCR化合物特异性检测服务市场上,对低成本、高效率的检测方法有巨大的需求。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷,本发明的首要目的在于提供一种重组的HEK-293细胞的制备方法,该制备方法是利用瞬时转染技术将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒和水母发光蛋白质粒共转染HEK-293细胞。
本发明的第二目的在于提供由上述方法制备得到的重组的HEK-293细胞。
本发明的第三目的在于提供上述重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用:一是用一种GPCR检测多种未知的化合物,以检测出与该GPCR能特异性结合的化合物;二为用一种化合物检测多种GPCR,以检测出能与该化合物特异性结合的GPCR。本发明的GPCR化合物特异性检测方法不需要构建稳定的细胞株,且能将细胞内复杂多变的GPCR信号通路统一为钙离子传导的GPCR信号通路,适用于所有GPCR信号通路的检测,检测的灵敏度高、周期短、成本低。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种重组的HEK-293细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备HEK-293细胞悬液:将HEK-293细胞分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到HEK-293细胞悬液;
(2)制备质粒混合物:将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比3:1:1加入到无血清培养基中,得到GPCR质粒混合物;
(3)配制转染复合物:将聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)加入到无血清培养基中,得到PEI试剂;聚乙烯亚胺的质量是水母发光蛋白质粒质量的2~10倍;
(4)将GPCR质粒混合物与PEI试剂混合均匀,室温静置5~15分钟,得到转染复合物;
(5)转染HEK-293细胞:将转染复合物加入到HEK-293细胞悬液中,悬浮培养48~72小时,得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞;
步骤(1)所述的悬浮培养是悬浮培养24~48小时,所述的HEK-293细胞悬液中HEK-293细胞的浓度为104~106/mL;
步骤(2)所述的GPCR质粒为质粒GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EP1、EP4、EP3、A1、GRPR、HTR4、HRH1、ENDO、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β2、NK1、NMBR、B1、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSR1、UTR2、V1A、MTLR、FPR1、IP、LPAR3、LPAR2或HTR2A中的一种;
步骤(1)-(3)中所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加了0.05%(质量体积比)的F-68试剂;
步骤(1)和(5)所述悬浮培养的条件是37℃、5%CO2、100~200rpm悬浮振荡培养。
由上述方法制备得到的重组的HEK-293细胞可以用于GPCR化合物特异性检测。
上述重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用,具体包括以下步骤:
(1)将重组的HEK-293细胞分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液;
(2)往步骤(1)的重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素(Coelenterazine),腔肠素与重组HEK-293细胞悬液的体积比为1:(1000~2000),悬浮培养30分钟后得到重组细胞液;
(3)用Hank's平衡盐溶液(Hank's Balanced Salt Solution,HBSS)稀释待测化合物,得到待测化合物溶液;
(4)将重组细胞液分为对照组和待测组,往待测组中加入待测化合物溶液,往对照组中加入Hank's平衡盐溶液;
(5)GPCR激活实验:检测对照组和待测组中重组的HEK-293细胞发出的荧光信号;若待测组发出的荧光信号强度高于对照组,则说明该待测化合物对所检测的GPCR有激活作用,反之则无;
(6)GPCR抑制实验:再往步骤(5)的待测组和对照组中加入GPCR相应的激动剂,检测其荧光信号;则对照组有相应的信号激活,若检测到的待测组荧光信号强度低于对照组的50%,则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有抑制作用,反之则无;
上述步骤中的重组的HEK-293细胞和待测化合物,是含有单一GPCR质粒的重组的HEK-293细胞与多种待测化合物,用于检测出能与该GPCR特异性结合的特异性化合物;或者是含有不同GPCR质粒的多种重组的HEK-293细胞与一种待测化合物,用于检测出能与该化合物特异性结合的GPCR种类;
步骤(1)所述的悬浮培养是悬浮培养24~48小时,所述的重组HEK-293细胞悬液中重组的HEK-293细胞的浓度为104~106/mL;
