CN1761879A - 测定细胞内环状核苷酸的浓度的测试方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对细胞内环状核苷酸cGMP和cAMP的浓度进行定量光学分析的方法。所述的方法利用了以重组方式将特定CNG通道、钙敏感的光蛋白和不同靶蛋白组合表达的细胞系，以找出调节物。以该方式修饰的细胞系适用于高通量筛选(HTS和uHTS)，并且可用于鉴别对参与环状核苷酸cGMP和cAMP的形成或分解的受体或酶的活性有影响的药物。

Description

测定细胞内环状核苷酸的浓度的测试方法
本发明涉及对环状鸟嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cGMP)或环状的腺嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cAMP)的胞内浓度进行定量光学分析的方法。该方法可用于鉴别和评估对参与环状核苷酸cGMP和cAMP的生成和分解的受体或酶的活性有影响的测试物质的药理学特性。因此该方法适合用于获得例如可溶的和膜结合的鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶(PDE)、NO合成酶和G蛋白质耦合的受体(GPCR)的调节物。
本发明描述了一种方法，该方法借助于重组细胞系对细胞内的cGMP或cAMP的浓度进行测量。所述细胞系通过将环状核昔酸活化的离子通道(CNG-通道)、一种钙敏感的光蛋白以及受体或酶组合一起重组表达，以便找到调节物。该方法适用于自动化，以及以高的或非常高的处理能力(″高通量筛选″(HTS)和″超高通量筛选″(uHTS))来寻找调节物。
现有的测量cGMP或cAMP的胞内浓度的方法存在缺陷：由于使用了放射性，非常昂贵，不能或只能部分地用于自动测量，并且非常昂贵。
用于测定cGMP和cAMP的传统商业系统是放射性技术如″放射性免疫分析″(RIA；例如来自于IBL，Hamburg)，″闪烁接近分析法″(SPA；AmershamBioscience，UK)和非放射性的″酶联免疫吸附分析″(ELISA；例如来自于Amersham Bioscience，Uk)。
上面描述的方法不能用于在活的细胞中“原位”测定cGMP和cAMP胞内浓度。在测量时必须将细胞破碎，并随后提取出环状核苷酸。
另一种测量cAMP胞内浓度的方法是借助于诱导性的启动子系统(″cAMP-应答元件″，CRE)和荧光素酶(Goetz等人，J.Biomol.Screen.(2000)5377-384)进行测量。该方法的缺点是为了形成信号必须启动转录和转译，这导致测量过程持续几小时以上。因此不适于快速测量细胞中实际的cAMP浓度。
本发明的任务是找到一种改进的非放射性的方法，用于测量细胞内cGMP或cAMP的浓度。该方法可以非常快速实施，并且有更高的灵敏性。该方法应当能够自动化并适合以高试样或测试化合物通量(HTS和uHTS)进行筛选。
本发明范围内的测试化合物优选的是分子量为100到500，或者100到1000，或以上的小分子化合物。在本发明方法中可以是使用单一物质或其混合物。本发明范围内的测试化合物包括抗体、天然物质、天然物质的提取物、肽、蛋白质及核酸。上面所述只是为了举例说明，而不是穷举。
为了建立酶和受体的筛选系统，以单一或不同组合的方式，将各种各样的对细胞内cAMP或cGMP水平有影响的由环状核苷酸活化的离子通道(CNG通道)转染到细胞中，所述的细胞另外还组合表达钙敏感的光蛋白。接着用各种各样的酶或受体转染所述细胞，以检测高通量筛选细胞的能力。在此例如使用可溶性的鸟苷酸环化酶，因为它在受刺激的情况下，能够形成胞内cGMP。例如β-肾上腺素能受体可用作为受体，其在活化之后，诱导胞内cAMP浓度上升。
CNG通道是内在膜蛋白，它被环状核苷酸cGMP和cAMP打开。所述的离子通道家族包括能渗透钠、钾和钙离子的非选择性阳离子通道。功能性的通道是由四种相同的或不同的亚单位(同源或异源四聚体)形成的。不同的亚单位组合将影响其对cGMP和cAMP的敏感性(Biel等人，TCM(1996)6，274-280；Kaupp和Seifert，Physiol.Rev.(2002)82，769-824)。CNG1-CNG6的通道亚单位已被克隆和公开了，其最新的分类命名为CNGA1-CNGB3(Bradley等人，Science(2001)294，2095-2096)。还存在拼接变型，如CNG4.3(Sauter等人，PNAS(1998)95，4696-4701)。
随着胞内cGMP或cAMP浓度的上升，CNG通道被打开，并且通过其流入钙离子。这时借助于钙敏感的荧光指示剂，如FURA，Fluo-3或借助于钙敏感的发光蛋白，如水母发光蛋白或奥贝林(Obelin)证实流入的钙离子。