步骤(1)中所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加了0.05%(质量体积比)的F-68试剂;
步骤(1)和(2)所述悬浮培养的条件是37℃、5%CO2、100~200rpm悬浮振荡培养;
步骤(4)所述的重组细胞液与待测化合物溶液的体积比为2:1。
本发明将重组的HEK-293细胞用于GPCR化合物特异性检测的原理是:
重组的HEK-293细胞能表达GPCR蛋白于细胞膜上,表达的GPCR受体蛋白能特异性识别其相应的激动剂(或拮抗剂)而激活(或抑制)细胞内G蛋白信号通路。G蛋白突变体质粒也被转染进293细胞中,细胞固有的G蛋白含量忽略不计,而G蛋白突变体只能介导钙离子信号通路,故而能将多样性的第二信使统一为钙离子第二信使(见图1虚线右侧部分的BeaverBio Pathway)(附图1中并没有这个Pathway的说明)。转染进细胞的水母发光蛋白质粒表达水母发光蛋白前体蛋白,这种蛋白与之后添加的腔肠素结合成为激发态的水母发光蛋白,此蛋白能捕捉钙离子,并释放出466nm蓝色荧光,通过检测发光信号来检测钙离子的释放量,从而检测化合物对GPCR的激动或抑制作用。
本发明相对于现有技术具有以下的优点及效果:
1、本发明通过构建高效瞬时共转染细胞体系(即重组的HEK-293细胞),把细胞内复杂多变的GPCR信号通路统一为钙离子传导的G蛋白信号通路,简化工作流程,节约时间。
2、本发明采用HEK-293细胞株作为质粒转染的宿主细胞,成功避开传统耗时费力的稳定传代细胞株的建立,降低产品周期和成本,提高生产效率。
3、本发明采用一种独特设计的水母自发光检测体系,信噪比高,可重复行好,避开荧光检测方法中需要激发光的弊端。
4、本发明所提供的方法是一种灵活可变的检测模式,不但可以通过已知GPCR来检测未知化合物,而且可以通过已知化合物来反向检测与其特异性结合的GPCR。
5、本发明所提供的方法允许单个或多个剂量反应的研究,并且,该检测方法有能力识别各类化合物,包括完全激动剂、部分激动剂、拮抗剂或异构调节剂;总之,本发明提供的方法能将化合物的检测时间从数月缩短至三到四天,且不需要昂贵的检测仪器与试剂,成本低,效率高。
附图说明
图1是GPCR信号通路示意图。虚线左侧是两种常见的GPCR信号通路示意图,一种是cAMP介导的信号通路,另一种是IP3介导的钙离子信号通路;虚线右侧是本发明的信号通路示意图(BeaverBio GPCR特异性检测信号通路),即利用高效瞬时共转染细胞体系(重组的HEK-293细胞)将多样性的第二信使统一为钙离子传导的信号通路。当激活剂与GPCR结合时时,细胞内的IP3浓度增高,刺激细胞内质网释放钙离子。水母发光蛋白能捕捉钙离子而发出荧光信号;当抑制剂抑制GPCR信号通路时,钙离子释放减少,从而抑制水母发光蛋白发出荧光信号。图中“→”表示促进作用,表示抑制作用。
图2是多个浓度的P物质激活NK1受体的荧光信号图。
图3是P物质激活NK1受体的剂量效应图。
图4是利坦舍林抑制试验的GPCR特异性检测图谱;其中,AEQ组为只转染水母发光蛋白质粒的实验组,Gα16和Gqs5组为只转染G蛋白突变体质粒和水母发光蛋白质粒的实验组;其他40组为转染G蛋白突变体质粒、水母发光蛋白质粒、相应GPCR质粒的实验组;“+”表示待测组,“-”表示阴性对照组。
图5是利坦舍林抑制HTR4和HTR2A受体的柱形信号图。
图6是多个浓度的利坦舍林抑制HTR4和HTR2A受体的荧光信号图;第一排图片是不同浓度梯度利坦舍林的作用下HTR4信号通路的荧光信号图;第二排图片是不同浓度梯度利担舍林的作用下HTR2A信号通路的荧光信号图。
图7是多巴胺激活GPCR的柱形信号图。
具体实施案例
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
P物质(Substance P)激活速激肽受体(NK1)的剂量效应检测
P物质是广泛分布于神经纤维细胞间的一种神经肽,为NK1受体的天然激动剂,其主要作用是传递痛觉信息,参与感觉、运动、情绪等的调节,也与焦虑证、抑郁症、精神分裂症等发病机理相关。
表达NK1的重组HEK-293细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备HEK-293细胞悬液:将HEK-293细胞(购于ATCC;下同)以6×105cells/mL的浓度悬浮培养于含0.05%(质量体积比;下同)F-68(购于Sigma-Aldrich;下同)的Free Style 293培养基(购于Life Technologies公司;下同)中,于37℃、5%CO2环境下,160rpm悬浮振荡培养24小时;
(2)制备质粒混合物:将NK1质粒(购于Missouri S&T cDNA ResourceCenter;下同)、G蛋白突变体质粒(购于Missouri S&T cDNA Resource Center;下同)、水母发光蛋白质粒(购于PerkinElmer公司;下同)按质量比3/1/1(单位:0.1μg/mL细胞悬液)加入到50μL含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,得到NK1质粒混合物;
(3)配制转染复合物:将聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI,购于PolyPlus-transfection公司;下同)以水母发光蛋白质粒2倍质量的量加入到50μL无血清培养基中,得到PEI试剂;
(4)将NK1质粒混合物与PEI试剂混合均匀,室温静置10分钟,得到转染复合物;
(5)转染HEK-293细胞:将100μL转染复合物加入到步骤(1)的HEK-293细胞悬液中,并将细胞液置于37℃、5%CO2中160rpm悬浮振荡培养72小时,得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞。
表达NK1的重组HEK-293细胞用于P物质的剂量效应检测,包括以下步骤:
(1)将重组的HEK-293细胞分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液;所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加了0.05%的F-68试剂;
(2)在重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素(Coelenterazine,购于LifeTechnologies公司;下同),重组HEK-293细胞悬液与腔肠素的体积比为1:2000,再置于培养箱中培养30分钟,得到重组细胞液;
(3)用HBSS(购于Life Technologies公司;下同)将P物质(Substance P,购于PHOENIX PHARMACEUTICALS,INC;下同)分别稀释成10-4μM、10-5μM、10-6μM、10-7μM、10-8μM、10-9μM、10-10μM的浓度梯度。
(4)实验时将50μL不同浓度的P物质液分别加入到100μL重组细胞液中;另设一对照组,100μL的重组细胞液中加入50μL的Hank's平衡盐溶液。检测细胞发出的荧光信号(应用Graphpad Prism软件分析不同浓度的P物质产生的荧光信号)。
(5)P物质激活实验结果分析:
荧光信号图见图2所示,随P物质浓度增加,细胞的信号峰渐强。其中对照组的图谱为加入50μL的Hank's平衡盐溶液,也即P物质的浓度为0uM时的荧光信号图。将各浓度的荧光信号值绘制剂量效应曲线,如图3所示。随着P物质浓度增加,各组细胞液发出的荧光信号逐渐增强,其中P物质的EC50的值为0.05965pM。
实验结果表明:P物质可特异性地激活NK1受体,且P物质与NK1受体有良好的剂量效应关系:在低浓度P物质溶液的作用下,重组HEK-293细胞发出的荧光信号弱,随着P物质浓度增加,荧光信号也相应地增强。
实施例2
检测与利坦舍林(Ritanserin)特异性结合的GPCR
利坦舍林为5-羟色胺受体(5-HTR,一种G蛋白偶联受体)的阻断剂,对5-HTR有选择性阻滞作用。在外周组织,5-THR介导血管收缩和平滑肌的收缩,是应对5-羟色胺(5-HT)引起的血管收缩和支气管痉孪的有效拮抗剂,有降低高血压的作用。
表达不同种类GPCR的重组HEK-293细胞的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备HEK-293细胞悬液:将HEK-293细胞以6×105cells/mL的浓度悬浮培养于含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,于37℃、5%CO2环境下,160rpm悬浮振荡培养24小时;
(2)制备质粒混合物:分别将不同的GPCR质粒(总共40种,分别为GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EP1、EP4、EP3、A1、GRPR、HTR4、HRH1、ENDO、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β2、NK1、NMBR、B1、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSR1、UTR2、V1A、MTLR、FPR1、IP、LPAR3、LPAR2,均购于Missouri S&T cDNA ResourceCenter;下同)与G蛋白突变体质粒、水母发光蛋白质粒按质量比3/1/1(单位:0.1μg/ml细胞悬液)加入到50μL含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,得到40种GPCR质粒混合物;
将水母发光蛋白质粒加入到含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,使培养基中水母发光蛋白质粒的浓度为0.1μg/mL,得到表达水母发光蛋白的质粒混合物;
将G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比1/1(单位:0.1μg/ml细胞悬液)加入到50μL含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,得到表达G蛋白突变体和水母发光蛋白的质粒混合物。
(3)配制转染复合物:将聚乙烯亚胺以发光蛋白质粒2倍质量的量加入到50μL无血清培养基中,得到PEI试剂;将步骤(2)得到的40种质粒混合物分别与PEI试剂混合均匀,室温静置10分钟,得到转染复合物;
(4)转染HEK-293细胞:将100μL转染复合物滴入HEK-293细胞悬液中,并将细胞液置于37℃、5%CO2,160rpm悬浮振荡培养72小时,得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞、只转染了水母发光蛋白质粒(AEQ)的重组HEK-293细胞、同时转染了G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒的重组HEK-293细胞。