来源于水母(Aequorea victoria)的发光蛋白水母发光蛋白在细胞中是高敏感的钙指示剂。水母发光蛋白复合物由蛋白质Apoaequorin，分子氧和发光体腔肠素组成。在钙存在时(Ca2+-离子)复合物发出蓝光，在466nM处有最大发光量(Jones等人，Trends Biotechnol.(1999)17，477-481)。
另一个发光蛋白是奥贝林，它是从不同的水螅纲如双叉薮枝(Obelialongissirna)克隆得到。它是由Apoobelin、O2和发光体腔肠素组成。钙存在时同样发出蓝光(Illarionov等人，Methods Enzymol.(2000)305，223-49)。
鸟苷酸环化酶负责由GTP产生cGMP。可以分为可溶性的和膜结合的鸟苷酸环化酶。可溶性的鸟苷酸环化酶是一个来自于α和β亚单位的异源二聚体。其对于内皮NO合成酶制备的一氧化氮(NO)是天然的受体，因此可以借助于释放NO的物质如SIN-1活化其药理学特性。由于由鸟苷酸环化酶制备的cGMP诱导血管放松，所述的酶包括有高价值的药物学靶(Hobbs AJ.，TIPS(1997)18，484-491)。膜结合的具有跨膜蛋白的片段，被不同的激动剂如ANP、BNP、CNP或鸟苷蛋白活化(Wedel和Garbers，Annual Rev.Physiol.(2001)63，215-233)。
另一个药物上有用的蛋白家族是所谓的G蛋白质结合的受体(GPCR)。它们是在细胞内具有胞外激素作用的内在膜蛋白。该受体与不同的G蛋白质的耦合，影响到细胞内cAMP或钙的水平。所谓的Gq耦合的受体的活化导致钙从内部存贮中释放，从而提高了细胞质中钙的浓度。所谓的Gs耦合的受体的活化导致cAMP浓度提高，所谓的Gi耦合的受体的活化却相反地导致胞内cAMP含量下降(Gurrath M.，Curr.Med.Chem.(2001)8，1605-1548)。Gs耦合的受体的一个例子是所谓的β-肾上腺素能受体，它借助于激动剂如异丙肾上腺素起刺激作用(Dzimiri N.，Pharmakol.Rev.(1999)51，465-501)。
由鸟昔酸环化酶和GPCRs产生的环状核苷酸cGMP或cAMP被所谓的磷酸二酯酶(PDEs)水解为GMP或AMP。磷酸二酯酶构成了酶家族，基于物质特异性、在体内的调节和表达方式可清楚地区分其成员(Francis等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.(2001)65，1-52)。PDEs对胞内cAMP和cGMP水平的控制起着决定性的作用，并且也是药物学干扰的重要的靶。
令人惊奇的是，CNG3-通道(SEQ ID NO：5，Acc.No.X 89600)或者特别是CNG2通道(Seq ID Nr.1.Acc.No.X55010)与一种发光蛋白的组合，特别适合于检测胞内cGMP浓度的变化(附图1)。
同样令人惊奇的是，CNG2/CNG4.3/CNG5(Seq ID Nr.1/Seq ID Nr.2，Acc.No.AJ000515/Seq ID Nr.3，Acc.No.U12623)与发光蛋白的组合可以非常好地适合检测胞内cAMP浓度的变化(附图3)。对于适用于cAMP测量，特别好的是CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5(Seq ID Nr.4/Seq ID Nr.2/Seq ID Nr.3)与发光蛋白的组合。对于CNG2突变体CNG2(T537A)(Seq ID Nr.4)，其氨基酸苏氨酸-537被丙氨酸替代(Altenhofen等人，PNAS(1991)88，9868-9872)。
可以使用常规载体如pcDNA1.1 Amp或pcDNA3(Invitrogen LifeTechnologies)来制备重组细胞系。采用例如Lipofectamin(Invitrogen LifeTechnologies)的转染试剂转染合适的质粒构建体。
在测量时，将细胞置于384孔微滴板(MTP上，每孔1500个细胞，置于1536孔的MTP上，每孔250个细胞。在37℃/5％CO2条件下培养1-2天后，将细胞培养基(添加了10％胎牛血清的DMEM/F12)去掉，在37℃/5％CO2条件下在无钙的蒂罗德溶液(Tyrode)中用腔肠体(0.8μg/ml)对细胞加载3小时。然后在无钙蒂罗德溶液中加入测试物质和相应的控制物质(例如SIN-1或异丙基肾上腺素)，在前述细胞孵育5-10分钟。随后，在附加了含超过峰值(钙终浓度：3mM)钙的蒂罗德溶液的暗箱中，借助于″电荷耦合器件(Charge-comple device)″照相机进行实际的测量。
为了直接测量物质的效果，将带腔肠体的细胞装入含钙的蒂罗德溶液中。然后在暗箱内将物质加入，在物质加入后立即进行测量(附图5).