利坦舍林GPCR特异性检测方法,包括以下步骤:
(1)将40种重组的HEK-293细胞分别分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液;所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加了0.05%的F-68试剂;
(2)在重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素,重组HEK-293细胞悬液与腔肠素的体积比为1:2000,再置于37℃、5%CO2培养箱中160rpm悬浮振荡培养30分钟,得到重组细胞液;
(3)用HBSS稀释利坦舍林(Ritanserin,购于R&D Systems;下同)的终浓度为10nM,
(4)实验时将步骤(2)所得到的各种重组细胞液分成两组,一组为阴性对照组,一组为待测组,每组100μL。将利坦舍林溶液50μL加入到待测组中,检测细胞发出的荧光信号。将50μL HBSS加入到阴性对照组中,检测细胞发出的荧光信号。
(5)在步骤(4)的基础上,往待测组和阴性对照组中分别加上相应的GPCR激动剂,检测细胞发出的荧光信号。各个激动剂的终浓度分别是该激动刚好能激活80%信号时该激动剂的浓度(EC80)。
各种GPCR对应的激动剂解释如下:GAL2的激动剂是促生长激素神经肽(Galanin,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);LTD4R2和LTD4R1的激动剂是白细胞三烯(LTD4,购于CAYMAN CHEMICAL COMPANY);HRH2和HRH1的激动剂是组胺(Histamine,购于Sigma-Aldrich);GCGR的激动剂是高血糖素(Glucagon,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);SST2和SST5的激动剂是生长激素抑制素(Somatostatin,购于PHOENIXPHARMACEUTICALSINC.);EP1、EP3和EP4的激动剂是前列腺素E2(Prostaglandin E2,购于CAYMAN CHEMICAL COMPANY);A1的激动剂是腺苷(Adenosine,购于Sigma-Aldrich);GRPR和NMBR的激动剂是铃蟾肽(Bombesin,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);HTR4和HTR2A的激动剂是血清素(Serotonin,购于TOCRIS BIOSCIENCE);ENDO的激动剂是内皮素(ET-1,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);MCHR2的激动剂是黑色素激素(MCH,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);M3和M1的激动剂是卡巴胆碱(Carbamoylcholine,购于Sigma-Aldrich);PTH1R的激动剂是甲状旁腺激素(PTH,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);D2和D1的激动剂是多巴胺(Dopamine,购于Sigma-Aldrich);FP和TP的激动剂是化合物U46619(购于CAYMAN CHEMICAL COMPANY);β2的激动剂是异丙肾上腺素(Isoprenaline,购于Sigma-Aldrich);NK1的激动剂是P物质(Substance P,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);B1的激动剂是缓激肽(Bradykinin,购于TOCRIS BIOSCIENCE);ADRA1A的激动剂是去氧肾上腺素(Phenylephrine,购于TOCRIS BIOSCIENCE);EDG3的激动剂是鞘氨醇-1-磷酸(S1P,购于CAYMAN CHEMICAL COMPANY);OXTR的激动剂是后叶催产素(Oxytocin,购于Sigma-Aldrich);E2、LPAR3和LPAR2是脂蛋白(LPA,购于CAYMAN CHEMICAL COMPANY);NTSR1的激动剂是神经降压素(Neurotensin,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);UTR2的激动剂是乌洛滕生Ⅱ(Urotensin Ⅱ,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);V1A的激动剂是后叶加压素(AVP,购于PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.);MTLR 的激动剂是促胃动素(Motilin,购于PHOENIXPHARMACEUTICALSINC.);FPR1的激动剂是化合物FPR A14(购于TOCRISBIOSCIENCE);IP的激动剂是伊洛前列素(Iloprost,购于TOCRISBIOSCIENCE)。
(6)分析结果
利坦舍林激活实验:在加入50μl利坦舍林之后,各GPCR待测组均无典型的荧光信号峰,与阴性对照组无显著区别。表明化合物利坦舍林对GPCR并没有特异性激活作用。