该方法的优点在于测量的灵敏度高，单位测试点费用低，适用于HTS或uHTS。该方法具有极好的信噪比，达到了50-150倍刺激因子。另外，测试物使用的时间非常短，原因是几秒钟后即可观察到信号(附图5)。该方法的优点是将测试物质在所使用的细胞的非特异性作用(例如借助细胞毒性)降低到最小。此外，该方法适用对所谓的″孤儿受体″(指其自然配体未知的受体)进行定性，因为借助于光或荧光测量，既可观察到细胞内cAMP(Gs耦合和Gi耦合)的变化，也可观察到细胞内钙浓度(Gq耦合)的变化。
本发明涉及用于测量环状核苷酸胞内浓度的方法，其特征在于制备和使用一种细胞，所述细胞将CNG通道与发光蛋白一起表达，并且借助于发光蛋白的发光信号测定环状核苷酸的胞内浓度。
根据本发明在上述的方法中，其中CNG通道是指CNG2或CNG3通道。
上述方法是本发明的组成部分，其中环状核苷酸是cGMP。
同样在根据本发明的前述方法中，其中环状核苷酸是cAMP并制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2/CNG4.3/CNG5通道的组合。
本发明涉及前述方法，其中环状核苷酸是cAMP并制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5通道的组合。
本发明的主题是前述方法，其中发光蛋白是水母发光蛋白。
本发明还涉及上面所述的方法，其中发光蛋白是奥贝林。
本发明涉及用于筛选用于识别受体配体的测试化合物的方法，其中使用一种如上所述的方法，在所用的细胞中表达受体，并且具有一个允许受体配体结合的胞内信使系统，导致通过离子通道的离子流可测量的调节，将该细胞用测试物质孵育，选出调节发光的那些测试物质。
本发明还涉及这样的方法，其中所述的受体是G蛋白耦合的受体。
本发明还涉及相应的方法，其中G蛋白耦合的受体是孤儿受体。
本发明的主题还在于另一方法，用于筛选识别磷酸二酯酶调节物的测试物质的方法，其中使用前述方法之一，其中所用的细胞表达磷酸二酯酶，将细胞用测试物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明同样涉及用于筛选识别鸟苷酸环化酶的调节物的测试化合物的方法，其中使用前述方法之一，该方法将所用的细胞用测试物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明还涉及用于筛选识别NO合成酶的调节物的测试化合物的方法，其中使用了上面描述的方法之一，该方法以所用的细胞表达NO合成酶以及可溶性鸟苷酸环化酶，该细胞用测试化合物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明还涉及一种相应的方法，其中在不同的细胞中表达NO合成酶和可溶性鸟苷酸环化酶。
本发明还涉及一种细胞，它是由前述任一种方法制备的。
附图说明
附图1：图解显示测定胞内cGMP浓度的方法。
附图2：用SIN-1活化可溶性鸟苷酸环化酶之后，测量发光值。″相对光单位″(RLU＝″相对光单位″)的测量进行1分钟。显示了在该时间内相对于SIN-1浓度的测得的光量。
附图3：图解显示测定胞内cAMP浓度的方法。
附图4：在用异丙肾上腺素激活β-肾上腺素能受体之后发光值的测量。在无钙的蒂罗德溶液中用异丙肾上腺素孵育10分钟。通过加入钙开始测量。以秒间隔测量″相对光单位″(RLU＝″相对光单位″)。在加入钙之后和用0M(星型)，10-7M(四边形)和10-6M(三角形)异丙肾上腺素预培养时，发光信号随时间的走向。
附图5：在含钙的蒂罗德溶液中用异丙肾上腺素激活β-肾上腺素能受体之后，发光信号的动力学。在暗箱内加入激动剂异丙肾上腺素(10-6M)后开始测量。
实施例
在细胞系中补充表达例如可溶性的鸟苷酸环化酶，在cGMP测试系统中，将钙敏感的光蛋白与CNG2通道(Seq ID Nr.1)一起表达，因此在鸟苷酸环化酶刺激剂SIN-1的帮助下，胞内cGMP浓度剂量依赖性地提高并且检测到更强的发光信号(附图2)。
在细胞系中补充表达例如β-肾上腺素能受体，在cGMP测试系统中，将钙敏感的光蛋白与CNG通道种类CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5(seq ID Nr.4/SeqID Nr.2/Seq ID Nr.3)一起表达，从而借助于剂量依赖性的异丙肾上腺素激活该受体，导致cAMP浓度升高和发光信号增强(附图4)。在含钙的蒂罗德溶液中装载具有腔肠体的细胞，以便可以直接向暗箱内的细胞供给激动剂异丙肾上腺素。然后在几秒钟内观察到发光信号(附图5)。
序列表
<110>Bayer AG，BHC
<120>用于测定胞内环状核苷酸浓度的测试方法
<130>Le A 36 621
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3166
<212>DNA
<213>Bos taurus
<400>1
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tctaagtttg aggaagaaag aaaagaggag catctctcca ggctcttttg catctagtta   2700
cctcctactt gattcttttc taatatgtgt tctgaatatt tccatttccc tgcagcagta   2760
tgtagttaga acactggctg cagacaccca gcactggtcc cagtgtcctt ttcccaaggc   2820
aggcaaaagg tgtggagggg ggcaaggagg agatgctcac tccaagtcct gccgtgctga   2880
ttcctccgcc tgtctgccaa cccagagtgg gagccctgtg gtcttttctg aaccaggggg   2940
aggaggatgc tcctggtctc caatccatcc caggacatgg agtgaggaac tagcagttgg   3000
ccagcaggca aggcacctgg agaaggtggt gggcaggagc ctggccatca cccctctatg   3060
cagagtgttt ctcaggaggc cctgaggctg atggtgggtg gatgactctt caagttaaca   3120
tctgcagtag agacacttac aagttaataa attcctctga actttt                  3166
<210>2
<211>3236
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>2
caccagctcc atgctgtgcc aatcacagcg tcttagaagc tgctgtcctg gctgacccag     60
ggcttctccc ggctccactc atatgctcca gtcccaggct tggcatcact gtcacagccc    120
caggctgacc tactgcaaca tggaccttcc taccagcaga gcccgaaaga cccaatgtcc    180
tgctggatag ctgtttggtg gtgcaggctg atgtggacca gtgccagcta gaaagggcac    240
agccagagac agcatcgatc caggagttac cagaagaaga agaggagaag gaggaagaga    300
agaaggagga ggaagaggag aaggaggagg aggaagagaa ggaagaggaa gaggagaagg    360
aggaggaggg ggaggccaca aactcaacag tccccaggat cacgcctctg cctgacacct    420
acgggaccca gtaccatggc taaaccaggc ctgaacatgg agctgaatcg cctggtccag    480
gaccagccac ctggccagga gggccccaga cctggccccc caaacccagc cgagcacctc    540
cccaatgtgc ccagctaccg tcccgcaacc acccgcatcc ccgtcctcgt ctcccggagg    600
acagccttgt ccaactccaa cttcaccaag gagatcagga gctccatccg tcgcctggta     660
ccagccacga aagagcaccc ggagctccag gtggaagaca cagatgccga agctggcccc     720
ctcatcccag aggagacgat cccgccacct gagagaccac cagtgtctcc cgccaagtct     780
gacaccctcg cggttcccag cgcagcaacc cacaggaaga agctaccttc tcaggatgat     840
gaggctgaag aactcaaggc cctgtcaccg gctgagtccc cagtggttgc ctggtcagac     900
cccaccaccc cacaggaggc tgatggcgag gaccgtgcgg cctccacagc cagccagaac     960
agtgccatca tcaacgaccg gctccaggag ctggtgaaga tgttcaagga gcggacagag    1020
aaggtgaagg agaagctcat tgaccctgac gtcacctccg atgaggagag ccccaagccc    1080
tccccagcca agaaggcccc agactcagcc ccagcccaga agccggcgga ggcagaggcg    1140
gcagaggagg agcactactg tgacatgctc tgctgcaagt tcaagcgcag gccctggaag    1200
atgtaccagt tcccccagag catcgaccca ctgaccaacc tcatgtacat cctgtggctg    1260
ttcttcgtgg tgctggcctg gaactggaac tgctggctga ttcctgtgcg ctgggccttc    1320
ccgtaccagc gggcagacaa catccacctc tggctgctca tggactactt gtgcgacttc    1380
atctacctcc tggacatcac cgtgttccag atgcgtctcc agtttgtcaa aggcggggac    1440
atcattacag ataagaagga gatgcgtaat aattacctga agtctcaacg atttaagatg    1500
gacttgctct gccttttgcc tttggatttt ctctacttga aacttggcgt gaaccccctt    1560
cttcgcctgc cccgctgcct gaagtacatg gccttctttg agtttaataa ccgtctggaa    1620
gccatcctca gcaaagccta cgtttacagg gttatcagga ccaccgccta cctgctgtat    1680
agcttgcatc tcaactcctg tctttactac tgggcgtcgg ccttccaggg catcggttcc    1740
actcactggg tttatgacgg cgtggggaac agctacattc gatgctacta ctgggctgtg    1800
aaaactctca tcaccatcgg aggactgccc gacccccaga cgctctttga gatcgtcttc    1860
cagctgctga attattttac aggtgtcttc gctttctctg tgatgattgg acagatgaga    1920
gatgtggtgg gggccgccac ggcagggcag acgtactacc gcagctgcat ggacagcacg    1980
gtgaagtaca tgaacttcta caagatcccc aggtctgtgc agaaccgcgt caagacctgg    2040
tatgagtaca cctggcattc acaaggcatg ctggatgagt cagagctgat ggttcagctt    2100
ccggacaaga tgcgtctgga cctggccatt gacgtaaact acaacattgt cagcaaagtg    2160
gcgctcttcc agggctgcga ccggcagatg atcttcgaca tgctcaagcg acttcgctca    2220