利坦舍林抑制实验:在加入相应的激动剂后,各GPCR待测组的荧光信号见图4。其中不表达GPCR的各实验组(AEQ组、Gα16、Gqs5组)为实验中的本底对照,无典型的荧光信号峰,表明实验运行正常。表达GPCR的各阴性对照组的图谱中倶有典型的荧光信号峰。待测组各组除了HTR2A和HTR4两个实验组的信号比相应的阴性对照组低外,其他各GPCR组与其相应的阴性对照组的信号峰无显著差别。
各GPCR的待测组荧光信号强度除以阴性对照组的荧光信号强度,得到一系列数值,结果制作成柱形图,即图5。图5中红色椭圆圈标记的两个GPCR(HTR2A和HTR4)反应的相对信号值显著低于对照组,其中HTR4的信号仅为对照组的40.79%,HTR2A的信号仅为对照组的20.61%。即只有HTR4和HTR2A待测组信号显著低于阴性对照组,其余各GPCR的检测组与对照组无显著差别。
以上结果表明利坦舍林(Ritanserin)对HTR4和HTR2A的信号通路有选择性抑制作用。注:HTR4和HTR2A为5-HTR的两个亚型。
实施例3
利坦舍林(Ritanserin)抑制5HTR受体的剂量效应检测
表达HTR4和HTR2A的重组HEK-293HEK-293细胞的制备步骤,如下:
(1)制备HEK-293细胞悬液:将HEK-293细胞以6×105cells/ml的浓度悬浮分散培养于含0.05%F-68的Free Style 293培养基中,37℃、5%CO2、160rpm悬浮振荡培养24小时。
(2)制备质粒混合物:将HTR4质粒、G蛋白突变体质粒、水母发光蛋白质粒按质量比3/1/1(单位:0.1μg/mL细胞悬液)加入到含0.05%F-68的Free Style293培养基中,得到HTR4组的质粒混合物;HTR2A组的质粒混合物的制备方法同HTR4组;
(3)配制转染复合物:将聚乙烯亚胺以发光蛋白质粒的2倍质量的量加入到50μL无血清培养基中,得到PEI试剂;将步骤(2)的2种质粒混合物与PEI试剂混合均匀,室温静置10分钟,得到2种转染复合物;
(4)转染HEK-293细胞:将步骤(3)的2种转染复合物各100μL分别加入到HEK-293细胞悬液中,并将细胞液置于37℃、5%CO2中160rpm悬浮振荡培养72小时,分别得到2种转染了三种质粒的重组HEK-293细胞。
利坦舍林GPCR特异性检测方法,包括以下步骤:
(1)将2种重组的HEK-293细胞分别分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到2种重组HEK-293细胞悬液;所述的无血清培养基是在Free Style 293培养基中添加了0.05%的F-68试剂;
(2)往重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素,重组HEK-293细胞悬液与腔肠素的体积比为1:2000,再置于培养箱中培养30分钟,得到2种重组细胞液;
(3)用HBSS将利坦舍林稀释成1μM,300nM,100nM,30nM,10nM,3nM,1nM的浓度梯度。
(4)将各浓度的利坦舍林液50μL分别加入到100μL的重组细胞液中。
(5)将10nM血清素(Serotonin)加入到步骤(4)的重组细胞液中,检测细胞发出的荧光信号。
(6)利坦舍林抑制实验分析结果:
加入10nM血清素后各浓度组细胞的荧光信号图见图6,第一排图片是各个浓度利坦舍林的作用下HTR4信号通路的荧光信号图;第二排图片是在各个浓度利担舍林的作用下HTR2A信号通路的荧光信号图。在低浓度利坦舍林溶液的作用下,重组HEK-293细胞的荧光信号无显著影响;随着利坦舍林溶液浓度增加,细胞发出的荧光信号也相应降低,其抑制强度也逐渐加强。
以上结果表明利坦舍林对HTR4和HTR2A信号通路的抑制作用具有剂量效应关系,进一步证明了利坦舍林液可以特异性抑制由HTR4或HTR2A通路的信号传导。
实施例4
多巴胺(Dopamine)的GPCR检测
化合物多巴胺为GPCR中的多巴胺受体(Dopamine receptor)激动剂。多巴胺是一种神经传导物质,用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。这种脑内分泌物主要负责大脑的情欲,感觉,将兴奋及开心的信息传递,一些疾病如帕金森病(PD)、精神分裂症、Tourette综合征(TS)、注意缺陷多动障碍(ADHD)等均与多巴胺神经递质传递障碍有关。
表达各GPCR的重组HEK-293细胞,其制备方法同实施例2重组HEK-293细胞的制备方法。
多巴胺GPCR特异性检测方法,包括以下步骤:
(1)将40种重组的HEK-293细胞分别分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液;所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加了0.05%的F-68试剂;
(2)往重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素,重组HEK-293细胞悬液与腔肠素的体积比为1:2000,再置于37℃、5%CO2培养箱中160rpm悬浮振荡培养30分钟,得到重组细胞液;
(3)用HBSS将多巴胺稀释成10μM。
(4)将步骤(2)所得到的各种重组细胞液分成两组,一组为阴性对照组,一组为待测组,每组100μL。将多巴胺(购于Sigma-Aldrich)溶液50μL加入到待测组中,检测细胞发出的荧光信号。将50μL HBSS加入到阴性组中,检测细胞发出的荧光信号。
(5)多巴胺激活实验分析结果:
各阴性对照组均无典型的荧光信号峰。除D1和D2(多巴胺受体的两个亚型)待测组有典型的信号峰,其余各待测组与其相应的阴性对照组一样,无典型的荧光信号峰。将各GPCR的待测组荧光信号强度除以阴性对照组的荧光信号强度,得到的一系列的数值制作成柱形图,即图7。结果显示只有转染了D1和D2的重组HEK-293细胞能有典型的荧光信号峰,而转染其它GPCR的重组HEK-293细胞在多巴胺的作用下无典型的荧光信号峰,由此可结论多巴胺只能特异性激活自身对应受体D1和D2,而不能激活40个待测GPCR中其他GPCR的信号传导。
本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种重组的HEK-293细胞的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将HEK-293细胞分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到HEK-293细胞悬液;
(2)将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比3:1:1加入到无血清培养基中,得到GPCR质粒混合物;
(3)将聚乙烯亚胺加入到无血清培养基中,得到PEI试剂;聚乙烯亚胺的质量是水母发光蛋白质粒质量的2~10倍;
(4)将GPCR质粒混合物与PEI试剂混合均匀,室温静置5~15分钟,得到转染复合物;
(5)将转染复合物加入到HEK-293细胞悬液中,悬浮培养48~72小时,得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞。
2.根据权利要求1所述的重组的HEK-293细胞的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述的悬浮培养是悬浮培养24~48小时,所述的HEK-293细胞悬液中HEK-293细胞的浓度为104~106/mL。
3.根据权利要求1所述的重组的HEK-293细胞的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述的GPCR质粒为质粒GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EP1、EP4、EP3、A1、GRPR、HTR4、HRH1、ENDO、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β2、NK1、NMBR、B1、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSR1、UTR2、V1A、MTLR、FPR1、IP、LPAR3、LPAR2或HTR2A中的一种。
4.根据权利要求1所述的重组的HEK-293细胞的制备方法,其特征在于:步骤(1)-(3)中所述的无血清培养基是在Free Style 293培养基中添加质量体积比为0.05%的F-68试剂。
5.一种重组的HEK-293细胞,其特征在于:是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。
6.权利要求5所述的重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用,其特征在于包括以下步骤:
(1)将权利要求5所述的重组的HEK-293细胞分散于无血清培养基中,悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液;
(2)往步骤(1)的重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素,腔肠素与重组HEK-293细胞悬液的体积比为1:(1000~2000),悬浮培养30分钟后得到重组细胞液;
(3)用Hank's平衡盐溶液稀释待测化合物,得到待测化合物溶液;
(4)将重组细胞液分为对照组和待测组,往待测组中加入待测化合物溶液,往对照组中加入Hank's平衡盐溶液;
(5)检测对照组和待测组中重组的HEK-293细胞发出的荧光信号;若待测组发出的荧光信号强度高于对照组,则说明该待测化合物对所检测的GPCR有激活作用,反之则无;
(6)再往步骤(5)的待测组和对照组中加入GPCR相应的激动剂,检测其荧光信号;则对照组有相应的信号激活,若检测到的待测组荧光信号强度低于对照组的50%,则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有抑制作用,反之则无;
上述步骤中的重组的HEK-293细胞和待测化合物,是含有单一GPCR质粒的重组的HEK-293细胞与多种待测化合物;或者是含有不同GPCR质粒的多种重组的HEK-293细胞与一种待测化合物。
8.根据权利要求7所述的重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用,其特征在于:步骤(1)中所述的无血清培养基是:在Free Style 293培养基中添加质量体积比为0.05%的F-68试剂。
9.根据权利要求7所述的重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用,其特征在于:步骤(1)所述的悬浮培养是悬浮培养24~48小时,所述的重组HEK-293细胞悬液中重组的HEK-293细胞的浓度为104~106/mL。
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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