gtcgtctacc tacccaatga ctatgtgtgc aagaaggggg agattggccg agagatgtat    2280
attatccagg cggggcaggt gcaggtgctg ggcggcccag atggaaaggc tgtcctggtg    2340
acactcaaag ccggatcggt gtttggagag ataagcttgc tggctgtcgg gggcggtaac    2400
aggcgcacgg ccaatgtggt ggcccacggc ttcaccaatc tcttcattct ggataagaag    2460
gacttgaatg agattttggt gcattaccct gaatctcaga agctgctccg gaagaaggcc    2520
aggcgcatgc tcagaaacaa caacaaaccc aaggaggaga agagtgtgct catcctgccc    2580
ccacgtgcgg gcaccccgaa gctcttcaat gctgccctgg ctgcagcagg aaagatgggc    2640
cccaggggag ccaagggcgg caagctcgcc cacctgagag ccaggctcaa agaactggct    2700
gcactggagg cagccgcacg acagcagcag ctgctggaac aggccaagag ctcgcaagaa    2760
gccgggggag aggagggctc tggagccaca gaccaacctg caccccagga gccgtcagag    2820
cccaaggagc ccccggagcc cccagccccg agttctccac cgccagcctc agcaaagccc    2880
gagggaagca cggaggaggc cgcagggccg ccggagcctt cagtgaggat ccgtgtgagt    2940
ccaggccctg atcccgggga acagacacta tcggtggaga tgctggaaga gaagaaggag    3000
gaggtggagt gaggtgcatt cagcaccctg atcccatccc taggtgcgga ccagaccttt    3060
gaaccacctg cctcaccaag catcttagcc taaaggcgcc ttctcaccgg cttatagaaa    3120
ctctcaaatt tcatcaagta gtggtggtga cctcgagctc ctaacattcc cggagcaccc    3180
tgctcccctc tcacagttgc tattttctag aagaaaaccg ccttgcactt taaaaa        3236
<210>3
<211>2351
<212>DNA
<213>Rattus norvegicus
<400>3
cgctggagcc cgagggcagc ctcttccagg aagccaggca ctttcccaag ccacctataa      60
tcggagaatc actggatagt ctacagacta gaaccacact acggaaacat gagccaggac     120
ggcaaagtga agaccacaga gtccacgccc ccagccccaa ccaaagccag gaagtggctg     180
ccagtcctag acccatctgg ggattactac tactggtggc tgaacacaat ggtcttccca     240
atcatgtaca acctcatcat cgttgtatgc agggcctgct ttcctgactt gcagcacagt     300
tacctggtgg cctggttcgt gctggactac acgagtgacc tgctgtacct actagatatt     360
ggggtacgct tccacacagg attcctagag cagggcatcc tggtggtaga caaaggcatg     420
atcgccagtc gctacgtccg cacctggagc ttcctgttgg acctggcgtc cctggtcccc     480
acagatgcgg cctatgtgca gctgggcccc cacatcccta cactccggct aaaccgcttt     540
ctccgagtgc cccgcctctt cgaggctttt gatcgtacag agacccgcac ggcttaccca     600
aatgccttcc gcatagccaa gctgatgctt tacatttttg ttgtcatcca ttggaacagt     660
tgcttatact tcgccctgtc caggtacctg ggctttggac gggatgcgtg ggtataccca     720
gaccctgcgc aacctggctt tgagcgcttg cggcgccagt atctctacag cttctacttc     780
tccactctga tcctgaccac agtgggtgac acgccgctgc cagaccgaga ggaagagtac     840
ctcttcatgg tgggtgactt cctgctggcc gtcatgggtt tcgccaccat catgggtagc     900
atgagctctg tcatttacaa catgaacact gcagatgcgg ccttctaccc agaccatgcg     960
ctggtaaaga agtacatgaa gctgcagcat gtcaacaaga ggctggagcg gcgagttatt    1020
gactggtacc agcatcttca gatcaacaag aagatgacca acgaggtagc catcttgcag    1080
cacctgcctg agcggctgcg ggcggaggtt gctgtgtccg tgcacctgtc taccctgagc    1140
cgagtacaga tcttccagaa ctgtgaagcc agcctgctgg aagagctggt gctgaagcta    1200
cagccccaga cctactcgcc aggcgaatat gtgtgccgca aaggggacat tggccgagag    1260
atgtacatca tccgtgaggg ccagctggct gtggtggccg atgatggtgt cacacagtat    1320
gctgtgcttg gtgcagggct ctactttggg gagatcagta tcatcaacat caaagggaac    1380
atgtctggaa accgacgaac agccaacatc aagagcctag gttattcaga cctgttctgc    1440
ctcagcaagg aggatctgcg ggaggtactg agtgagtacc cacaggccca ggcggtcatg    1500
gaggagaagg gccgagaaat cttgctcaaa atgaataagt tggatgtgaa tgctgaggca    1560
gctgagatcg ccctccagga ggccacagag tctcggctca aaggcctcga ccagcagctt    1620
gatgatctgc agaccaagtt tgctcgccta ctggctgagc tggagtccag tgcactgaag    1680
atagcttacc gcatcgaaag gctggagtgg cagactcgag agtggccaat gccagaggac    1740
atgggtgagg ctgatgatga ggctgagcct ggagaaggga cgtccaagga tggagaggga    1800
aaggctggcc aggcgggacc ctcaggcata gaatgacccc gtcctgaccc taggactccc    1860
agctcaaata aatccagagt ggtgggaaag tctgcctgca ggaactgtca tcctctttgc    1920
taggttacag aacgtaggta aattggtcta tagatgccta gctagggatg tgggtcacag    1980
catccattag tcccatactc accagcaaat gtacacacac acacacacac aaacatgcgc    2040
acgcacacgc tcaagactga gttctacata atgttcctgt cttctgcaca catgtgcacc    2100
atgatcacag agaacaattg aatgcactgg gactcttgag gtaagcttta cacatcttaa    2160
aggaggtctg ctggtttagg gcaaggacag tgttggagct acagggaaag tagacagata    2220
caattcctga actctaggtc accacttcag ctgcttcagg gtatggcccg acttcaggtc    2280
tgagctggga caggcggtat tttgaaatga acctgatgtg tgatttatta ataaaatata    2340
aggttcataa c                                                         2351
<210>4
<211>1992
<212>DNA
<213>突变的CNG2
<400>4
atgacagaaa aagccaatgg cgtgaagagc tccccagcca ataaccacaa ccaccatgcc      60
cctcctgcca tcaaggccag tggcaaagat gaccacaggg ccagcagccg gccacagtct     120
gctgctgctg atgacacctc ctcagagcta cagcaactgg cagagatgga tgccccccag     180
cagaggaggg gtggcttccg caggattgcc cgcctggtgg gggtcctcag agagtgggct     240
tacaggaact tccgtgagga ggagcctaga cctgactcat tccttgagcg tttccggggg     300
cctgagctcc acaccgtgac aacacaacaa ggagacggca aaggcgacaa ggacggcgag     360
ggcaagggca ccaagaagaa gtttgaactc tttgtcttgg acccagccgg ggactggtac     420
taccgctggc tttttctcat tgccttgccc gtcctctaca actggtgcct attggtggcc     480
agagcctgct tcagtgacct gcagaaaggc tactacatag tgtggctggt gctggattac     540
gtctcagatg tggtctacat cgcagacctc ttcatccgac tgcgcacagg tttcttggag     600
caggggctac tggtgaaaga caccaagaag ttgcgggaca actacatcca caccatgcag     660
tttaagctgg atgtggcctc catcatccct acagacctga tctattttgc tgtggggatc     720
cataaccctg aggtgcgctt caaccgcctg ctacactttg cccgcatgtt tgagttcttt     780
gaccgcactg agacacgcac cagctacccc aacatcttcc gaataagcaa cctgatcctc     840
tacatcttga tcatcattca ctggaatgcc tgcatctact atgccatctc caagtccatc     900
ggctttgggg tagacacctg ggtttacccc aacatcactg accctgagta tggctacctg     960
tctagggagt acatctattg cctttactgg tctacactga ccctcaccac cattggggag    1020
acaccacccc ctgtaaagga tgaggagtac ctgtttgtca tctttgactt cctgattggt    1080
gtcctcatct ttgccaccat cgtgggaaat gtgggctcca tgatctccaa catgaatgcc    1140
acccgggctg agttccaggc caagattgat gctgtcaaac attatatgca gttccgaaag    1200
gtcagcaagg agatggaagc caaggtcatt aggtggtttg actacttgtg gaccaataag    1260
aagagtgtag atgagcgaga agtcctcaaa aacctgccag caaagctcag ggctgagata    1320
gccatcaacg tccacctgtc cacactcaag aaagtgcgca tctttcagga ctgtgaggct    1380
ggcctgctgg tggaactggt attaaagctc cggcctcagg tctttagccc tggggactac    1440
atttgccgca agggggatat tgggaaggag atgtacataa tcaaggaggg aaaattggca    1500
gtggtggctg atgacggtgt cactcagtat gccctgctct cggctgggag ttgctttgga    1560
gagatcagta tccttaatat taagggcagc aaaatgggca atcggcgcgc agccaacatc    1620
cgcagtcttg gctactctga tctgttctgc ttgtccaagg atgatcttat ggaagctgtg    1680
actgagtacc ctgatgccaa gagggtcttg gaggagagag gccgggagat tctgatgaag    1740
gagggcttgt tggatgagaa tgaggtggca gccagcatgg aggtagatgt gcaggaaaag    1800
ctagaacagc tggagaccaa catggacacc ttgtacactc gttttgcccg cctgctggcc    1860
gagtacacgg gagcccagca gaagctcaag cagcgcatca cagttttgga aacgaagatg    1920
aagcagaata atgaggatga ctccctgtca gatgggatga acagcccaga gccacctgcc    1980
gagaagccat aa                                                        1992
<210>5
<211>2641
<212>DNA
<213>Bos taurus
<400>5
gtcgtcatgg cggaggatgc tgtgcgaggt ggatggcagc cttctcccca ggaccctcca      60
ggtccgagtc tgtggaggcc tcagcaactg gagtatgtgg acactgccat tcagcagcca     120
ccttggggtg gaatgtgaca cagcaagaag atggccaaga ttagcaccca atactcccac     180
cccaccagga cacacccctc ggtcaggacc atggacagag atctggattg cattgaaaac     240
ggtctcagca ggacccactt gccatgcgag gagacatcgt cagaactgca ggaaggcatt     300
gccatggaga ctagaggact ggctgaatcc aggcaaagct ccttcaccag ccagggtccc     360
accaggttgt cacgcctcat catctcgctc cgtgcctgga gcgccaggca cttacaccag     420
gaggaccaga ggcccgactc tttcctggag cgtttccgcg gagctgagct ccaagaggtg     480
tctagccgag aaagccatgt ccagttcaat gtgggcagcc aggagccacc agacagaggg     540
agaagtgcct ggcccctggc cagaaacaac accaacacct gcaacaactc ggagaaggat     600
gacaaggcga aaaaggagga gaaagagaaa aaggaagaga aaaaggagaa ccccaagaaa     660
gaggagaaga agaaggacag cgttgtgatg gacccttcca gcaacatgta ctaccactgg     720
ctgactgtca tcgccgtgcc tgtcttctac aactggtgtc tgctcgtgtg cagggcctgt     780
ttcgatgagc tccagtccga gcacctgatg ctttggctgg tcctggacta ctcagcagac     840
atcctctatg gcatggatat gctggtccga gcccggacag gcttcctgga gcaaggcctg     900
atggtcatgg acgccagccg gctgtggaag cactacacac agaccttgca cttcaagctg     960
gacgtgttgt ccctggtgcc cacagacctg gcttatttta agctgggcat gaactaccca    1020
gaactgaggt tcaaccgcct cctgaagttg gcccggctct tcgaattctt tgaccgcacg    1080
gagacaagga ccaactaccc caacatgttc aggatcggga acttggtctt gtacatcctc    1140
atcatcatcc actggaatgc ctgcatctac tttgccattt ccaagttcat tggtttcggg    1200
accgactcct gggtctaccc aaacgtctcc aacccagagt atgggcgcct ctccagaaag    1260
tacatttaca gtctctactg gtccaccttg accctgacca ccattgggga gaccccgccc    1320
cccgtaaaag acgaggaata tctctttgtg gtcatcgact tcctggtggg cgtcctgatt    1380
tttgccacca tcgtgggcaa cgtgggctcc atgatctcaa acatgaatgc ttcacgggcc    1440
gagttccagg ccaagatcga ttccatcaag cagtacatgc agttccgcaa ggtgaccaag    1500
gacttggaga cacgggtgat ccgctggttc gactacctgt gggccaataa gaagacagtg    1560
gatgagaagg aggtgctcaa gagcctcccc gacaagctga aggccgagat cgccatcaac    1620
gtgcacctgg acaccctgag gaaggtccga atcttccagg actgcgaggc ggggctgctg    1680
gtggagctgg tgctgaagct gcggccggca gtgttcagcc ccggggacta catctgcaag    1740
aagggggaca tcgggaggga gatgtacatt atcaaggagg gcaagctggc cgtggtggcc    1800
gaggacggca tcacccagtt cgtggtcctc ggcgacggga gttatttcgg ggagatcagc    1860
atcttgaaca tcaaggggag caagtccggg aaccgccgca cggccaacat caggagcatc    1920
ggctactcgg acctgttctg cctctccaag gacgacctga tggaggcgct caccgagtac    1980
cccgaggcca agaaggcgct ggaggagaaa gggcggcaga tcctcatgaa ggacaacctg    2040
atcgacgagg agctggccaa ggccggggca gaccccaagg acatcgagga gaaggtggag    2100
cacctcgaga cctccctgga ctccctgcag accaggtttg cgcggctcct ggctgagtac    2160
aacgccaccc agatgaaggt gaagcagcgg ctcagccagt tggaaagcca ggtgaagatg    2220
ggcctcccgc ctgatggcga tgctccgcaa actgaggcca gtcagccctg aagacacagg    2280
tgccctctcc tgcctccccg gggcggcggt cagtgcgacg ctgcgccgca cggggctcgg    2340
ccgggaccga attctagctt tccccaccct ctgtgcgctg cgtggccttg ggagagagcc    2400
ttggtttccc tcatctagat aacaggactc tttatgtctg tcccagttaa gtgacaggtt    2460
gctgtgagct ccacaagaaa cgcttcgtga ggcagggttt tgttaagtgt gagatgtttc    2520
taggccaaga gtataaaaat gtgagcacag aagttgtttt tttttttttt ttttaatccg    2580
tggggaatat ttagactcct gaacttcatt ttttttgtaa atgggaggtt atttacttac    2640
c

Claims (15)

1.测定胞内环状核苷酸浓度的方法，其特征在于：
i)制备和使用一种细胞，该细胞将CNG通道与发光蛋白一起表达，和
ii)借助于发光蛋白的发光信号测定细胞内环状核苷酸的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述的CNG通道是指CNG2或CNG3通道。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的环状核苷酸是cGMP。
4.权利要求1的方法，其中所述的环状核苷酸是cAMP，并且制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2/CNG4.3/CNG5通道的结合体。
5.权利要求1的方法，其中所述的环状核苷酸是cAMP，并且制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5通道的结合体。
6.权利要求1-5的方法，其中发光蛋白是水母发光蛋白。
7.权利要求1-5的方法，其中发光蛋白是奥贝林。
8.一种用于鉴定受体-配体的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞能够表达受体并且具有胞内信使系统，该系统允许受体-配体结合，引起通过离子通道的离子流的可测量调节，将该细胞用测试物质孵育，并选出能够调节发光的测试物质。
9.权利要求8的方法，其中所述的受体是G-蛋白质偶合的受体。
10.权利要求9的方法，其中所述的G-蛋白质偶合的受体是孤儿受体。
11.一种用于鉴定磷酸二酯酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达磷酸二酯酶，将该细胞用测试物质孵育，并选出能够调节发光的测试物质。
12.一种用于鉴定鸟苷酸环化酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达鸟苷酸环化酶，将该细胞用测试物质孵育，选出能够调节发光的测试物质。
13.一种用于鉴定NO合成酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达NO合成酶以及可溶的鸟苷酸环化酶，将该细胞用测试物质孵育，选出能够调节发光的测试物质。
14.权利要求13的方法，其中在不同的细胞中表达NO合成酶和可溶性的鸟苷酸环化酶。
15.按权利要求1-14之一的方法制备的细胞。
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